Name: optogenetic manipulation of neuronal activity to modulate behavior in freely moving mice
Uploaded: 2020-10-27T12:30:00
Duration: 14 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity to Modulate Behavior in Freely Moving Mice at JoVE.com

Merci au Professeur Klaus-Armin Narve et au Dr Sandra Goebbels (Max-Plank-Institute of Experimental Medicine, Goettingen, Allemagne) d’avoir gentiment fourni des souris Nex-Cre. En outre, nous remercions notre équipe vidéo Yunus Dikici et Ruben Wiesner pour l’enregistrement et le traitement de la vidéo JoVE pour cet article. En outre, merci à Kristin Claussen pour sa voix-off et Kimberly Anne Go pour la relecture du manuscrit.
Les résultats présentés ont été obtenus à la Ruhr-Université de Bochum et la vidéo a été enregistrée à l’Université de Brême.
Ces travaux ont été financés par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fondation allemande de recherche) - Projektnummer 122679504 - SFB 874 et DFG MA 4692/3-2.

Les auteurs n’ont rien à révéler.

La modulation des circuits neuronaux dans le système nerveux central et leurs résultats comportementaux sont importants pour comprendre comment le cerveau fonctionne, en particulier dans les maladies psychiatriques et les tâches cognitives telles que l’apprentissage et la mémoire. Avec l’optogénétique, les cellules individuelles ou les populations cellulaires jusqu’à des circuits entiers peuvent être modulées par la lumière. Les outils optogénétiques courants comme Channelrhodopsin2 (ChR2) ou Archaerhodopsin (Arch) sont capables d’activer ou de réduire au silence les neurones, ou d’augmenter ou d’inhiber la libération d’émetteur aux terminaux d’axon qui se projettent vers des régions distinctes du cerveau1,2,3,4. Cependant, Arch doit être utilisé avec soin car il a été démontré que son activation aux terminaux présynaptiques augmente la libération spontanée de l’émetteur5. Arch est une pompe à protons rectifiante vers l’extérieur qui modifie la valeur du pH à l’intérieur de la cellule. Ce milieu alcalin induit l’afflux de calcium et améliore la libération de l’émetteur5. Pour moduler spécifiquement les voies de signalisation intracellulaire, les chimères récepteurs composées d’un outil optogénétique activateur léger, comme la rhodopsine ou la cône opsine, en conjonction avec un récepteur couplé à la protéine G adéquat, peuvent être créées6,,7,8. La quantité et la variation des outils optogénétiques disponibles ont considérablement augmenté au cours de la dernière décennie9.
Le but de l’optogénétique est de manipuler les circuits neuronaux pendant le comportement. L’optogénétique permet, par exemple, la mesure des changements comportementaux aigus tels que les changements dans le comportement anxieux. Les outils optogénétiques sont livrés dans les régions cibles du cerveau par l’intermédiaire de vecteurs viraux. Avec l’aide de promoteurs et d’exhausteurs spéciaux, ou du système Cre-loxP, la spécificité du type de cellule peut être assurée pour l’expression d’outils optogénétiques (Figure 1A). Il existe plusieurs lignées de souris génétiquement modifiées exprimant l’enzyme Cre-Recombinase dans des types de cellules spécifiques seulement. Par exemple, les souris Nex-Cre expriment la Cre-Recombinase dans les neurones pyramidaux du cortex et de l’hippocampe sous le contrôle du Nex-promotor10. Cette enzyme est capable d’inverser les séquences d’ADN, qui sont flanquées de côtés loxP11. Par conséquent, la séquence d’ADN d’un outil optogénétique à double floxé, qui est inversé et flanqué de côtés loxP, ne peut être transcrite que par des neurones qui possèdent le Cre-Recombinase, mais pas par d’autres types neuronaux12,13. Dans le cas des souris Nex-Cre, l’outil optogénétique sera uniquement exprimé dans les neurones pyramidaux. La stimulation lumineuse de certaines régions du cerveau est ensuite réalisée par l’implantation chronique de fibres optiques directement au-dessus de la région d’intérêt. Les animaux peuvent alors être couplés à une source de lumière appropriée et se comporter librement dans presque toutes sortes de tests comportementaux.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61023/61023fig01.jpg"> Figure 1 : Injection et implantation. A) Système Cre-loxP pour ChR2-YFP. Double outil optogénétique floxé est emballé dans un virus adéno associé (AAV) pour l’injection dans le tissu cérébral. B) Vue sagittale de l’injection et de l’implantation d’une interface neuronale optique dans/au-dessus de la région IL du mPFC. L’injection et l’implantation ont été faites d’en haut. Toutes les régions d’intérêt, IL, BLA et DRN, sont présentées. C) Vue détaillée de la fibre optique implantée, de la manche et de la source lumineuse. D) Diffusion de la stimulation de lumière laser bleue et rouge dans le tissu cérébral de matière grise à partir d’une fibre lumineuse de 200 μm (Yizhar et al., 2011). La lumière bleue se propage, au maximum, 0,5 mm dans le tissu, la lumière rouge d’environ 1 mm. Codage de couleur : rouge 50%, jaune 10%, vert 5%, bleu 1% si la lumière atteint cette zone. E) Vue coronale de l’implantation unilatérale directement au-dessus de l’IL gauche avec une fibre optique de 200 μm. La région IL a une largeur de 0,25 mm dans chaque hémisphère et une profondeur de 0,2 mm. Les ampoules bleues et rouges sont le pensionnaire de 5% d’épandage de lumière et sont transférées de Yizhar et al à la bonne taille. LoxP: locus de X-over P1; ChR2: Channelrhodopsin; YFP : protéine fluorescente jaune; dflox: double floxed; IL : cortex infralimbique ; BLA: amygdale basolaterale; DRN: noyaux de raphe dorsal; PrL: région prélimbique. Ce chiffre a été modifié par Berg 201948. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61023/61023fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
Les approches optogénétiques sont utilisées car elle permet à la fois une haute résolution temporelle et spatiale14 et une modulation spécifique de type cellulaire. En outre, il est possible d’utiliser de façon répétitive le dispositif implanté sans autre traitement. Après une chirurgie stéréotaxique, où l’injection d’un virus adéno-associé portant l’outil optogénétique et l’implantation de la fibre optique est effectuée, les souris peuvent récupérer pendant deux semaines. Nous avons choisi un temps de récupération de seulement 2 semaines, parce que c’est assez de temps pour récupérer de la chirurgie et pour le virus à exprimer. Comme les expériences comportementales sont suivies par l’immunohistorique, nous devons nous assurer que les souris ne deviennent pas trop vieux pendant l’expérience; sinon, la qualité des tissus est diminuée. Ils ne montrent aucune déficience comportementale évidente de l’implant et s’engagent dans le comportement typique de cage. Bien sûr, l’implantation est accompagnée d’une lésion chirurgicale significative; par conséquent, les souris sont surveillées intensivement. Après la chirurgie, les souris doivent être logées seules, car les souris logées en groupe ont tendance à se blesser mutuellement des blessures et des implants frais. Cependant, les conditions de logement ont un grand impact sur le niveau d’anxiété des souris mâles, comme les souris logées simples montrent des niveaux d’anxiétéinférieurs 15 et en général moins dépressif-comme des symptômes16.
La manipulation chimique ou électrique des circuits cérébraux n’a pas la spécificité élevée du type cellulaire de l’optogénétique et ont une résolution temporelle et spatiale inférieure14,17,18. Selon la question expérimentale, la stimulation électrique ou chimique peut avoir des avantages différents. Lorsque les bornes de fibre de passage dans une région spécifique doivent également être stimulées, la stimulation électrique est la meilleure méthode. La stimulation chimique est un bon choix pour quand les récepteurs spécifiques d’émetteur dans toute une région devraient être activés par des agonistes. Un autre grand avantage de l’optogénétique par rapport à la stimulation chimique ou électrique est que endogènement, les neurones ne sont pas sensibles à la lumière, ce qui évite l’apparition d’effets secondaires19. En effet, les intensités lumineuses élevées pourraient induire des effets de chauffage8,20, mais en raison des groupes témoins appropriés, les effets comportementaux dus à la manipulation optogénétique peuvent être éliminés.
L’étude du comportement des rongeurs, en particulier en ce qui concerne les maladies psychiatriques, s’est grandement améliorée avec l’optogénétique chez les animaux en mouvement libre, car elle permet la modulation directe des récepteurs uniques jusqu’à des populations cellulaires spécifiques21 et circuits22. La possibilité de mesurer les effets aigus de telles modulations, ainsi que les effets comportementaux à long terme après un temps défini23 ou après la stimulation chronique24, permet une grande flexibilité des conceptions expérimentales et fournit des informations très détaillées sur les circuits cérébraux. La stimulation lumineuse peut être utilisée pour moduler les neurones situés au site d’injection de l’outil optogénétique. Lorsque l’injection et l’implantation s’adressent à la même région du cerveau, les corps cellulaires et le dos projetant des axones de neurones de principe et d’interneurones dans cette région peuvent être ciblés3,6,8. Cependant, la fibre lumineuse peut également être implantée dans une région différente de celle injectée. Dans ce cas, la stimulation lumineuse peut moduler la libération de l’émetteur dans les terminaux d’axone dans les zones de projection de la région injectée25,26,27.
Dans l’étude ici, l’optogénétique est utilisé en combinaison avec des expériences pour analyser le comportement lié à l’anxiété. Les maladies psychiatriques liées à l’anxiété touchent plus d’un tiers de la population mondialede 28,29,30 et causent un lourd fardeau économique31. Les personnes touchées souffrent d’un sentiment d’excitation, de tension et d’inquiétude suivi d’un comportement d’évitement32,33. Ces émotions négatives chroniques, qui sont principalement axées sur les événements futurs34, interfèrent fortement avec la vie quotidienne des patients. Les traitements courants comme les benzodiazépines ou les inhibiteurs sélectifs du recaptage de la sérotonine (ISRS) ne sont efficaces que chez certains patients. Un grand nombre de personnes ne répondent pas au traitement à tous les35, montrant que le mécanisme sous-jacent à ces maladies n’est pas encore pleinement compris. Le cortex préfrontal médial (mPFC) est connu pour jouer un rôle important dans le développement et la manifestation de l’anxiété21,25,27,36,37,38. Plus précisément, la suractivation de la région du cortex infralimbique (IL) dans le mPFC pourrait faire partie des troubles liés à l’anxiété39,40. L’exemple décrit ici pourrait aider à comprendre comment les modulations dans la région IL du mPFC influencent le comportement anxieux. En outre, l’élaboration de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les maladies psychiatriques liées à l’anxiété peut également être soutenue.
2-6 mois mâles Nex-Cre souris sont utilisés pour exprimer ChR2 spécifiquement dans les neurones pyramidaux dans la région IL de la mPFC41. Les souris Nex-Cre ont un fond C57Bl/6 et expriment l’enzyme Cre-recombinase spécifiquement dans les neurones pyramidaux. Au cours d’une chirurgie stéréotaxique, le chR2-ADN à double floxé est injecté dans la région IL par l’intermédiaire de vecteurs viraux associés à l’adéno. L’implant optique est placé directement au-dessus de la région d’intérêt (Figure 1B) et l’implant est fixé avec du ciment dentaire. Les animaux témoins reçoivent une injection de tdTomato-ADN à double floxé dans la même région pour imiter l’expression spécifique à la cellule.
Les animaux sont logés en groupe jusqu’au jour de la chirurgie et sont ensuite logés seuls pour éviter les blessures d’autres souris. Les souris sont logées dans des grilles individuelles en cage ventilée (IVC) dans des cages TypI-L pour les souris seules logées. Le cycle lumière-obscurité suit un rythme de 12:12 h, la phase de lumière à partir de 10 h. Toutes les expériences comportementales sont effectuées dans la phase sombre, qui ressemble à la phase active des rongeurs. De l’eau et des granulés alimentaires standard sont disponibles ad libitum. Après deux semaines de récupération, ce qui assure une expression suffisante de ChR2 dans les neurones pyramidaux, les souris sont utilisées pour des expériences comportementales.
Le champ ouvert (OF) est un labyrinthe de 50 cm x 50 cm carrés avec des murs sablés de 40 cm de haut. Le sol est divisé en 16 carrés où les 4 intérieurs représentent le centre. Le comportement mesuré est : 1) le temps passé dans le centre, 2) le nombre d’entrées centrales, et 3) la distance totale déplacée. Au cours de cette expérience, il y a 4 essais totalisant 20 minutes. Dans les essais 1 et 3, aucune stimulation lumineuse ne se produit, et dans les essais 2 et 4, une stimulation de 20 Hz avec 5 ms d’impulsion lumineuse et 1 mW d’intensité lumineuse de 473 nm est effectuée (Figure 2A). Dans les essais ultérieurs, l’accoutumance à la zone d’essai a été prise en compte, mais l’utilisation d’animaux témoins sous injection simulée indique comment l’accoutumance est exprimée.
Le labyrinthe barnes est une expérience pour l’apprentissage et la mémoire. Il s’agit d’une plate-forme circulaire de 92 cm de diamètre et contient 20 trous d’équidistant autour de la circonférence. 19 des trous sont fermés et sous un trou une boîte d’évacuation est présentée. Pendant 4 jours consécutifs, les souris ont 4 essais de formation pour apprendre l’emplacement de la boîte d’évasion. Le5ème jour, la boîte d’échappement est enlevée, et les souris sont testées sur combien de temps ils ont besoin pour trouver le trou correct. Le comportement mesuré est : 1) Temps jusqu’à ce que la boîte d’échappement/trou correct soit trouvée, 2) Nombre de visites et d’erreurs cibles, et 3) Distance déplacée jusqu’à ce que dans la zone d’échappement. La stimulation lumineuse dans différents groupes se fait soit lors de l’acquisition ou de la consolidation, qui ont lieu les jours de formation 1-4, ou lors de la récupération le jour d’essai, qui est le jour 5 (Figure 2D).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61023/61023fig2v2.jpg"> Figure 2 : Expériences comportementales avec des protocoles optogénétiques. A) Dessin schématique de l’expérience Open Field avec le protocole de stimulation lumineuse correspondant. C) Dessin schématique de l’expérience Elevated-Plus Maze avec le protocole de stimulation lumineuse correspondant. D) Dessin schématique de l’expérience Barnes Maze avec le protocole de stimulation lumineuse correspondant. EPM: Déhéated-Plus Maze; OF: Open Field; BM: Barnes Maze Test. Ce chiffre a été modifié par Berg 201948. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61023/61023fig2v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
Pour la stimulation optogénétique, l’intensité et la fréquence lumineuses doivent être adaptées à l’outil optogénétique et au type neuronal qui fait l’objet d’une étude. L’intensité lumineuse la plus faible possible devrait être utilisée afin d’éviter des dommages au tissu, car plusieurs études ont montré qu’il y a des effets de chauffage possibles dus à une forte intensité lumineuse8,,20. Pour chR2, une stimulation de 20 Hz avec une impulsion lumineuse de 5 ms est couramment utilisée2. Comme le ChR2 est très sensible à la lumière, 1 mW d’intensité lumineuse est suffisante. Le protocole de stimulation lumineuse alterne entre la lumière éteinte et les essais pour mesurer directement les changements comportementaux. Les conditions extérieures de pièce pour les expériences comportementales devraient rester stables pour tout le groupe d’animaux. Les conditions importantes à considérer sont le bruit (gardez à l’esprit que les appareils eux-mêmes pourraient faire du bruit), l’odeur (toujours nettoyer les configurations comportementales avec de l’éthanol), l’intensité lumineuse, et l’expérimentateur. L’expérimentateur doit toujours être la même personne. En outre, l’heure de la journée des expériences devrait être la même pour tous les animaux d’un groupe, quelques heures après le début de la phase sombre dans l’installation est préférable.
Le but de cette expérience est d’augmenter le rapport excitation/inhibition (E/I) dans la région IL grâce à une forte activation des neurones pyramidaux excitateurs. Un ratio E/I amélioré dans cette région spéciale du cortex est connu pour augmenter les niveaux d’anxiété chez les souris40,42,43,44.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ketamin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K2753-64</td>
			<td>Anestasia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 % Glucose</td>
			<td>AlleMan Pharma</td>
			<td></td>
			<td>Injection s.c. for fast recovery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Behavioral mazes</td>
			<td>Costum made</td>
			<td></td>
			<td>Measure anxiety</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bepanthen</td>
			<td>Bayer</td>
			<td></td>
			<td>Ophthalmic oinment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betaisodona</td>
			<td>Monodipharma</td>
			<td></td>
			<td>Sterilant containing iodine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betaisodona</td>
			<td>Monodipharma</td>
			<td></td>
			<td>Iodine oinment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ52, 110AL0.62x WD160</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic ferrules</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CFLC230-10</td>
			<td>Implant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic Fiber Scribe</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CSW12.5</td>
			<td>Cutting of the glass fiber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Channelrhodopsin2-YFP virus</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>Addgene 20298</td>
			<td>Optogenetic tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed air</td>
			<td>Kontakt Chemie</td>
			<td>Druckluft 67</td>
			<td>Drying of the skull</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coordinate system</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td></td>
			<td>Stereotactic coordinates for the surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Correl Draw</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Graphical software version 13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryoslicer</td>
			<td>MICROM</td>
			<td>HM500OM</td>
			<td>Production of brain slices for staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethovision XT 14</td>
			<td>Noldus</td>
			<td></td>
			<td>Software for behavioral tracking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Statistical Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferrule Polishing Puck</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>D50-F</td>
			<td>Polishing implants round side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Patch Cord dual</td>
			<td>Prizmatix</td>
			<td>Optogenetics-Fiber 500, 1,20 m, Ferrule core 1,25 mm</td>
			<td>Cables, which are connected with the two implants of a bilateral implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Patch Cord single</td>
			<td>Prizmatix</td>
			<td>Optogenetics-Fiber 500, 1,20 m, Ferrule core 1,25 mm</td>
			<td>Cable, which is connected with the implant via a sleeve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Stripping Tool</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>T06S13</td>
			<td>Stripping glass fiber for implant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>VWR European</td>
			<td>516-0300</td>
			<td>Cut into pieces for the Novelty-Suppressed Feeding test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food pellets</td>
			<td>M&#252;hle Levers</td>
			<td>H&#246;veler Nagerfutter</td>
			<td>Nutrition for the mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipettes</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>GC150-10</td>
			<td>Injection pipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gradia direct-Flo</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>103322</td>
			<td>Fluid dental cementum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating lamp</td>
			<td>efbe-Schott/Phillips</td>
			<td>R95E</td>
			<td>Prevent the mice from cooling after the surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating plate</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td></td>
			<td>Integrated into coordinate system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection canula</td>
			<td>Braun</td>
			<td>100 Sterican, 0,4 x 20 mm, Gr. 20</td>
			<td>All injections and to bore hole into the skull</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Litter</td>
			<td></td>
			<td>T 1350</td>
			<td>Grounding for the Novelty-Supressed Feeding test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse cages</td>
			<td>Zoonlab</td>
			<td>405 cm^2</td>
			<td>Single housing for experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optibond FL</td>
			<td>Kerr</td>
			<td>26684E</td>
			<td>Preparation of the skull for implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical glass fiber</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FT200EMT</td>
			<td>Light fiber for implant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optogenetics-LED.STSI</td>
			<td>Prizmatix</td>
			<td></td>
			<td>Optogenetic toolbox for light stimulation during behavioral experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>16005-1KG-R</td>
			<td>Perfusion of mice to remove the brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polishing sheet 0.02 &#181;m grit</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LFCF</td>
			<td>Polishing implants round side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polishing sheet 1 &#181;m grit</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LF1D</td>
			<td>Polishing implants round side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polishing sheet 30 &#181;m grit</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LF30D</td>
			<td>Polishing implants round side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polishing sheet 6 &#181;m grit</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LF6D</td>
			<td>Polishing implants round side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulser Software</td>
			<td>Prizmatix</td>
			<td></td>
			<td>Software for light device control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rimadyl-Carprofen</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td></td>
			<td>Analgesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma Plot</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Software for statistics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sleeve</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FT200EMT</td>
			<td>Connection of implant and light cable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SodiumCloride (NaCl)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>3570410</td>
			<td>Rinsing of the skull</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superglue</td>
			<td>Pattex Henkel</td>
			<td></td>
			<td>To Fix the glass fiber in the ferrule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>td-Tomato virus</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>Addgene 51503</td>
			<td>Optogenetic tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV light</td>
			<td>KoQGHJ</td>
			<td>wireless, 1200 mW/cm^2</td>
			<td>Polymeration lamp for dental cementum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylavet-Xylazin</td>
			<td>cp pharma</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optogenetic manipulation of neuronal activity to modulate behavior in freely moving mice

La modulation optogénétique des circuits neuronaux chez les souris en mouvement libre affecte le comportement aigu et à long terme. Cette méthode est capable d’effectuer des manipulations de neurones simples et de libération d’émetteurs spécifiques à la région, jusqu’à des circuits neuronaux entiers dans le système nerveux central, et permet la mesure directe des résultats comportementaux. Les neurones expriment les outils optogénétiques par injection de vecteurs viraux porteurs de l’ADN de choix, tels que Channelrhodopsin2 (ChR2). La lumière est apportée dans des régions spécifiques du cerveau par l’intermédiaire d’implants optiques chroniques qui se terminent directement au-dessus de la région cible. Après deux semaines de récupération et une bonne expression d’outil, les souris peuvent être utilisées à plusieurs reprises pour des tests comportementaux avec la stimulation optogénétique des neurones d’intérêt.
La modulation optogénétique a une haute résolution temporelle et spatiale qui peut être accomplie avec une spécificité cellulaire élevée, par rapport aux méthodes couramment utilisées telles que la stimulation chimique ou électrique. La lumière ne nuit pas aux tissus neuronaux et peut donc être utilisée pour des expériences à long terme ainsi que pour de multiples expériences comportementales chez une souris. Les possibilités d’outils optogénétiques sont presque illimitées et permettent l’activation ou le silence de neurones entiers, ou même la manipulation d’un type de récepteur spécifique par la lumière.
Les résultats de telles expériences comportementales avec la stimulation optogénétique intégrée visualisent directement les changements de comportement causés par la manipulation. Le comportement du même animal sans stimulation lumineuse comme ligne de base est un bon contrôle pour les changements induits. Cela permet une vue d’ensemble détaillée des types neuronaux ou des systèmes de neurotransmetteurs impliqués dans des comportements spécifiques, tels que l’anxiété. La plasticité des réseaux neuronaux peut également être étudiée en détail par la stimulation à long terme ou des observations comportementales après la stimulation optique. L’optogénétique aidera à éclairer la signalisation neuronale dans plusieurs types de maladies neurologiques.

Le but de ce protocole est de mesurer les changements dans le comportement des souris génétiquement modifiées au cours d’une expérience optogénétique. La manipulation optogénétique se fait par injection d’un vecteur viral associé à l’adéno. La stimulation lumineuse chez les souris en mouvement libre est possible par l’implantation d’une fibre lumineuse directement au-dessus de la région d’intérêt.
Dans la figure 4, les résultats d’une expérience optogénétique sont présentés. Une forte activation des neurones pyramidaux excitateurs dans la région IL via ChR2 a augmenté le comportement lié à l’anxiété dans le champ ouvert. ChR2 a été injecté dans la région IL du mPFC chez les souris Nex-Cre pour l’expression dans les neurones pyramidaux (Figure 4A). Au cours de deux tests d’anxiété, le champ ouvert (figure 4B,C) et le test d’alimentation de nouveauté-supprimée (figure 4F,G), ChR2 est stimulé avec la lumière bleue et active les neurones pyramidaux. Comme contrôle, un autre groupe de souris a reçu une injection de la fluorophore tdTomato au lieu de ChR2 (Figure 4D,G). Dans une telle expérience, l’anxiété est définie comme l’évitement de la zone centrale plus lumineuse. Les souris montrent une évitement intrinsèque des zones ouvertes parce qu’elles sont anxieuses des prédateurs.
Dans l’expérience Open Field, présentée à la figure 4B, les souris ont exécuté 4 essais de 5 minutes chacun. Dans les essais 1 et 3, aucune stimulation lumineuse ne s’est produite (Off1,2) et dans les essais 2 et 4, la stimulation de la lumière bleue avec 20 Hz (5 ms d’impulsion lumineuse) et 1 mW d’intensité a été effectuée (On1,2). Les cartes thermiques montrent que, dans le groupe expérimental, la durée du centre différait entre les essais Off et On. Pendant la stimulation lumineuse, les souris restent de préférence dans la zone frontalière. Les animaux témoins préfèrent également la frontière, mais ne changent pas leur comportement lors de la stimulation lumineuse. Dans la figure 4C, les principales mesures comportementales au cours de l’expérience Open Field sont affichées pour le groupe expérimental. Si les données ont réussi le test Shapiro-Wilk pour la normalité, les statistiques ont été faites avec un test t indépendant à deux queues. Si le test de normalité a échoué, le test Mann-Whitney-Rank Sum a été utilisé comme alternative non paramétrique. Pour ce genre d’expériences, une comparaison au sein du groupe a été choisie pour étudier si la stimulation lumineuse peut changer directement le comportement anxieux au fil du temps, indépendamment de l’anxiété de base des animaux expérimentaux et témoins. La durée du centre a diminué de manière significative pendant les deux essais de stimulation lumineuse, indiquant des niveaux accrus d’anxiété. La distance totale déplacée n’a pas été modifiée, ce qui montre que le comportement locomoteur n’a pas été affecté. Le nombre d’entrées centrales a été augmenté, mais pas de manière significative. Dans la figure 4D, les données du groupe témoin sont affichées. Les animaux témoins n’ont montré aucun changement de comportement entre les essais Off et On dans l’un des paramètres analysés, montrant que la stimulation lumineuse ou l’implantation n’a pas causé les effets observés. En somme, ce test montre une anxiété accrue lors de la stimulation lumineuse des neurones pyramidaux IL via ChR2.
Dans la figure 5, les données d’une expérience optogénétique infructueuse sont affichées pour le labyrinthe Elevated-Plus. Au cours de l’expérience Elevated-Plus Maze, qui est présentée à la figure 5A,les souris ont terminé 6 essais de 3 minutes chacun. Dans les essais 1, 3 et 5, aucune stimulation lumineuse n’a été effectuée (Off1, Off2, Off3) et dans les essais 2, 4 et 6, stimulation de la lumière bleue avec 20 Hz (5 ms d’impulsion légère) et 1 mW d’intensité a été effectuée (On1, On2, On3). Dans ces résultats exemplaires, la longueur du protocole optogénétique et la construction du labyrinthe lui-même ne convenaient pas à la ligne de souris transgénique. Dans la figure 5B, on peut voir, que plusieurs souris ont glissé hors du labyrinthe avec leurs pattes arrières ou même tombé. Lorsque cela s’est produit, les souris ont eu une deuxième chance d’effectuer l’EPM un jour plus tard. S’ils tombaient à nouveau, ils étaient exclus de l’analyse. Lorsque les souris ont glissé à plusieurs reprises, mais ont réussi à rester sur le labyrinthe, les données ont été analysées normalement. Néanmoins, les données doivent être interprétées avec beaucoup de soin et les animaux témoins deviennent plus importants. Les souris Nex-Cre avaient des difficultés motrices pour rester sur les bras ouverts étroits. Pour éviter cela, les petits murs, d’une hauteur de 1 cm, auraient aidé à une prise sûre des pattes arrière sur les bras du labyrinthe. Les cartes thermiques et les graphiques montrent que les souris expérimentales, ainsi que les souris témoins, ont commencé à éviter les bras ouverts de l’essai 2 (On1) sur (Figure 5C-E). Le temps passé à bras ouverts est considérablement réduit pour les deux groupes, tout comme les entrées de bras ouverts. L’analyse du groupe expérimental n’a obtenu que des données impliquant un grand effet anxiogène de la stimulation lumineuse, car le temps sur le bras ouvert et les entrées de bras ouverts sont significativement diminués au cours de l’essai On1. Cependant, en comparant ces données au groupe témoin, qui montrent le même comportement, il devient clair que le comportement observé n’est pas médié par la stimulation optogénétique, mais par l’évitement des bras ouverts en général en raison de l’accoutumance au labyrinthe. Ces données soulignent l’importance d’un groupe témoin approprié pour distinguer les effets comportementaux médiés par la stimulation optogénétique et l’adaptation comportementale possible. En outre, ces données mettent en lumière l’importance d’adapter correctement une configuration expérimentale en fonction de la ligne de mousse spécifique et de la question expérimentale.
Pour valider et renforcer les données comportementales recueillies, les cerveaux de souris sont retirés après la dernière expérience pour contrôler l’injection et l’implantation correctes (Figure 6). Les cerveaux sont fixés dans 4% de paraformaldéhyde et retirés du crâne. Les cerveaux sont déshydratés dans 30% de saccharose pendant 1-2 jours et cryoslicés par la suite. Les tranches cérébrales coronales de 40 μm d’épaisseur sont lavées et montées sur des lames objectives de superfrost avec un milieu de montage contenant DAPI, qui tache les noyaux cellulaires. Cela permet d’identifier les zones cibles dans les tranches coronales. La fluorescence de l’étiquette YFP ou tdTomato elle-même indique l’emplacement de l’injection de virus. Dans la figure 6B, les sites d’injection exemplaires de ChR2-YFP à gauche (jaune) et tdTomato à droite (rouge) sont présentés. À l’aide d’un modèle, adapté de l’atlas du cerveau de la souris Paxinos et Franklin45, la région IL peut être identifiée. Dans les deux diapositives, l’outil optogénétique est exprimé dans la région IL, mais aussi dans les régions adjacentes du cerveau. Pour une interprétation appropriée, la diffusion de la lumière bleue dans les tissus cérébraux est consultée8 (Figure 1D,E). Il peut être vu que la lumière bleue atteindra la région DP en dessous de l’IL avec seulement moins de 5% de l’intensité lumineuse initiale de 1 mW à la pointe de la fibre (Ligne bleue dans la figure 1D)8. En outre, une petite quantité de lumière peut aller vers le haut à la région PrL en raison de la rétro-dispersion47. Par conséquent, on peut dire que la région de l’IL est la plus fortement éclairée, mais les régions adjacentes comme le DP et la région prL peuvent également être légèrement stimulées. Par conséquent, la stimulation spécifique aux cellules IL n’est pas garantie et l’analyse immunohistochimique des régions adjacentes devrait être effectuée, pour voir si l’activité des cellules PrL et DP est modulée par la lumière. Dans la figure 6C, un autre contrôle important est indiqué : la spécificité de la ligne de souris Nex-Cre. Par l’intermédiaire de la coloration d’anticorps contre les deux types de cellules dans la région il, les neurones de principe glutamatergiques et les interneurones GABAergic, on peut voir, que l’expression chR2-YFP se produit seulement dans les neurones glutamatergiques et non avec les GABAergic.
Dans l’ensemble, nos expériences montrent qu’avec la manipulation optogénétique pendant les tests comportementaux, des changements dans le comportement lié à l’anxiété pourraient être observés. En utilisant plus d’un test pour le même comportement, une conclusion fiable peut être tirée. En outre, l’analyse immunohistochimique confirme les données obtenues. Nos expériences suggèrent que l’activation spécifique des neurones pyramidaux dans le cortex infralimbique a augmenté le comportement lié à l’anxiété dans certains tests.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61023/61023fig04v4.jpg"> Figure 4 : L’activation optogénétique des neurones pyramidaux il augmente le comportement anxieux. Stimulation lumineuse pendant les expériences : 473 nm, 1 mW, stimulation de 20 Hz. A) Dessin schématique du site d’injection et d’implantation pour ChR2-YFP ou tdTomato dans l’IL. Pendant l’expérience, les neurones pyramidaux de la région IL du mPFC sont activés par ChR2. Tranches cérébrales saggitales adaptées de l’atlas du cerveau de la souris Paxinos et Franklin, saggitale : alignaux latéraux o,6. B) Labyrinthe de champ ouvert avec protocole de stimulation de la lumière (20 min avec 4x5 min alternant off et on essais; à gauche) et des cartes thermiques des souris exemplaires chR2-injectées (EXP) et tdTomato -injectées (CT) dans tous les 4 essais de l’expérience (à droite). Exp animaux passent moins de temps dans le centre de l’OF lorsqu’il est stimulé avec la lumière laser bleue. Pour les animaux ct, le temps passé dans le centre ne diffère pas entre la lumière Off et on essais. C) Données de groupe pour les animaux EXP dans l’OF, n=11. Les souris passent beaucoup moins de temps au centre de l’OF lorsqu’elles sont stimulées avec de la lumière bleue (Off1 39,49±6,9 s, Le 1 19.87±4.47 s, Off2 28.13±8.55 s, On2 23.42±9.32 s, Off1:On1, t-test, p = 0.033, *; Off1:On2, MDRS, p=0,049, *). La distance déplacée n’est pas affectée (Off1 2703.09±292.65 cm, On1 3113.4±491.15 cm, Off2 3331.86 ±482.62 cm, On2 3082.17±658.61 cm). # des entrées centrales diminuent avec le temps, mais ne montrent pas de différences significatives (Off 1 22.36±3.78, On1 18.45±3.95, Off2 17.36±1.99, On2 13.27±2.64). D) Données de groupe pour les animaux CT dans l’OF, n=15. Temps que les souris passent au centre de l’OF, la distance déplacée, # des entrées centrales ne change pas entre la lumière On et Off trials (Time in center Off116.73±2.65 s, On1 16.02±1.89 s, Off2 12.02±1.76 s, On2 13.04±2.58 s; Distance Off1 3399.69±296.77 cm, On1 3210.6±446.9 cm, Off2 3030.28±513.83 cm, On2 2955±617.7 cm; # des entrées centrales Off1 14.2±1.98, On1 13.6±2.02, Off2 10.8±1.88, On2 11.67±2.5). Les souris ct montrent une anxiété de base significativement plus élevée (Off1 EXP:CT, MVRS, p=0,005, **). Les valeurs sont moyennes±S.E.M. * indiquent des différences significatives (p≤0.05), ** indiquent des différences significatives (p≤0.01). t-test toujours à deux queues, MVRS: Mann-Whitney Rank Sum test; IL : cortex infralimbique ; BLA: amygdale basolaterale; DRN: noyaux de raphe dorsal; OF: Open Field; CT: animaux témoins; EXP: animal expérimental; L: lumière. Ce chiffre a été modifié de Berg et coll. 2019, PLoS One43 et de Berg 201948. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61023/61023fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61023/61023fig5v4.jpg"> Figure 5 : L’expérience EPM n’a pas montré d’effets comportementaux chez les souris Nex-Cre. Stimulation lumineuse pendant les expériences : 473 nm, 1 mW, stimulation de 20 Hz. A) Labyrinthe surélevé-plus avec protocole de stimulation lumineuse (18 min, 6x3 min, alternant off et on essais). B) Données de groupe pour les souris qui « glissent » sont incluses dans les données, total n=23. Les souris Nex-Cre avaient tendance à glisser hors du bras ouvert avec leurs pattes arrière, indépendamment du groupe expérimental (à gauche). Seules les souris qui sont restées dans le labyrinthe pour les 6 essais ont été prises en compte dans des analyses ultérieures. Slip off dans la première phase Off1 sont des raisons pour éviter plus tard les bras ouverts (Off1 EXP 1.63±0.6, CT 2.2±0.79, Off2+3 EXP 0.125±0.125, CT 0±0, On1+2+3 EXP 0.625±0.26, CT 0.1±0.1). Le graphique à secteurs (à droite) montre des souris tombant du labyrinthe pendant les 18 min avec 42,42 %. Seulement 57,57% ont terminé l’expérience. C) Cartes thermiques des souris EXP et CT exemplaires dans les 6 essais de l’expérience. Les deux groupes montrent une diminution de la durée du bras ouvert après l’essai Off1. D) Données de groupe pour les animaux EXP dans l’EPM, n=12. Le temps passé à bras ouverts a diminué de façon significative au cours des deux premiers essais et constamment après (Off1 73.91±12.22 s, On1 36.15±14.65 s, Off2 15.61±6.23 s, On2 19.49±7.51 s, Off3 9.36±4.44 s, On3 7.96±3.47 s. Off1:On1, t-test, p=0,041, *). La distance déplacée n’est pas affectée (Off1 679.96±71.63 cm, On1 712.24±112.82 cm, Off2 717.49±97.39 cm, On2 782.51±81.11 cm, Off3 722.11±68.60 cm, On3 663.90±106.57 cm). Le nombre d’entrées de bras ouverts diminue considérablement de Off1 à On1, puis reste constant (Off1 8.08±1.08, Le 13.33±0.76, off2 2.16±0.69, on2 2.91±1.09, off3 1.73±0.75, on3 1.73±0.66. Off1:On1, t-test, p=0,002, **). Le temps passé au centre de l’EPM diminue le long des essais, mais ne montre aucune différence significative de Off to On trial (Off1 41.71±5.34 s, Le 1 31.2±4.59 s, Off2 19.8±3.44 s, On2 24.49±3.38 s, Off3 20.37±4.77 s, On3 18.85±4.07 s). E) Données de groupe pour les animaux ct dans l’EPM, n=11. Les données CT montrent les mêmes diminutions significatives que les données EXP, ce qui indique que l’expérience n’a pas fonctionné correctement (Temps à bras ouverts Off1 86,92±12,74 s, On1 33.78±14.38 s, Off2 18.01±11.61 s, On2 16.41±9.61 s, Off3 11.36±4.01 s, On3 5.43±2.07 s. Off1:On1, MVRS, p=0.009, **; Distance Off1 705.11±88.36 cm, On1 789.45±77.53 cm, Off2 724.74±80.49 cm, On2 676.57±111.99 cm, Off3 716.99±132.47 cm, On3 663.03±132.46 cm; Open arm entries Off1 7.09±1, On1 3.72±1.17, Off2 1.45±0.47, On2 1.36±0.58, Off3 0.91±0.43, Off3 1.64±0.59. Off1:On1, MDRS, p=0,01, *; Temps passé dans le centre Off1 35.89 s, Le 1 29.25±3.96 s, Off2 22.17±3.58 s, On2 15.9±2.57 s, Off3 13.86±4.2 s, On3 16.89±5.75 s). Les valeurs sont moyennes ± S.E.M. * indiquent des différences significatives (p≤0,05), ** indiquent des différences significatives (p≤0.01). t-test est toujours à deux queues, MVRS: Mann-Whitney Rank Sum test; EPM: Déhéated-Plus Maze; CT: animaux témoins; EXP: animal expérimental; OA: bras ouverts. Ce chiffre a été modifié de Berg et coll. 2019, PLoS One43 et de Berg 201948. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61023/61023fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61023/61023fig06.jpg"> Figure 6 : Côté injection de ChR2 et tdTomato dans la spécificité IL et Nex-Cre. A) Dessin schématique du site d’implantation sur tranches cérébrales coronales à AP + 1,66 mm, mL 0,3 mm, DV -1,8 mm, avec injection unilatérale et implantation (adapté de l’atlas du cerveau de la souris, Paxinos et Franklin, Bregma +1,54 mm). B) Les sites d’injection exemplaires de ChR2-YFP (gauche, jaune) et tdTomato (droite, rouge) ont fusionné avec des noyaux cellulaires tachés DAPI (bleu) chez les souris Nex-Cre. Barre d’échelle 1 mm. Les encarts montrent un grossissement élevé de la région IL. Barre d’échelle 150 μm. Les boîtes blanches indiquent l’emplacement des insets. C) Rangée supérieure : images confocales de la région IL gauche d’une souris Nex-Cre tachée de CamKII comme marqueur pour les neurones glutamatergiques (bleu), et ChR2-YFP (jaune) ou Gad67 comme marqueur pour les neurones GABAergic (vert), d’une souris Nex-Cre. Rangée inférieure : colocalisation du ChR2-YFP (jaune) avec CamKII (gauche, bleu), mais pas avec Gad67 (droite, vert), montrant la spécificité des souris Nex-Cre pour les neurones glutamatergiques. Barre d’échelle 50 μm. PrL : cortex prélimbique ; IL : cortex infralimbique ; DP : cortex pédunculaire dorsal. Ce chiffre a été modifié de Berg et coll. 2019, PLoS One43 et de Berg 201948. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61023/61023fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

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Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity to Modulate Behavior in Freely Moving Mice

Avec la manipulation optogénétique de populations neuronales spécifiques ou de régions du cerveau, le comportement peut être modifié avec une résolution temporelle et spatiale élevée chez les animaux en mouvement libre. En utilisant différents outils optogénétiques en combinaison avec des fibres optiques implantées chroniquement, une variété de modulations neuronales et de tests comportementaux peuvent être effectuées.

Manipulation optogénétique de l’activité neuronale pour moduler le comportement chez les souris en mouvement libre

Optogenetic modulation of neuronal circuits in freely moving mice affects acute and long-term behavior. This method is able to perform manipulations of ...

Avec la manipulation optogénétique de populations neuronales spécifiques ou de régions cérébrales, le comportement peut être modifié avec une résolution temporelle et spatiale élevée chez les animaux en mouvement libre. En utilisant différents outils optogénétiques en combinaison avec des fibres optiques implantées de façon chronique, une variété de modulations neuronales et de tests comportementaux peuvent être effectués. Le but ultime de l’optogénétique est la modulation des circuits neuronaux avec une résolution temporelle et spatiale élevée chez l’animal qui se comporte.Contrairement aux manipulations pharmacologiques ou électriques, l’optogénétique permet le contrôle précis de types de cellules spécifiques sur les circuits neuronaux. L’optogénétique est le moyen idéal de cibler des types de cellules spécifiques dans une région spécialement définie pendant le comportement, et d’examiner l’effet direct des changements dans ces microcircuits. Nous allons maintenant présenter une étape pour guider la façon de préparer et de planter et de conduire l’optogénétique chez une souris librement en mouvement.Pour la préparation de l’implant optique, placez un côté plat de ferrule en céramique vers le haut dans un étau de banc. Dépouillez le code d’une fibre de verre de 200 micromètres de diamètre, avec un outil de décapage de fibre et coupez deux à trois centimètres non morceaux avec un scribe en fibre de céramique. Placez le morceau de fibre de verre dans la ferrule en céramique, puis placez une goutte d’une superglue sur le côté plat avec une injection cannular.Sur le côté rond de la ferrule en céramique, couper la fibre de verre aussi court que possible et placer le pré-implant à une rondelle de polissage ferrule pour polir le côté rond sur quatre papiers d’édition différents. Ensuite, couper la fibre de verre sur le côté plat de la ferrule en céramique, à la longueur nécessaire à l’implantation. Utilisez un atlas du cerveau de souris pour calculer la longueur de l’implant.L’implant doit se terminer directement au-dessus de la région d’intérêt. Avant l’implantation, l’anesthésie est appliquée. La technique précise et esthétique est décrite dans le manuscrit.Lorsque la souris atteint un état profond d’anesthésie, placez-la sur une plaque chauffante et fixez la tête dans un cadre stéréotaxique. Fixer le nez et les dents à l’avant et les oreilles des deux côtés. Appliquez une algésie avec une tasse de coïnf subcuntaneously dans le dos de la souris et appliquez l’onguent opaque d’oeil sur les deux yeux pour les protéger du séchage.Humidifiez les cheveux sur le cuir chevelu avec une serviette en papier humide, puis coupez-les à l’aide de ciseaux. Assurez-vous d’enlever tous les cheveux lâches avec une serviette en papier humide. Utilisez un bâton de coton pour désinfecter le cuir chevelu avec une teinture contenant de l’iode.Soulevez le cuir chevelu sur la région d’intérêt avec une pince à épiler et coupez un centimètre le long de la ligne médiane. Pour malmener le crâne pour l’implantation, appliquer une petite quantité d’acide phosphorique sur la cicatrice et laisser prendre effet pendant 15 secondes. Retirer tout l’acide à l’aide d’un bâton de coton et rincer la cicatrice avec du chlorure de sodium deux fois.Pour une injection appropriée, calculez le facteur F pour les coordonnées individuelles. Placez un cannular en verre dans le cadre stéréoctatique et localisez-le directement au-dessus du bregma. Maintenant, zéro le système de coordonnées et déplacer la canule en verre à Lambda.Calculez le facteur F avec la formule suivante. Bregma moins Lambda divisé par 4,2 égale le facteur F. Les coordonnées exactes sont très importantes pour l’injection et l’implantation parce que sinon, si la mauvaise structure est stimulée, alors les effets comportementaux ne sont pas spécifiques.Toutes les souris ont des écarts minimaux dans la taille de leur crâne, par conséquent, le coefficient est absolument obligatoire. Utilisez les coordonnées ajustées pour trouver l’emplacement de la cicatrice directement au-dessus de la structure d’intérêt. Utilisez une canule d’injection pour percer un trou dans le crâne, en faisant pivoter la canule sur place.Pour prendre une solution virale dans la canule de verre reliée à la seringue, placez une goutte de chlorure de sodium sur le crâne et un morceau de pirophen sur le dessus. Placez une goutte de deux solutions de virus microlitres sur le pirophen et abaissez la pointe de la canule en verre dans le virus. Appliquez une pression négative et attendez que la solution virale soit prise par la canule.Zéro à cette coordonnée lorsque la pointe du virus avec canule est au niveau du crâne et lentement l’abaisser dans le forage à la position la plus basse du côté de l’injection. Appliquer une petite quantité de pression positive avec la seringue jusqu’à ce que le ménisque soit abaissé. Laissez le virus se propager pendant deux à trois minutes avant de déplacer la canule en verre vers le haut à la position suivante.Retirer la canule de verre très lentement et la jeter après l’injection finale. Maintenant, préparez le crâne pour l’implantation. Séchez le crâne avec de l’air comprimé, appliquez l’amorce avec ce bâton correspondant et laissez-le sécher pendant 15 secondes.Appliquer le lien avec le même bâton et le guérir pendant 20 secondes avec la lumière UV. Placez l’implant dans le support correspondant et placez la pointe de la fibre de verre directement au-dessus du trou de forage et abaissez-la soigneusement. Arrêtez d’abaisser l’implant lorsque la valve restante de superglue touche le crâne.L’implantation de fibres optiques peut également être faite pour des structures bilatérales comme l’hippocampe. Cela permet une légère stimulation dans les deux hémisphères en même temps ou permet la stimulation de deux structures différentes. Il est également possible d’injecter le virus à un endroit différent de l’implant de fibre optique.Si l’injection et l’implantation se font dans différentes régions, percer tous les trous nécessaires après l’application d’acide phosphorique, mais avant l’adhérence des deux composants. Vérifiez à nouveau si le crâne est encore complètement sec, puis appliquer du ciment dentaire fluide autour de l’implant et dans les environs, puis guérir pendant 20 secondes avec la lumière UV Appliquer deux ciments plus moindres dans la zone complètement sans fourrure et séché crâne. Guérir chaque couche avec de la lumière UV.Pour terminer la chirurgie appliquer l’onguent d’iode sur l’ensemble de la plaie. Relâchez la fixation du nez et de l’oreille, amenez la souris dans une cage fraîche et placez-la sous une lampe chauffante pour éviter la perte de chaleur corporelle. Vérifiez son état de santé au moins une fois par jour et il affichera l’opération et l’algésie après trois jours si nécessaire.Après deux semaines de récupération, les souris peuvent être utilisées pour des expériences comportementales. Ouvrez le logiciel Pulser et sélectionnez le port USB com sur qui la source lumineuse est branchée. Choisissez le mode de fonctionnement trois pour permettre à un logiciel externe de contrôler la source de lumière.Choisissez le réglage correct pour 20 stimulation Hertz avec impulsion lumineuse de cinq millisecondes. Pour localiser la division pour communiquer avec le pulseur, appuyez sur la séquence de démarrage. Ce statut restera jusqu’à ce que les expériences soient terminées.Maintenant, créez une nouvelle expérience dans EthoVision XT, passez au fichier, choisissez nouveau à partir du modèle et sélectionnez appliquer un modèle prédéfini. Choisissez le suivi en direct et sélectionnez la caméra avec source et confirmez la came Puslar Gen-Eye connectée. Choisissez la souris comme animal qui doit être enregistré.Sélectionnez le modèle d’arène, le carré de champ ouvert et le centre de modèle de zone, la bordure, les coins. Confirmez un sujet qui doit être suivi et sélectionnez le point central, le point avant et la base de la queue. Confirmez que la couleur de l’animal par rapport à l’arrière-plan est plus foncée et le taux d’échantillonnage recommandé pour terminer l’étape.Nommez l’expérience appropriée et choisissez un emplacement à enregistrer. Jusqu’à ce que vous trouviez les paramètres de l’arène, la caméra ouvrira automatiquement une image de fond. Adaptez les zones prédéfinis à l’arène réelle en utilisant la flèche et les deux symboles sur sa droite.Si certaines zones ne sont pas nécessaires, supprimez-les. Appuyez sur l’échelle de tirage pour calibrer et mettre une ligne d’un coin du labyrinthe à l’autre. Entrez la longueur de la distance réelle en centimètres.Répétez cela pour l’autre axe. Pour définir les paramètres de contrôle d’essai, préparez la règle principale en ajustant le temps de condition à 20 minutes. La condition pour Star Trek devrait être, lorsque le sujet est dans l’arène pendant deux secondes, pour un état automatique du suivi lorsque la souris est dans l’arène.Pour créer une sous-règle pour la stimulation de la lumière, allez aux structures, plus et sélectionnez sous-règle. Placez-le en dessous de la règle principale et étalez les deux boîtes. Aller à des conditions, le temps et lui donner un nom comme la lumière sur un, ajuster l’état est rencontré après cinq minutes.Placez la boîte directement derrière la case de début de règle de la sous-règle. Passez à l’action du matériel personnalisé et nommez-le avec de la lumière sur un. Sélectionnez l’action pour effectuer comme: Je vais mettre un haut.Placez la boîte directement derrière la boîte d’état. Répétez les étapes pour programmer la lumière à la lumière sur. Maintenant, allez aux structures, sous référence de règles et vérifiez que la référence appartient à la sous-règle correcte.Choisissez les conditions de démarrage comme sans délai et les conditions de démarrage comme exécutez une fois par condition de démarrage. Placez la boîte de référence entre les livres supplémentaires un et les livres d’état deux de la règle principale. Définissez maintenant les paramètres de détection pour afficher au système ce qu’il doit suivre.Placez un test miles dans l’arène et sélectionnez la configuration automatisée. Choisissez le rongeur comme type d’animal et utilisez le curseur de souris pour dessiner une boîte autour des souris dans l’arène. Confirmez les résultats de la question de soins avec oui.Pour l’expérience en plein champ, apportez la souris expérimentale à la salle de comportement juste avant l’expérience pour assurer un niveau approprié d’anxiété. Couplez la souris être une fente de la source de lumière en appuyant doucement sur la grille de la cage. Placez-le dans une cage d’attente avec de la litière fraîche pendant 10 minutes pour vous acclimater au câble léger.Commencez l’acquisition en appuyant sur le bouton stop et vous pour visionner XT. Transférer la souris de la cage d’attente dans le coin supérieur gauche du champ ouvert. Laissez le champ visuel de la souris pendant l’expérience et restez calme. Après 20 minutes, lorsque l’expérience est terminée, retirez la souris du labyrinthe, déconnectez le câble lumineux et remetez-la dans sa propre cage.Par une visualisation de contrôle, les différences dans le temps central entre la lumière éteinte et la lumière sur les visages peuvent être directement vues. La souris passe moins de temps au centre lorsque la lumière est allumée. Pour l’expérience barnes labyrinthe, apporter toutes les souris expérimentales dans la salle de comportement autour d’une heure avant l’expérience.Préparez le labyrinthe Barnes en fermant tous les trous sauf un, et maintenant qu’une boîte d’évacuation est placée. Connectez une souris dans la source lumineuse aux deux implants et placez-la directement au milieu du labyrinthe Barnes. Appuyez sur démarrer et besoin de visiter le prochain T et enlever la boîte en carton.Soyez prêt à arrêter l’essai manuellement juste au cas où le logiciel ne reconnaît pas toute la transition. Sortez la souris du labyrinthe et retirez la connexion au câble lumineux. Lors de l’exécution, l’apprentissage et la tâche de mémoire, non seulement l’effet immédiat de la manipulation est étudié, mais aussi l’effet à long terme de la manipulation lors de l’acquisition, la consolidation ou la récupération.Pour l’analyse des données, vous trouvez l’état de traitement traité ou contrôlé, allez à la nidification et sélectionnez l’état de contrôle d’essai. Choisissez l’intervalle d’état de l’action de l’élément Star Trek à la lumière d’action de l’élément s’allume sur un. Placez le nichoir entre le traitement de la boîte de filtre et la boîte de résultat correspondante.Cet intervalle défini est d’un. Répétez les étapes pour les intervalles sur l’un des deux et sur deux ainsi que pour le groupe témoin. Définissez également les paramètres à analyser dans le profil d’analyse.Choisissez la variable dépendante dans la zone et sélectionnez le centre de zone, le point du corps, le point central, et aller sur les statistiques d’essai. Sélectionnez la fréquence, la durée cumulative, et laissez-le voir le premier. Ajoutez également le déplacement de distance comme variable.Avec ce profil, les données pour le temps passé dans le centre, les entrées du centre et dit de se déplacer à distance est disponible. Pour extraire des données de chaque division, aller aux résultats et sélectionner des statistiques et des graphiques, appuyez sur calculer pour voir les données analysées. Appuyez sur les données d’exportation et sélectionnez les statistiques d’essai et l’emplacement à enregistrer.Les données exportées sont enregistrées sous forme de fichier Excel et avec des valeurs individuelles pour chaque souris. En outre, allez à la visualisation de la carte thermique et appuyez sur les cartes thermiques des parcelles, sélectionnez des essais sur la droite pour voir des cartes thermiques individuelles pour chaque souris et essai. Faites un clic droit sur la souris et exportez les cartes thermiques sous forme d’images.Plus tard, ouvrez le fichier Excel de l’ordinateur et de calculer la moyenne et standard euros SCM pour les quatre essais et tous les groupes de conditionnement mesuré. Pour générer des graphiques et l’intrigue Sigma, copiez les moyens et SCM dans l’ordre correct du fichier supplémentaire à l’intrigue Sigma. Les lignes doivent contenir les données pour off un, sur un, et les colonnes contiennent essai, moyenne et SCM hertz.Sélectionnez les trois colonnes et allez créer des graphiques. Sélectionnez la boîte à barres et choisissez la boîte non groupée avec flèche. Étiquetez l’ensemble du graphique, rentrez chez vous, sélectionnez la boîte graphique et pressez l’exportation.Sélectionnez le dossier destination et choisissez meta file comme format. Pour calculer les statistiques pour les données obtenues, copiez les données à droite de Xcel sur un contre un, et cetera, et à des colonnes simples de l’intrigue Sigma. Marquez les colonnes que vous souhaitez comparer et passez à l’analyse, choisissez le test T et appuyez sur exécuter.Enfin, les données comportementales peuvent être affichées divisées en let off et à l’essai avec une spécialisation supplémentaire de carte thermique. Dans l’expérience en plein champ, pendant la stimulation lumineuse de Channelrhodopsin2 et les neurones pyramidaux, la durée du centre est diminuée, ce qui indique des niveaux d’anxiété accrus. Par immunohistochimie, le site d’injection et l’expression du virus peuvent être déterminés, également à la spécificité à la ligne spéciale de souris cre-dépendante peut être validée.On peut clairement voir que la stimulation lumineuse de Channelrhodopsin2 améliorer les neurones de l’esprit de cette région spécifique du cortex augmente les niveaux d’anxiété, par rapport à l’anxiété de base avant cette stimulation. Cet effet immédiat de la manipulation sur le comportement est la raison pour laquelle optogénétique est utilisé aujourd’hui pour tant de questions de recherche concernant le comportement. Cette procédure peut être utilisée pour la modulation optogénétique de n’importe quel type de cellule désiré ou circuits neuronaux dans le cerveau de la souris.En combinant cette procédure avec des tests comportementaux appropriés pour votre recherche, un aperçu plus approfondi des circuits neuronaux impliqués dans les comportements et les maladies d’intérêt peut être acquis.

Research

JoVE Journal

Behavior

Long-term Potentiation of Perforant Pathway-dentate Gyrus Synapse in Freely Behaving Mice

Potentialisation à long terme de perforante Pathway-gyrus denté Synapse en se comportant librement souris

Studies of long-term potentiation of synaptic efficacy, an activity-dependent synaptic phenomenon having properties that make it attractive as a potential ...

Recherche

Sciences du comportement

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