Name: optogenetic manipulation of neuronal activity to modulate behavior in freely moving mice
Uploaded: 2020-10-27T12:30:00
Duration: 14 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity to Modulate Behavior in Freely Moving Mice at JoVE.com

Herzlichen Dank an Prof. Klaus-Armin Narve und Dr. Sandra Goebbels (Max-Plank-Institut für Experimentelle Medizin, Göttingen, Deutschland) für die freundliche Bereitstellung von Nex-Cre-Mäusen. Außerdem danken wir unserem Video-Team Yunus Dikici und Ruben Wiesner für die Aufnahme und Bearbeitung des JoVE-Videos für diesen Artikel. Außerdem vielen Dank an Kristin Claussen für ihre Stimme und Kimberly Anne Go für das Korrekturlesen des Manuskripts.
Die vorgestellten Ergebnisse wurden an der Ruhr-Universität Bochum eingeholt und das Video an der Universität Bremen aufgenommen.
Gefördert wurde diese Arbeit von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 122679504 - SFB 874 und DFG MA 4692/3-2.

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Die Verwendung von Licht zur Manipulation neuronaler Signalisierung ist seit fast einem Jahrzehnt die Methode der Wahl. Seit 2005 die Anzahl der veröffentlichten Artikel über die Entwicklung neuer optogenetischer Werkzeuge4,6,8,14,49,50,51 und Studien, in denen solche Werkzeuge verwendet werden, um Gehirn-Schaltungen zu untersuchen21,23,40,43,52, stark erhöht. Einerseits ist die Experimentiermöglichkeit mit der enormen Vielfalt an injizierbaren optogenetischen Werkzeugen, Implantationsvarianten, transgenen Mauslinien und Verhaltensexperimenten vielfältig und unbegrenzt. Andererseits ist die Möglichkeit, Fehler bei der Auswahl der Versuchsbedingungen zu machen, sehr hoch und die Experimente sind so spezifisch, dass oft die Vergleichbarkeit mit anderen Studien schwierig ist.
Kritische Schritte Ein wichtiger wichtiger Schritt dieses Protokolls ist die ordnungsgemäße Planung. Die Wahl des optogenetischen Instruments sollte der wissenschaftlichen Frage entsprechen. Ist es nur notwendig, die Gesamtaktivität eines Neurons oder einer Synapse zu manipulieren? Dann sind kommerziell bereitgestellte Werkzeuge wie ChR221,25,27 und Arch37 eine gute Wahl. Aber abgesehen davon, wenn ein spezielles Neurotransmitter-System oder sogar ein einzelner Rezeptor manipuliert werden sollte, ist ein einzelner Rezeptor Chimäre oft die bessere Wahl3,6. Mehrere Rezeptor-Chimären mit GPCRs, die sogenannten Opto-XRs, und Richtlinien, um sie zu produzieren, sind bereits verfügbar4,50. Neben der Wahl optogenetischer Werkzeuge ist auch die Mauslinie in Kombination mit dem Verhaltensexperiment von entscheidender Bedeutung. Verschiedene Hintergrundstämme, wie z.B. C57Bl/6 und BALB/cByJ, zeigen in mancher Hinsicht unterschiedliche Verhaltensphänotypen53,54an. C57Bl/6-Mäuse haben eine niedrige Ausgangsangst und können für angstlösende Manipulationen verwendet werden, während BALB/cByJ höhere Angstniveaus aufweisen und daher empfindlicher auf angstlösende Medikamente reagieren. Darüber hinaus können die transgenen Varianten dieser Hintergrundstämme auch in ihrem Phänotyp48variieren. Mit einer richtigen Kombination spezifischer Promotoren in Verbindung mit einem optogenetischen Werkzeug und einer transgenen Mauslinie kann fast jede gewünschte Zellpopulation gezielt werden.
Ein kritischer Schritt während der Operation ist die Ausrichtung auf den richtigen Ort. Mit Hilfe des Maus-Gehirnatlas können die richtigen Koordinaten für die vordere-hintere Achse und die medial-laterale Achse und die Tiefe der Struktur45festgelegt werden. In Wirklichkeit hat jeder Schädel eine etwas andere Form und Größe. Daher ist der F-Faktor46 zur Einstellung der stereotaktischen Koordinaten sehr wichtig, ebenso wie die richtige Nasen- und Ohrfixierung während der stereotaktischen Chirurgie. Wenn der Kopf der Maus geneigt ist, wird die Injektionskanüle nicht auf den gewünschten Interessenbereich abzielen.
Darüber hinaus ist auch der Durchmesser der Injektionskanüle entscheidend. Wenn es zu klein ist, kann kein Virus in das Gewebe freigesetzt werden, wenn es zu breit ist, wird die Kanüle Viruslösung auf dem Weg in die Region von Interesse lecken. Wenn die implantierte optische Faser direkt über der Zielregion endet, spielt die Virusexpression in den oben genannten Kortexregionen keine Rolle. Wenn das Implantat jedoch über anderen Regionen platziert wird, um Axonklemmen zu stimulieren, werden die Axone der oberen Kortexregionen auch durch Licht aktiviert und verfälschen erhaltene Daten. Ein Beispiel: Die IL-Region und die prälimbische (PrL) Region projizieren beide auf die basale Amygdala55,56, haben aber völlig unterschiedliche Funktionen und Rollen in der Modulation von Angst26,57. Wenn das Implantat oberhalb der Amygdala platziert wird, um Axonklemmen aus der IL-Region zu aktivieren, und während der Injektionviruslösung auch in die PrL aufgrund der falschen Injektionskanüle gelegt wurde, ist das Risiko, auch Axonklemmen aus dem PrL zu aktivieren, sehr hoch.
Bei der Vorbereitung des Schädels auf die Fixierung des Implantats ist der spärliche Einsatz von Primer und Bindung entscheidend für eine zuverlässige und dauerhafte Fixierung. Wenn das 2-Komponenten-Haftsystem nicht dünn aufgetragen wird, kann sich der Zahnzement nach ein paar Tagen oder Wochen vom Schädel lösen. Darüber hinaus muss der Schädel auch vor der Fixierung des Implantats vollständig getrocknet werden, da sonst der Zement nicht richtig am Schädel befestigt wird.
Kritische Schritte sind auch im Verhaltensteil dieses Protokolls vorhanden. Erstens ist der Bau des Labyrinths sehr wichtig. In jedem Verhaltens-Setup existieren in der Literatur mehrere Varianten in Bezug auf Größe und Form, sowie für das Verfahren selbst58,59,60. Es ist wichtig, eine Variante zu wählen, die die Daten vergleichbar und reproduzierbar macht. Auch besondere Anforderungen an genutzte Mauslinien sollten berücksichtigt werden43,48. In den repräsentativen Daten für die EPM ist zu sehen, dass mehrere Nex-Cre-Mäuse aus dem Labyrinth fielen oder mehrmals abrutschten (Abbildung 2b). Für diese Mäuse wäre ein Labyrinth mit einer kleinen Wand um die offenen Arme eine bessere Alternative gewesen.
Zweitens ist es wichtig, alle äußeren Raumbedingungen konstant zu halten61, sonst wären verschiedene Gruppen von Mäusen überhaupt nicht vergleichbar. In dieser Hinsicht ist es sehr wichtig, die Zeit des Experiments als eine zu wählen, in der der Versuchsaufbau leer ist und der Experimentator immer anwesend ist. Darüber hinaus sollten Ereignisse im Gebäude, wie Bauarbeiten, Das Testen von Systemen (Feueralarm) oder der Reinigungstag der Mausanlage, berücksichtigt werden, um Störungen der erhaltenen Daten zu vermeiden.
Schließlich sind Handhabungs- und Gehäusebedingungen für Verhaltensexperimente von entscheidender Bedeutung. Wenn eine Implantation durchgeführt wird, müssen Mäuse allein untergebracht werden, da das Risiko einer Verletzung durch andere Mäuse besteht. Um eine gute Vergleichbarkeit zwischen Gruppen und einen niedrigen Fehler innerhalb einer Gruppe zu gewährleisten, muss jede Maus die gleiche Käfiggröße und -anreicherung aufweisen. Für Angst-bezogene Experimente, Einzelgehäuse hat einige Vorteile als singe untergebracht männliche Mäuse zeigen eine niedrigere Ausgangsangst Ebene, weniger Variation in ihrer Angst-Level, und weniger depressiv-ähnliche Symptome15,16. Gruppe untergebracht männliche Mäuse können in ihrer Angst Ebene aufgrund der Hierarchie unter den Mäusen stark unterscheiden. Neben dem Gehäuse ist auch ein konstanter und gleichberechtigter Umgang mit allen Mäusen und Gruppen wichtig. Die Maus zu greifen, um die Lichtfaser am Implantat zu verbinden, ist sehr anstrengend. Daher muss dieses Verfahren für jede Maus gleich sein, was die gleiche Technik und den gleichen Experimentator bedeutet. Darüber hinaus muss die Gewöhnungszeit im Wartekäfig, die die Maus von der stressigen Verbindungsprozedur abbringen soll, auch gleiche Bedingungen in Dauer, Wurf und Position zum Labyrinth haben. Die Handhabung innerhalb der Mausfunktion ist auch für die spätere Verhaltensleistung entscheidend. Versuchs- und Kontrolltiere sollten nicht an verschiedenen Tagen oder von verschiedenen Menschen gereinigt werden, da dies auch für Mäuse belastend ist. Darüber hinaus sollte der Reinigungstag nicht der versuchsweise Tag sein, um Verhaltensunterschiede zu vermeiden.
Problembehandlung Es gibt mehrere Probleme, die während des Protokolls auftreten können. Zum Beispiel könnte das Bohren eines Ganzen im Schädel während der stereotaktischen Operation Blutgefäße schädigen. In der Regel tritt starke Blutungen auf, vor allem über Bregma und Lambda. Wenn dies geschieht, versuchen Sie nicht, die Blutung mit Baumwollstäben zu stoppen, da sie dazu neigen, noch mehr Blutungen aus dem Gefäß wegen ihrer Saugfähigkeit zu verlängern, sondern direkt mit NaCl abspülen.
Es kann auch vorkommen, dass die Druckinjektion der Viruslösung nicht funktioniert. In diesem Fall könnte es sein, dass Parafilm, ein Schorf aus dem Gratloch oder Hirngewebe, die Spitze der Kanüle verstopft. Entfernen Sie in diesem Fall die Kanüle langsam aus dem Gehirn, ohne die x- oder y-Achse zu ändern, und entfernen Sie mit einer Pinzette 1-2 mm des vorderen Teils der Kanülenspitze. Bevor Sie die Kanüle erneut senken, testen Sie die Funktionalität, indem Sie einen kleinen Druck ausüben, um zu sehen, ob das Virus aus der Kanülenspitze kommt. Um Verstopfung zu vermeiden, senken Sie die Kanüle mit einer konstanten Geschwindigkeit und stoppen Sie die Bewegung nicht, bis die tiefste Tiefe der Injektionsseite erreicht ist. Wenn zu viel der Kanülenspitze entfernt wird und der Durchmesser zu groß ist, wird die Kanüle Gewebe schädigen und das Risiko, das Virus auf einmal anzuwenden, erhöht. Stellen Sie daher sicher, dass nur der verstopfte Teil der Spitze sorgfältig entfernt wird.
Während des Verhaltensexperiments kann die Einrichtung des Experiments in der Video-Tracking-Software (z. B. Ethovision XT) Probleme verursachen. Wenn z. B. die Lichtleistung nicht richtig funktioniert, kann dies aus mehreren Gründen geschehen. Der Pulser muss geöffnet, programmiert und gestartet werden, bevor Ethovision XT geöffnet wird. Die Hardware muss im "Experimentellen Setup" (Schritt 3.2.2.4) korrekt ausgewählt werden. Wenn die falsche IO-Box oder etwas anderes als "Costume Hardware" ausgewählt ist, kann das Pulser-Gerät nicht von Ethovision gesteuert werden. Wenn der Test der Lichtleistung erfolgreich ist, aber das programmierte Lichtprotokoll in "Teststeuerungseinstellungen" während der Erfassung nicht funktioniert, kann die Unterregel oder Unterregelreferenz falsch lokalisiert werden oder die Bedingungen und Aktionen sind unklar. Zum Beispiel: Gehört der Verweis zur richtigen Unterregel? Ist die Referenz korrekt programmiert (z.B. wie oft wird die Unterregel ausgeführt)?
Darüber hinaus kann es vorkommen, dass das Tier während der "Erkennungseinstellungen" angemessen verfolgt wird, aber während der Erfassung gibt es Proben, bei denen das Motiv nicht gefunden wird. Überprüfen Sie in diesem Fall, ob die Beleuchtung im Versuchsraum verändert wurde oder ob irgendetwas unerwünschte Schatten im Labyrinth erzeugt. Der gesamte Boden des Labyrinths muss die gleiche Farbe haben, da die Einstellung nur für eine bestimmte Kombination funktioniert. Wenn aus welchen Gründen auch immer unterschiedliche Unterfarben oder Schatten nicht vermieden werden können, definieren Sie die Erkennungseinstellung im dunkelsten Teil des Labyrinths.
Um Einstellungen nach dem Erwerb der ersten Tiere zu ändern, wenden Sie diese Änderungen nicht in den bereits verwendeten Einstellungen an. Duplizieren Sie sie, um sie anzupassen. Dies bedeutet auch, dass die bereits aufgezeichnete Studie für die Datenanalyse nicht mehr gültig ist. Zeichnen Sie in einem solchen Fall alle Tiere für diese Versuchsgruppe mit den ursprünglichen Einstellungen auf und erstellen Sie anschließend ein neues Experiment, bei dem die aufgenommenen Videos anstelle von Live-Tracking analysiert werden. In diesem "von Video"-Experiment können mehrere Einstellungen für die Analyse verwendet werden, ohne die Vergleichbarkeit zwischen Tieren oder sogar Daten zu verlieren.
Einschränkungen und zukünftige Anwendungen Diese Methode der Manipulation des Verhaltens mit der Optogenetik bei frei beweglichen Tieren beinhaltet auch Einschränkungen. Während der Operation ist die Nähe der beiden Implantate eingeschränkt. Bei der doppelten Implantation muss der Abstand zwischen den beiden Implantaten minimal die Breite des Geräts sein, um das Implantat zu halten. Das Gerät muss das zweite Implantat in das Gratloch senken, während die ersten Implantate bereits fixiert sind. Eine Lösung dafür könnte eine abgewinkelte Implantation sein, bei der die Spitzen der Glasfaser sehr nah sein können, während die Keramikfeder über dem Schädel einen größeren Abstand23,55,,56,57,62,63haben. Ein Nachteil einer abgewinkelten Implantation ist die Lichtausbreitung. Wenn die Faserspitze schräg statt von geradeoben ist, ist der stimulierte Bereich anders. Bei zwei Zielregionen in unmittelbarer Nähe muss die veränderte Position der Lichtstimulation berücksichtigt werden.
Während des Verhaltensexperiments kann die Konstruktion des Labyrinths das mit dem Tier verbundene optische Kabel stören. Einige Verhaltenstests, wie z. B. die Hell-Dunkel-Box, enthalten einen Innenbereich64,65, und andere Labyrinthe enthalten Fächer, die die Maus betreten muss. Solche Experimente können mit diesem Setup nicht durchgeführt werden. Alternativ kann ein drahtloses System eine Option22,26,66sein. Aber zum Glück können einige Labyrinthe, wie das Barnes Maze, so angeordnet werden, dass die Mäuse die entsprechenden Fächer67betreten können.
Neben solchen mit geschlossenen Zonen können auch zu breite Labyrinthe Probleme verursachen. Je größer die Fläche des Labyrinths, desto länger muss das Kabel sein, damit das Tier an jede Position im Labyrinth gehen kann. Es ist darauf zu achten, dass das Tier nicht in der Lage ist, auf das Kabel zu treten oder es zu greifen und es zu beißen. Eine Lösung dafür könnte eine Konstruktion sein, die das redundante Kabel aufrollt. Ein Nachteil ist, dass der Luftwiderstand zum Ausrollen des Kabels für Mäuse schwierig ist. Diese Lösung würde besser für Ratten geeignet. Eine weitere Möglichkeit könnte sein, die Lichtstimulation im Voraus durchzuführen, statt während des Experiments ist dies natürlich nur möglich, wenn ein Langzeiteffekt durch die Lichtstimulation auftritt23.
Vergleich zu bestehenden/alternativen Methoden Alternative Methoden wären chemische oder elektrische Stimulation während des Verhaltens8,18. Chemische Agonisten oder Antagonisten sind in der Lage, Neuronen über bestimmte Rezeptoren zu aktivieren oder zum Schweigen zu bringen und können auch einzelne Neurotransmitter-Systeme38,68manipulieren. Einerseits ist die Rezeptor-Spezifität für Chemikalien recht hoch, da spezifischer Agonist oder Antagonist nur bestimmte Rezeptoren aktiviert39. Auf der anderen Seite, die Spezifität für Rezeptor-Subtypen der gleichen Neurotransmitter-Gruppe ist oft unzureichend. Die meisten Chemikalien binden an mindestens zwei Untertypen mit unterschiedlichen Wahrscheinlichkeiten69. Darüber hinaus können Chemikalien nicht zwischen neuronalen Zelltypen unterscheiden, solange sie die gleichen Rezeptortypen besitzen. Darüber hinaus ist die zeitliche und räumliche Auflösung schlecht für chemische Manipulationen im Vergleich zur Optogenetik. Agonisten oder Antagonisten werden oft oral35 oder über systemische Injektionen57,70verabreicht. Wenn die Infusion der Chemikalie direkt im Gehirngewebe erfolgt, effekte schneller als bei oralen Anwendungen, aber immer noch auf einer langsameren Zeitskala als bei der Lichtstimulation. Da die verabreichten Chemikalien im Gehirn diffundieren und nicht spezifisch für neuronale Typen oder Hirnregionen sind, ist die Manipulation bestimmter Gehirnschaltkreise nicht möglich.
Elektrische Stimulation hat eine höhere zeitliche Auflösung als chemische Stimulation9,14. Die Streuung im neuronalen Gewebe ist geringer als bei der chemischen Stimulation und die räumliche Auflösung ist besser als bei der chemischen Stimulation. Die elektrische Stimulation hat jedoch keine Möglichkeit, verschiedene neuronale Zelltypen oder Rezeptortypen gezielt anzusprechen, da jedes Neuron in der Nähe der Elektrode auf die elektrische Stimulation reagiert.
Alternative Methoden zum Verhalten bei frei beweglichen Mäusen sind beispielsweise elektrophysiologische Aufnahmen in Hirnscheiben, bei denen einzelne Neuronen oder Axone mit Optogenetik moduliert und Effekte über die Aufzeichnung von Elektroden6,71gemessen werden können. In-vitro-Experimente bieten die Möglichkeit, die molekulare und zelluläre Basis optogenetischer Stimulationen zu untersuchen, haben aber die Einschränkung, dass intrinsische Konnektivität und Input aus anderen Hirnregionen fehlen. Eine weitere Möglichkeit ist die Optogenetik in Verbindung mit Multiphotonen-Bildgebung1,72. In diesem Fall haben Mäuse ihren Kopf fixiert und können beästhetisiert werden oder wach sein, um einfache Aufgaben zu lösen.
Um ein erfolgreiches optogenetisches Experiment durchzuführen, stehen heutzutage eine breite Palette von Werkzeugen und Anwendungen zur Verfügung. Die Auswahl optogenetischer Werkzeuge und die Verhaltenseinstellung sind entscheidend, um spezifische Forschungsfragen zu beantworten. Wenn die richtige Kombination von Werkzeugen und Experimenten gewählt wird, ermöglicht die Optogenetik eine beispiellose, eingehende Untersuchung neuronaler Schaltkreise mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung. Dies wird dazu beitragen, neue therapeutische Strategien für psychiatrische Erkrankungen und Kognition zu verstehen und zu entwickeln.

Die Modulation der neuronalen Schaltkreise im zentralen Nervensystem und ihre Verhaltensergebnisse sind wichtig für das Verständnis, wie das Gehirn funktioniert, vor allem bei psychiatrischen Erkrankungen und kognitiven Aufgaben wie Lernen und Gedächtnis. Mit der Optogenetik können einzellige zellen- oder Zellpopulationen bis hin zu ganzen Schaltkreisen durch Licht moduliert werden. Häufige optogenetische Werkzeuge wie Channelrhodopsin2 (ChR2) oder Archaerhodopsin (Arch) sind in der Lage, Neuronen zu aktivieren oder zum Schweigen zu bringen, oder die Freisetzung von Sendern an Axonklemmen zu erhöhen oder zu hemmen, die auf verschiedene Hirnregionen1,2,3,4projiziert werden. Arch muss jedoch sorgfältig verwendet werden, da gezeigt wurde, dass seine Aktivierung an präsynaptischen Klemmen die spontane Senderfreigabe5erhöht. Arch ist eine nach außen korrigierende Protonenpumpe, die den pH-Wert innerhalb der Zelle ändert. Dieses alkalische Milieu induziert Kalziumzufluss und verbessert die Senderfreisetzung5. Um spezifisch intrazelluläre Signalwege zu modulieren, können Rezeptorchimären, die aus einem lichtaktivierbaren optogenetischen Werkzeug wie Rhodopsin oder Kegelopsin bestehen, in Verbindung mit einem geeigneten G-Protein-gekoppelten Rezeptor6,,7,8erstellt werden. Die Menge und Variation der verfügbaren optogenetischen Werkzeuge hat in den letzten zehn Jahren deutlich zugenommen9.
Der Zweck der Optogenetik ist es, neuronale Schaltkreise während des Verhaltens zu manipulieren. Die Optogenetik ermöglicht beispielsweise die Messung akuter Verhaltensänderungen wie Veränderungen im Angstverhalten. Optogenetische Werkzeuge werden über virale Vektoren in Zielregionen des Gehirns geliefert. Mit Hilfe von speziellen Promotoren und Enhancern oder dem Cre-loxP-System kann die Zelltypspezifität für die Expression optogenetischer Werkzeuge gewährleistet werden (Abbildung 1A). Es gibt mehrere genetisch veränderte Mauslinien, die das Enzym Cre-Recombinase nur in bestimmten Zelltypen exemiten. Zum Beispiel drücken Nex-Cre-Mäuse die Cre-Recombinase in pyramidenförmigen Neuronen im Kortex und im Hippocampus unter der Kontrolle des Nex-Promotors10aus. Dieses Enzym ist in der Lage, DNA-Sequenzen umzukehren, die von loxP-Seiten11flankiert werden. Folglich kann die DNA-Sequenz eines doppelfläxten optogenetischen Werkzeugs, das von loxP-Seiten invertiert und flankiert wird, nur von Neuronen transkribiert werden, die die Cre-Recombinasebesitzen, aber nicht von anderen neuronalen Typen12,13. Bei Nex-Cre-Mäusen wird das optogenetische Werkzeug ausschließlich in pyramidenförmigen Neuronen ausgedrückt. Die Lichtstimulation bestimmter Hirnregionen erfolgt dann durch chronische Implantation von optischen Fasern direkt über dem Interessengebiet. Tiere können dann an eine geeignete Lichtquelle gekoppelt werden und verhalten sich in fast allen Arten von Verhaltenstests frei.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61023/61023fig01.jpg"> Abbildung 1: Injektion und Implantation. A) Cre-loxP-System für ChR2-YFP. Doppel-Floxed optogenetische nokgenetic Werkzeug wird in einem Adeno assoziierten Virus (AAV) für die Injektion in das Gehirngewebe verpackt. B) Sagittale Ansicht der Virusinjektion und Implantation einer optischen neuronalen Schnittstelle in/über dem IL-Bereich des mPFC. Injektion und Implantation wurden von oben durchgeführt. Alle Regionen von Interesse, IL, BLA und DRN, werden angezeigt. C) Detailansicht der implantierten optischen Faser, Hülse und Lichtquelle. D) Verbreitung der blauen und roten Laserlichtstimulation im grauen Materie-Hirngewebe aus einer 200-m-Lichtfaser (Yizhar et al. 2011). Blaues Licht breitet sich maximal 0,5 mm in das Gewebe aus, rotes Licht ca. 1 mm. Farbcodierung: rot 50%, gelb 10%, grün 5%, blau 1%, wenn Licht diesen Bereich erreicht. E) Koronale Ansicht der einseitigen Implantation direkt über der linken IL mit einer 200 m Glasfaser. Der IL-Bereich hat eine Breite von 0,25 mm in jeder Hemisphäre und eine Tiefe von 0,2 mm. Blaue und rote Glühbirnen sind die Boarder von 5% Licht ausbreitung und werden von Yizhar et al auf die richtige Größe übertragen. LoxP: Lokus von X-over P1; ChR2: Channelrhodopsin; YFP: gelbes fluoreszierendes Protein; dflox: doppelfloxiert; IL: infralimbischer Kortex; BLA: basolaterale Amygdala; DRN: dorsale raphe Kerne; PrL: prälimbische Region. Diese Zahl wurde von Berg 201948geändert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61023/61023fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Optogenetische Ansätze werden genutzt, da sie sowohl eine hohe zeitliche als auch räumliche Auflösung14 und eine zelltypspezifische Modulation ermöglichen. Darüber hinaus ist es möglich, das implantierte Gerät ohne weitere Behandlung wiederholt zu verwenden. Nach einer stereotaktischen Operation, bei der die Injektion eines adenoassoziierten Virus, das das optogenetische Werkzeug trägt, und die Implantation der optischen Faser durchgeführt wird, können sich Mäuse zwei Wochen lang erholen. Wir haben eine Erholungszeit von nur 2 Wochen gewählt, weil dies genug Zeit ist, um sich von der Operation zu erholen und für das Virus auszudrücken. Da auf die Verhaltensexperimente die Immunhistochemie folgt, müssen wir sicherstellen, dass Mäuse während des Experiments nicht zu alt werden; andernfalls wird die Gewebequalität verringert. Sie zeigen keine offensichtlichen Verhaltensstörungen durch das Implantat und verhalten sich in einem typischen Käfigverhalten. Natürlich wird die Implantation von einer signifikanten chirurgischen Läsion begleitet; Daher werden die Mäuse intensiv überwacht. Nach der Operation müssen Mäuse einzeln untergebracht werden, da Gruppenmäuse dazu neigen, sich gegenseitig die frischen Wunden und Implantate zu verletzen. Jedoch, Gehäusebedingungen haben einen großen Einfluss auf die Angst ebene männlichen Mäusen, wie Einzelzimmer Mäuse zeigen niedrigere Angstniveaus15 und im Allgemeinen weniger depressiv-ähnliche Symptome16.
Chemische oder elektrische Manipulation von Gehirnschaltkreisen fehlt die hohe Zelltyp-Spezifität der Optogenetik und haben eine niedrigere zeitliche und räumliche Auflösung14,17,18. Je nach experimenteller Frage kann elektrische oder chemische Stimulation unterschiedliche Vorteile haben. Beim Passieren von Faserklemmen in einer bestimmten Region muss auch stimuliert werden, elektrische Stimulation ist die beste Methode. Chemische Stimulation ist eine gute Wahl, wenn senderspezifische Rezeptoren in einer ganzen Region von Agonisten aktiviert werden sollten. Ein weiterer großer Vorteil der Optogenetik im Vergleich zur chemischen oder elektrischen Stimulation ist, dass endogen, Neuronen sind nicht empfindlich auf Licht, die das Auftreten von Nebenwirkungen vermeidet19. In der Tat, hohe Lichtintensitäten können Heizeffekteinduzieren 8,20, aber aufgrund der richtigen Kontrollgruppen, die Verhaltenseffekte aufgrund optogenetischer Manipulation kann eliminiert werden.
Die Untersuchung des Nagetierverhaltens, insbesondere in Bezug auf psychiatrische Erkrankungen, hat sich mit der Optogenetik bei frei beweglichen Tieren erheblich verbessert, da es die direkte Modulation einzelner Rezeptoren bis zu bestimmten Zellpopulationen21 und Schaltkreise22ermöglicht. Die Möglichkeit, die akuten Wirkungen solcher Modulationen sowie die langfristigen Verhaltenseffekte nach einer definierten Zeit23 oder nach chronischer Stimulation24zu messen, ermöglicht eine breite Flexibilität experimenteller Entwürfe und bietet sehr detaillierte Einblicke in Gehirnschaltungen. Lichtstimulation kann verwendet werden, um Neuronen an der Injektionsstelle des optogenetischen Werkzeugs zu modulieren. Wenn sowohl die Injektion als auch die Implantation die gleiche Hirnregion ansprechen, können Zellkörper und rückenprojizierte Axone von Prinzipneuronen und Interneuronen in dieser Regionzielgerichtetwerden 3,6,8. Die Lichtfaser kann jedoch auch in einer anderen Region als der injizierten implantiert werden. In diesem Fall kann die Lichtstimulation die Senderentriegelung an Axonklemmen in Projektionsbereichen des injizierten Bereichs25,26,27modulieren.
In der Studie hier wird die Optogenetik in Kombination mit Experimenten zur Analyse von Angstverhalten eingesetzt. Angstbedingte psychiatrische Erkrankungen betreffen mehr als ein Drittel der Weltbevölkerung28,29,30 und verursachen eine hohe wirtschaftliche Belastung31. Betroffene leiden unter einem Gefühl von Erregung, Anspannung und Sorge, gefolgt von Vermeidungsverhalten32,33. Diese chronisch auftretenden negativen Emotionen, die sich hauptsächlich auf zukünftige Ereignisse konzentrieren34, stören stark den Alltag der Patienten. Häufige Behandlungen wie Benzodiazeze oder selektive Serotonin-Wiederaufnahmehemmer (SSRIs) sind nur bei einigen Patienten erfolgreich. Eine große Anzahl von Menschen reagieren überhaupt nicht auf die Behandlung35, was zeigt, dass der Mechanismus, der solchen Krankheiten zugrunde liegt, noch nicht vollständig verstanden ist. Der mediale präfrontale Kortex (mPFC) ist dafür bekannt, eine wichtige Rolle bei der Entwicklung und Manifestation von Angst21,25,27,36,37,38zu spielen. Insbesondere könnte die Überaktivierung der infralimbischen Kortex (IL) Region im mPFC Teil von Angststörungensein 39,40. Das hier beschriebene Beispielexperiment könnte helfen zu verstehen, wie Modulationen im IL-Bereich des mPFC das Angstverhalten beeinflussen. Darüber hinaus kann die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien für angstbedingte psychiatrische Erkrankungen potenziell auch unterstützt werden.
2-6 Monate alte männliche Nex-Cre Mäuse werden verwendet, um ChR2 speziell in pyramidenförmigen Neuronen innerhalb der IL-Region des mPFC41auszudrücken. Nex-Cre-Mäuse haben einen C57Bl/6-Hintergrund und exprimieren das Enzym Cre-recombinase speziell in pyramidenförmigen Neuronen. Während einer stereotaktischen Operation wird die doppelfloxierte ChR2-DNA über adenoassoziierte virale Vektoren in die IL-Region injiziert. Das optische Implantat wird direkt über dem Interessenbereich platziert (Abbildung 1B) und das Implantat wird mit Zahnzement fixiert. Kontrolltiere erhalten eine Injektion von Doppel-Floxed-TdTomato-DNA in der gleichen Region, um zellspezifische Expression zu imitieren.
Die Tiere sind bis zum Tag der Operation in Gruppen untergebracht und danach einzeln untergebracht, um Verletzungen durch andere Mäuse zu vermeiden. Mäuse sind in einzelnen belüfteten Käfigen (IVC) in TypI-L Käfigen für Einzelmäuse untergebracht. Der Hell-Dunkel-Zyklus folgt einem 12:12 h-Rhythmus, die Lichtphase ab 10 Uhr. Alle Verhaltensexperimente werden in der dunklen Phase durchgeführt, die der aktiven Phase von Nagetieren ähnelt. Wasser und Standard-Lebensmittelpellets sind ad libitum erhältlich. Nach zwei Wochen der Genesung, die eine ausreichende Expression von ChR2 in pyramidenförmigen Neuronen gewährleistet, werden Mäuse für Verhaltensexperimente verwendet.
Das Open Field (OF) ist ein 50 cm x 50 cm quadratisches Labyrinth mit sandgestrahlten 40 cm hohen Wänden. Der Boden ist in 16 Quadrate unterteilt, wo die innere 4 das Zentrum darstellt. Das gemessene Verhalten ist: 1) Zeit in der Mitte verbracht, 2) Anzahl der Mitte Einträge, und 3) Gesamtentfernung verschoben. Während dieses Experiments gibt es 4 Versuche mit einer Gesamtzeit von 20 Minuten. In den Studien 1 und 3 findet keine Lichtstimulation statt, und in den Studien 2 und 4 wird eine 20 Hz Stimulation mit 5 ms Lichtimpuls und 1 mW Lichtintensität von 473 nm durchgeführt (Abbildung 2A). In den späteren Versuchen wurde die Gewöhnung an das Testgebiet berücksichtigt, aber die Verwendung von Schein-injizierten Kontrolltieren zeigt an, wie Gewöhnung ausgedrückt wird.
Das Barnes Maze ist ein Experiment für Lernen und Gedächtnis. Es ist eine kreisförmige Plattform mit einem Durchmesser von 92 cm und enthält 20 äquidistante Löcher um den Umfang. 19 der Löcher sind geschlossen und unter einem Loch wird ein Fluchtkasten präsentiert. An 4 aufeinanderfolgenden Tagen haben Mäuse 4 Trainingsversuche, um den Standort der Fluchtbox zu erfahren. Am5. Tag wird die Escapebox entfernt und Mäuse werden getestet, wie viel Zeit sie benötigen, um das richtige Loch zu finden. Das gemessene Verhalten ist: 1) Zeit, bis das Escape-Box/korrekte Loch gefunden wird, 2) Anzahl der Zielbesuche und Fehler und 3) Abstand verschoben, bis in das Escape-Box. Die Lichtstimulation in verschiedenen Gruppen erfolgt entweder während der Erfassung oder Konsolidierung, die an den Trainingstages 1-4 stattfinden, oder während des Abrufs am Testtag, d. h. Tag 5 (Abbildung 2D).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61023/61023fig2v2.jpg"> Abbildung 2: Verhaltensexperimente mit optogenetischen Protokollen. A) Schematische Zeichnung des Open Field-Experiments mit dem entsprechenden Lichtstimulationsprotokoll. C) Schematische Zeichnung des Elevated-Plus Maze-Experiments mit dem entsprechenden Lichtstimulationsprotokoll. D) Schematische Zeichnung des Barnes Maze-Experiments mit dem entsprechenden Lichtstimulationsprotokoll. EPM: Elevated-Plus Maze; VON: Open Field; BM: Barnes Maze Test. Diese Zahl wurde von Berg 201948geändert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61023/61023fig2v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Für die optogenetische Stimulation müssen Lichtintensität und -frequenz an das zu untersuchende optogenetische Werkzeug und den neuronalen Typ angepasst werden. Die geringstmögliche Lichtintensität sollte verwendet werden, um Schäden am Gewebe zu vermeiden, da mehrere Studien gezeigt haben, dass es mögliche Heizeffekte aufgrund der starken Lichtintensität8,20gibt. Für ChR2 wird häufig eine 20 Hz Stimulation mit einem 5 ms Lichtimpulsverwendet 2. Da ChR2 sehr lichtempfindlich ist, reichen 1 mW Lichtintensität aus. Das Lichtstimulationsprotokoll wechselt zwischen Licht aus und bei Versuchen, um Verhaltensänderungen direkt zu messen. Die äußeren Raumbedingungen für Verhaltensexperimente sollten für die gesamte Tiergruppe stabil bleiben. Wichtige Zu berücksichtigende Bedingungen sind das Rauschen (beachten Sie, dass Geräte selbst Geräusche machen können), der Geruch (immer die Verhaltenseinstellungen mit Ethanol reinigen), die Lichtintensität und der Experimentator. Der Experimentator sollte immer die gleiche Person sein. Darüber hinaus sollte die Tageszeit der Experimente für alle Tiere in einer Gruppe gleich sein, ein paar Stunden nach Beginn der dunklen Phase in der Anlage wird bevorzugt.
Das Ziel dieses Experiments ist es, das Anregungs-/Hemmungsverhältnis (E/I) in der IL-Region durch starke Aktivierung von erregenden pyramidenförmigen Neuronen zu erhöhen. Ein verbessertes E/I-Verhältnis in dieser speziellen Kortexregion ist bekannt, angstzuhaben bei Mäusen zu erhöhen40,42,43,44.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ketamin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K2753-64</td>
			<td>Anestasia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 % Glucose</td>
			<td>AlleMan Pharma</td>
			<td></td>
			<td>Injection s.c. for fast recovery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Behavioral mazes</td>
			<td>Costum made</td>
			<td></td>
			<td>Measure anxiety</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bepanthen</td>
			<td>Bayer</td>
			<td></td>
			<td>Ophthalmic oinment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betaisodona</td>
			<td>Monodipharma</td>
			<td></td>
			<td>Sterilant containing iodine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betaisodona</td>
			<td>Monodipharma</td>
			<td></td>
			<td>Iodine oinment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ52, 110AL0.62x WD160</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic ferrules</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CFLC230-10</td>
			<td>Implant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic Fiber Scribe</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CSW12.5</td>
			<td>Cutting of the glass fiber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Channelrhodopsin2-YFP virus</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>Addgene 20298</td>
			<td>Optogenetic tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed air</td>
			<td>Kontakt Chemie</td>
			<td>Druckluft 67</td>
			<td>Drying of the skull</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coordinate system</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td></td>
			<td>Stereotactic coordinates for the surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Correl Draw</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Graphical software version 13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryoslicer</td>
			<td>MICROM</td>
			<td>HM500OM</td>
			<td>Production of brain slices for staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethovision XT 14</td>
			<td>Noldus</td>
			<td></td>
			<td>Software for behavioral tracking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Statistical Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferrule Polishing Puck</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>D50-F</td>
			<td>Polishing implants round side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Patch Cord dual</td>
			<td>Prizmatix</td>
			<td>Optogenetics-Fiber 500, 1,20 m, Ferrule core 1,25 mm</td>
			<td>Cables, which are connected with the two implants of a bilateral implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Patch Cord single</td>
			<td>Prizmatix</td>
			<td>Optogenetics-Fiber 500, 1,20 m, Ferrule core 1,25 mm</td>
			<td>Cable, which is connected with the implant via a sleeve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Stripping Tool</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>T06S13</td>
			<td>Stripping glass fiber for implant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>VWR European</td>
			<td>516-0300</td>
			<td>Cut into pieces for the Novelty-Suppressed Feeding test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food pellets</td>
			<td>M&#252;hle Levers</td>
			<td>H&#246;veler Nagerfutter</td>
			<td>Nutrition for the mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipettes</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>GC150-10</td>
			<td>Injection pipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gradia direct-Flo</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>103322</td>
			<td>Fluid dental cementum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating lamp</td>
			<td>efbe-Schott/Phillips</td>
			<td>R95E</td>
			<td>Prevent the mice from cooling after the surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating plate</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td></td>
			<td>Integrated into coordinate system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection canula</td>
			<td>Braun</td>
			<td>100 Sterican, 0,4 x 20 mm, Gr. 20</td>
			<td>All injections and to bore hole into the skull</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Litter</td>
			<td></td>
			<td>T 1350</td>
			<td>Grounding for the Novelty-Supressed Feeding test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse cages</td>
			<td>Zoonlab</td>
			<td>405 cm^2</td>
			<td>Single housing for experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optibond FL</td>
			<td>Kerr</td>
			<td>26684E</td>
			<td>Preparation of the skull for implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical glass fiber</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FT200EMT</td>
			<td>Light fiber for implant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optogenetics-LED.STSI</td>
			<td>Prizmatix</td>
			<td></td>
			<td>Optogenetic toolbox for light stimulation during behavioral experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>16005-1KG-R</td>
			<td>Perfusion of mice to remove the brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polishing sheet 0.02 &#181;m grit</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LFCF</td>
			<td>Polishing implants round side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polishing sheet 1 &#181;m grit</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LF1D</td>
			<td>Polishing implants round side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polishing sheet 30 &#181;m grit</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LF30D</td>
			<td>Polishing implants round side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polishing sheet 6 &#181;m grit</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LF6D</td>
			<td>Polishing implants round side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulser Software</td>
			<td>Prizmatix</td>
			<td></td>
			<td>Software for light device control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rimadyl-Carprofen</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td></td>
			<td>Analgesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma Plot</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Software for statistics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sleeve</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FT200EMT</td>
			<td>Connection of implant and light cable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SodiumCloride (NaCl)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>3570410</td>
			<td>Rinsing of the skull</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superglue</td>
			<td>Pattex Henkel</td>
			<td></td>
			<td>To Fix the glass fiber in the ferrule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>td-Tomato virus</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>Addgene 51503</td>
			<td>Optogenetic tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV light</td>
			<td>KoQGHJ</td>
			<td>wireless, 1200 mW/cm^2</td>
			<td>Polymeration lamp for dental cementum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylavet-Xylazin</td>
			<td>cp pharma</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optogenetic manipulation of neuronal activity to modulate behavior in freely moving mice

Die optogenetische Modulation neuronaler Schaltkreise bei frei beweglichen Mäusen wirkt sich auf das akute und langfristige Verhalten aus. Diese Methode ist in der Lage, Manipulationen von einzelnen Neuronen und regionsspezifische Senderfreisetzung durchzuführen, bis hin zu ganzen neuronalen Schaltkreisen im zentralen Nervensystem, und ermöglicht die direkte Messung von Verhaltensergebnissen. Neuronen drücken optogenetische Werkzeuge über eine Injektion von viralen Vektoren aus, die die DNA der Wahl tragen, wie Channelrhodopsin2 (ChR2). Licht wird über chronische optische Implantate, die direkt über der Zielregion enden, in bestimmte Hirnregionen gebracht. Nach zwei Wochen Erholung und korrekter Werkzeugexpression können Mäuse wiederholt für Verhaltenstests mit optogenetischer Stimulation der Neuronen von Interesse verwendet werden.
Die optogenetische Modulation hat eine hohe zeitliche und räumliche Auflösung, die mit hoher Zellspezifität erreicht werden kann, im Vergleich zu den häufig verwendeten Methoden wie chemischer oder elektrischer Stimulation. Das Licht schadet dem neuronalen Gewebe nicht und kann daher sowohl für Langzeitexperimente als auch für mehrere Verhaltensexperimente mit einer Maus verwendet werden. Die Möglichkeiten optogenetischer Werkzeuge sind nahezu unbegrenzt und ermöglichen die Aktivierung oder das Stummschaltung ganzer Neuronen oder sogar die Manipulation eines bestimmten Rezeptortyps durch Licht.
Die Ergebnisse solcher Verhaltensexperimente mit integrierter optogenetischer Stimulation visualisieren Verhaltensänderungen, die durch die Manipulation verursacht werden. Das Verhalten desselben Tieres ohne Lichtstimulation als Basisistin ist eine gute Kontrolle für induzierte Veränderungen. Dies ermöglicht einen detaillierten Überblick über neuronale Typen oder Neurotransmitter-Systeme, die an bestimmten Verhaltensweisen beteiligt sind, wie Angst. Die Plastizität neuronaler Netzwerke kann auch durch Langzeitstimulation oder Verhaltensbeobachtungen nach optischer Stimulation sehr detailliert untersucht werden. Optogenetik wird helfen, neuronale Signalisierung bei verschiedenen Arten von neurologischen Erkrankungen zu erleuchten.

Ziel dieses Protokolls ist es, Veränderungen im Verhalten genetisch veränderter Mäuse während eines optogenetischen Experiments zu messen. Optogenetische Manipulation erfolgt durch Injektion eines adeno assoziierten viralen Vektors. Die Lichtstimulation bei frei beweglichen Mäusen ist durch Implantation einer Lichtfaser direkt über dem Interessengebiet möglich.
In Abbildung 4werden die Ergebnisse eines optogenetischen Experiments vorgestellt. Eine starke Aktivierung von exzitatorischen pyramidenförmigen Neuronen in der IL-Region über ChR2 erhöhte Angst-bezogenes Verhalten im Offenen Feld. ChR2 wurde in die IL-Region des mPFC in Nex-Cre-Mäusen zur Expression in pyramidenförmigen Neuronen injiziert (Abbildung 4A). Während zweier Angsttests, dem Offenen Feld (Abbildung 4B,C) und dem Novelty-Suppressed Feeding Test (Abbildung 4F,G), wird ChR2 mit blauem Licht stimuliert und aktiviert pyramidale Neuronen. Als Kontrolle erhielt eine andere Gruppe von Mäusen eine Injektion des Fluorophors tdTomato anstelle von ChR2 (Abbildung 4D,G). In einem solchen Experiment wird Angst als Vermeidung des helleren zentralen Bereichs definiert. Mäuse zeigen eine intrinsische Vermeidung von offenen Flächen, weil sie Angst vor Raubtieren haben.
Im Open Field-Experiment, das in Abbildung 4Bgezeigt wird, führten Mäuse 4 Versuche von jeweils 5 Minuten durch. In den Studien 1 und 3 kam es zu keiner Lichtstimulation (Off1,2) und in den Prüfungen 2 und 4 wurde eine Blaulichtstimulation mit 20 Hz (5 ms Lichtimpuls) und 1 mW Intensität durchgeführt (On1,2). Die Heatmaps zeigen, dass in der experimentellen Gruppe die Mittlere Dauer zwischen Off- und On-Tests unterschiedlich war. Bei der Lichtstimulation bleiben Mäuse bevorzugt im Grenzgebiet. Kontrolltiere bevorzugen auch die Grenze, ändern aber ihr Verhalten bei Lichtstimulation nicht. In Abbildung 4Cwerden die wichtigsten Verhaltensmessungen während des Open Field-Experiments für die experimentelle Gruppe angezeigt. Wenn die Daten den Shapiro-Wilk-Test auf Normalität bestanden haben, wurden Statistiken mit einem unabhängigen zweischwanzigen t-Test durchgeführt. Wenn der Normalitätstest fehlgeschlagen ist, wurde der Mann-Whitney-Rank Sum-Test als nicht-parametrische Alternative verwendet. Für diese Art von Experimenten wurde ein Gruppenvergleich gewählt, um zu untersuchen, ob die Lichtstimulation das Angstverhalten im Laufe der Zeit direkt verändern kann, unabhängig von der Grundangst von Versuchs- und Kontrolltieren. Die mittlere Dauer verringerte sich während der beiden Lichtstimulationsstudien signifikant, was auf erhöhte Angstniveaus hindeutet. Die bewegte Gesamtentfernung wurde nicht verändert, was zeigt, dass das Verhalten des Bewegungsapparates nicht beeinträchtigt wurde. Die Anzahl der Center-Einträge wurde erhöht, wenn auch nicht signifikant. In Abbildung 4Dwerden die Daten der Kontrollgruppe angezeigt. Kontrolltiere zeigten keine Verhaltensänderungen zwischen Off- und On-Studien in einem der analysierten Parameter, was zeigte, dass Lichtstimulation oder Implantation nicht die beobachteten Effekte verursachten. Zusammenfassend zeigt dieser Test erhöhte Angst bei der Lichtstimulation von IL-Pyramidenneuronen über ChR2.
In Abbildung 5werden die Daten eines erfolglosen optogenetischen Experiments für das Elevated-Plus Maze gezeigt. Während des Elevated-Plus Maze-Experiments, das in Abbildung 5Avorgestellt wird, absolvierten Mäuse 6 Versuche von jeweils 3 Minuten. In den Versuchen 1, 3 und 5 wurde keine Lichtstimulation durchgeführt (Off1, Off2, Off3) und in den Versuchen 2, 4 und 6 wurde blaulichtstimulierend mit 20 Hz (5 ms Lichtimpuls) und 1 mW Intensität durchgeführt (On1, On2, On3). In diesen beispielhaften Ergebnissen waren die Länge des optogenetischen Protokolls und der Bau des Labyrinths selbst für die transgene Mauslinie nicht geeignet. In Abbildung 5Bist zu sehen, dass mehrere Mäuse mit ihren Hinterpfoten aus dem Labyrinth gerutscht sind oder sogar umgefallen sind. Als dies geschah, bekamen Mäuse eine zweite Chance, die EPM einen Tag später durchzuführen. Wenn sie wieder herunterfielen, wurden sie von der Analyse ausgeschlossen. Als Mäuse mehrmals abrutschten, aber es schafften, im Labyrinth zu bleiben, wurden die Daten normal analysiert. Dennoch müssen die Daten sehr sorgfältig interpretiert werden, und die Kontrolle der Tiere gewinnt an Bedeutung. Nex-Cre-Mäuse hatten motorische Schwierigkeiten, auf den schmalen offenen Armen zu bleiben. Um dies zu vermeiden, hätten kleine Wände mit einer Höhe von 1 cm zu einem sicheren Halt der hinteren Pfoten an den Armen des Labyrinths beigetragen. Sowohl die Heatmaps als auch die Graphiken zeigen, dass sowohl experimentelle als auch Kontrollmäuse begonnen haben, die offenen Arme von Versuch 2 (On1) auf zu vermeiden (Abbildung 5C-E). Die Zeit auf den offenen Armen wird für beide Gruppen deutlich verkürzt, ebenso wie die offenen Armeintritte. Die Analyse der Versuchsgruppe erhielt nur Daten, die eine große anxiogene Wirkung der Lichtstimulation implizierten, da die Zeit auf den offenen Arm und die Eintritte des offenen Arms während der On1-Studie signifikant verringert wird. Beim Vergleich dieser Daten mit der Kontrollgruppe, die das gleiche Verhalten zeigen, wird jedoch deutlich, dass das beobachtete Verhalten nicht durch die optogenetische Stimulation vermittelt wird, sondern durch Vermeidung der offenen Arme im Allgemeinen aufgrund der Gewöhnung an das Labyrinth. Diese Daten unterstreichen die Bedeutung einer geeigneten Kontrollgruppe, um zwischen Verhaltenseffekten, die durch optogenetische Stimulation vermittelt werden, und möglicher Verhaltensanpassung zu unterscheiden. Diese Daten beleuchten auch die Bedeutung einer ordnungsgemäßen Anpassung eines Versuchsaufbaus an die spezifische Mousselinie und die experimentelle Frage.
Um die gesammelten Verhaltensdaten zu validieren und zu stärken, werden Gehirne von Mäusen nach dem letzten Experiment entfernt, um die richtige Injektion und Implantation zu kontrollieren (Abbildung 6). Gehirne werden in 4% Paraformaldehyd fixiert und aus dem Schädel entfernt. Gehirne werden in 30% Saccharose für 1-2 Tage dehydriert und danach kryosliced. Die 40 m dicken koronalen Hirnscheiben werden gewaschen und auf Superfrostobjektivrutschen mit einem Montagemedium mit DAPI montiert, das Zellkerne färbt. Dies ermöglicht die Identifizierung von Zielbereichen in den koronalen Scheiben. Fluoreszenz des YFP-Tags oder tdTomato selbst gibt den Standort der Virusinjektion an. In Abbildung 6B werden die beispielhaften Injektionsstellen von ChR2-YFP links (gelb) und tdTomato rechts (rot) dargestellt. Mit Hilfe einer Vorlage, die aus dem45 Paxinos- und Franklin 45-Maus-Gehirnatlas angepasst wurde, kann die IL-Region identifiziert werden. In beiden Dias wird das optogenetische Werkzeug in der IL-Region, aber auch in angrenzenden Hirnregionen exprimiert. Für eine korrekte Interpretation wird die Verbreitung von blauem Licht im Hirngewebe konsultiert8 (Abbildung 1D,E). Es kann gesehen werden, dass das blaue Licht den DP-Bereich unterhalb der IL mit nur weniger als 5% der anfänglichen 1 mW Lichtintensität an der Faserspitze erreichen wird (Blaue Linie in Abbildung 1D)8. Zusätzlich kann eine kleine Menge Licht in die PrL-Region aufgrund der Rückstreuung47nach oben gehen. Folglich kann man sagen, dass die IL-Region am stärksten beleuchtet ist, aber angrenzende Regionen wie die DP- und PrL-Region können auch leicht stimuliert werden. Daher ist eine IL-zellspezifische Stimulation nicht garantiert und eine immunhistochemische Analyse der angrenzenden Regionen sollte durchgeführt werden, um zu sehen, ob die Aktivität von PrL- und DP-Zellen über Licht moduliert wird. In Abbildung 6Cwird ein weiteres wichtiges Steuerelement dargestellt: die Spezifität der Nex-Cre-Mauslinie. Durch Antikörperfärbung gegen die beiden Zelltypen in der IL-Region, glutamaterge Prinzip Neuronen und GABAerge Interneurons, Kann man sehen, dass die ChR2-YFP-Expression nur in glutamatergen Neuronen und nicht bei GABAergen auftritt.
Alles in allem zeigen unsere Experimente, dass bei optogenetischer Manipulation während Verhaltenstests Veränderungen im Angstverhalten beobachtet werden können. Durch die Verwendung von mehr als einem Test für das gleiche Verhalten kann eine zuverlässige Schlussfolgerung gezogen werden. Darüber hinaus bestätigt die immunhistochemische Analyse die erhaltenen Daten. Unsere Experimente deuten darauf hin, dass die spezifische Aktivierung von pyramidenförmigen Neuronen im fralimbischen Kortex das Angstverhalten in bestimmten Assays erhöht hat.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61023/61023fig04v4.jpg"> Abbildung 4: Optogenetische Aktivierung von IL-Pyramidenneuronen erhöht das Angstverhalten. Lichtstimulation während der Experimente: 473 nm, 1 mW, 20 Hz Stimulation. A) Schematische Zeichnung der Injektions- und Implantationsstelle für ChR2-YFP oder tdTomato in die IL. Während des Experiments werden pyramidale Neuronen im IL-Bereich des mPFC durch ChR2 aktiviert. Saggitale Hirnscheiben angepasst aus dem Paxinos und Franklin Maus Gehirn Atlas, saggital: lateral o,6. B) Open Field Labyrinth mit Lichtstimulation Stoltonie (20 min mit 4x5 min abwechselnd Off und On Trials; links) und Heatmaps von beispielhaften ChR2-injizierten (EXP) und tdTomato-injizierten (CT) Mäusen in allen 4 Studien des Experiments (rechts). EXP Tiere verbringen weniger Zeit in der Mitte des OF, wenn sie mit blauem Laserlicht stimuliert werden. Bei CT-Tieren unterscheidet sich die im Zentrum verbrachte Zeit nicht zwischen Licht-Aus- und On-Tests. C) Gruppendaten für EXP-Tiere im OF, n=11. Mäuse verbringen deutlich weniger Zeit in der Mitte des OF, wenn sie mit blauem Licht stimuliert werden (Off1 39,49±6,9 s, On1 19,87±4,47 s, Off2 28,13±8,55 s, On2 23,42±9,32 s, Off1:On1, t-Test, p = 0,033, *; Off1:On2, MWRS, p=0,049, *). Die entfernungbewegten (Off1 2703.09±292.65 cm, On1 3113.4±491.15 cm, Off2 3331.86 ±482.62 cm, On2 3082.17±658,61 cm). Die Anzahl der Centereinträge nimmt mit der Zeit ab, zeigt aber keine signifikanten Unterschiede (Aus 1 22,36±3,78, On1 18,45±3,95, Off2 17,36±1,99, On2 13,27±2,64). D) Gruppendaten für CT-Tiere im OF, n=15. Zeit, die Mäuse in der Mitte des OF verbringen, die Entfernung bewegt, die Anzahl der Mitteleinträge ändert sich nicht zwischen Licht Ein und Off-Tests (Zeit in der Mitte Off116.73±2.65 s, On1 16.02±1.89 s, Off2 12.02±1.76 s, On2 13.04±2.58 s; Abstand 1 3399.69±296.77 cm, On1 3210.6±446.9 cm, Off2 3030.28±513.83 cm, On2 2955±617.7 cm; Anzahl der Centereinträge Off1 14.2±1.98, On1 13.6±2.02, Off2 10.8±1.88, On2 11.67±2.5). CT-Mäuse zeigen deutlich höhere Ausgangsangst (Off1 EXP:CT, MWRS, p=0,005, **). Werte sind Mittelwert±S.E.M. * zeigen signifikante Unterschiede (p≤0,05), ** signifikante Unterschiede (p≤0,01). t-Test immer zweischwanzigen, MWRS: Mann-Whitney Rank Sum Test; IL: infralimbischer Kortex; BLA: basolaterale Amygdala; DRN: dorsale raphe Kerne; VON: Open Field; CT: Kontrolltiere; EXP: Versuchstier; L: Licht. Diese Zahl wurde von Berg et al. 2019, PLoS One43 und von Berg 201948geändert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61023/61023fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61023/61023fig5v4.jpg"> Abbildung 5: Das EPM-Experiment konnte bei Nex-Cre-Mäusen keine Verhaltenseffekte zeigen. Lichtstimulation während der Experimente: 473 nm, 1 mW, 20 Hz Stimulation. A) Elevated-Plus Maze mit Lichtstimulationsprotokoll (18 min, 6x3 min, abwechselnd Aus und On Trials). B) Gruppendaten für die Mäuse, die "abrutschen", sind in den Daten enthalten, insgesamt n=23. Nex-Cre-Mäuse neigten dazu, unabhängig von der Versuchsgruppe (links) mit ihren Hinterpfoten aus dem offenen Arm zu rutschen. Nur Mäuse, die für alle 6 Studien im Labyrinth blieben, wurden in späteren Analysen berücksichtigt. Slip-offs in der ersten Off1-Phase sind Grund für die spätere Vermeidung der offenen Arme (Off1 EXP 1.63±0.6, CT 2.2±0.79, Off2+3 EXP 0.125±0.125, CT 0±0, On1+2+3 EXP 0.625±0.26, CT 0.1±0.1). Das Kreisdiagramm (rechts) zeigt Mäuse, die während der 18 min aus dem Labyrinth fallen, mit 42,42%. Nur 57,57% beendeten das Experiment. C) Heatmaps von beispielhaften EXP- und CT-Mäusen in allen 6 Studien des Experiments. Beide Gruppen zeigen nach der Off1-Studie eine Abnahme der Dauer des offenen Arms. D) Gruppendaten für EXP-Tiere im EPM, n=12. Die Zeit, die in den offenen Armen verbracht wurde, verringerte sich in den ersten beiden Versuchen und danach kontinuierlich (Off1 73,91±12,22 s, Am1 36.15±14.65 s, Off2 15.61±6.23 s, On2 19.49±7.51 s, Off3 9.36±4.44 s, On3 7.96±3.47 s. Off1:On1, t-test, p=0,041, *). Der bewegte Abstand ist nicht betroffen (Off1 679.96±71.63 cm, On1 712.24±112.82 cm, Off2 717.49±97.39 cm, On2 782.51±81.11 cm, Off3 722.11±68.60 cm, On3 663.90±106.57 cm). Die Anzahl der offenen Armeinträge verringert sich deutlich von Off1 auf On1 und bleibt dann konstant (Off1 8.08±1.08, On1 3.33±0.76, Off2 2.16±0.69, On2 2.91±1.09, Off3 1.73±0.75, On3 1.73±0.66. Off1:On1, t-test, p=0.002, **). Die Zeit, die im Zentrum der EPM verbracht wird, nimmt entlang der Versuche ab, zeigt aber keinen signifikanten Unterschied von Off to On Trial (Off1 41.71±5.34 s, On1 31.2±4.59 s, Off2 19.8±3.44 s, On2 24.49±3.38 s, Off3 20.37±4.77 s, On3 18.85±4.07 s). E) Gruppendaten für CT-Tiere im EPM, n=11. DIE CT-Daten zeigen die gleichen signifikanten Rückgänge wie EXP-Daten, was darauf hindeutet, dass das Experiment nicht richtig funktioniert hat (Zeit in offenen Armen Off1 86.92±12.74 s, On1 33.78±14.38 s, Off2 18.01±11.61 s, On2 16.41±9.61 s, Off3 11.36±4.01 s, On3 5.43±2.07 s. Off1:On1, MWRS, p=0.009, **; Abstand 1 705.11±88.36 cm, On1 789.45±77.53 cm, Off2 724.74±80.49 cm, On2 676.57±111.99 cm, Off3 716.99±132.47 cm, On3 663.03±132.46 cm; Offene Armeinträge Off1 7.09±1, On1 3.72±1.17, Off2 1.45±0.47, On2 1.36±0.58, Off3 0.91±0.43, Off3 1.64±0.59. Off1:On1, MWRS, p=0.01, *; Zeit verbringen im Zentrum Off1 35,89 s, On1 29.25±3.96 s, Off2 22.17±3.58 s, On2 15.9±2.57 s, Off3 13.86±4.2 s, On3 16.89±5.75 s). Werte sind Mittelwerte ± S.E.M. * signifikante Unterschiede (p≤0,05) und ** signifikante Unterschiede (p≤0,01) anzeigen. t-Test ist immer zweischwänzig, MWRS: Mann-Whitney Rank Sum Test; EPM: Elevated-Plus Maze; CT: Kontrolltiere; EXP: Versuchstier; OA: offene Arme. Diese Zahl wurde von Berg et al. 2019, PLoS One43 und von Berg 201948geändert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61023/61023fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61023/61023fig06.jpg"> Abbildung 6: Injektionsseite von ChR2 und tdTomato in der IL- und Nex-Cre-Spezifität. A) Schematische Zeichnung der Implantationsstelle auf koronalen Hirnscheiben bei AP + 1,66 mm, ml 0,3 mm, DV -1,8 mm, mit einseitiger Injektion und Implantation (angepasst aus Maushirnatlas, Paxinos und Franklin, Bregma +1,54 mm). B) Beispielhafte Injektionsstellen von ChR2-YFP (links, gelb) und tdTomato (rechts, rot) verschmolzen mit DAPI-gebeizten Zellkernen (blau) bei Nex-Cre-Mäusen. Maßstabsstange 1 mm. Eintsets weisen eine hohe Vergrößerung der IL-Region auf. Skala bar 150 'm. Weiße Felder zeigen die Position der Einzahlenan. C) Obere Reihe: Konfokalaufnahmen der linken IL-Region einer Nex-Cre-Maus, die mit CamKII als Marker für glutamaterge Neuronen (blau) und ChR2-YFP (gelb) oder Gad67 als Marker für GABAerge Neuronen (grün) einer Nex-Cre-Maus befleckt ist. Untere Reihe: Kolokalisierung von ChR2-YFP (gelb) mit CamKII (links, blau), aber nicht mit Gad67 (rechts, grün), die Spezifität von Nex-Cre-Mäusen für glutamaterge Neuronen zeigt. Skalenstange 50 'm. PrL: prälimbischer Kortex; IL: infralimbischer Kortex; DP: dorsale pedunkuläre Kortex. Diese Zahl wurde von Berg et al. 2019, PLoS One43 und von Berg 201948geändert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61023/61023fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

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Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity to Modulate Behavior in Freely Moving Mice

Mit optogenetischer Manipulation bestimmter neuronaler Populationen oder Hirnregionen kann das Verhalten bei frei beweglichen Tieren mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung verändert werden. Durch den Einsatz verschiedener optogenetischer Werkzeuge in Kombination mit chronisch implantierten optischen Fasern kann eine Vielzahl neuronaler Modulationen und Verhaltenstests durchgeführt werden.

Optogenetische Manipulation der neuronalen Aktivität, um das Verhalten bei frei beweglichen Mäusen zu modulieren

Optogenetic modulation of neuronal circuits in freely moving mice affects acute and long-term behavior. This method is able to perform manipulations of ...

Mit optogenetischer Manipulation bestimmter neuronaler Populationen oder Hirnregionen kann das Verhalten bei frei beweglichen Tieren mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung verändert werden. Durch den Einsatz verschiedener optogenetischer Werkzeuge in Kombination mit chronisch implantierten optischen Fasern kann eine Vielzahl neuronaler Modulationen und Verhaltenstests durchgeführt werden. Das ultimative Ziel der Optogenetik ist die Modulation neuronaler Schaltkreise mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung im verhaltenden Tier.Im Gegensatz zu pharmakologischen oder elektrischen Manipulationen ermöglicht die Optogenetik die präzise Kontrolle bestimmter Zelltypen auf neuronalen Schaltkreisen. Optogenetik ist der perfekte Weg, um bestimmte Zelltypen in speziell definierten Regionen während des Verhaltens zu zielen und die direkten Auswirkungen von Veränderungen in solchen Mikrokreisläufen zu untersuchen. Wir werden nun einen Schritt zur Schrittführung vorstellen, wie man Optogenetik in einer frei beweglichen Maus vorbereitet und pflanzt und durchführt.Zur Herstellung des optischen Implantats eine keramische Ferrule flach seite oben in eine Bank vise legen. Streifen Sie den Code einer 200 Mikrometer Durchmesser Glasfaser, mit einem Faser-Abisolierwerkzeug und schneiden Sie zwei bis drei Zentimeter non Stücke mit einem Keramikfaser-Schreiber. Legen Sie das Stück Glasfaser in die Keramikferrule dann legen Sie einen Tropfen einen Superkleber an der flachen Seite mit einem Injektionskanon.Auf der runden Seite der Keramikferrule die Glasfaser so kurz wie möglich schneiden und das Vorimplantat an einem Ferrule-Polierpuck platzieren, um die runde Seite auf vier verschiedenen Veröffentlichungspapieren zu polieren. Danach schneiden Sie die Glasfaser auf der flachen Seite der Keramikferrule auf die für die Implantation benötigte Länge. Verwenden Sie einen Maus-Gehirnatlas, um die Länge des Implantats zu berechnen.Das Implantat muss direkt über dem Interessengebiet enden. Vor der Implantation wird eine Anästhesie angewendet. Die präzise und ästhetische Technik wird im Manuskript beschrieben.Wenn die Maus einen tiefen Zustand der Anästhesie erreicht, legen Sie sie auf eine Heizplatte und fixieren Sie den Kopf in einem stereotaktischen Rahmen. Fixieren Sie die Nase und die Zähne vorne und die Ohren auf beiden Seiten. Tragen Sie eine Algesie mit einem Cuprofen subcuntanely in den Rücken der Maus auf und tragen Sie undurchsichtige Augensalbe auf beide Augen auf, um sie vor dem Trocknen zu schützen.Befeuchten Sie das Haar auf der Kopfhaut mit einem nassen Papiertuch und schneiden Sie es dann mit einer Schere ab. Achten Sie darauf, alle lockeren Haare mit einem nassen Papiertuch zu entfernen. Verwenden Sie einen Baumwollstab, um die Kopfhaut mit einer Jodtindose zu desinfizieren.Heben Sie die Kopfhaut über die Region von Interesse mit einer Pinzette und schneiden Sie einen Zentimeter entlang der Mittellinie. Um den Schädel für die Implantation aufzurauen, tragen Sie eine kleine Menge Phosphorsäure auf die Narbe auf und lassen Sie sie 15 Sekunden lang wirken. Entfernen Sie alle Säure mit einem Baumwollstab und spülen Sie die Narbe zweimal mit Natriumchlorid.Für eine ordnungsgemäße Injektion berechnen Sie den F-Faktor für einzelne Koordinaten. Legen Sie einen Glaskanonin in den stereoktatischen Rahmen und lokalisieren Sie ihn direkt über Bregma. Jetzt Null das Koordinatensystem und verschieben Sie die Glaskanüle nach Lambda.Berechnen Sie den F-Faktor mit der folgenden Formel. Bregma minus Lambda geteilt durch 4,2 entspricht dem F-Faktor. Genaue Koordinaten sind sehr wichtig für Injektion und Implantation, denn sonst, wenn die falsche Struktur stimuliert wird, dann sind die Verhaltenseffekte unspezifisch.Alle Mäuse haben minimale Abweichungen in der Größe ihres Schädels, daher ist der Koeffizient absolut obligatorisch. Verwenden Sie die angepassten Koordinaten, um die Position auf der Narbe direkt über der Struktur des Interesses zu finden. Verwenden Sie eine Injektionskanüle, um ein Loch in den Schädel zu bohren, indem Sie die Kanüle an der Stelle drehen.Um eine Viruslösung in die mit der Spritze verbundene Glaskanüle zu nehmen, legen Sie einen Tropfen Natriumchlorid auf den Schädel und ein Stück Pirophen auf die Oberseite. Legen Sie einen Tropfen von zwei Mikroliter-Viruslösung auf die Pirophen und senken Sie die Spitze der Glaskanüle in das Virus. Tragen Sie unterdruck und warten Sie, bis die Viruslösung von der Kanüle übernommen wird.Null zu dieser Koordinate, wenn die Spitze des Virus mit Kanüle auf der Ebene des Schädels ist und langsam in das Bohrloch auf die niedrigste Position der Injektionsseite absenken. Tragen Sie eine kleine Menge an positivem Druck mit der Spritze auf, bis der Meniskus abgesenkt ist. Lassen Sie das Virus für zwei bis drei Minuten verbreiten, bevor Sie die Glaskanüle nach oben in die nächste Position bewegen.Entfernen Sie die Glaskanüle sehr langsam und entsorgen Sie sie nach der endgültigen Injektion. Bereiten Sie nun den Schädel für die Implantation vor. Den Schädel mit Druckluft trocknen, die Grundierung mit dem entsprechenden Stick auftragen und 15 Sekunden trocknen lassen.Tragen Sie die Bindung mit dem gleichen Stick auf und härten Sie sie 20 Sekunden lang mit UV-Licht aus. Das Implantat in den entsprechenden Halter legen und die Spitze der Glasfaser direkt über dem Bohrloch positionieren und vorsichtig absenken. Beenden Sie das Absenken des Implantats, wenn das verbleibende Ventil aus Superkleber den Schädel berührt.Die Implantation von optischen Fasern kann auch für bilaterale Strukturen wie den Hippocampus erfolgen. Dies ermöglicht eine leichte Stimulation in beiden Hemisphären gleichzeitig oder ermöglicht die Stimulation zweier unterschiedlicher Strukturen. Es ist auch möglich, das Virus an einem anderen Ort als dem Glasfaserimplantat zu injizieren.Wenn die Injektion und Implantation in verschiedenen Regionen durchgeführt werden, bohren Sie alle notwendigen Löcher nach dem Auftragen von Phosphorsäure, aber vor der Zweikomponenten-Haftung. Überprüfen Sie noch einmal, ob der Schädel noch vollständig trocken ist, dann geben Sie flüssigen Zahnzement um das Implantat und in der Umgebung dann für 20 Sekunden mit UV-Licht heilen Zwei mehr weniger Zement in völlig pelzfreien und getrockneten Schädelbereich. Härten Sie jede Schicht mit UV-Licht.Um die Operation zu beenden, wenden Sie Jodsalon auf die gesamte Wunde an. Lassen Sie die Nasen- und Ohrfixierung los, bringen Sie die Maus in einen frischen Käfig und legen Sie sie unter eine Heizlampe, um den Verlust von Körperwärme zu vermeiden. Überprüfen Sie seinen Gesundheitszustand mindestens einmal am Tag und es wird operative und Algesie nach drei Tagen, wenn nötig.Nach zwei Wochen der Genesung können Mäuse für Verhaltensexperimente verwendet werden. Öffnen Sie die Pulser-Software, und wählen Sie den USB-Kom-Anschluss aus, an den die Lichtquelle angeschlossen ist. Wählen Sie den Betriebsmodus 3, damit eine externe Software die Lichtquelle steuern kann.Wählen Sie die richtige Einstellung für 20 Hertz Stimulation mit fünf Millisekunden Lichtimpuls. Um die Division zu suchen, um mit dem Pulser zu kommunizieren, drücken Sie auf die Startsequenz. Dieser Status bleibt bestehen, bis die Experimente abgeschlossen sind.Erstellen Sie nun ein neues Experiment in EthoVision XT, gehen Sie zur Datei, wählen Sie neue Aus-Vorlage aus und wählen Sie eine vordefinierte Vorlage anwenden aus. Wählen Sie Live-Tracking und wählen Sie die Kamera mit Quelle und bestätigen Sie die angeschlossene Puslar Gen-Eye-Cam. Wählen Sie die Maus als das Tier, das aufgezeichnet werden soll.Wählen Sie die Arena-Vorlage, das offene Feldquadrat und die Zonenvorlagenmitte, den Rahmen und die Ecken aus. Bestätigen Sie ein Motiv, das verfolgt werden soll, und wählen Sie Mittelpunkt, Nasenpunkt und Schwanzbasis aus. Bestätigen Sie, dass die Tierfarbe im Vergleich zum Hintergrund dunkler ist und die empfohlene Abtastrate zum Beenden des Schritts angezeigt wird.Benennen Sie das entsprechende Experiment, und wählen Sie einen zu speichernden Speicherort aus. Bis Sie die Arena-Einstellungen gefunden haben, öffnet die Kamera automatisch ein Hintergrundbild. Passen Sie die vordefinierten Zonen an die reale Arena an, indem Sie den Pfeil und die beiden Symbole auf der rechten Seite verwenden.Wenn einige Zonen nicht erforderlich sind, löschen Sie sie. Drücken Sie die Zeichnungsskala, um zu kalibrieren, und legen Sie eine Linie von einer Ecke des Labyrinths zur anderen. Geben Sie die Länge der realen Entfernung in Zentimetern ein.Wiederholen Sie dies für die andere Achse. Um die Einstellungen für die Teststeuerung zu definieren, bereiten Sie die Hauptregel vor, indem Sie die Konditionszeit auf 20 Minuten anpassen. Die Bedingung für Star Trek sollte, wenn sich der Betreff zwei Sekunden lang in der Arena befindet, für einen automatischen Status der Verfolgung sein, wenn sich die Maus in der Arena befindet.Um eine Unterregel für die Lichtstimulation zu erstellen, gehen Sie zu Strukturen, mehr und wählen Sie Unterregel. Platzieren Sie es unter der Hauptregel und verteilen Sie die beiden Boxen. Gehen Sie zu Bedingungen, Zeit und geben Sie ihm einen Namen wie Licht auf einem, anpassen Bedingung ist mit nach fünf Minuten erfüllt.Platzieren Sie das Feld direkt hinter dem Regelstartfeld der Unterregel. Gehen Sie zu Aktion benutzerdefinierte Hardware und nennen Sie es mit Licht auf einem. Wählen Sie die Aktion aus, um als:Ich lege eine Hoch-Wert-Aktion.Platzieren Sie das Feld direkt hinter dem Zustandsfeld. Wiederholen Sie die Schritte, um Licht aus zu programmieren. Gehen Sie nun zu Strukturen, Unterregelverweis und überprüfen Sie, ob der Verweis zur richtigen Unterregel gehört.Wählen Sie Startbedingungen als ohne Verzögerung und Startbedingungen als einmal pro Startbedingung ausgeführt. Platzieren Sie das Referenzfeld zwischen den zusätzlichen Büchern eins und Bedingung Bücher zwei der Hauptregel. Definieren Sie nun die Erkennungseinstellungen, um dem System anzuzeigen, was es verfolgen soll.Legen Sie eine Testmeilen in die Arena und wählen Sie automatisierte Einrichtung. Wählen Sie Nagetier als Tiertyp und verwenden Sie den Mauszeiger, um ein Kästchen um die Mäuse in der Arena zu zeichnen. Bestätigen Sie die Ergebnisse der Pflegefrage mit ja.Für das Freifeldexperiment bringen Sie die experimentelle Maus direkt vor dem Experiment in den Verhaltensraum, um ein angemessenes Maß an Angst zu gewährleisten. Koppeln Sie die Maus ein Schlitz der Lichtquelle, indem Sie sie sanft auf das Gitter des Käfigs drücken. Legen Sie es in einen Wartekäfig mit frischem Wurf für 10 Minuten, um sich an das Lichtkabel zu gewöhnen.Starten Sie die Erfassung, indem Sie die Stopp-Taste drücken und Sie XT sehen. Übertragen Sie die Maus aus dem wartenden Käfig in die obere linke Ecke des offenen Feldes. Lassen Sie das Gesichtsfeld der Maus während des Experiments und halten Sie Ruhe. Nach 20 Minuten, wenn das Experiment abgeschlossen ist, entfernen Sie die Maus aus dem Labyrinth, trennen Sie das Lichtkabel und legen Sie es wieder in seinen eigenen Käfig.Durch eine Scheckvisualisierung können die Unterschiede in der Mittenzeit zwischen Licht aus und Licht auf Flächen direkt sichtbar werden. Die Maus verbringt weniger Zeit in der Mitte, wenn das Licht eingeschaltet ist. Für das Barnes-Labyrinthexperiment bringen Sie alle versuchsweise Mäuse etwa eine Stunde vor dem Experiment in den Verhaltensraum.Bereiten Sie das Barnes-Labyrinth vor, indem Sie alle Löcher außer einem schließen, und jetzt, wo eine Escape-Box platziert wird. Verbinden Sie eine Maus in der Lichtquelle an beiden Implantaten und legen Sie sie direkt in die Mitte des Barnes-Labyrinths. Drücken Sie start und müssen Sie das nächste T besuchen und den Karton entfernen.Seien Sie darauf vorbereitet, die Testversion manuell zu stoppen, nur für den Fall, dass die Software den gesamten Übergang nicht erkennt. Nehmen Sie die Maus aus dem Labyrinth und entfernen Sie die Verbindung zum Lichtkabel. Bei der Durchführung, Deminitäts- und Gedächtnisaufgabe wird nicht nur die unmittelbare Wirkung der Manipulation untersucht, sondern auch die langfristigen Auswirkungen von Manipulationen beim Erwerb, Konsolidierung oder Abrufen.Für die Datenanalyse finden Sie den Behandlungszustand behandelt oder kontrolliert, gehen Sie zum Verschachteln und wählen Sie den Testkontrollstatus aus. Wählen Sie das Zustandsintervall von der Elementaktion Star Trek bis zur Elementaktionsleuchte auf eins aus. Platzieren Sie den Nistkasten zwischen der Filterkastenbehandlung und dem entsprechenden Ergebnisfeld.Dieses definierte Intervall ist von einem. Wiederholen Sie die Schritte für Intervalle auf einem von zwei und auf zwei sowie für die Kontrollgruppe. Definieren Sie auch die zu analysierenden Parameter im Analyseprofil.Wählen Sie die abhängige Variable in der Zone aus, und wählen Sie den Zonenmittelpunkt, den Körperpunkt, den Mittelpunkt aus, und gehen Sie mit der Teststatistik. Wählen Sie Häufigkeit, kumulative Dauer aus, und lassen Sie es die erste uhr anzeigen. Fügen Sie auch Entfernungsverschiebung als Variable hinzu.Mit diesem Profil sind die Daten für die Zeit verfügbar, die in der Mitte, in den Mitteneinträgen und in der Entfernungsverschiebung verbracht wird. Um Daten aus jeder Division zu extrahieren, gehen Sie zu den Ergebnissen und wählen Sie Statistiken und Diagramme aus, drücken Sie die Berechnung, um die analysierten Daten anzuzeigen. Drücken Sie exportdaten, und wählen Sie die Teststatistiken und den zu speichernden Speicherort aus.Die exportierten Daten werden als Excel-Datei und mit individuellen Werten für jede Maus gespeichert. Gehen Sie außerdem zur Heatmap-Visualisierung und drücken Sie Heatmaps, wählen Sie Versuche auf der rechten Seite aus, um individuelle Heatmaps für jede Maus und jeden Versuch anzuzeigen. Machen Sie einen Rechtsklick auf die Maus und exportieren Sie die Heatmaps als Bilder.Später öffnen Sie die Excel-Datei den Computer und berechnen sie den Mittelwert und standard Euro SCM für alle vier Versuche und jede gemessene Konditionierungsgruppe. Um Diagramme und Sigma-Plots zu generieren, kopieren Sie die Mittelwerte und SCM in die richtige Reihenfolge von der zusätzlichen Datei in sigma-Plot. Die Zeilen müssen die Daten für eine, auf einem enthalten, und die Spalten enthalten Test,Mittelwert und SCM-Hertz.Wählen Sie alle drei Spalten aus, und erstellen Sie Diagramme. Wählen Sie das Balkenfeld aus, und wählen Sie das nicht gruppierte Feld mit dem Pfeil aus. Beschriften Sie das gesamte Diagramm, gehen Sie nach Hause, wählen Sie das Diagrammfeld aus und drücken Sie den Export.Wählen Sie den Zielordner aus, und wählen Sie die Metadatei als Format aus. Um Statistiken für erhaltene Daten zu berechnen, kopieren Sie rechte Daten von Xcel aus einem nach eins, et cetera und in einzelne Spalten des Sigma-Plots. Markieren Sie die Spalten, die Sie vergleichen möchten, und gehen Sie zur Analyse, wählen Sie T-Test und drücken Sie die Ausführung.Schließlich können Verhaltensdaten in Loslassen und Aufprobe mit zusätzlicher Heatmap-Spezialisierung dargestellt werden. Im Offenen Feldexperiment wird bei der Lichtstimulation von Channelrhodopsin2 und pyramidenförmigen Neuronen die mittlere Dauer verringert, was auf erhöhte Angstniveaus hinweist. Durch die Immunhistochemie können die Injektionsstelle und die Expression des Virus bestimmt werden, auch an der Spezifität an der speziellen Cre-abhängigen Mauslinie kann validiert werden.Man kann deutlich sehen, dass die Leichte Stimulation von Channelrhodopsin2 den Geist Neuronen dieser spezifischen Kortexregion erhöht Angstniveaus, im Vergleich zu Baseline Angst vor dieser Stimulation. Diese unmittelbare Wirkung der Manipulation auf das Verhalten ist der Grund, warum optogenetische heute für so viele Forschungsfragen zum Verhalten verwendet wird. Dieses Verfahren kann für die optogenetische Modulation jedes gewünschten Zelltyps oder neuronalen Schaltkreises im Mausgehirn verwendet werden.Durch die Kombination dieses Verfahrens mit geeigneten Verhaltenstests für Ihre Forschung kann ein tieferer Einblick in neuronale Schaltkreise gewonnen werden, die an Verhaltensweisen und Krankheiten von Interesse beteiligt sind.

Research

JoVE Journal

Behavior

Long-term Potentiation of Perforant Pathway-dentate Gyrus Synapse in Freely Behaving Mice

Langzeit-Potenzierung der perforant Pathway-Gyrus dentatus Synapse in Frei Behaving Mäuse

Studies of long-term potentiation of synaptic efficacy, an activity-dependent synaptic phenomenon having properties that make it attractive as a potential ...

Forschung

Verhalten

Uncovering Beat Deafness: Detecting Rhythm Disorders with Synchronized Finger Tapping and Perceptual Timing Tasks

Aufdecken Schlag Taubheit: Entdecken Rhythmusstörungen mit Synchronized Finger Tapping und Wahrnehmungszeit Aufgaben

A set of behavioral tasks for assessing perceptual and sensorimotor timing abilities in the general population (i.e., non-musicians) is presented here ...

Flat-floored Air-lifted Platform: A New Method for Combining Behavior with Microscopy or Electrophysiology on Awake Freely Moving Rodents

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It is widely acknowledged that the use of general anesthetics can undermine the relevance of electrophysiological or microscopical data obtained from a ...

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In vivo electrophysiology is a powerful technique to investigate the relationship between brain activity and behavior at a millisecond and micrometer ...

Assessing Activity-based Anorexia in Mice

Beurteilung der Activity based Anorexie bei Mäusen

Rodents develop activity-based anorexia (ABA) when exposed to a restricted feeding schedule and allowed free access to a running wheel. These conditions ...