Name: optogenetic manipulation of neuronal activity to modulate behavior in freely moving mice
Uploaded: 2020-10-27T12:30:00
Duration: 14 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity to Modulate Behavior in Freely Moving Mice at JoVE.com

Grande grazie alla prof.ssa Klaus-Armin Narve e alla dott.ssa Sandra Goebbels (Max-Plank-Institute of Experimental Medicine, Goettingen, Germania) per aver gentilmente fornito topi Nex-Cre. Inoltre, ringraziamo il nostro team video Yunus Dikici e Ruben Wiesner per la registrazione e l'elaborazione del video JoVE per questo articolo. Inoltre, grazie a Kristin Claussen per la sua voce fuori campo e Kimberly Anne Go per la correzione delle bozze del manoscritto.
I risultati presentati sono stati ottenuti presso la Ruhr-University di Bochum e il video è stato registrato presso l'Università di Brema.
Questo lavoro è stato finanziato dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) - Projektnummer 122679504 - SFB 874 e DFG MA 4692/3-2.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

L'uso della luce per manipolare la segnalazione neuronale è stato il metodo di scelta per quasi un decennio. Dal 2005, il numero di articoli pubblicati sullo sviluppo di nuovi strumenti optogenetici4,6,8,14,49,50,51 e studi in cui tali strumenti sono utilizzati per indagare circuiti cerebrali21,23,40,43,52, altamente aumentato. Da un lato, con l'enorme diversità di strumenti optogenetici iniettabili, varianti di impianto, linee di topi transgenici ed esperimenti comportamentali, la possibilità di esperimenti è molteplici e illimitata. D'altra parte, la possibilità di fare difetti nella scelta delle condizioni sperimentali è molto alta e gli esperimenti sono così specifici, che spesso la comparabilità ad altri studi è difficile.
Passaggi critici Un importante passo critico di questo protocollo è la corretta pianificazione. La scelta dello strumento optogenetico dovrebbe corrispondere alla questione scientifica. È solo necessario manipolare l'attività complessiva di un neurone o di una sinapsi? Poi strumenti forniti commercialmente come ChR221,25,27 e Arch37 sono una buona scelta. Ma a parte questo, se un sistema speciale di neurotrasmettitore o anche un singolo recettore dovrebbe essere manipolato, un singolo recettore chimera è spesso la scelta migliore3,6. Diverse chimere recettoriali con GPCR, i cosiddetti Opto-XR, e le linee guida per produrle sono giàdisponibili 4,50. Oltre alla scelta degli strumenti optogenetici, anche la linea del mouse in combinazione con l'esperimento comportamentale è fondamentale. Diversi ceppi di fondo, come ad esempio C57Bl/6 e BALB/cByJ, visualizzano diversi fenotipi comportamentali peralcuni aspetti 53,54. I topi C57Bl/6 hanno una bassa ansia di base e possono essere utilizzati per la manipolazione anssiogenica, mentre BALB/cByJ mostrano livelli di ansia più elevati e sono quindi più sensibili ai farmaci ansiotici. Inoltre, le varianti transgeniche di questi ceppi di fondo possono anche variare nel loro fenotipo48. Con una corretta combinazione di promotori specifici in combinazione con uno strumento optogenetico e una linea di topo transgenica, quasi ogni popolazione di cellule desiderata può essere mirata.
Un passaggio critico durante l'intervento chirurgico è la destinazione della posizione corretta. Con l'aiuto dell'atlante del cervello del topo, è possibile stabilire le coordinate corrette per l'asse anteriore-posteriore e l'asse mediale-laterale e la profonditàdella struttura 45. In realtà, ogni teschio ha una forma e dimensioni leggermente diverse. Così, il fattore F46 per regolare le coordinate stereotattiche è abbastanza importante, così come la corretta fissazione del naso e dell'orecchio durante la chirurgia stereotassica. Se la testa del mouse è inclinata, la canula di iniezione non riuscirà a colpire la regione di interesse desiderata.
Inoltre, il diametro della canula di iniezione è anche critico. Se è troppo piccolo, nessun virus può essere rilasciato nel tessuto, se è troppo largo, la canula perderà soluzione di virus sulla sua strada verso la regione di interesse. Se la fibra ottica impiantata termina direttamente sopra la regione di destinazione, l'espressione del virus nelle regioni della corteccia di cui sopra non ha importanza. Ma se l'impianto è posizionato sopra altre regioni per stimolare i terminali assoni, gli assoni delle regioni della corteccia superiore saranno attivati anche dalla luce e falsificano i dati ottenuti. Ad esempio: la regione IL e la regione prelimbice (PrL) proiettano entrambi l'amigdala basale55,56 ma hanno funzioni e ruoli completamente diversi nella modulazionedell'ansia 26,57. Se l'impianto è posizionato sopra l'amigdala per attivare i terminali assoni dalla regione IL, e durante la soluzione di virus di iniezione è stato anche inserito nella PrL a causa della canula di iniezione sbagliata, il rischio di attivare anche terminali assoni dalla PrL è molto alto.
Durante la preparazione del cranio per la fissazione dell'impianto, l'uso scarso di primer e legame è fondamentale per una fissazione affidabile e durevole. Se il sistema di adesione a 2 componenti non viene applicato sottilmente, il cemento dentale potrebbe staccarsi dal cranio dopo un paio di giorni o settimane. Inoltre, il cranio deve anche essere completamente asciugato prima di fissare l'impianto, altrimenti il cemento non si attacca correttamente al cranio.
Nella parte comportamentale di questo protocollo sono inoltre disponibili passaggi critici. In primo luogo, la costruzione del labirinto è molto importante. In ogni impostazione comportamentale, esistono diverse varianti nella letteratura per quanto riguarda le dimensioni e la forma, così come per la procedura stessa58,59,60. È importante scegliere una variante che renda i dati comparabili e riproducibili. Inoltre, devono essere presi in considerazione i requisiti speciali per le linee del mouse utilizzate43,48. Nei dati rappresentativi dell'EPM si può vedere che diversi topi Nex-Cre sono caduti dal labirinto o sono scivolati più volte (Figura 2b). Per questi topi, un labirinto con una piccola parete intorno alle braccia aperte sarebbe stata un'alternativa migliore.
In secondo luogo, è fondamentale mantenere costanti tutte le condizioni dellastanza esterna 61, altrimenti diversi gruppi di topi non sarebbero affatto comparabili. A questo proposito, è molto importante scegliere il tempo dell'esperimento come uno in cui l'installazione sperimentale è vacante e lo sperimentatore è sempre presente. Inoltre, gli eventi nell'edificio, come i lavori di costruzione, le prove di qualsiasi sistema (allarme antincendio) o il giorno di pulizia dell'impianto del topo, devono essere considerati al fine di evitare interferenze con i dati ottenuti.
Infine, le condizioni di movimentazione e alloggio sono fondamentali per gli esperimenti comportamentali. Quando viene eseguito un impianto, i topi devono essere alloggiati in modo singolo a causa del rischio di lesioni da altri topi. Per garantire una buona comparabilità tra i gruppi e un errore basso all'interno di un gruppo, ogni mouse deve avere le stesse dimensioni e arricchimento della gabbia. Per gli esperimenti legati all'ansia, singolo alloggiamento ha alcuni vantaggi come singe ospitato topi maschi mostrano un livello di ansia di base inferiore, meno variazione nel loro livello di ansia, e sintomi meno depressivi-come15,16. I topi maschi alloggiati nel gruppo potrebbero differire fortemente nel loro livello di ansia a causa della gerarchia tra i topi. Oltre all'alloggiamento, è importante anche una gestione costante ed equa di tutti i topi e gruppi. Afferrare il mouse per collegare la fibra luminosa sull'impianto è molto stressante. Pertanto, questa procedura deve essere la stessa per ogni mouse, il che significa la stessa tecnica e lo stesso sperimentatore. Inoltre, il tempo di assuola nella gabbia di attesa, che ha lo scopo di calmare il mouse dalla procedura di collegamento stressante, deve anche avere condizioni uguali in durata, lettiera e posizione al labirinto. La gestione all'interno della struttura del mouse è fondamentale anche per prestazioni comportamentali successive. Gli animali sperimentali e di controllo non devono essere puliti in giorni diversi o da persone diverse, in quanto questo è anche stressante per i topi. Inoltre, il giorno di pulizia non dovrebbe essere il giorno sperimentale per evitare differenze di comportamento.
Risoluzione dei problemi relativi Ci sono diversi problemi che potrebbero verificarsi durante il protocollo. Ad esempio, la perforazione di un intero nel cranio durante la chirurgia stereotassica potrebbe danneggiare i vasi sanguigni. Di solito, si verifica un forte sanguinamento, soprattutto sopra bregma e lambda. Se questo accade, non cercare di fermare l'emorragia con bastoncini di cotone in quanto tendono ad estendere ancora più sanguinamento fuori dal vaso a causa della loro assorbimento, invece, risciacquare direttamente con NaCl.
Può anche accadere che l'iniezione di pressione della soluzione di virus non funzioni. In questo caso, potrebbe essere che il parafilm, una crosta dal foro della bava o tessuto cerebrale, sta intasando la punta della canula. In questo caso, rimuovere la canula lentamente dal cervello senza cambiare l'asse x o y e utilizzare un tweezer per rimuovere 1-2 mm della parte anteriore della punta di canula. Prima di abbassare di nuovo la canula, testare la funzionalità applicando una piccola quantità di pressione per vedere se il virus esce dalla punta di canula. Per evitare la stitichezza, abbassare la canula con una velocità costante e non interrompere il movimento fino a raggiungere la profondità più profonda del lato di iniezione. Se troppo della punta di canula viene rimosso e il diametro è troppo grande, la canula danneggerà il tessuto e il rischio di applicare il virus tutto in una volta sarà aumentato. Quindi, assicurarsi che solo la parte intasata della punta venga accuratamente rimossa.
Durante l'esperimento comportamentale, la configurazione dell'esperimento nel software di tracciamento video (ad esempio, Ethovision XT) potrebbe causare problemi. Se, ad esempio, l'uscita della luce non funziona correttamente, ciò può essere dovuto a diversi motivi. Il Pulser deve essere aperto, programmato e avviato prima dell'apertura di Ethovision XT. L'hardware deve essere selezionato correttamente nella "Configurazione sperimentale" (passaggio 3.2.2.4). Se è selezionata la I/O-Box errata o qualcosa di diverso da "Costume Hardware", il dispositivo Pulser non può essere controllato da Ethovision. Se il test dell'uscita luminosa ha esito positivo, ma il protocollo di luce programmato in "Impostazioni di controllo di prova" non funziona durante l'acquisizione, il riferimento della regola secondaria o della sotto-regola potrebbe essere posizionato in modo non corretto o le condizioni e le azioni non sono chiare. Ad esempio: il riferimento appartiene alla sottorete corretta? Il riferimento è programmato correttamente (ad esempio, con quale frequenza viene eseguita la sottorete)?
Inoltre, potrebbe accadere che durante le "impostazioni di rilevamento" l'animale sia adeguatamente monitorato, ma durante l'acquisizione ci sono campioni in cui il soggetto non viene trovato. In questo caso, verificare se l'illuminazione nella stanza sperimentale è stata modificata, o se qualcosa ha prodotto ombre indesiderate all'interno del labirinto. L'intero fondo del labirinto deve avere lo stesso colore, poiché l'impostazione funzionerà solo per una combinazione specifica. Se per qualsiasi motivo non è possibile evitare diversi colori o ombre inferiori, definire l'impostazione di rilevamento nella parte più scura del labirinto.
Per modificare le impostazioni dopo l'acquisizione dei primi animali, non applicare queste modifiche nelle impostazioni già utilizzate. Duplicarli per regolarli. Ciò significa anche che la versione di prova già registrata non è più valida per l'analisi dei dati. In tal caso, registrare tutti gli animali per questo gruppo sperimentale con le impostazioni originali, e creare un nuovo esperimento in seguito in cui i video registrati vengono analizzati invece di live tracking. In questo esperimento "da video", diverse impostazioni possono essere utilizzate per l'analisi senza perdere la comparabilità tra gli animali o anche i dati.
Limitazioni e applicazioni future Questo metodo di manipolazione del comportamento con l'optogenetica negli animali in movimento libero include anche limitazioni. Durante l'intervento chirurgico, la vicinanza dei due impianti è limitata. Per il doppio impianto, la distanza tra i due impianti deve essere minimamente la larghezza dell'apparecchio per contenere l'impianto. L'apparecchio deve abbassare il secondo impianto nel foro della bava, mentre i primi impianti sono già fissi. Una soluzione per questo potrebbe essere un impianto angolato, dove le punte della fibra di vetro possono essere molto vicine mentre i ferule ceramici sopra il cranio hanno una distanzamaggiore 23,55,56,57,62,63. Uno svantaggio di un impianto angolato è la diffusione della luce. Quando la punta della fibra è inclinata invece che dall'alto, l'area stimolata è diversa. Nel caso di due regioni bersaglio nelle immediate vicinanze, è necessario considerare la posizione modificata della stimolazione della luce.
Durante l'esperimento comportamentale, la costruzione del labirinto potrebbe interferire con il cavo ottico collegato all'animale. Alcuni test comportamentali, come la casella chiaro-scuro, contengono un'area interna64,65e altri labirinti contengono scomparti che il mouse deve entrare. Tali esperimenti non possono essere eseguiti con questa configurazione. In alternativa, un sistema wireless potrebbe essereun'opzione 22,26,66. Ma per fortuna alcuni labirinti, come il Labirinto barnes, possono essere disposti in modo tale, che i topi sono in grado di entrare nei relativi scomparti67.
Oltre a quelli con zone chiuse, labirinti troppo larghi possono causare anche problemi. Più grande è l'area del labirinto, più lungo deve essere il cavo per consentire all'animale di andare in ogni posizione nel labirinto. Si deve fare attenzione che l'animale non sia in grado di intervenire sul cavo o afferrarlo e morderlo. Una soluzione potrebbe essere una costruzione che arrotono il cavo ridondante. Uno svantaggio è che la resistenza per srotolare il cavo è difficile per i topi. Questa soluzione sarebbe più adatto per i ratti. Un'altra opzione possibile potrebbe essere fare la stimolazione della luce in anticipo, invece che durante l'esperimento, naturalmente questo è fattibile solo se si verifica un effetto a lungo termine dovuto alla stimolazionedella luce 23.
Confronto con i metodi esistenti/alternativi Metodi alternativi sarebbero stimolazione chimica o elettrica durante ilcomportamento 8,18. Agonisti chimici o antagonisti sono in grado di attivare o silenziare i neuroni tramite recettori specifici e possono anche manipolare singoli sistemi di neurotrasmettitore38,68. Da un lato, la specificità del recettore è abbastanza alta per le sostanze chimiche, perché agonista specifico o antagonista attivano solo alcuni recettori39. D'altra parte, la specificità per i sottotipi recettori dello stesso gruppo di neurotrasmettitori è spesso insufficiente. La maggior parte delle sostanze chimiche si legano ad almeno due sottotipi con probabilitàdiverse 69. Inoltre, le sostanze chimiche non possono distinguere tra i tipi di cellule neuronali, purché possiedano gli stessi tipi di recettori. Al di là di questo, la risoluzione temporale e spaziale è scarsa per le manipolazioni chimiche rispetto all'optogenetica. Agonisti o antagonisti sono spesso somministrati per via orale35 o tramite iniezioni sistemiche57,70. Se l'infusione della sostanza chimica è fatta direttamente nel tessuto cerebrale, gli effetti appare più velocemente rispetto alle applicazioni orali, ma ancora su una scala temporale più lenta rispetto alla stimolazione della luce. Come le sostanze chimiche somministrate si diffondono nel cervello e non sono specifiche per i tipi neuronali o regioni del cervello, manipolazione di circuiti cerebrali specifici non è possibile.
La stimolazione elettrica ha una risoluzione temporale più elevata rispetto alla stimolazionechimica 9,14. La diffusione all'interno del tessuto neuronale è inferiore a quella della stimolazione chimica e la risoluzione spaziale è migliore rispetto alla stimolazione chimica. Tuttavia, la stimolazione elettrica manca la possibilità di affrontare specificamente diversi tipi di cellule neuronali o tipi di recettori, poiché ogni neurone in prossimità dell'elettrodo risponderà alla stimolazione elettrica.
Metodi alternativi al comportamento nei topi in movimento libero sono ad esempio registrazioni elettrofisiologiche in fette cerebrali, dove singoli neuroni o assoni possono essere modulati con optogenetica ed effetti suscitati possono essere misurati tramite la registrazione di elettrodi6,71. Gli esperimenti in vitro offrono la possibilità di studiare la base molecolare e cellulare delle stimolazioni optogenetiche, ma hanno la limitazione che manca la connettività intrinseca e l'input da altre regioni del cervello. Un'altra opzione consiste nell'utilizzare optogenetica in combinazione con l'imagingmultifoto 1,72. In questo caso, i topi hanno la testa fissa e possono essere anetitizzati o essere svegli per risolvere compiti semplici.
Per eseguire un esperimento optogenetico di successo, una vasta gamma di strumenti e applicazioni sono disponibili al giorno d'oggi. La selezione di strumenti optogenetici e l'impostazione comportamentale sono fondamentali per rispondere a domande di ricerca specifiche. Se viene scelta la giusta combinazione di strumenti ed esperimenti, l'optogenetica consente un'indagine senza precedenti e approfondita dei circuiti neuronali con alta risoluzione temporale e spaziale. Ciò contribuirà a comprendere e sviluppare nuove strategie terapeutiche per le malattie psichiatriche e la cognizione.

La modulazione dei circuiti neuronali nel sistema nervoso centrale e i loro esiti comportamentali sono importanti per capire come funziona il cervello, soprattutto nelle malattie psichiatriche e nei compiti cognitivi come l'apprendimento e la memoria. Con l'optogenetica, le singole cellule o le popolazioni cellulari fino a circuiti interi possono essere modulate dalla luce. Gli strumenti optogenetici comuni come Channelrhodopsin2 (ChR2) o Archaerhodopsin (Arco) sono in grado di attivare o silenziare i neuroni, o aumentare o inibire il rilascio del trasmettitore ai terminali assoni che proiettano in regioni cerebralidistinte 1,2,3,4. Tuttavia, Arch deve essere utilizzato con attenzione come è stato dimostrato che la sua attivazione ai terminali presinaptici aumenta il rilascio spontaneo del trasmettitore5. Arch è una pompa di protone di rettifica verso l'esterno che modifica il valore del pH all'interno della cella. Questo ambiente alcalino induce l'afflusso di calcio e migliora il rilascio del trasmettitore5. Per modulare in modo specifico le vie di segnalazione intracellulari, le chimere recettorie composte da uno strumento optogenetico leggero, come la rodopsina o l'opsin cono, in combinazione con un adeguato recettore accoppiato G-proteina, possono esserecreate 6,7,8. La quantità e la variazione degli strumenti optogenetici disponibili è aumentata in modo significativo nell'ultimo decennio9.
Lo scopo dell'optogenetica è quello di manipolare i circuiti neuronali durante il comportamento. L'optogenetica consente, ad esempio, la misurazione di cambiamenti comportamentali acuti come i cambiamenti nel comportamento di ansia. Gli strumenti optogenetici vengono consegnati nelle regioni bersaglio del cervello tramite vettori virali. Con l'aiuto di promotori e potenziatori speciali, o del sistema Cre-loxP, è possibile garantire la specificità del tipo di cella per l'espressione di strumenti optogenetici (Figura 1A). Ci sono diverse linee di topo geneticamente modificate che esprimono l'enzima Cre-Recombinase solo in tipi di cellule specifiche. Ad esempio, i topi Nex-Cre esprimono la Cre-Recombinase nei neuroni piramidali nella corteccia e nell'ippocampo sotto il controllo del Nex-promotore10. Questo enzima è in grado di invertire le sequenze di DNA, che sono affiancate da lati loxP11. Di conseguenza, la sequenza di DNA di uno strumento optogenetico a doppio floxed, invertito e affiancato da lati loxP, può essere trascritta solo da neuroni che possiedono la Cre-Recombinase, ma non da altri tipi neuronali12,13. Nel caso dei topi Nex-Cre, lo strumento optogenetico sarà espresso esclusivamente nei neuroni piramidali. La stimolazione della luce di alcune regioni cerebrali viene quindi ottenuta attraverso l'impianto cronico di fibre ottiche direttamente sopra la regione di interesse. Gli animali possono quindi essere accoppiati a una fonte di luce adatta e comportarsi liberamente in quasi tutti i tipi di test comportamentali.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61023/61023fig01.jpg"> Figura 1: Iniezione e impianto. A) Sistema Cre-loxP per ChR2-YFP. Doppio strumento optogenetico floxed è confezionato in un virus associato adeno (AAV) per l'iniezione nel tessuto cerebrale. B) Vista sagittale dell'iniezione di virus e dell'impianto di un'interfaccia neuronale ottica nella/sopra la regione IL dell'mPFC. L'iniezione e l'impianto sono stati fatti dall'alto. Vengono visualizzate tutte le aree di interesse, IL, BLA e DRN. C) Vista dettagliata della fibra ottica impiantata, del manicotto e della sorgente luminosa. D) Diffusione della stimolazione della luce laser blu e rossa nel tessuto cerebrale della materia grigia da una fibra luminosa di 200 m (Yizhar et al. 2011). La luce blu si diffonde, al massimo, 0,5 mm nel tessuto, luce rossa di circa 1 mm. Codifica a colori: rosso 50%, giallo 10%, verde 5%, blu 1% se la luce raggiunge quest'area. E) Vista coronale dell'impianto unilaterale direttamente sopra l'IL sinistro con una fibra ottica di 200 m. La regione IL ha una larghezza di 0,25 mm in ogni emisfero e una profondità di 0,2 mm. Le lampadine blu e rosse sono il boarder di diffusione della luce del 5% e vengono trasferite da Yizhar et al alla giusta dimensione. LoxP: locus di X-over P1; ChR2: Channelrhodopsin; YFP: proteina fluorescente gialla; dflox: doppio floxed; IL: corteccia infralimobica; BLA: amigdala basolaterale; DRN: nuclei di raphe dorsali; PrL: regione prelimbica. Questa cifra è stata modificata da Berg 201948. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61023/61023fig01large.jpg" target="_blank">Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Gli approcci optogenetici sono utilizzati in quanto consente sia alta risoluzione temporale e spaziale14 e la modulazione specifica del tipo di cellula. Inoltre, è possibile utilizzare ripetutamente il dispositivo impiantato senza ulteriori trattamenti. Dopo un intervento chirurgico stereotattico, in cui viene eseguita l'iniezione di un virus associato all'adeno che trasporta lo strumento optogenetico e l'impianto della fibra ottica, i topi possono recuperare per due settimane. Abbiamo scelto un tempo di recupero di solo 2 settimane, perché questo è abbastanza tempo per recuperare dall'intervento chirurgico e per il virus di esprimere. Poiché gli esperimenti comportamentali sono seguiti dall'immunohistochimica, dobbiamo garantire che i topi non dis abbiano troppo a lungo durante l'esperimento; in caso contrario, la qualità del tessuto è diminuita. Non mostrano evidenti danni comportamentali dall'impianto e si impegnano in un comportamento tipico della gabbia. Naturalmente, l'impianto è accompagnato da una lesione chirurgica significativa; pertanto, i topi sono monitorati intensamente. Dopo l'intervento chirurgico, i topi devono essere alloggiati in un singolo, poiché i topi alloggiati in gruppo tendono a ferire le ferite e gli impianti freschi dell'altro. Tuttavia, le condizioni abitative hanno un grande impatto sul livello di ansia dei topi maschi, poiché i topi singoli ospitati mostrano livelli di ansiapiù bassi 15 e in generale sintomi meno depressivi16.
La manipolazione chimica o elettrica dei circuiti cerebrali non ha l'alta specificità del tipo di cellula dell'optogenetica e ha una risoluzione temporale e spazialeinferiore 14,17,18. A seconda della domanda sperimentale, la stimolazione elettrica o chimica può avere diversi vantaggi. Quando si passano terminali in fibra in una regione specifica anche bisogno di essere stimolato, stimolazione elettrica è il metodo migliore. La stimolazione chimica è una buona scelta per quando i recettori specifici del trasmettitore in un'intera regione dovrebbero essere attivati dagli agonisti. Un altro grande vantaggio dell'optogenetica rispetto alla stimolazione chimica o elettrica è che endogenamente, i neuroni non sono sensibili alla luce, che evita l'insorgenza di effetticollaterali 19. Infatti, intensità di luce elevata potrebbe indurre effetti di riscaldamento8,20, ma a causa di gruppi di controllo adeguati, gli effetti comportamentali dovuti alla manipolazione optogenetica possono essere eliminati.
Lo esame del comportamento dei roditori, soprattutto per quanto riguarda le malattie psichiatriche, è notevolmente migliorato con l'optogenetica negli animali in movimento libero, in quanto consente la modulazione diretta di singoli recettori fino a specifiche popolazionicellulari 21 e circuiti22. La possibilità di misurare gli effetti acuti di tali modulazioni, così come gli effetti comportamentali a lungo termine dopo un tempodefinito 23 o dopo la stimolazionecronica 24, consente un'ampia flessibilità di progetti sperimentali e fornisce informazioni molto dettagliate sui circuiti cerebrali. La stimolazione della luce può essere utilizzata per modulare i neuroni situati nel sito di iniezione dello strumento optogenetico. Quando sia l'iniezione che l'impianto rifornano alla stessa regione del cervello, i corpi cellulari e gli assoni di protesi posteriore di neuroni e interneuroni principali in questa regione possono esseremirati 3,6,8. Tuttavia, la fibra luminosa può anche essere impiantata in una regione diversa da quella iniettata. In questo caso, la stimolazione della luce può modulare il rilascio del trasmettitore ai terminali d'assone nelle aree di proiezione della regione iniettata25,26,27.
Nello studio qui, l'optogenetica viene utilizzata in combinazione con esperimenti per analizzare il comportamento legato all'ansia. Le malattie psichiatriche legate all'ansia colpiscono più di un terzo della popolazionemondiale 28,29,30 e causano un elevato onere economico31. Le persone colpite soffrono di una sensazione di eccitazione, tensione e preoccupazione seguita dal comportamento dievitamento 32,33. Queste emozioni negative cronicamente presenti, che si concentrano principalmente su eventi futuri34, interferiscono fortemente con la vita quotidiana dei pazienti. Trattamenti comuni come benzodiazepine o inibitori selettivi della ricorsiva della serotonina (SSRI) hanno successo solo in alcuni dei pazienti. Una grande quantità di persone non risponde al trattamento atutti 35, dimostrando che il meccanismo alla base di tali malattie non è ancora pienamente compreso. La corteccia prefrontale mediale (mPFC) è nota per svolgere un ruolo importante nello sviluppo e nella manifestazionedell'ansia 21,25,27,36,37,38. In particolare, l'iperattivazione della regione di corteccia infralimbice (IL) nell'mPFC potrebbe far parte di disturbi legatiall'ansia 39,40. L'esperimento di esempio qui descritto potrebbe aiutare a capire come le modulazioni nella regione IL del mPFC influenzano il comportamento di ansia. Inoltre, lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche per le malattie psichiatriche legate all'ansia può anche essere potenzialmente supportato.
Topi Nex-Cre maschi di 2-6 mesi sono utilizzati per esprimere ChR2 specificamente nei neuroni piramidali all'interno della regione IL del mPFC41. I topi Nex-Cre hanno uno sfondo C57Bl/6 ed esprimono l'enzima Cre-ricombinazione specificamente nei neuroni piramidali. Durante un intervento stereotattico, il doppio ChR2-DNA viene iniettato nella regione IL tramite vettori virali associati a adeno. L'impianto ottico è posizionato direttamente sopra la regione di interesse (Figura 1B) e l'impianto è fissato con cemento dentale. Gli animali di controllo ricevono un'iniezione di tdTomato-DNA a doppia floxed nella stessa regione per simulare l'espressione specifica delle cellule.
Gli animali sono alloggiati in gruppo fino al giorno dell'intervento chirurgico e successivamente sono alloggiati in modo singolo per evitare lesioni da altri topi. I topi sono alloggiati in singoli rack di gabbia ventilata (IVC) in gabbie TypI-L per topi singoli alloggiati. Il ciclo chiaro-scuro segue un ritmo di 12:12 h, la fase di luce a partire dalle 10:00. Tutti gli esperimenti comportamentali vengono eseguiti nella fase oscura, che assomiglia alla fase attiva dei roditori. Acqua e pellet di cibo standard sono disponibili al libitum. Dopo due settimane di recupero, che assicura un'espressione sufficiente di ChR2 nei neuroni piramidali, i topi vengono utilizzati per esperimenti comportamentali.
L'Open Field (OF) è un labirinto quadrato di 50 cm x 50 cm con pareti alte 40 cm. Il terreno è diviso in 16 quadrati dove il 4 interno rappresenta il centro. Il comportamento misurato è: 1) tempo trascorso al centro, 2) numero di voci centrale e 3) distanza totale spostata. Durante questo esperimento, ci sono 4 prove per un totale di 20 minuti. Nelle prove 1 e 3, non si verifica alcuna stimolazione della luce e nelle prove 2 e 4 viene eseguita una stimolazione a 20 Hz con impulso di luce di 5 ms e un'intensità di luce di 1 mW di 473 nm (Figura 2A). Nelle prove successive, è stata presa in considerazione l'assu stesse assu stesse esodimento dell'area di prova, ma l'uso di animali di controllo finti indica come viene espressa l'assuno.
Il Labirinto barnes è un esperimento per l'apprendimento e la memoria. Si tratta di una piattaforma circolare di 92 cm di diametro e contiene 20 fori equidibili intorno alla circonferenza. 19 dei fori sono chiusi e sotto un foro viene presentata una scatola di fuga. Per 4 giorni consecutivi, i topi hanno 4 prove di formazione per imparare la posizione della scatola di fuga. Il quintogiorno, la scatola di fuga viene rimossa e i topi vengono testati su quanto tempo hanno bisogno per trovare il foro corretto. Il comportamento misurato è: 1) Tempo fino a quando non viene trovata la casella di fuga/foro corretto, 2) Numero di visite e errori di destinazione e 3) Distanza spostata fino a quando nella casella di fuga. La stimolazione leggera in diversi gruppi viene eseguita durante l'acquisizione o il consolidamento, che si svolgono nei giorni di allenamento 1-4, o durante il recupero il giorno di test, che è il giorno 5 (Figura 2D).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61023/61023fig2v2.jpg"> Figura 2: Esperimenti comportamentali con protocolli optogenetici. Oggetto T:System.Drawing.Drawing2D.Drawing2D4D.A4 per il metodo F:System.Windows.Data.Data. C) Disegno schematico dell'esperimento Elevated-Plus Maze con il protocollo di stimolazione della luce corrispondente. D) Disegno schematico dell'esperimento Barnes Maze con il corrispondente protocollo di stimolazione della luce. EPM: Labirinto Elevato-Plus; OF: Campo aperto; BM: Barnes Maze Test. Questa cifra è stata modificata da Berg 201948. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61023/61023fig2v2large.jpg" target="_blank">Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Per la stimolazione optogenetica, l'intensità e la frequenza della luce devono essere adattate allo strumento optogenetico e al tipo neuronale in esame. La più bassa intensità di luce possibile deve essere utilizzata per evitare danni al tessuto, come diversi studi hanno dimostrato che ci sono possibili effetti di riscaldamento a causa della forte intensitàdella luce 8,20. Per ChR2, una stimolazione a 20 Hz con un impulso di luce di 5 ms è comunemente utilizzata2. Poiché ChR2 è abbastanza sensibile alla luce, l'intensità della luce di 1 mW è sufficiente. Il protocollo di stimolazione della luce si alterna tra le prove di luce spenta e su per misurare direttamente i cambiamenti comportamentali. Le condizioni della stanza esterna per gli esperimenti comportamentali dovrebbero rimanere stabili per l'intero gruppo di animali. Condizioni importanti da considerare sono il rumore (tenere a mente che i dispositivi stessi potrebbero fare rumore), l'odore (pulire sempre le configurazioni comportamentali con l'etanolo), l'intensità della luce e lo sperimentatore. Lo sperimentatore deve essere sempre la stessa persona. Inoltre, l'ora del giorno degli esperimenti dovrebbe essere la stessa per tutti gli animali in un gruppo, poche ore dopo l'inizio della fase oscura nella struttura è preferito.
L'obiettivo di questo esperimento è quello di aumentare il rapporto eccitazione/inibizione (E/I) nella regione IL attraverso una forte attivazione di neuroni piramidali eccitatori. Un rapporto E/I migliorato in questa regione speciale della corteccia è noto per aumentare i livelli di ansia nei topi40,42,43,44.

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			<td>Ketamin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K2753-64</td>
			<td>Anestasia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 % Glucose</td>
			<td>AlleMan Pharma</td>
			<td></td>
			<td>Injection s.c. for fast recovery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Behavioral mazes</td>
			<td>Costum made</td>
			<td></td>
			<td>Measure anxiety</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bepanthen</td>
			<td>Bayer</td>
			<td></td>
			<td>Ophthalmic oinment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betaisodona</td>
			<td>Monodipharma</td>
			<td></td>
			<td>Sterilant containing iodine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betaisodona</td>
			<td>Monodipharma</td>
			<td></td>
			<td>Iodine oinment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ52, 110AL0.62x WD160</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic ferrules</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CFLC230-10</td>
			<td>Implant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic Fiber Scribe</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CSW12.5</td>
			<td>Cutting of the glass fiber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Channelrhodopsin2-YFP virus</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>Addgene 20298</td>
			<td>Optogenetic tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed air</td>
			<td>Kontakt Chemie</td>
			<td>Druckluft 67</td>
			<td>Drying of the skull</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coordinate system</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td></td>
			<td>Stereotactic coordinates for the surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Correl Draw</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Graphical software version 13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryoslicer</td>
			<td>MICROM</td>
			<td>HM500OM</td>
			<td>Production of brain slices for staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethovision XT 14</td>
			<td>Noldus</td>
			<td></td>
			<td>Software for behavioral tracking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Statistical Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferrule Polishing Puck</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>D50-F</td>
			<td>Polishing implants round side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Patch Cord dual</td>
			<td>Prizmatix</td>
			<td>Optogenetics-Fiber 500, 1,20 m, Ferrule core 1,25 mm</td>
			<td>Cables, which are connected with the two implants of a bilateral implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Patch Cord single</td>
			<td>Prizmatix</td>
			<td>Optogenetics-Fiber 500, 1,20 m, Ferrule core 1,25 mm</td>
			<td>Cable, which is connected with the implant via a sleeve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Stripping Tool</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>T06S13</td>
			<td>Stripping glass fiber for implant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>VWR European</td>
			<td>516-0300</td>
			<td>Cut into pieces for the Novelty-Suppressed Feeding test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food pellets</td>
			<td>M&#252;hle Levers</td>
			<td>H&#246;veler Nagerfutter</td>
			<td>Nutrition for the mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipettes</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>GC150-10</td>
			<td>Injection pipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gradia direct-Flo</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>103322</td>
			<td>Fluid dental cementum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating lamp</td>
			<td>efbe-Schott/Phillips</td>
			<td>R95E</td>
			<td>Prevent the mice from cooling after the surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating plate</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td></td>
			<td>Integrated into coordinate system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection canula</td>
			<td>Braun</td>
			<td>100 Sterican, 0,4 x 20 mm, Gr. 20</td>
			<td>All injections and to bore hole into the skull</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Litter</td>
			<td></td>
			<td>T 1350</td>
			<td>Grounding for the Novelty-Supressed Feeding test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse cages</td>
			<td>Zoonlab</td>
			<td>405 cm^2</td>
			<td>Single housing for experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optibond FL</td>
			<td>Kerr</td>
			<td>26684E</td>
			<td>Preparation of the skull for implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical glass fiber</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FT200EMT</td>
			<td>Light fiber for implant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optogenetics-LED.STSI</td>
			<td>Prizmatix</td>
			<td></td>
			<td>Optogenetic toolbox for light stimulation during behavioral experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>16005-1KG-R</td>
			<td>Perfusion of mice to remove the brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polishing sheet 0.02 &#181;m grit</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LFCF</td>
			<td>Polishing implants round side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polishing sheet 1 &#181;m grit</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LF1D</td>
			<td>Polishing implants round side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polishing sheet 30 &#181;m grit</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LF30D</td>
			<td>Polishing implants round side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polishing sheet 6 &#181;m grit</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LF6D</td>
			<td>Polishing implants round side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulser Software</td>
			<td>Prizmatix</td>
			<td></td>
			<td>Software for light device control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rimadyl-Carprofen</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td></td>
			<td>Analgesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma Plot</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Software for statistics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sleeve</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FT200EMT</td>
			<td>Connection of implant and light cable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SodiumCloride (NaCl)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>3570410</td>
			<td>Rinsing of the skull</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superglue</td>
			<td>Pattex Henkel</td>
			<td></td>
			<td>To Fix the glass fiber in the ferrule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>td-Tomato virus</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>Addgene 51503</td>
			<td>Optogenetic tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV light</td>
			<td>KoQGHJ</td>
			<td>wireless, 1200 mW/cm^2</td>
			<td>Polymeration lamp for dental cementum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylavet-Xylazin</td>
			<td>cp pharma</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optogenetic manipulation of neuronal activity to modulate behavior in freely moving mice

La modulazione optogenetica dei circuiti neuronali nei topi in movimento libero influisce sul comportamento acuto e a lungo termine. Questo metodo è in grado di eseguire manipolazioni di singoli neuroni e rilascio del trasmettitore specifico della regione, fino a interi circuiti neuronali nel sistema nervoso centrale, e consente la misurazione diretta dei risultati comportamentali. I neuroni esprimono strumenti optogenetici attraverso un'iniezione di vettori virali che trasportano il DNA preferito, come Channelrhodopsin2 (ChR2). La luce viene portata in specifiche regioni cerebrali tramite impianti ottici cronici che terminano direttamente sopra la regione di destinazione. Dopo due settimane di recupero e corretta espressione-strumento, i topi possono essere ripetutamente utilizzati per test comportamentali con stimolazione optogenetica dei neuroni di interesse.
La modulazione optogenetica ha un'alta risoluzione temporale e spaziale che può essere eseguita con un'elevata specificità cellulare, rispetto ai metodi comunemente utilizzati come la stimolazione chimica o elettrica. La luce non danneggia il tessuto neuronale e può quindi essere utilizzata per esperimenti a lungo termine e per più esperimenti comportamentali in un topo. Le possibilità di strumenti optogenetici sono quasi illimitate e consentono l'attivazione o il silenziamento di interi neuroni, o anche la manipolazione di un tipo di recettore specifico dalla luce.
I risultati di tali esperimenti comportamentali con stimolazione optogenetica integrata visualizza direttamente i cambiamenti nel comportamento causati dalla manipolazione. Il comportamento dello stesso animale senza stimolazione leggera come base è un buon controllo per i cambiamenti indotti. Questo permette una panoramica dettagliata dei tipi neuronali o sistemi di neurotrasmettitori coinvolti in comportamenti specifici, come l'ansia. La plasticità delle reti neuronali può anche essere studiata in grande dettaglio attraverso la stimolazione a lungo termine o le osservazioni comportamentali dopo la stimolazione ottica. L'optogenetica aiuterà a illuminare la segnalazione neuronale in diversi tipi di malattie neurologiche.

Lo scopo di questo protocollo è quello di misurare i cambiamenti nel comportamento dei topi geneticamente modificati durante un esperimento optogenetico. La manipolazione optogenetica viene eseguita per iniezione di un vettore virale associato a adeno. La stimolazione della luce nei topi in movimento libero è possibile attraverso l'impianto di una fibra luminosa direttamente sopra la regione di interesse.
Nella Figura 4vengono presentati i risultati di un esperimento optogenetico. Una forte attivazione di neuroni piramidali eccitatori nella regione IL tramite ChR2 ha aumentato il comportamento legato all'ansia nel campo aperto. ChR2 è stato iniettato nella regione IL del mPFC nei topi Nex-Cre per l'espressione nei neuroni piramidali (Figura 4A). Durante due test di ansia, il campo aperto (Figura 4B,C) e il test di alimentazione soppressa novità (Figura 4F,G), ChR2 viene stimolato con la luce blu e attiva i neuroni piramidali. Come controllo, un altro gruppo di topi ha ricevuto un'iniezione del fluoroforo tdTomato invece di ChR2(Figura 4D,G). In tale esperimento, l'ansia è definita come evitare l'area centrale più luminosa. I topi mostrano un'elusione intrinseca delle aree aperte perché sono ansiosi di predatori.
Nell'esperimento Open Field, illustrato nella Figura 4B, i mouse hanno eseguito 4 prove di 5 minuti ciascuna. Nelle prove 1 e 3 non si è verificata alcuna stimolazione della luce (Off1,2) e nelle prove 2 e 4, è stata eseguita una stimolazione della luce blu con 20 Hz (5 ms impulso di luce) e intensità di 1 mW (On1,2). Le mappe di calore mostrano che, nel gruppo sperimentale, la durata del centro differiva tra le prove Off e On. Durante la stimolazione della luce, i topi rimangono preferibilmente nella zona di confine. Gli animali di controllo preferiscono anche il bordo, ma non cambiano il loro comportamento sulla stimolazione della luce. Nella Figura 4C, le principali misurazioni comportamentali durante l'esperimento Open Field sono mostrate per il gruppo sperimentale. Se i dati hanno superato il test Shapiro-Wilk per la normalità, le statistiche sono state fatte con un test t a due code indipendente. Se il test di normalità non è riuscito, il test Mann-Whitney-Rank Sum è stato utilizzato come alternativa non parametrica. Per questi tipi di esperimenti, è stato scelto un confronto all'interno del gruppo per studiare se la stimolazione della luce può cambiare direttamente il comportamento di ansia nel tempo, indipendentemente dall'ansia di base degli animali sperimentali e di controllo. La durata del centro è diminuita in modo significativo durante entrambe le prove di stimolazione della luce, indicando un aumento dei livelli di ansia. La distanza totale spostata non è stata alterata, dimostrando che il comportamento del locomotore non è stato influenzato. Il numero di voci del centro è stato aumentato, anche se non in modo significativo. Nella Figura 4D, vengono visualizzati i dati del gruppo di controllo. Gli animali di controllo non hanno mostrato alcun cambiamento comportamentale tra le prove Off e On in nessuno dei parametri analizzati, dimostrando che la stimolazione della luce o l'impianto non ha causato gli effetti osservati. In sintesi, questo test mostra una maggiore ansia durante la stimolazione della luce dei neuroni piramidali IL tramite ChR2.
Nella Figura 5, i dati di un esperimento optogenetico non riuscito vengono visualizzati per il labirinto Elevated-Plus. Durante l'esperimento Elevated-Plus Maze, presentato nella Figura 5A, i topi hanno completato 6 prove di 3 minuti ciascuna. Nelle prove 1, 3 e 5 non è stata eseguita alcuna stimolazione della luce (Off1, Off2, Off3) e nelle prove 2, 4 e 6, è stata eseguita la stimolazione della luce blu con 20 Hz (5 ms impulso di luce) e 1 mW di intensità (On1, On2, On3). In questi risultati esemplari, la lunghezza del protocollo optogenetico e la costruzione del labirinto stesso non erano adatte alla linea del topo transgenico. In Figura 5B, si può vedere, che diversi topi scivolato fuori dal labirinto con le zampe della schiena o addirittura caduto. Quando questo è accaduto, i topi hanno avuto una seconda possibilità di eseguire l'EPM un giorno dopo. Se sono caduti di nuovo, sono stati esclusi dall'analisi. Quando i topi sono scivolati via più volte, ma sono riusciti a rimanere nel labirinto, i dati sono stati analizzati normalmente. Tuttavia, i dati devono essere interpretati con molta attenzione e gli animali di controllo hanno maggiore importanza. I topi Nex-Cre avevano difficoltà motorie a rimanere a braccia aperte. Per evitare questo, piccole pareti, con un'altezza di 1 cm, avrebbero aiutato per una presa sicura delle zampe di schiena sulle braccia del labirinto. Sia le mappe di calore che i grafici mostrano che i topi sperimentali, così come i topi di controllo, hanno iniziato ad evitare le braccia aperte dalla prova 2 (On1) su (Figura 5C-E). Il tempo a braccia aperte è significativamente diminuito per entrambi i gruppi, così come le voci del braccio aperto. L'analisi del gruppo sperimentale ha ottenuto solo dati che implicano un grande effetto ansiogenico della stimolazione della luce, poiché il tempo sul braccio aperto e le voci del braccio aperto sono significativamente diminuiti durante lo studio On1. Tuttavia, quando si confrontano questi dati con il gruppo di controllo, che mostrano lo stesso comportamento, diventa chiaro che il comportamento osservato non è mediato dalla stimolazione optogenetica, ma per evitare le braccia aperte in generale a causa dell'assuolazione al labirinto. Questi dati sottolineano l'importanza di un gruppo di controllo adeguato per distinguere tra effetti comportamentali mediati dalla stimolazione optogenetica e un possibile adattamento comportamentale. Inoltre, questi dati fanno luce sull'importanza di adattare correttamente un setup sperimentale per soddisfare la linea di mousse specifica e la domanda sperimentale.
Per convalidare e rafforzare i dati comportamentali raccolti, i cervelli dei topi vengono rimossi dopo l'ultimo esperimento per controllare la corretta iniezione e impianto (Figura 6). I cervelli sono fissati in paraformaldeide del 4% e rimossi dal cranio. I cervelli sono disidratati nel 30% di saccarosio per 1-2 giorni e criosliced in seguito. Le fette cerebrali coronali spesse 40 m vengono lavate e montate su scivoli oggettivi superfrost con un mezzo di montaggio contenente DAPI, che macchia i nuclei cellulari. Ciò consente l'identificazione delle aree di destinazione nelle sezioni coronali. La fluorescenza del tag YFP o tdTomato indica la posizione dell'iniezione di virus. Nella Figura 6B sono presentati i siti di iniezione esemplari di ChR2-YFP a sinistra (giallo) e tdTomato a destra (rosso). Con l'aiuto di un modello, adattato dall'atlante del cervello dei topi Paxinos e Franklin45, è possibile identificare la regione IL. In entrambe le diapositive, lo strumento optogenetico è espresso nella regione IL, ma anche nelle regioni cerebrali adiacenti. Per una corretta interpretazione, la diffusione della luce blu nel tessuto cerebrale èconsultata 8 (Figura 1D,E). Si può vedere che la luce blu raggiungerà la regione DP al di sotto dell'IL con solo meno del 5% dell'intensità iniziale di 1 mW alla punta della fibra (linea blu nella figura 1D)8. Inoltre, una piccola quantità di luce può andare verso l'alto verso la regione PrL a causa di back-scattering47. Di conseguenza si può dire che la regione IL è illuminata più fortemente, tuttavia anche le regioni adiacenti come la regione DP e PrL possono essere leggermente stimolate. Pertanto, la stimolazione specifica delle cellule IL non è garantita e deve essere eseguita un'analisi immunostochimica delle regioni adiacenti, per vedere se l'attività delle cellule PrL e DP è modulata tramite la luce. Nella Figura 6Cè illustrato un altro importante controllo: la specificità della linea del mouse Nex-Cre. Attraverso la colorazione anticorpale contro i due tipi di cellule nella regione IL, neuroni principio glutatergico e interneuroni GABAergici, si può vedere, che l'espressione ChR2-YFP si verifica solo nei neuroni glutatergici e non con quelli GABAergici.
Tutto in tutto, i nostri esperimenti mostrano che con la manipolazione optogenetica durante i test comportamentali, si potrebbero osservare cambiamenti nel comportamento legato all'ansia. Utilizzando più di un test per lo stesso comportamento, è possibile trarre una conclusione affidabile. Inoltre, l'analisi immunostochimica conferma i dati ottenuti. I nostri esperimenti suggeriscono, che l'attivazione specifica dei neuroni piramidali nella corteccia infralimbica ha aumentato il comportamento correlato all'ansia in alcuni saggi.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61023/61023fig04v4.jpg"> Figura 4: Attivazione optogenetica dei neuroni piramidali IL aumenta il comportamento di ansia. Stimolazione della luce durante gli esperimenti: 473 nm, 1 mW, 20 Hz stimolazione. Oggetto T:System.Windows.Media.Media3D.Media3D.IsDTomato da aggiungere all'oggetto T:System.Windows.Media.Media3D.Is Durante l'esperimento, i neuroni piramidali nella regione IL del mPFC vengono attivati da ChR2. Fette di cervello saggita adattate dall'atlante del cervello del topo Paxinos e Franklin, saggital: lateral o,6. B) Labirinto Open Field con protocollo di stimolazione della luce (20 min con 4x5 min alternati Off e On prove; sinistra) e mappe termiche di esemplari ChR2-iniettati (EXP) e tdTomato-iniettato (CT) topi in tutte e 4 le prove dell'esperimento (a destra). Gli animali EXP trascorrono meno tempo al centro dell'OF quando stimolati con luce laser blu. Per gli animali TC, il tempo trascorso al centro non differisce tra le prove di luce Off e On. C) Dati di gruppo per gli animali EXP nell'OF, n.11. I topi trascorrono molto meno tempo al centro dell'OF quando stimolati con la luce blu (Off1 39.49±6.9 s, Su 19.87±4.47 s, Off2 28.13±8.55 s, On2 23.42±9.32 s, Off1:On1, t-test, p - 0.033, Off1:On2, MWRS, p-0,049, La distanza spostata non è interessata (Off1 2703.09±292,65 cm, On1 3113.4±491,15 cm, Off2 3331.86 ±482,62 cm, On2 3082.17±658,61 cm). Le voci di centro diminuiscono con il tempo, ma non mostrano differenze significative (Off 1 22±3,78, On1 18.45±3.95, Off2 17.36±1.99, On2 13.27±2.64). D) Dati di gruppo per gli animali TC nell'OF, n. 15. Tempo topi trascorrere al centro del OF, la distanza spostata, il numero di voci di centro non cambia tra le prove di luce On e Off (Tempo al centro Off116.73±2,65 s, On1 16.02±1.89 s, Off2 12.02±1.76 s, On2 13.04±2.58 s; Distanza Off1 3399.69±296,77 cm, On1 3210.6±446,9 cm, Off2 3030.28±513,83 cm, On2 2955±617,7 cm; Numero di voci del centro Off1 14.2±1.98, On1 13.6±2.02, Off2 10.8±1.88, On2 11.67±2.5). I topi TC mostrano un'ansia di base significativamente più elevata (Off1 EXP:CT, MWRS, p.0.005, . I valori sono ±S.E.M. - indicano differenze significative (p≤0,05), indicano differenze significative (p≤0.01). test t sempre a due code, MWRS: Mann-Whitney Rank Sum test; IL: corteccia infralimobica; BLA: amigdala basolaterale; DRN: nuclei di raphe dorsali; OF: Campo aperto; CT: animali di controllo; EXP: animale sperimentale; L: luce. Questa cifra è stata modificata da Berg et al. 2019, PLoS One43 e da Berg 201948. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61023/61023fig04large.jpg" target="_blank">Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61023/61023fig5v4.jpg"> Figura 5: Esperimento EPM non è riuscito a mostrare gli effetti comportamentali nei topi Nex-Cre. Stimolazione della luce durante gli esperimenti: 473 nm, 1 mW, 20 Hz stimolazione. A) Labirinto Elevated-Plus con protocollo di stimolazione della luce (18 min, 6x3 min, alternando off e On prove). B) I dati di gruppo per i topi che "scivolano" sono inclusi nei dati, totale n. 23. I topi Nex-Cre avevano la tendenza a scivolare via dal braccio aperto con le zampe della schiena, indipendentemente dal gruppo sperimentale (a sinistra). Solo i topi che sono rimasti nel labirinto per tutte e 6 le prove sono stati considerati nelle analisi successive. Slip off nella prima fase Off1 sono motivo per evitare successivamente le braccia aperte (Off1 EXP 1.63±0.6, CT 2.2±0.79, Off2, 3 EXP 0.125±0.125, CT 0±0, On1,2,3 EXP 0.625±0.26, CT 0.1±0.1). Il grafico a torta (a destra) mostra i topi che cadono dal labirinto durante il 18 min con il 42,42%. Solo il 57,57% ha terminato l'esperimento. C) Mappe termiche di topi esemplari EXP e CT in tutte e 6 le prove dell'esperimento. Entrambi i gruppi mostrano una diminuzione della durata del braccio aperto dopo la prova Off1. D) Dati di gruppo per gli animali EXP nell'EPM, n.12. Il tempo trascorso a braccia aperte è diminuito in modo significativo durante le prime due prove e costantemente in seguito (Off1 73±12,22 s, On1 36.15±14.65 s, Off2 15.61±6.23 s, On2 19.49±7.51 s, Off3 9.36±4.44 s, On3 7.96±3.47 s. Off1:On1, t-test, p'0,041, .). La distanza spostata non è interessata (Off1 679.96±71,63 cm, On1 712.24±112,82 cm, Off2 717.49±97,39 cm, On2 782.51±81,11 cm, Off3 722.11±68,60 cm, On3 663.90±106,57 cm). La quantità di movimenti di braccio aperto diminuisce in modo significativo da Off1 a On1 e quindi rimane costante (Off1 8.08±1.08, Su 1 3.33±0.76, Off2 2.16±0.69, On2 2.91±1.09, Off3 1.73±0.75, On3 1.73±0.66. Off1:On1, t-test, p-0.002, . Il tempo trascorso al centro dell'EPM diminuisce lungo le prove, ma non mostra alcuna differenza significativa da Off a On trial (Off1 41.71±5.34 s, Su 1 31.2±4.59 s, Off2 19.8±3.44 s, On2 24.49±3.38 s, Off3 20.37±4.77 s, On3 18.85±4.07 s). E) Dati di gruppo per gli animali TC nell'EPM, n.11. I dati CT mostrano le stesse diminuzioni significative dei dati EXP, indicando che l'esperimento non ha funzionato correttamente (Tempo a braccia aperte Off1 86.92±12,74 s, On1 33.78±14.38 s, Off2 18.01±11.61 s, On2 16.41±9.61 s, Off3 11.36±4.01 s, On3 5.43±2.07 s. Off1:On1, MWRS, p Distanza Off1 705.11±88,36 cm, On1 789.45±77,53 cm, Off2 724.74±80.49 cm, On2 676.57±111,99 cm, Off3 716.99±132,47 cm, On3 663.03±132,46 cm; Aprire le voci di braccio Off1 7.09±1, On1 3.72±1.17, Off2 1.45±0.47, On2 1.36±0.58, Off3 0.91±0.43, Off3 1.64±0.59. Off1:On1, MWRS, p-0.01, Tempo trascorso nel centro Off1 35.89 s, Su 1 29.25±3.96 s, Off2 22.17±3.58 s, On2 15.9±2.57 s, Off3 13.86±4.2 s, On3 16.89±5.75 s). I valori sono ± S.E.M. - indicano differenze significative (p≤0,05), indicano differenze significative (p≤0,01). t-test è sempre a due code, MWRS: Mann-Whitney Rank Sum test; EPM: Labirinto Elevato-Plus; CT: animali di controllo; EXP: animale sperimentale; OA: braccia aperte. Questa cifra è stata modificata da Berg et al. 2019, PLoS One43 e da Berg 201948. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61023/61023fig05large.jpg" target="_blank">Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61023/61023fig06.jpg"> Figura 6: Lato di iniezione di ChR2 e tdTomato nella specificità IL e Nex-Cre. A) Disegno schematico del sito di impianto su fette cerebrali coronali a AP : 1,66 mm, mL 0,3 mm, DV -1,8 mm, con iniezione unilaterale e impianto (adattato dall'atlante cerebrale del topo, Paxinos e Franklin, Bregma 1,54 mm). B) Siti di iniezione esemplari di ChR2-YFP (sinistra, giallo) e tdTomato (destra, rosso) fusi con i nuclei delle cellule macchiate DAPI (blu) nei topi Nex-Cre. Barra di scala 1 mm. Gli inset mostrano un elevato ingrandimento dell'area IL. Barra della scala 150 m. Le caselle bianche indicano la posizione degliinset. C) Riga superiore: immagini confocali della regione IL sinistra di un topo Nex-Cre macchiato con CamKII come marcatore per i neuroni glutamatorgici (blu) e ChR2-YFP (giallo) o Gad67 come marcatore per i neuroni GABAergic (verde), di un topo Nex-Cre. Riga inferiore: colocalizzazione di ChR2-YFP (giallo) con CamKII (sinistra, blu), ma non con Gad67 (destra, verde), che mostra specificità dei topi Nex-Cre per i neuroni glutamatogici. Barra di scala 50 m. PrL: corteccia prelimbica; IL: corteccia infralimobica; DP: corteccia peduncolare dorsale. Questa cifra è stata modificata da Berg et al. 2019, PLoS One43 e da Berg 201948. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61023/61023fig06large.jpg" target="_blank">Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity to Modulate Behavior in Freely Moving Mice

Con la manipolazione optogenetica di specifiche popolazioni neuronali o regioni cerebrali, il comportamento può essere modificato con alta risoluzione temporale e spaziale in animali in movimento libero. Utilizzando diversi strumenti optogenetici in combinazione con fibre ottiche cronicamente impiantate, è possibile eseguire una varietà di modulazioni neuronali e test comportamentali.

Manipolazione optogenetica dell'attività neuronale per modulare il comportamento nei topi in movimento libero

Optogenetic modulation of neuronal circuits in freely moving mice affects acute and long-term behavior. This method is able to perform manipulations of ...

Con la manipolazione optogenetica di specifiche popolazioni neuronali o regioni cerebrali, il comportamento può essere modificato con un'alta risoluzione temporale e spaziale negli animali che si muovono liberamente. Utilizzando diversi strumenti optogenetici in combinazione con fibre ottiche impiantate cronicamente, è possibile eseguire una varietà di modulazioni neuronali e test comportamentali. L'obiettivo finale dell'optogenetica è la modulazione dei circuiti neuronali ad alta risoluzione temporale e spaziale nell'animale che si comporta.A differenza delle manipolazioni farmacologiche o elettriche, l'optogenetica consente il controllo preciso di specifici tipi di cellule sui circuiti neuronali. L'optogenetica è il modo perfetto per indirizzare specifici tipi di cellule in una regione appositamente definita durante il comportamento e per esaminare l'effetto diretto dei cambiamenti in tali microcircuiti. Ora presenteremo un passo per guidare come preparare e piantare e condurre l'optogenetica in un topo che si muove liberamente.Per la preparazione dell'impianto ottico, posizionare un lato piatto ferrule in ceramica in una morsa da banco. Strisciare il codice di una fibra di vetro di 200 micrometri di diametro, con uno strumento di stripping della fibra e tagliare da due a tre centimetri non pezzi con uno scriba in fibra ceramica. Posizionare il pezzo di fibra di vetro nel ferrule ceramico, quindi posizionare una goccia una supercolla sul lato piatto con un cannoulare di iniezione.Sul lato rotondo del ferrule ceramico, tagliare la fibra di vetro il più corta possibile e posizionare il preimpianto su un disco di lucidatura ferrule per lucidare il lato rotondo su quattro diverse carte di pubblicazione. Successivamente, tagliare la fibra di vetro sul lato piatto del ferrule ceramico, alla lunghezza necessaria per l'impianto. Usa un atlante cerebrale del topo per calcolare la lunghezza dell'impianto.L'impianto deve terminare direttamente al di sopra della regione di interesse. Prima dell'impianto, viene applicata l'anestesia. La tecnica precisa ed estetica è descritta nel manoscritto.Quando il mouse raggiunge uno stato profondo di anestesia, posizionarlo su una piastra riscaldante e fissare la testa in un telaio stereotattico. Fissare il naso e i denti nella parte anteriore e le orecchie su entrambi i lati. Applicare un'algesia con un cuprofene subcuntaneamente nella parte posteriore del mouse e applicare un unguento opaco sugli occhi su entrambi gli occhi per proteggerli dall'asciugatura.Inumidire i capelli sul cuoio capelluto con un tovagliolo di carta bagnato e quindi tagliarlo con le forbici. Assicurarsi di rimuovere tutti i capelli sciolti con un tovagliolo di carta bagnato. Utilizzare un bastoncino di cotone per disinfettare il cuoio capelluto con una tintura contenente iodio.Sollevare il cuoio capelluto sulla regione di interesse con una pinzetta e tagliare un centimetro lungo la linea mediana. Per irrogitare il cranio per l'impianto, applicare una piccola quantità di acido fosforico sulla cicatrice e lasciarlo avere effetto per 15 secondi. Rimuovere tutto l'acido con un bastoncino di cotone e sciacquare due volte la cicatrice con cloruro di sodio.Per una corretta iniezione, calcolare il fattore F per le singole coordinate. Posizionare un cannolare di vetro nella cornice stereoctatica e localizzarlo direttamente sopra il bregma. Ora azzerare il sistema di coordinate e spostare la cannula di vetro su Lambda.Calcolare il fattore F con la formula seguente. Bregma meno Lambda diviso per 4,2 è uguale al fattore F. Le coordinate esatte sono molto importanti per l'iniezione e l'impianto perché altrimenti, se viene stimolata la struttura sbagliata, gli effetti comportamentali non sono specifici.Tutti i topi hanno deviazioni minime nella dimensione del cranio, quindi il coefficiente è assolutamente obbligatorio. Utilizzare le coordinate regolate per trovare la posizione sulla cicatrice direttamente sopra la struttura di interesse. Utilizzare una cannula di iniezione per praticare un foro nel cranio, ruotando la cannula sul posto.Per prendere una soluzione virale nella cannula di vetro collegata alla siringa, posizionare una goccia di cloruro di sodio sul cranio e un pezzo di pirofene sopra. Posizionare una goccia di due soluzione di virus microliter sul pirofene e abbassare la punta della cannula di vetro nel virus. Applicare la pressione negativa e attendere che la soluzione virale sia adottata dalla cannula.Zero a quella coordinata quando la punta del virus con cannula è a livello del cranio e lentamente abbassarla nel foro di trivellazione nella posizione più bassa del lato di iniezione. Applicare una piccola quantità di pressione positiva con la siringa fino a quando il menisco non viene abbassato. Lasciare che il virus si diffonda per due o tre minuti prima di spostare la cannula di vetro verso l'alto nella posizione successiva.Rimuovere la cannula di vetro molto lentamente e scartarla dopo l'iniezione finale. Ora prepara il cranio per l'impianto. Asciugare il cranio con aria compressa, applicare il primer con questo bastoncino corrispondente e lasciarlo asciugare per 15 secondi.Applicare il legame con lo stesso bastoncino e polimerirlo per 20 secondi con luce UV. Posizionare l'impianto nel supporto corrispondente e posizionare la punta della fibra di vetro direttamente sopra il foro di trivellazione e abbassarla con attenzione. Interrompere l'abbassamento dell'impianto quando la valvola rimanente della supercolla tocca il cranio.L'impianto di fibre ottiche può anche essere fatto per strutture bilaterali come l'ippocampo. Ciò consente una leggera stimolazione in entrambi gli emisferi contemporaneamente o consente la stimolazione di due strutture diverse. È anche possibile iniettare il virus in una posizione diversa dall'impianto in fibra ottica.Se l'iniezione e l'impianto vengono eseguiti in diverse regioni, praticare tutti i fori necessari dopo aver applicato acido fosforico ma prima dell'adesione dei due componenti. Controllare di nuovo se il cranio è ancora completamente asciutto, quindi applicare cemento dentale fluido intorno all'impianto e nell'area circostante quindi curare per 20 secondi con luce UV Applicare altri due cemento minori in un'area del cranio completamente priva di pelliccia e essiccata. Curare ogni strato con la luce UV.Per completare l'intervento chirurgico applicare l'unguento allo iodio su tutta la ferita. Rilasciare il naso e la fissazione dell'orecchio, portare il mouse in una gabbia fresca e posizionarlo sotto una lampada riscaldante per evitare la perdita di calore corporeo. Controlla il suo stato di salute almeno una volta al giorno e, se necessario, pubblica operativa e algesia dopo tre giorni.Dopo due settimane di recupero, i topi possono essere utilizzati per esperimenti comportamentali. Aprire il software Pulser e selezionare la porta COM USB a cui è collegata la sorgente luminosa. Scegliere la modalità di funzionamento tre per consentire a un software esterno di controllare la sorgente luminosa.Scegli la regolazione corretta per la stimolazione di 20 Hertz con un impulso luminoso di cinque millisecondi. Per individuare la divisione per comunicare con il pulser, premere la sequenza iniziale. Questo stato rimarrà fino al termine degli esperimenti.A questo punto, creare un nuovo esperimento in EthoVision XT, passare al file, scegliere nuovo dal modello e selezionare applica un modello predefinito. Scegli il tracciamento dal vivo e seleziona la fotocamera con la sorgente e conferma la camma Puslar Gen-Eye collegata. Scegli il mouse come animale che dovrebbe essere registrato.Selezionare il modello di arena, il quadrato del campo aperto e il centro del modello di zona, il bordo, gli angoli. Confermare un soggetto che deve essere tracciato e selezionare il punto centrale, il punto del naso e la base della coda. Verificare che il colore animale rispetto allo sfondo sia più scuro e che la frequenza di campionamento consigliata per completare il passaggio.Assegnare all'esperimento il nome appropriato e scegliere una posizione da salvare. Fino a quando non trovi le impostazioni dell'arena, la fotocamera aprirà automaticamente un'immagine di sfondo. Adatta le zone predefinite all'arena reale usando la freccia e i due simboli su di essa è a destra.Se alcune zone non sono necessarie, eliminarle. Premere la scala di disegno per calibrare e mettere una linea da un angolo del labirinto all'altro. Inserisci la lunghezza della distanza reale in centimetri.Ripeterlo per l'altro asse. Per definire le impostazioni del controllo di prova, preparare la regola principale regolando il tempo delle condizioni a 20 minuti. La condizione per Star Trek dovrebbe essere, quando il soggetto è nell'arena per due secondi, per uno stato automatico del tracciamento quando il mouse è nell'arena.Per creare una sottoretità per la stimolazione della luce, vai alle strutture, di più e seleziona la sottoretia. Posizionarlo sotto la regola principale e stendere le due caselle. Vai a condizioni, tempo e dagli un nome come luce su uno, regola le condizioni che si incontra dopo cinque minuti.Posizionare la casella direttamente dietro la casella di inizio della regola della sotto regola. Vai all'hardware personalizzato d'azione e denominalo con la luce su uno. Selezionare l'azione da eseguire come:Ne metterò uno alto.Posizionare la scatola direttamente dietro la casella delle condizioni. Ripetere i passaggi per programmare la luce su in luce. Ora vai alle strutture, sottoreti di riferimento e controlla che il riferimento appartenga alla sotto regola corretta.Scegliere le condizioni di inizio come senza indugio e le condizioni di inizio come eseguite una volta per condizione iniziale. Posizionare la casella di riferimento tra i libri extra uno e i libri delle condizioni due della regola principale. Ora definisci le impostazioni di rilevamento per mostrare al sistema cosa dovrebbe tenere traccia.Posiziona un'miglia di prova nell'arena e seleziona la configurazione automatizzata. Scegli il roditore come tipo animale e usa il cursore del mouse per disegnare una scatola intorno ai topi nell'arena. Conferma i risultati della domanda di cura con sì.Per l'esperimento a campo aperto, portare il mouse sperimentale nella stanza del comportamento proprio prima dell'esperimento per garantire un adeguato livello di ansia. Accoppiare il mouse essere una fessura della sorgente luminosa premendolo delicatamente sulla griglia della gabbia. Mettilo in una gabbia d'attesa con lettiera fresca per 10 minuti per acclimatarlo al cavo leggero.Inizia l'acquisizione premendo il pulsante di arresto e ti per visionare XT. Trasferire il mouse dalla gabbia di attesa nell'angolo superiore sinistro del campo aperto. Lasciare il campo visivo del mouse durante l'esperimento e mantenere la calma. Dopo 20 minuti, al termine dell'esperimento, rimuovere il mouse dal labirinto, scollegare il cavo luminoso e rimetterlo nella propria gabbia.Con una visualizzazione di controllo, le differenze nel tempo centrale tra la luce spenta e la luce sui volti possono essere viste direttamente. Il mouse trascorre meno tempo al centro quando la luce è accende. Per l'esperimento sul labirinto di Barnes, porta tutti i topi sperimentali nella stanza del comportamento circa un'ora prima dell'esperimento.Prepara il labirinto barnes chiudendo tutti i fori tranne uno e ora quale scatola di fuga è posizionata. Collegare un mouse nella sorgente luminosa di entrambi gli impianti e posizionarlo direttamente nel mezzo del labirinto barnes. Premi start e devi visitare la prossima T e rimuovere la scatola di cartone.Preparati a interrompere manualmente la prova nel caso in cui il software non riconosca l'intera transizione. Togliere il mouse dal labirinto e rimuovere il collegamento al cavo luminoso. Quando si esegue, si apprende e si indaga sull'attività di memoria, non solo viene studiato l'effetto immediato della manipolazione, ma anche l'effetto a lungo termine della manipolazione durante l'acquisizione, il consolidamento o il recupero.Per l'analisi dei dati, si trova la condizione di trattamento trattata o controllata, si passa alla nidificazione e si seleziona lo stato del controllo di prova. Scegli l'intervallo di stato dall'azione dell'elemento Star Trek alla luce d'azione dell'elemento che si accende. Posizionare la casella di nidificazione tra il trattamento della scatola del filtro e la casella dei risultati corrispondente.Questo intervallo definito è di uno. Ripetere i passaggi per intervalli su uno dei due e su due come anche per il gruppo di controllo. Definire anche i parametri da analizzare nel profilo di analisi.Scegliere la variabile dipendente nella zona e selezionare il centro della zona, il punto del corpo, il punto centrale e passare alle statistiche di prova. Selezionare la frequenza, la durata cumulativa e lasciare che veda la prima. Aggiungere anche lo spostamento della distanza come variabile.Con questo profilo, sono disponibili i dati per il tempo trascorso al centro, le voci del centro e gli viene detto di spostarsi a distanza. Per estrarre i dati da ogni divisione, passare ai risultati e selezionare statistiche e grafici, premere calcola per visualizzare i dati analizzati. Premere esporta i dati e selezionare le statistiche di valutazione e il percorso da salvare.I dati esportati vengono salvati come file excel e con singoli valori per ogni mouse. Inoltre, vai alla visualizzazione della mappa termica e premi le mappe di calore della trama, seleziona le prove a destra per vedere le singole mappe di calore per ogni mouse e prova. Fai un clic con il pulsante destro del mouse ed esporta le mappe di calore come immagini.Successivamente, aprire il file excel del computer e calcolare la media e gli euro standard SCM per tutte e quattro le prove e ogni gruppo di condizionamento misurato. Per generare grafici e plottaggio Sigma, copiate i mezzi e SCM nell'ordine corretto dal file aggiuntivo al plottaggio Sigma. Le righe devono contenere i dati per uno spento, uno su uno e le colonne contengono trial, mean e SCM hertz.Selezionare tutte e tre le colonne e passare alla creazione di grafici. Selezionare la casella della barra e scegliere una casella non raggruppata con freccia. Etichettare l'intero grafico, andare a casa, selezionare la casella del grafico e premere esporta.Selezionare la cartella di destinazione e scegliere metafile come formato. Per calcolare le statistiche per i dati ottenuti, copiare i dati giusti da Xcel uno contro uno, eccetera, e in singole colonne del plottaggio Sigma. Contrassegnare le colonne da confrontare e passare all'analisi, scegliere Test T e premere Esegui.Infine, i dati comportamentali possono essere mostrati divisi in let off e in prova con una specializzazione aggiuntiva della mappa termica. Nell'esperimento a campo aperto, durante la stimolazione leggera di Channelrhodopsin2 e neuroni piramidali, la durata centrale è diminuita, il che indica un aumento dei livelli di ansia. Attraverso l'immunoistochimica, è possibile determinare il sito di iniezione e l'espressione del virus, anche alla specificità della speciale linea del topo cre-dipendente può essere convalidata.Si può vedere chiaramente che la stimolazione della luce di Channelrhodopsin2 migliora i neuroni mentali di questa specifica regione della corteccia aumenta i livelli di ansia, rispetto all'ansia di base prima di quella stimolazione. Questo effetto immediato della manipolazione sul comportamento è il motivo per cui l'optogenetico viene utilizzato oggi per così tante domande di ricerca sul comportamento. Questa procedura può essere utilizzata per la modulazione optogenetica di qualsiasi tipo di cellula desiderata o circuito neuronale nel cervello del topo.Combinando questa procedura con test comportamentali adatti per la tua ricerca, è possibile ottenere una visione più profonda dei circuiti neuronali coinvolti in comportamenti e malattie di interesse.

Research

JoVE Journal

Behavior

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