Name: optogenetic manipulation of neuronal activity to modulate behavior in freely moving mice
Uploaded: 2020-10-27T12:30:00
Duration: 14 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity to Modulate Behavior in Freely Moving Mice at JoVE.com

Stor takk til Prof Klaus-Armin Narve og Dr. Sandra Goebbels (Max-Plank-Institute of Experimental Medicine, Goettingen, Tyskland) for vennlig å gi Nex-Cre mus. Vi takker også vårt videoteam Yunus Dikici og Ruben Wiesner for opptak og behandling av JoVE-videoen for denne artikkelen. I tillegg, stor takk til Kristin Claussen for hennes voice-over og Kimberly Anne Go for korrekturlesing av manuskriptet.
De presenterte resultatene ble oppnådd ved Ruhr-universitetet i Bochum og videoen ble spilt inn ved Universitetet i Bremen.
Dette arbeidet ble finansiert av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) - Projektnummer 122679504 - SFB 874 og DFG MA 4692/3-2.

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Å bruke lys til å manipulere nevronal signalisering har vært den metoden for valg i nesten ett tiår nå. Siden 2005, antall publiserte artikler om utvikling av nye optogenetic verktøy4,6,8,14,49,50,51 og studier der slike verktøy benyttes til å undersøke hjernen kretser21,23,40,43,52, høyt økt. På den ene siden, med det enorme mangfoldet av injiserbare optogenetiske verktøy, implantasjonsvarianter, transgene muselinjer og atferdseksperimenter, er muligheten for eksperimenter mangfoldig og ubegrenset. På den annen side er muligheten til å gjøre feil ved valg av eksperimentelle forhold svært høy og eksperimentene er så spesifikke, at ofte er sammenlignbarheten med andre studier vanskelig.
Kritiske trinn Et viktig kritisk trinn i denne protokollen er riktig planlegging. Valget av optogenetic verktøyet bør matche det vitenskapelige spørsmålet. Er det bare nødvendig å manipulere den generelle aktiviteten til en nevron eller synapse? Deretter kommersielt gitt verktøy som ChR221,,25,,27 og Arch37 er et godt valg. Men bortsett fra det, hvis en spesiell nevrotransmitter system eller en enkelt reseptor bør manipuleres, en individuell reseptor chimera er ofte bedre valg3,6. Flere reseptor chimeras med GPCRs, den såkalte Opto-XRs, og retningslinjer for å produsere dem er allerede tilgjengelig4,50. Annet enn valg av optogenetiske verktøy, er muselinjen i kombinasjon med atferdseksperimentet også kritisk. Ulike bakgrunnsstammer, som for eksempel C57Bl/6 og BALB/cByJ, viser forskjellige atferdsfenotyper i noen henseender53,,54. C57Bl/6-mus har lav baseline angst og kan brukes til anxiogen manipulasjon, mens BALB/cByJ viser høyere angstnivåer og er derfor mer følsomme for anxiolytiske legemidler. I tillegg kan de transgene variantene av disse bakgrunnsstammene også variere i fenotypen48. Med en riktig kombinasjon av spesifikke arrangører i forbindelse med et optogenetisk verktøy og transgen muselinje, kan nesten alle ønskede cellepopulasjoner målrettes.
Et kritisk skritt under operasjonen er rettet mot riktig plassering. Ved hjelp av musen hjerneatlas, riktige koordinater for fremre-bakre aksen, og mediale-lateral akse, og dybden av strukturen kan etableres45. I virkeligheten har hver hodeskalle en litt annen form og størrelse. Dermed er F-faktor46 for å justere stereotaktiske koordinater ganske viktig, som er riktig nese- og ørefiksering under stereotaktisk kirurgi. Hvis musens hode er vippet, vil injeksjons canulaen ikke klare å målrette mot ønsket interesseområde.
I tillegg er diameteren på injeksjons canula også kritisk. Hvis det er for lite, kan ingen virus slippes ut i vevet, hvis det er for bredt, vil kanulaen lekke virusløsning på vei til interesseområdet. Hvis den implanterte optiske fiberen avsluttes rett over målområdet, spiller virusuttrykket i cortex-områdene ovenfor ingen rolle. Men hvis implantatet er plassert over andre regioner for å stimulere axon terminaler, aksonene i øvre cortex regioner vil også bli aktivert av lys og forfalske innhentet data. Som et eksempel: IL-regionen og den prelimbic (PrL) regionen begge projisere til basal amygdala55,56 menhar helt forskjellige funksjoner og roller i modulering av angst26,57. Hvis implantatet er plassert over amygdala for å aktivere axon terminaler fra IL-regionen, og under injeksjon virusoppløsningen ble også plassert i PrL på grunn av feil injeksjon kanula, risikoen for også å aktivere axon terminaler fra PrL er svært høy.
Under utarbeidelsen av skallen for fiksering av implantatet, er den sparsomme bruken av primer og binding avgjørende for en pålitelig og holdbar fiksering. Hvis 2-komponent vedheftssystemet ikke påføres tynt, kan tannsementen løsne fra skallen etter et par dager eller uker. I tillegg må skallen også tørkes helt før du fikser implantatet, da ellers vil sementen ikke festes riktig til skallen.
Kritiske trinn finnes også i atferdsdelen av denne protokollen. For det første er byggingen av labyrinten svært viktig. I hvert atferdsoppsett finnes det flere varianter i litteraturen om størrelse og form, samt for selve prosedyren58,,59,,60. Det er viktig å velge en variant som gjør dataene sammenlignbare og reproduserbare. Også spesielle krav til brukte muselinjer bør tas i betraktning43,48. I de representative dataene for EPM kan det ses at flere Nex-Cre-mus falt fra labyrinten eller gled av flere ganger (Figur 2b). For disse musene ville en labyrint med en liten vegg rundt de åpne armene ha vært et bedre alternativ.
For det andre er det viktig å holde alle eksterne romforholdkonstante 61, ellers ville forskjellige grupper av mus ikke være sammenlignbare i det hele tatt. I denne forbindelse er det svært viktig å velge tidspunktet for eksperimentet som en hvor det eksperimentelle oppsettet er ledig og eksperimentereren alltid er tilstede. Videre bør hendelser i bygningen, for eksempel byggearbeid, testing av systemer (brannalarm) eller rengjøringsdagen til museanlegget, vurderes for å unngå interferens med de oppnådde dataene.
Til slutt er håndtering og boforhold avgjørende for atferdseksperimenter. Når en implantasjon utføres, må mus være enkelt plassert på grunn av risikoen for skade fra andre mus. For å sikre god sammenligning mellom grupper og en lav feil i én gruppe, må hver mus ha samme burstørrelse og berikelse. For angstrelaterte eksperimenter har enkeltboliger noen fordeler som singe housed mannlige mus viser en lavere baseline angst nivå, mindre variasjon i deres angstnivå, og mindre depressive-lignende symptomer15,16. Gruppehus hannmus kan sterkt variere i angstnivået på grunn av hierarki blant musene. Foruten huset er en konstant og lik håndtering av alle mus og grupper også viktig. Å gripe musen for å koble den lette fiberen på implantatet er veldig stressende. Derfor må denne prosedyren være den samme for hver mus, noe som betyr samme teknikk og samme eksperimenterer. Videre må habituation tid i venteburet, som er ment å roe musen ned fra stressende tilkoblingsprosedyre, også ha like forhold i varighet, søppel og posisjon til labyrinten. Håndteringen i museanlegget er også avgjørende for senere atferdsytelse. Eksperimentelle og kontrollerende dyr bør ikke rengjøres på forskjellige dager eller av forskjellige mennesker, da dette også er stressende for mus. I tillegg bør rengjøringsdagen ikke være den eksperimentelle dagen for å unngå forskjeller i atferd.
Feilsøking Det er flere problemer som kan oppstå under protokollen. For eksempel kan boring av en helhet i skallen under stereotaktisk kirurgi skade blodårene. Vanligvis oppstår sterk blødning, spesielt over bregma og lambda. Hvis dette skjer, ikke prøv å stoppe blødningen med bomullpinner som de har en tendens til å utvide enda mer blødning ut av fartøyet på grunn av deres absorbens, i stedet, skyll direkte med NaCl.
Det kan også hende at trykkinjeksjonen av virusoppløsningen ikke virker. I dette tilfellet kan det være at parafilm, en scab fra burr hullet eller hjernevev, tetter spissen av kanula. I dette tilfellet fjerner du kanulaen sakte ut av hjernen uten å endre x- eller y-aksen og bruker en pinsett for å fjerne 1-2 mm av den fremre delen av kanulaspissen. Før du senker kanula igjen, test for funksjonalitet ved å bruke liten mengde trykk for å se om viruset kommer ut av kanulaspissen. For å unngå forstoppelse, senk kanulaen med konstant hastighet og ikke stopp bevegelsen før den dypeste dybden på injeksjonssiden er nådd. Hvis for mye av kanulaspissen fjernes og diameteren er for stor, vil kanulaen skade vevet og risikoen for å bruke viruset samtidig vil bli økt. Sørg derfor for at bare den tette delen av spissen fjernes nøye.
Under atferdseksperimentet kan oppsettet av eksperimentet i videosporingsprogramvaren (f.eks. Ethovision XT) forårsake problemer. Hvis for eksempel lyseffekten ikke fungerer som den skal, kan dette skyldes flere grunner. Pulser må åpnes, programmeres og startes før Ethovision XT åpnes. Maskinvaren må velges riktig i "Eksperimentell oppsett" (trinn 3.2.2.4). Hvis feil IO-Box, eller noe annet enn "Kostymemaskinvare" er valgt, kan ikke Pulser-enheten styres av Ethovision. Hvis testen av lyseffekten er vellykket, men den programmerte lysprotokollen i "Innstillinger for prøvekontroll" ikke fungerer under anskaffelsen, kan underregelen eller underregelreferansen være plassert feil eller betingelsene og handlingene er uklare. For eksempel: tilhører referansen den riktige underregelen? Er referansen programmert riktig (f.eks. hvor ofte utføres underregelen)?
I tillegg kan det hende at under "deteksjonsinnstillinger" dyret er tilstrekkelig sporet, men under oppkjøpet er det prøver der motivet ikke er funnet. I dette tilfellet, sjekk om belysningen i eksperimentelle rommet ble endret, eller om noe produsert uønskede skygger i labyrinten. Hele bunnen av labyrinten må ha samme farge, da innstillingen bare vil fungere for en bestemt kombinasjon. Hvis forskjellige bunnfarger eller skygger av en eller annen grunn ikke kan unngås, definerer du deteksjonsinnstillingen i den mørkeste delen av labyrinten.
Hvis du vil endre eventuelle innstillinger etter anskaffelsen av de første dyrene, må du ikke bruke disse endringene i de allerede brukte innstillingene. Dupliser dem for å justere dem. Dette betyr også at den allerede registrerte prøveversjonen ikke er gyldig lenger for dataanalyse. I et slikt tilfelle registrerer du alle dyr for denne eksperimentelle gruppen med de opprinnelige innstillingene, og opprett et nytt eksperiment etterpå hvor de innspilte videoene analyseres i stedet for live sporing. I dette "fra video" eksperimentet kan flere innstillinger brukes til analyse uten å miste sammenlignbarhet mellom dyr eller til og med data.
Begrensninger og fremtidige applikasjoner Denne metoden for å manipulere atferd med optogenetikk i fritt bevegelige dyr inkluderer også begrensninger. Under operasjonen er nærheten til de to implantatene begrenset. For dobbel implantasjon må avstanden mellom de to implantatene minimalt være bredden på apparatet for å holde implantatet. Apparatet må senke det andre implantatet ned i burrhullet, mens de første implantatene allerede er festet. En løsning for dette kan være en vinklet implantasjon, hvor tuppene av glassfiberen kan være svært nær mens de keramiske ferlene over skallen har størreavstand 23,,55,,56,,57,,62,,63. En ulempe med en vinklet implantasjon er lyset som sprer seg. Når fiberspissen skrås i stedet for rett over, er det stimulerte området forskjellig. Ved to målregioner i umiddelbar nærhet må den endrede posisjonen til lysstimuleringen vurderes.
Under atferdseksperimentet kan byggingen av labyrinten forstyrre den optiske kabelen som er koblet til dyret. Noen atferdstester, for eksempel den lyse mørke boksen, inneholder et innendørs område64,,65og andre labyrinter inneholder rom som musen må gå inn i. Slike eksperimenter kan ikke utføres med dette oppsettet. Et trådløst system kan også være et alternativ22,26,66. Men heldigvis kan noen labyrinter, som Barnes Maze, ordnes på en slik måte, at musene er i stand til å gå inn i de relevanterommene 67.
Foruten de med lukkede soner, kan labyrinter som er for brede forårsake også problemer. Jo større området av labyrinten, jo lenger kabelen må være for å tillate dyret å gå til alle posisjoner i labyrinten. Det må tas hensyn til at dyret ikke er i stand til å tråkke på kabelen eller ta det og bite det. En løsning for det kan være en konstruksjon som ruller opp overflødig kabel. En ulempe er at dra for å rulle ut kabelen er vanskelig for mus. Denne løsningen passer bedre for rotter. Et annet mulig alternativ kan være å gjøre lysstimuleringen på forhånd, i stedet for under forsøket, er dette selvfølgelig bare mulig hvis en langsiktig effekt på grunn av lysstimuleringen oppstår23.
Sammenligning med eksisterende/alternative metoder Alternative metoder ville være kjemisk eller elektrisk stimulering underatferd 8,18. Kjemiske agonister eller antagonister er i stand til å aktivere eller dempe nevroner via spesifikke reseptorer og kan også manipulere enkelt nevrotransmittersystemer38,68. På den ene siden er reseptorspesifisiteten ganske høy for kjemikalier, fordi spesifikk agonist eller antagonist bare aktiverer visse reseptorer39. På den annen side er spesifisiteten for reseptorundertyper av samme nevrotransmittergruppe ofte utilstrekkelig. De fleste kjemikalier binder seg til minst to undertyper med ulike sannsynligheter69. I tillegg kan kjemikalier ikke skille mellom nevronale celletyper så lenge de har de samme reseptortypene. Utover dette er timelig og romlig oppløsning dårlig for kjemiske manipulasjoner i forhold til optogenetikk. Agonister eller antagonister administreres ofte oralt35 eller via systemiske injeksjoner57,,70. Hvis infusjonen av kjemikaliet gjøres direkte i hjernevevet, vises effektene raskere enn med orale applikasjoner, men fortsatt på en langsommere tidsskala enn med lysstimulering. Som administrerte kjemikalier diffuse i hjernen og er ikke spesifikke for nevronale typer eller hjerneregioner, manipulering av spesifikke hjernekretser det ikke mulig.
Elektrisk stimulering har en høyere temporal oppløsning enn kjemiskstimulering 9,,14. Spredningen i nevronalt vev er mindre enn med kjemisk stimulering, og romlig oppløsning er bedre enn med kjemisk stimulering. Elektrisk stimulering mangler imidlertid muligheten til å spesifikt adressere forskjellige nevronale celletyper eller reseptortyper, da hver nevron i nærheten av elektroden vil reagere på den elektriske stimuleringen.
Alternative metoder for atferden i fritt bevegelige mus er for eksempel elektrofysiologiske opptak i hjerneskiver, hvor enkeltnevroner eller aksoner kan moduleres med optogenetikk og fremkalte effekter kan måles via opptak avelektroder 6,,71. In vitro eksperimenter tilbyr muligheten til å undersøke molekylær og cellulær basis av optogenetiske stimuleringer, men har begrensningen at iboende tilkobling og innspill fra andre hjerneregioner mangler. Et annet alternativ er å bruke optogenetic i forbindelse med multiphoton imaging1,72. I dette tilfellet har mus hodet fast og kan bedøves eller være våken for å løse enkle oppgaver.
For å utføre et vellykket optogenetisk eksperiment, er et bredt spekter av verktøy og applikasjoner tilgjengelige i dag. Valg av optogenetiske verktøy og atferdsmessig oppsett er avgjørende for å svare på spesifikke forskningsspørsmål. Hvis den rette kombinasjonen av verktøy og eksperimenter er valgt, tillater optogenetikk en enestående, grundig undersøkelse av nevronale kretser med høy temporal og romlig oppløsning. Dette vil bidra til å forstå og utvikle nye terapeutiske strategier for psykiatriske sykdommer og kognisjon.

Moduleringen av nevronale kretser i sentralnervesystemet og deres atferdsmessige resultater er viktig for å forstå hvordan hjernen fungerer, spesielt i psykiatriske sykdommer og kognitive oppgaver som læring og hukommelse. Med optogenetikk kan enkeltceller eller cellepopulasjoner opptil hele kretser moduleres av lys. Vanlige optogenetiske verktøy som Channelrhodopsin2 (ChR2) eller Archaerhodopsin (Arch) er i stand til å aktivere eller dempe nevroner, eller øke eller hemme senderutgivelse ved axonterminaler som projiserer til distinkte hjerneregioner1,,2,,3,,4. Arch må imidlertid brukes nøye da det ble vist at aktiveringen ved presynaptiske terminaler øker spontan senderutgivelse5. Arch er en ytre utbedring protonpumpe som endrer pH-verdien inne i cellen. Dette alkaliske miljøet induserer kalsiumtilstrømning og forbedrer senderutgivelsen5. For å spesifikt modulere intracellulære signalveier, kan reseptor chimeras består av et lettaktiverbart optogenetisk verktøy, for eksempel rhodopsin eller kjegle opsin, sammen med en tilstrekkelig G-protein komponertreseptor, opprettes 6,7,8. Mengden og variasjonen av optogenetiske verktøy tilgjengelig har økt betydelig i løpet av det siste tiåret9.
Formålet med optogenetikk er å manipulere nevronale kretser under oppførsel. Optogenetikk muliggjør for eksempel måling av akutte atferdsendringer som endringer i angstatferd. Optogenetiske verktøy leveres inn i målområder av hjernen via virale vektorer. Ved hjelp av spesielle arrangører og enhancers, eller Cre-loxP-systemet, kan celletype spesifisitet sikres for uttrykk for optogenetiske verktøy (Figur 1A). Det er flere genmodifiserte muselinjer som uttrykker enzymet Cre-Recombinase i bestemte celletyper bare. For eksempel uttrykker Nex-Cre-mus Cre-Recombinase i pyramidale nevroner i cortex og hippocampus under kontroll av Nex-promotor10. Dette enzymet er i stand til å invertere DNA-sekvenser, som er flankert av loxP-sidene11. Følgelig kan DNA-sekvensen av et dobbelt-floxed optogenetisk verktøy, som er invertert og flankert av loxP-sider, bare transkriberes av nevroner som har Cre-Recombinase, men ikke av andre nevronaletyper 12,13. Når det gjelder Nex-Cre-mus, vil det optogenetiske verktøyet utelukkende uttrykkes i pyramidale nevroner. Lysstimulering av visse hjerneregioner oppnås deretter via kronisk implantasjon av optiske fibre rett over interesseområdet. Dyr kan deretter bli kombinert med en passende lyskilde og fritt oppføre seg i nesten alle slags atferdstester.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61023/61023fig01.jpg"> Figur 1: Injeksjon og implantasjon. A) Cre-loxP system for ChR2-YFP. Dobbel floxed optogenetic verktøyet er pakket i en adeno assosiert virus (AAV) for injeksjon i hjernevevet. B) Skytten visning av virusinjeksjon og implantasjon av et optisk nevronalt grensesnitt inn i / over IL-regionen av mPFC. Injeksjon og implantasjon ble gjort ovenfra. Alle områder av interesse, IL, BLA og DRN, vises. C) Detaljert visning av den implanterte optiske fiberen, hylsen og lyskilden. D) Spredning av blå og rød laserlysstimulering i grå materie hjernevev fra en 200 μm lysfiber (Yizhar et al. 2011). Blått lys sprer seg, maksimalt 0, 5 mm inn i vevet, rødt lys ca 1 mm. Fargekoding: rød 50%, gul 10%, grønn 5%, blå 1% hvis lyset når dette området. E) Koronar visning av ensidig implantasjon rett over venstre IL med en 200 μm optisk fiber. IL-regionen har en bredde på 0,25 mm på hver halvkule og en dybde på 0, 2 mm. Blå og røde lyspærer er boarder av 5% lys spredning og overføres fra Yizhar et al til riktig størrelse. LoxP: locus av X-over P1; ChR2: Channelrhodopsin; YFP: gul fluorescerende protein; dflox: dobbel floxed; IL: infralimbic cortex; BLA: basolateral amygdala; DRN: dorsal raphe kjerner; PrL: prelimbic region. Dette tallet er endret fra Berg 201948. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61023/61023fig01large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Optogenetic tilnærminger benyttes som det muliggjør både høy temporal og romlig oppløsning14 og celletype spesifikk modulasjon. I tillegg er det mulig å gjentatte ganger bruke implantert enhet uten videre behandling. Etter en stereotaktisk kirurgi, hvor injeksjonen av et adeno-assosiert virus som bærer det optogenetiske verktøyet og implantasjonen av den optiske fiberen utføres, kan musene komme seg i to uker. Vi har valgt en gjenopprettingstid på bare 2 uker, fordi dette er nok tid til å komme seg fra operasjonen og for viruset å uttrykke. Etter hvert som atferdseksperimentene etterfølges av immunohistokjemi, må vi sørge for at mus ikke blir for gamle under forsøket; ellers reduseres vevskvaliteten. De viser ingen åpenbare atferdsmessige funksjonsnedsettelse fra implantatet og engasjerer seg i typisk buratferd. Selvfølgelig er implantasjonen ledsaget av en betydelig kirurgisk lesjon; Derfor overvåkes musene intensivt. Etter operasjonen må mus være enkelt plassert, da gruppehusmus har en tendens til å skade hverandres friske sår og implantater. Imidlertid har boligforhold en stor innvirkning på angstnivået til hannmus, da enkelthusmus viser lavere angstnivåer15 og generelt mindre depressive symptomer16.
Kjemisk eller elektrisk manipulering av hjernekretser mangler den høye celletypen spesifisitet av optogenetikk og har en lavere temporal og romlig oppløsning14,,17,,18. Avhengig av det eksperimentelle spørsmålet kan elektrisk eller kjemisk stimulering ha forskjellige fordeler. Når du passerer fiberterminaler i en bestemt region må også stimuleres, elektrisk stimulering er den beste metoden. Kjemisk stimulering er et godt valg for når senderspesifikke reseptorer i en hel region skal aktiveres av agonister. En annen stor fordel med optogenetikk sammenlignet med kjemisk eller elektrisk stimulering er at endogene, nevroner ikke er følsomme for lys, noe som unngår forekomsten av bivirkninger19. Faktisk kan høye lysintensiteter indusere varmeeffekter8,20, men på grunn av riktige kontrollgrupper kan atferdseffektene på grunn av optogenetisk manipulasjon elimineres.
Undersøke gnageratferd, spesielt med hensyn til psykiatriske sykdommer, har sterkt forbedret seg med optogenetikk hos fritt bevegelige dyr, da det muliggjør direkte modulering av enkeltreseptorer opp til bestemtecellepopulasjoner 21 ogkretser 22. Muligheten til å måle de akutte effektene av slike modulasjoner, samt de langsiktige atferdseffektene etter en definert tid23 eller etter kronisk stimulering24,gir en bred fleksibilitet av eksperimentelle design og gir svært detaljert innsikt i hjernekretser. Lysstimulering kan brukes til å modulere nevroner som ligger på injeksjonsstedet til det optogenetiske verktøyet. Når både injeksjon og implantasjon adresserer samme hjerneregion, kan cellelegemer og ryggprojisering av aksler av prinsippnevroner og interneuroner i denne regionen målrettes3,,6,,8. Imidlertid kan lysfiberen også implanteres i et område forskjellig fra den injiserte. I dette tilfellet kan lysstimulering modulere senderutløsning ved axonterminaler i projeksjonsområder i den injiserte regionen25,,26,,27.
I studien her brukes optogenetikk i kombinasjon med eksperimenter for å analysere angstrelatert oppførsel. Angstrelaterte psykiatriske sykdommer påvirker mer enn en tredjedel av verdensbefolkning 28,29,30 og forårsaker en høy økonomiskbyrde 31. De berørte lider av en følelse av opphisselse, spenning og bekymring etterfulgt av unngåelsesatferd32,33. Disse kronisk forekommende negative følelser, som hovedsakelig fokuserer på fremtidigehendelser 34, forstyrrer sterkt pasientens daglige liv. Vanlige behandlinger som benzodiazepiner eller selektive serotoninreopptakshemmere (SSRI) er bare vellykkede hos noen av pasientene. En stor mengde mennesker reagerer ikke på behandlingen i det hele tatt35, som viser at mekanismen som ligger til grunn for slike sykdommer ennå ikke er fullt ut forstått. Den mediale prefrontal cortex (mPFC) er kjent for å spille en viktig rolle i utviklingen og manifestasjonen av angst21,25,27,36,37,38. Spesielt kan overaktivering av den infralimbic cortex (IL) regionen i mPFC være en del av angstrelatertelidelser 39,40. Eksempeleksperimentet som er beskrevet her, kan bidra til å forstå hvordan modulasjoner i IL-regionen i mPFC påvirker angstatferd. I tillegg kan utviklingen av nye terapeutiske strategier for angstrelaterte psykiatriske sykdommer også potensielt støttes.
2-6 måneder gamle mannlige Nex-Cre mus brukes til å uttrykke ChR2 spesielt i pyramidale nevroner innenfor IL-regionen av mPFC41. Nex-Cre mus har en C57Bl/6 bakgrunn og uttrykke enzymet Cre-recombinase spesielt i pyramidale nevroner. Under en stereotaktisk kirurgi injiseres dobbelt floxed ChR2-DNA inn i IL-regionen via adeno-tilknyttede virale vektorer. Det optiske implantatet er plassert rett over interesseområdet (figur 1B) og implantatet er festet med tannsement. Kontrolldyr får en injeksjon av dobbel floxed tdTomato-DNA i samme region for å etterligne cellespesifikt uttrykk.
Dyr er gruppe-plassert til operasjonsdagen og etterpå er enkelt plassert for å unngå skader fra andre mus. Mus er plassert i individuelle ventilerte bur (IVC) stativer i TypI-L bur for enkelthus mus. Den lyse mørke syklusen følger en 12:12 h rytme, lysfasen starter kl 10. Alle atferdseksperimenter utføres i den mørke fasen, som ligner den aktive fasen av gnagere. Vann og standard matpellets er tilgjengelig ad libitum. Etter to uker med utvinning, som sikrer et tilstrekkelig uttrykk for ChR2 i pyramidale nevroner, brukes mus til atferdseksperimenter.
Open Field (OF) er en 50 cm x 50 cm kvadrert labyrint med sandblåste 40 cm høye vegger. Bakken er delt i 16 firkanter hvor de indre 4 representerer sentrum. Den målte virkemåten er: 1) tid brukt i midten, 2) antall midtoppføringer og 3) total avstand flyttet. I løpet av dette eksperimentet er det 4 studier på totalt 20 minutter. I forsøk 1 og 3 oppstår ingen lysstimulering, og i forsøk 2 og 4 utføres en stimulering på 20 Hz med 5 ms lyspuls og 1 mW lysintensitet på 473 nm (figur 2A). I de senere studiene ble det tatt hensyn til boligen til testområdet, men bruk av sham-injiserte kontrolldyr indikerer hvordan habituation uttrykkes.
Barnes Maze er et eksperiment for læring og hukommelse. Det er en sirkulær plattform som er 92 cm i diameter og inneholder 20 likeverdige hull rundt omkretsen. 19 av hullene er lukket og under ett hull presenteres en escape box. I 4 påfølgende dager har mus 4 treningsforsøk for å lære plasseringen av escape-boksen. På den femtedagen fjernes rømningsboksen, og mus testes på hvor mye tid de trenger for å finne riktig hull. Den målte virkemåten er: 1) Tid til escape box / riktig hull er funnet, 2) Antall målbesøk og feil, og 3) Avstand flyttet til i escape-boksen. Lysstimuleringen i ulike grupper gjøres enten under oppkjøp eller konsolidering, som finner sted på treningsdagene 1-4, eller under henting på testdagen, som er dag 5 (figur 2D).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61023/61023fig2v2.jpg"> Figur 2: Atferdseksperimenter med optogenetiske protokoller. A) Skjematisk tegning av Open Field-eksperimentet med den tilsvarende lysstimuleringsprotokollen. C) Skjematisk tegning av Elevated-Plus Maze-eksperimentet med den tilsvarende lysstimuleringsprotokollen. D) Skjematisk tegning av Barnes Maze-eksperimentet med den tilsvarende lysstimuleringsprotokollen. EPM: Forhøyet pluss labyrint; AV: Åpent felt; BM: Barnes Labyrint Test. Dette tallet er endret fra Berg 201948. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61023/61023fig2v2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
For optogenetisk stimulering må lysintensiteten og frekvensen tilpasses det optogenetiske verktøyet og nevronale typen som er under etterforskning. Lavest mulig lysintensitet bør brukes for å unngå skade på vevet, da flere studier har vist at det er mulige varmeeffekter på grunn av sterk lysintensitet8,20. For ChR2 brukes ofte en 20 Hz stimulering med 5 ms lyspuls2. Siden ChR2 er ganske lysfølsom, er 1 mW lysintensitet tilstrekkelig. Lysstimuleringsprotokollen veksler mellom lys av og på forsøk for å måle atferdsendringer direkte. De eksterne romforholdene for atferdseksperimenter bør forbli stabile for hele gruppen av dyr. Viktige forhold å vurdere er støyen (husk at enhetene selv kan lage støy), lukten (rengjør alltid atferdsoppsettene med etanol), lysintensiteten og eksperimentereren. Eksperimentereren bør alltid være den samme personen. I tillegg bør tiden på dagen for eksperimentene være den samme for alle dyr i en gruppe, noen timer etter starten av den mørke fasen i anlegget foretrekkes.
Målet med dette eksperimentet er å øke eksitasjon / hemming (E / I) forholdet i IL-regionen gjennom sterk aktivering av eksitatoriske pyramidale nevroner. Et forbedret E/I-forhold i denne spesielle cortex-regionen er kjent for å øke angstnivået hosmus 40,,42,,43,,44.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ketamin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K2753-64</td>
			<td>Anestasia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 % Glucose</td>
			<td>AlleMan Pharma</td>
			<td></td>
			<td>Injection s.c. for fast recovery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Behavioral mazes</td>
			<td>Costum made</td>
			<td></td>
			<td>Measure anxiety</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bepanthen</td>
			<td>Bayer</td>
			<td></td>
			<td>Ophthalmic oinment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betaisodona</td>
			<td>Monodipharma</td>
			<td></td>
			<td>Sterilant containing iodine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betaisodona</td>
			<td>Monodipharma</td>
			<td></td>
			<td>Iodine oinment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ52, 110AL0.62x WD160</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic ferrules</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CFLC230-10</td>
			<td>Implant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic Fiber Scribe</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CSW12.5</td>
			<td>Cutting of the glass fiber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Channelrhodopsin2-YFP virus</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>Addgene 20298</td>
			<td>Optogenetic tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed air</td>
			<td>Kontakt Chemie</td>
			<td>Druckluft 67</td>
			<td>Drying of the skull</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coordinate system</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td></td>
			<td>Stereotactic coordinates for the surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Correl Draw</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Graphical software version 13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryoslicer</td>
			<td>MICROM</td>
			<td>HM500OM</td>
			<td>Production of brain slices for staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethovision XT 14</td>
			<td>Noldus</td>
			<td></td>
			<td>Software for behavioral tracking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Statistical Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferrule Polishing Puck</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>D50-F</td>
			<td>Polishing implants round side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Patch Cord dual</td>
			<td>Prizmatix</td>
			<td>Optogenetics-Fiber 500, 1,20 m, Ferrule core 1,25 mm</td>
			<td>Cables, which are connected with the two implants of a bilateral implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Patch Cord single</td>
			<td>Prizmatix</td>
			<td>Optogenetics-Fiber 500, 1,20 m, Ferrule core 1,25 mm</td>
			<td>Cable, which is connected with the implant via a sleeve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Stripping Tool</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>T06S13</td>
			<td>Stripping glass fiber for implant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>VWR European</td>
			<td>516-0300</td>
			<td>Cut into pieces for the Novelty-Suppressed Feeding test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food pellets</td>
			<td>M&#252;hle Levers</td>
			<td>H&#246;veler Nagerfutter</td>
			<td>Nutrition for the mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipettes</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>GC150-10</td>
			<td>Injection pipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gradia direct-Flo</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>103322</td>
			<td>Fluid dental cementum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating lamp</td>
			<td>efbe-Schott/Phillips</td>
			<td>R95E</td>
			<td>Prevent the mice from cooling after the surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating plate</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td></td>
			<td>Integrated into coordinate system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection canula</td>
			<td>Braun</td>
			<td>100 Sterican, 0,4 x 20 mm, Gr. 20</td>
			<td>All injections and to bore hole into the skull</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Litter</td>
			<td></td>
			<td>T 1350</td>
			<td>Grounding for the Novelty-Supressed Feeding test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse cages</td>
			<td>Zoonlab</td>
			<td>405 cm^2</td>
			<td>Single housing for experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optibond FL</td>
			<td>Kerr</td>
			<td>26684E</td>
			<td>Preparation of the skull for implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical glass fiber</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FT200EMT</td>
			<td>Light fiber for implant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optogenetics-LED.STSI</td>
			<td>Prizmatix</td>
			<td></td>
			<td>Optogenetic toolbox for light stimulation during behavioral experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>16005-1KG-R</td>
			<td>Perfusion of mice to remove the brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polishing sheet 0.02 &#181;m grit</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LFCF</td>
			<td>Polishing implants round side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polishing sheet 1 &#181;m grit</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LF1D</td>
			<td>Polishing implants round side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polishing sheet 30 &#181;m grit</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LF30D</td>
			<td>Polishing implants round side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polishing sheet 6 &#181;m grit</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LF6D</td>
			<td>Polishing implants round side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulser Software</td>
			<td>Prizmatix</td>
			<td></td>
			<td>Software for light device control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rimadyl-Carprofen</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td></td>
			<td>Analgesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma Plot</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Software for statistics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sleeve</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FT200EMT</td>
			<td>Connection of implant and light cable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SodiumCloride (NaCl)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>3570410</td>
			<td>Rinsing of the skull</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superglue</td>
			<td>Pattex Henkel</td>
			<td></td>
			<td>To Fix the glass fiber in the ferrule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>td-Tomato virus</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>Addgene 51503</td>
			<td>Optogenetic tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV light</td>
			<td>KoQGHJ</td>
			<td>wireless, 1200 mW/cm^2</td>
			<td>Polymeration lamp for dental cementum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylavet-Xylazin</td>
			<td>cp pharma</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optogenetic manipulation of neuronal activity to modulate behavior in freely moving mice

Optogenetisk modulering av nevronale kretser i fritt bevegelige mus påvirker akutt og langsiktig oppførsel. Denne metoden er i stand til å utføre manipulasjoner av enkeltnevroner og regionspesifikt senderutløsning, opptil hele nevronale kretser i sentralnervesystemet, og tillater direkte måling av atferdsutfall. Nevroner uttrykker optogenetiske verktøy via en injeksjon av virale vektorer som bærer DNA av valget, for eksempel Channelrhodopsin2 (ChR2). Lys bringes inn i spesifikke hjerneregioner via kroniske optiske implantater som avsluttes rett over målområdet. Etter to uker med utvinning og riktig verktøyuttrykk, kan mus gjentatte ganger brukes til atferdstester med optogenetisk stimulering av nevronene av interesse.
Optogenetisk modulering har en høy temporal og romlig oppløsning som kan oppnås med høy cellespesifisitet, sammenlignet med de vanlige metodene som kjemisk eller elektrisk stimulering. Lyset skader ikke nevronalt vev og kan derfor brukes til langsiktige eksperimenter, samt for flere atferdseksperimenter i en mus. Mulighetene for optogenetiske verktøy er nesten ubegrenset og muliggjør aktivering eller deaktivering av hele nevroner, eller til og med manipulering av en bestemt reseptortype for lys.
Resultatene av slike atferdseksperimenter med integrert optogenetisk stimulering visualiserer direkte endringer i atferd forårsaket av manipulasjonen. Oppførselen til samme dyr uten lysstimulering som baseline er en god kontroll for induserte endringer. Dette gir en detaljert oversikt over nevronale typer eller nevrotransmittersystemer som er involvert i spesifikk atferd, for eksempel angst. Plastisiteten til nevronale nettverk kan også undersøkes i detalj gjennom langsiktig stimulering eller atferdsobservasjoner etter optisk stimulering. Optogenetikk vil bidra til å opplyse nevronal signalering i flere typer nevrologiske sykdommer.

Målet med denne protokollen er å måle endringer i oppførselen til genmodifiserte mus under et optogenetisk eksperiment. Optogenetic manipulasjon er gjort ved injeksjon av en adeno assosiert viral vektor. Lysstimulering i fritt bevegelige mus er mulig via implantasjon av en lett fiber rett over interesseområdet.
I figur 4presenteres resultatene av et optogenetisk eksperiment. En sterk aktivering av eksiatoriske pyramidale nevroner i IL-regionen via ChR2 økte angstrelatert oppførsel i det åpne feltet. ChR2 ble injisert i IL-regionen av mPFC i Nex-Cre mus for uttrykk i pyramidale nevroner (figur 4A). Under to angsttester stimuleres Open Field (figur 4B,C) og Novelty-Suppressed Feeding test (Figur 4F, G), ChR2 med blått lys og aktiverer pyramidale nevroner. Som kontroll fikk en annen gruppe mus en injeksjon av fluorofortdTomato i stedet for ChR2 (figur 4D,G). I et slikt eksperiment er angst definert som unngåelse av det lysere sentrale området. Mus viser en iboende unngåelse av åpne områder fordi de er engstelige for rovdyr.
I Open Field-eksperimentet, vist i figur 4B,utførte mus 4 studier på 5 minutter hver. I forsøk 1 og 3 oppstod ingen lysstimulering (Off1,2) og i forsøk 2 og 4 ble det ikke utført blå lysstimulering med 20 Hz (5 ms lyspuls) og 1 mW intensitet (On1,2). Varmekartene viser at i den eksperimentelle gruppen var midtvarighet forskjellig mellom Off og On-forsøk. Under lysstimulering forblir mus fortrinnsvis i grensesonen. Kontroll dyr foretrekker også grensen, men endrer ikke sin oppførsel ved lysstimulering. I figur 4Cvises de viktigste atferdsmålingene under Open Field-eksperimentet for den eksperimentelle gruppen. Hvis dataene besto Shapiro-Wilk-testen for normalitet, ble statistikken gjort med en uavhengig to-tailed t-test. Hvis normalitetstesten mislyktes, ble Mann-Whitney-Rank Sum-testen brukt som ikke-parametrisk alternativ. For slike eksperimenter ble en sammenligning i gruppen valgt for å undersøke om lysstimulering direkte kan endre angstatferd over tid, uavhengig av baseline angst for eksperimentelle og kontrollere dyr. Sentervarigheten gikk betydelig ned i begge lysstimuleringsforsøkene, noe som indikerer økte angstnivåer. Den totale avstanden flyttet ble ikke endret, noe som viser at lokomotorisk oppførsel ikke ble påvirket. Antallet senteroppføringer ble økt, men ikke signifikant. I figur 4Dvises dataene for kontrollgruppen. Kontrolldyr viste ingen atferdsendringer mellom av- og på-studier i noen av de analyserte parametrene, noe som viser at lysstimulering eller implantasjon ikke forårsaket de observerte effektene. I sum viser denne testen økt angst under lysstimulering av IL pyramidale nevroner via ChR2.
I figur 5vises dataene for et mislykket optogenetisk eksperiment for Elevated-Plus Maze. Under Elevated-Plus Maze-eksperimentet, som presenteres i figur 5A,fullførte mus 6 studier på 3 minutter hver. I forsøk 1, 3 og 5 ble det ikke utført lysstimulering (Off1, Off2, Off3) og i forsøk 2, 4 og 6 ble det ikke utført lysstimulering med 20 Hz (5 ms lyspuls) og 1 mW intensitet (On1, On2, On3). I disse eksemplariske resultatene var lengden på den optogenetiske protokollen og konstruksjonen av labyrinten i seg selv ikke egnet for den transgene muselinjen. I figur 5Bkan det ses, at flere mus gled av labyrinten med sine bakpoter eller til og med falt ned. Da dette skjedde, fikk mus en ny sjanse til å utføre EPM en dag senere. Hvis de falt ned igjen, ble de ekskludert fra analyse. Når mus gled av flere ganger, men klarte å holde seg på labyrinten, ble data analysert normalt. Likevel må dataene tolkes svært nøye og kontrollere dyr får større betydning. Nex-Cre-mus hadde motoriske vanskeligheter med å holde seg på de smale åpne armene. For å unngå dette, ville små vegger, med en høyde på 1 cm, ha bidratt til et sikkert grep av bakpotene på armene på labyrinten. Både varmekartene og grafene viser at eksperimentelle, så vel som kontrollmus, begynte å unngå de åpne armene fra studie 2 (On1) på (figur 5C-E). Tiden på de åpne armene er betydelig redusert for begge grupper, som er de åpne arm oppføringer. Analysere den eksperimentelle gruppen bare innhentet data som impliserer en stor anxiogen effekt av lysstimuleringen, da tiden på den åpne armen og åpne armoppføringer reduseres betydelig under On1-studien. Men når du sammenligner disse dataene med kontrollgruppen, som viser samme oppførsel, blir det klart at den observerte oppførselen ikke medieres av optogenetisk stimulering, men ved å unngå de åpne armene generelt på grunn av habituation til labyrinten. Disse dataene understreker viktigheten av en riktig kontrollgruppe for å skille mellom atferdseffekter mediert av optogenetisk stimulering og mulig atferdstilpasning. Disse dataene belyser også viktigheten av å tilpasse et eksperimentelt oppsett på riktig måte for å passe den spesifikke mousselinjen og eksperimentelle spørsmålet.
For å validere og styrke innsamlede atferdsdata fjernes hjerner av mus etter det siste forsøket for å kontrollere for riktig injeksjon og implantasjon (figur 6). Hjernen er fast i 4% paraformaldehyd og fjernet fra skallen. Hjernen er dehydrert i 30% sukrose i 1-2 dager og kryosliced etterpå. De 40 μm tykke koronale hjerneskivene vaskes og monteres på superfrostmålsklier med et monteringsmedium som inneholder DAPI, som flekker cellekjerner. Dette gjør det mulig å identifisere målområder i koronale skiver. Fluorescens av YFP-koden eller tdTomato selv indikerer plasseringen av virusinjeksjonen. I figur 6B presenteres de eksemplariske injeksjonsstedene til ChR2-YFP til venstre (gul) og tdTomato til høyre (rød). Ved hjelp av en mal, tilpasset fra Paxinos og Franklin45 mus hjerneatlas, kan IL-regionen identifiseres. I begge lysbildene uttrykkes det optogenetiske verktøyet i IL-regionen, men også i tilstøtende hjerneregioner. For en riktig tolkning konsulteres spredning av blått lys i hjernevev8 (figur 1D, E). Det kan ses at det blå lyset vil nå DP-regionen under IL med bare mindre enn 5% av den første 1 mW lysintensiteten på fiberspissen (Blå linje i figur 1D)8. I tillegg kan liten mengde lys gå oppover til PrL-regionen på grunn av bakspyende47. Følgelig kan man si at IL-regionen er opplyst sterkest, men tilstøtende regioner som DP og PrL-regionen kan også stimuleres litt. Derfor er IL-celle spesifikk stimulering ikke garantert, og immunohistokjemisk analyse av de tilstøtende regionene bør utføres, for å se om aktiviteten til PrL- og DP-celler moduleres via lys. I figur 6C visesen annen viktig kontroll: spesifisiteten til Nex-Cre-muselinjen. Via antistofffarging mot de to celletypene i IL-regionen, glutamatergiske prinsippnevroner og GABAergic interneurons, kan det ses, at ChR2-YFP-uttrykket bare forekommer i glutamatergiske nevroner og ikke med GABAergic.
Alt i alt viser våre eksperimenter at med optogenetisk manipulasjon under atferdstesting, kan endringer i angstrelatert atferd observeres. Ved å bruke mer enn én test for samme oppførsel, kan en pålitelig konklusjon trekkes. I tillegg bekrefter immunohistokjemisk analyse de oppnådde dataene. Våre eksperimenter tyder på at den spesifikke aktiveringen av pyramidale nevroner i den infralimbic cortex økte angstrelatert oppførsel i visse analyser.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61023/61023fig04v4.jpg"> Figur 4: Optogenetisk aktivering av IL pyramidale nevroner øker angstatferd. Lysstimulering under eksperimenter: 473 nm, 1 mW, 20 Hz stimulering. A) Skjematisk tegning av injeksjons- og implantasjonsstedet for ChR2-YFP eller tdTomato inn i IL. Under forsøket aktiveres pyramidale nevroner i IL-regionen av mPFC av ChR2. Saggital hjerneskiver tilpasset fra Paxinos og Franklin mus hjerneatlas, saggital: lateral o,6. B) Open Field labyrint med lysstimulering protokoll (20 min med 4x5 min vekslende Off og På forsøk; venstre) og varmekart over eksemplariske ChR2-injisert (EXP) og tdTomato-injisert (CT) mus i alle 4 studier av eksperimentet (høyre). EXP dyr tilbringer mindre tid i sentrum av OF når stimulert med blått laserlys. For CT-dyr varierer ikke tiden i sentrum mellom lys av og på-forsøk. C) Gruppedata for EXP-dyr i OF, n=11. Mus tilbringer betydelig mindre tid i sentrum av OF når stimulert med blått lys (Off1 39.49±6.9 s, On1 19.87±4.47 s, Off2 28.13±8.55 s, On2 23.42±9.32 s, Off1:On1, t-test, p = 0.033, *; Off1:On2, MWRS, p = 0049, *). Distanse flyttet påvirkes ikke (Av1 2703,09±292,65 cm, On1 3113,4±491,15 cm, Off2 3331,86 ±482,62 cm, On2 3082,17±658,61 cm). # av sentrum oppføringer reduseres med tiden, men viser ingen signifikante forskjeller (Av 1 22,36±3,78, On1 18,45±3,95, Off2 17,36±1,99, On2 13,27±2,64). D) Gruppedata for CT-dyr i OF, n=15. Tid mus tilbringer i sentrum av OF, avstanden flyttet, # av midtoppføringer endres ikke mellom lys På og Av forsøk (Tid i sentrum Off116.73±2.65 s, On1 16.02±1.89 s, Off2 12.02±1.76 s, On2 13.04±2.58 s; Avstand Avslag1 3399,69±296,77 cm, On1 3210,6±446,9 cm, Off2 3030.28±513.83 cm, On2 2955±617.7 cm; Antall senteroppføringer Off1 14,2±1,98, On1 13,6±2,02, Off2 10,8±1,88, On2 11,67±2,5). CT-mus viser signifikant høyere baseline angst (Off1 EXP:CT, MWRS, p=0,005, **). Verdier er ±S.E.M. * indikerer signifikante forskjeller (s≤0,05), ** indikerer signifikante forskjeller (p≤0,01). t-test alltid to-tailed, MWRS: Mann-Whitney Rank Sum test; IL: infralimbic cortex; BLA: basolateral amygdala; DRN: dorsal raphe kjerner; AV: Åpent felt; CT: kontroll dyr; EXP: eksperimentelt dyr; L: lys. Dette tallet er endret fra Berg et al. 2019, PLoS One43 og fra Berg 201948. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61023/61023fig04large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61023/61023fig5v4.jpg"> Figur 5: EPM-eksperiment viste ikke atferdseffekter hos Nex-Cre-mus. Lysstimulering under eksperimenter: 473 nm, 1 mW, 20 Hz stimulering. A) Elevated-Plus Maze med lysstimuleringsprotokoll (18 min, 6x3 min, vekslende off og on-forsøk). B) Gruppedata for musene som "slip off" er inkludert i dataene, totalt n = 23. Nex-Cre mus hadde en tendens til å skli ut av den åpne armen med sine ryggpoter, uavhengig av eksperimentell gruppe (venstre). Bare mus som bodde på labyrinten for alle 6 studier ble vurdert i senere analyser. Slip off's i den første Off1 fasen er grunn til senere unngåelse av de åpne armene (Off1 EXP 1.63±0.6, CT 2.2±0.79, Off2+3 EXP 0.125±0.125, CT 0±0, On1+2+3 EXP 0.625±0.26, CT 0.1±0.1). Sektordiagram (høyre) viser mus som faller fra labyrinten i løpet av 18 min med 42,42%. Bare 57,57% fullførte eksperimentet. C) Varme kart over eksemplariske EXP og CT mus i alle 6 studier av eksperimentet. Begge gruppene viser en nedgang i varigheten av åpen arm etter Off1-studien. D) Gruppedata for EXP-dyr i EPM, n=12. Tiden i de åpne armene gikk betydelig ned i løpet av de to første studiene og stadig etterpå (Off1 73.91±12.22 s, On1 36.15±14.65 s, Off2 15.61±6.23 s, On2 19.49±7.51 s, Off3 9.36±4.44 s, On3 7.96±3.47 s. Off1:On1, t-test, p = 0,041, *). Avstanden som flyttes påvirkes ikke (Av1 679,96±71,63 cm, On1 712,24±112,82 cm, Av2 717,49±97,39 cm, On2 782,51±81,11 cm, Off3 722,11±68,60 cm, On3 663,90±106,57 cm). Mengden åpne armoppføringer reduseres betydelig fra Off1 til On1 og forblir deretter konstant (Off1 8,08±1,08, On1 3.33±0.76, Off2 2.16±0.69, On2 2.91±1.09, Off3 1.73±0.75, On3 1.73±0.66. Off1:On1, t-test, p = 0,002, **). Tiden brukt i midten av EPM reduseres langs forsøk, men viser ingen signifikant forskjell fra Off to On-studien (Off1 41.71±5.34 s, On1 31.2±4.59 s, Off2 19.8±3.44 s, On2 24.49±3.38 s, Off3 20.37±4.77 s, On3 18.85±4.07 s). E) Gruppedata for CT-dyr i EPM, n=11. CT-data viser de samme signifikante reduksjonene som EXP-data, noe som indikerer at eksperimentet ikke har fungert som det skal (Tid i åpne armer Off1 86,92±12,74 s, On1 33,78±14.38 s, Off2 18.01±11.61 s, On2 16.41±9.61 s, Off3 11.36±4.01 s, On3 5.43±2.07 s. Off1:On1, MWRS, p =0.009, **; Avstand Avslag1 705.11±88.36 cm, On1 789.45±77.53 cm, Av2 724,74±80,49 cm, On2 676,57±111,99 cm, Av3 716,99±132,47 cm, On3 663.03±132.46 cm; Åpne arm oppføringer Off1 7.09±1, On1 3.72±1.17, Off2 1.45±0.47, On2 1.36±0.58, Off3 0.91±0.43, Off3 1.64±0.59. Off1:On1, MWRS, p = 0,01, *; Tid brukt i sentrum Off1 35.89 s, On1 29.25±3.96 s, Off2 22.17±3.58 s, On2 15.9±2.57 s, Off3 13.86±4.2 s, On3 16.89±5.75 s). Verdier er ± S.E.M. * indikerer signifikante forskjeller (s≤0,05), ** indikerer signifikante forskjeller (p≤0,01). t-test er alltid to-tailed, MWRS: Mann-Whitney Rank Sum test; EPM: Forhøyet pluss labyrint; CT: kontroll dyr; EXP: eksperimentelt dyr; OA: åpne armer. Dette tallet er endret fra Berg et al. 2019, PLoS One43 og fra Berg 201948. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61023/61023fig05large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61023/61023fig06.jpg"> Figur 6: Injeksjonssiden av ChR2 og tdTomato i IL- og Nex-Cre-spesifisiteten. A)Skjematisk tegning av implantasjonsstedet på koronar hjerneskiver ved AP + 1,66 mm, ml 0,3 mm, DV -1,8 mm, med ensidig injeksjon og implantasjon (tilpasset fra mushjerneatlas, Paxinos og Franklin, Bregma +1,54 mm). B) Eksemplariske injeksjonssteder for ChR2-YFP (venstre, gul) og tdTomato (høyre, rød) fusjonert med DAPI-fargede cellekjerner (blå) i Nex-Cre-mus. Vektstangen 1 mm. Innsetter viser høy forstørrelse av IL-regionen. Vektstangen 150 μm. Hvite bokser angir plasseringen av innsetter. C) Øverste rad: konfokale bilder av venstre IL-regionen i en Nex-Cre-mus farget med CamKII som markør for glutamatergiske nevroner (blå), og ChR2-YFP (gul) eller Gad67 som markør for GABAergic nevroner (grønn), av en Nex-Cre mus. Nederste rad: colocalization av ChR2-YFP (gul) med CamKII (venstre, blå), men ikke med Gad67 (høyre, grønn), viser spesifisitet av Nex-Cre mus for glutamatergic nevroner. Vektstangen 50 μm. PrL: prelimbic cortex; IL: infralimbic cortex; DP: dorsal peduncular cortex. Dette tallet er endret fra Berg et al. 2019, PLoS One43 og fra Berg 201948. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61023/61023fig06large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity to Modulate Behavior in Freely Moving Mice at JoVE.com

Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity to Modulate Behavior in Freely Moving Mice

Med optogenetisk manipulering av spesifikke nevronale populasjoner eller hjerneregioner, kan atferd endres med høy temporal og romlig oppløsning hos fritt bevegelige dyr. Ved å bruke forskjellige optogenetiske verktøy i kombinasjon med kronisk implanterte optiske fibre, kan en rekke nevronale modulasjoner og atferdstesting utføres.

Optogenetic manipulering av nevronal aktivitet for å modulere atferd i fritt bevegelige mus

Optogenetic modulation of neuronal circuits in freely moving mice affects acute and long-term behavior. This method is able to perform manipulations of ...

Med optogenetisk manipulering av spesifikke nevronale populasjoner eller hjerneregioner, kan atferd endres med høy temporal og romlig oppløsning hos fritt bevegelige dyr. Ved å bruke forskjellige optogenetiske verktøy i kombinasjon med kronisk implanterte optiske fibre, kan en rekke nevronale modulasjoner og atferdstesting utføres. Det endelige målet med optogenetikk er modulering av nevronale kretser med høy temporal og romlig oppløsning i det oppfører seg dyret.I motsetning til farmakologiske eller elektriske manipulasjoner, tillater optogenetikk nøyaktig kontroll av bestemte celletyper på nevronale kretser. Optogenetikk er den perfekte måten å målrette bestemte celletyper i spesielt definert region under atferd, og å granske den direkte effekten av endringer i slike mikrokretser. Vi vil nå presentere et skritt for å gå guide hvordan å forberede og plante og gjennomføre optogenetikk i en fritt bevegelig mus.For fremstilling av det optiske implantatet, legg en keramisk ferrul flat side opp i en benk skrustikke. Strip koden til en 200 mikrometer diameter glassfiber, med en fiber stripping verktøy og kutte to til tre centimeter ikke stykker med en keramisk fiber skriver. Legg glassfiberstykket i den keramiske ferrulen og legg deretter en dråpe en superlim på den flate siden med en injeksjonskanyte.På den runde siden av den keramiske gløden kutter du glassfiberen så kort som mulig og plasserer pre-implantatet på en ferrule polering puck for å polere den runde siden på fire forskjellige publiseringspapirer. Etterpå kutter du glassfiberen på den flate siden av den keramiske ferrulen, til den lengden som trengs for implantasjon. Bruk et musehjerneatlas til å beregne lengden på implantatet.Implantatet må ende rett over interesseområdet. Før implantasjonen påføres anestesi. Den presise og estetiske teknikken er beskrevet i manuskriptet.Når musen når en dyp tilstand av anestesi, plasser den på en varmeplate og fest hodet i en stereotaktisk ramme. Fest nesen og tennene foran og ørene på begge sider. Påfør en algesi med en cuprofen subcuntaneously inn i baksiden av musen og bruke ugjennomsiktig øye salve på begge øynene for å beskytte dem mot tørking.Fukt håret på hodebunnen med et vått papirhåndkle og klipp det av med saks. Pass på å fjerne alt løst hår med et vått papirhåndkle. Bruk en bomullspinne til å desinfisere hodebunnen med en tinktur som inneholder jod.Løft hodebunnen om interesseregionen med en pinsett og kutt en centimeter langs midtlinjen. For å grove skallen for implantasjon, bruk en liten mengde fosforsyre på arret og la den tre i kraft i 15 sekunder. Fjern all syre med en bomullspinne og skyll arret med natriumklorid to ganger.For riktig injeksjon, beregn F-faktoren for individuelle koordinater. Plasser en glasskanyte i stereokratisk ramme og finn den rett over bregma. Nå null koordinatsystemet og flytt glasskanylen til Lambda.Beregn F-faktoren med følgende formel. Bregma minus Lambda delt på 4,2 tilsvarer F-faktoren. Eksakte koordinater er svært viktig for injeksjon og implantasjon fordi ellers, hvis feil struktur stimuleres så atferdseffekter er uspesifik.Alle mus har minimumsavvik i størrelsen på skallen, derfor er koeffisienten helt obligatorisk. Bruk de justerte koordinatene til å finne plasseringen på arret rett over strukturen av interesse. Bruk en injeksjonsmetyle til å bore et hull i skallen, ved å rotere kanylen på stedet.For å ta en virusløsning inn i glasskanylenlen som er koblet til sprøyten, legg en dråpe natriumklorid på skallen og et stykke pirophen på toppen. Legg en dråpe to mikrolitervirusløsning på pirophen og senk tuppen av glasskanylen inn i viruset. Påfør negativt trykk og vent til virusløsningen er tatt opp av kanylen.Null til den koordinaten når spissen av viruset med kanyle er på nivået av skallen og sakte senke den inn i borehullet til den laveste posisjonen til injeksjonssiden. Påfør en liten mengde positivt trykk med sprøyten til menisken senkes. La viruset spre seg i to til tre minutter før du flytter glasskanylen oppover til neste posisjon.Fjern glasskanylen veldig sakte og kast den etter den endelige injeksjonen. Nå forberede skallen for implantasjon. Tørk skallen med trykkluft, påfør primeren med denne tilsvarende pinnen og la den tørke i 15 sekunder.Påfør båndet med samme pinne og kurere den i 20 sekunder med UV-lys. Plasser implantatet i den tilsvarende holderen og plasser tuppen av glassfiberen rett over borehullet og senk det forsiktig. Slutt å senke implantatet når den gjenværende ventilen av superlim berører skallen.Implantasjonen av optiske fibre kan også gjøres for bilaterale strukturer som hippocampus. Dette muliggjør liten stimulering på begge halvkuler samtidig eller tillater stimulering av to forskjellige strukturer. Det er også mulig å injisere viruset på et annet sted enn det optiske fiberimplantatet.Hvis injeksjonen og implantasjonen gjøres i forskjellige regioner, bor alle nødvendige hull etter påføring av fosforsyre, men før de to komponentadene. Sjekk igjen om skallen fortsatt er helt tørr, og påfør deretter flytende tannsement rundt implantatet og i området rundt og deretter kurere i 20 sekunder med UV-lys Påfør to mindre sement i helt pelsfri og tørket skalleområde. Herd hvert lag med UV-lys.For å fullføre operasjonen, bruk jodsoppringelse på hele såret. Slipp nesen og ørefikseringen, ta musen inn i et nytt bur og plasser den under en varmelampe for å unngå tap av kroppsvarme. Sjekk det er helsetilstand minst en gang om dagen, og det vil poste operativ og algesia etter tre dager om nødvendig.Etter to uker med utvinning kan mus brukes til atferdseksperimenter. Åpne Pulser-programvaren, og velg USB-com-porten som lyskilden er koblet til. Velg driftsmodus tre for å la en ekstern programvare styre lyskilden.Velg riktig justering for 20 Hertz stimulering med fem millisekund lyspuls. Hvis du vil finne divisjonen for å kommunisere med pulseren, trykker du på startsekvensen. Denne statusen forblir til eksperimentene er fullført.Nå oppretter du et nytt eksperiment i EthoVision XT, går til fil, velger ny fra mal og velger bruk en forhåndsdefinert mal. Velg live sporing og velg kameraet med kilde og bekreft den tilkoblede Puslar Gen-Eye cam. Velg mus som dyret som skal registreres.Velg arenamalen, åpne feltplassen og sonemalen sentrum, kantlinje, hjørner. Bekreft ett emne som skal spores og velg midtpunkt, nesepunkt og halebase. Bekreft at dyrefargen i forhold til bakgrunnen er mørkere og den anbefalte samplingsfrekvensen for å fullføre trinnet.Gi eksperimentet et passende navn, og velg et sted du vil lagre. Til du finner arenainnstillingene, åpner kameraet automatisk et bakgrunnsbilde. Tilpass de forhåndsdefinerte sonene til den virkelige arenaen ved hjelp av pilen og de to symbolene til høyre.Hvis noen soner er unødvendige, sletter du dem. Trykk på tegneskalaen for å kalibrere og sette en linje fra det ene hjørnet av labyrinten til det andre. Angi lengden på den virkelige avstanden i centimeter.Gjenta det for den andre aksen. Hvis du vil definere innstillingene for prøvekontroll, klargjør du hovedregelen ved å justere betingelsestiden til 20 minutter. Betingelsen for Star Trek bør være, når motivet er på arena i to sekunder, for en automatisk status for sporingen når musen er i arenaen.Hvis du vil opprette en underregel for lysstimuleringen, går du til strukturer, mer og velger underregel. Plasser den under hovedregelen og spre ut de to boksene. Gå til betingelser, tid og gi det et navn som lys på en, justere tilstanden blir møtt med etter fem minutter.Plasser boksen rett bak regelboksen for underregelen. Gå til handling tilpasset maskinvare og navngi den med lys på en. Velg handling for å utføre som: Jeg skal sette en høy.Plasser boksen rett bak betingelsesboksen. Gjenta trinnene for å programmere lyset til i lys på. Gå nå til strukturer, underregelreferanse og kontroller at referansen tilhører den riktige underregelen.Velg startbetingelser som uten forsinkelse og startforhold som utføres én gang per startbetingelse. Plasser referanseboksen mellom de ekstra bøkene en og betingelse bøker to av hovedregelen. Definer nå deteksjonsinnstillingene for å vise systemet hva det skal spore.Plasser en test miles inn i arenaen og velg automatisert oppsett. Velg gnager som dyretype og bruk musepekeren til å tegne en boks rundt musene i arenaen. Bekreft resultatene av omsorgsspørsmålet med ja.For det åpne felteksperimentet, ta den eksperimentelle musen til atferdsrommet rett før eksperimentet for å sikre et riktig nivå av angst. Par musen være en spalte av lyskilden ved å trykke den forsiktig til rutenettet av buret. Plasser den i et ventebur med friskt kull i 10 minutter for å bli akklimatisert til lyskabelen.Start oppkjøpet ved å trykke på stoppknappen og du til visjon XT. Overfør musen fra venteburet til øvre venstre hjørne av det åpne feltet. La det visuelle feltet av musen under eksperimentet og holde seg rolig. Etter 20 minutter, når eksperimentet er ferdig, fjern musen fra labyrinten, koble fra lyskabelen og legg den tilbake i sitt eget bur.Ved en kontrollvisualisering kan forskjellene i midttid mellom lys av og lys på ansikter ses direkte. Musen tilbringer mindre tid i midten når lyset er på. For Barnes labyrint eksperiment, bringe alle eksperimentelle mus inn i atferdsrommet rundt en time før eksperimentet.Forbered Barnes labyrinten ved å lukke alle hull unntatt ett, og nå som en escape box er plassert. Koble en mus i lyskilden på begge implantater og plasser den direkte inn i midten av Barnes labyrinten. Trykk på start og må besøke neste T og fjerne esken.Vær forberedt på å stoppe rettssaken manuelt bare i tilfelle programvaren ikke gjenkjenner hele overgangen. Ta musen ut av labyrinten og fjern tilkoblingen til lyskabelen. Når du utfører, lærer og minneoppgave, undersøkes ikke bare den umiddelbare effekten av manipulasjonen, men også den langsiktige effekten av manipulasjon under oppkjøp, konsolidering eller gjenfinning.For dataanalyse finner du behandlingstilstanden behandlet eller kontrollert, gå til hekkende og velg prøvekontrolltilstand. Velg tilstandsintervallet fra elementhandlingen Star Trek til elementhandlingslyset går på ett. Plasser hekkeboksen mellom filterboksbehandlingen og den tilsvarende resultatboksen.Dette definerte intervallet er av ett. Gjenta trinnene for intervaller på en av to og på to som også for kontrollgruppen. Definer også parameterne som skal analyseres i analyseprofilen.Velg den avhengige variabelen i sonen, og velg sonesenteret, brødtekstpunktet, midtpunktet og gå på prøvestatistikk. Velg frekvens, kumulativ varighet, og la den se den første. Legg også til avstandstrekk som variabel.Med denne profilen er dataene for tiden som er brukt i midten, midtre oppføringer og bedt om avstandstrekk tilgjengelig. Hvis du vil trekke ut data fra hver divisjon, går du til resultater og velger statistikk og diagrammer, trykker på beregn for å se de analyserte dataene. Trykk eksportdata og velg prøvestatistikken og plasseringen du vil lagre.De eksporterte dataene lagres som en Excel-fil og med individuelle verdier for hver mus. I tillegg går du til varmekartvisualisering og trykker plottvarmekart, velger forsøk til høyre for å se individuelle varmekart for hver mus og prøve. Gjør et høyreklikk på musen og eksporter varmekartene som bilder.Senere åpner du excel-filen datamaskinen og beregner gjennomsnittlig og standard euro SCM for alle fire forsøk og hver målt kondisjoneringsgruppe. For å generere grafer og Sigma-plott, kopier midler og SCM i riktig rekkefølge fra den ekstra filen til Sigma-plottet. Radene må inneholde dataene for av en, på en, og kolonnene inneholder prøveversjon, gjennomsnitt og SCM hertz.Velg alle tre kolonnene, og gå for å opprette grafer. Merk stolpeboksen, og velg ugruppert boks med pil. Merk hele grafen, gå hjem, velg grafboksen og trykk eksport.Velg målmappen, og velg metafil som format. For å beregne statistikk for innhentede data, kopier riktige data fra Xcel av en på en, et cetera og til enkeltkolonner av Sigma-plottet. Merk kolonnene du vil sammenligne, og gå til analyse, velg T-test og trykk kjør.Til slutt kan atferdsdata vises delt inn i la av og på prøve med ekstra varmekart spesialisering. I det åpne felteksperimentet, under lysstimulering av Channelrhodopsin2 og pyramidale nevroner, reduseres midtvarigheten, noe som indikerer økte angstnivåer. Via immunohistochemistry kan injeksjonsstedet og uttrykket av viruset bestemmes, også ved spesifisitet på den spesielle Cre-avhengige muselinjen kan valideres.Man kan tydelig se at lysstimuleringen av Channelrhodopsin2 forbedrer sinnetevroner i denne spesifikke cortex-regionen øker angstnivået, sammenlignet med baseline angst før den stimuleringen. Denne umiddelbare effekten av manipulasjon på atferd er grunnen til at optogenetic brukes i dag for så mye forskningsspørsmål om atferd. Denne prosedyren kan brukes til optogenetisk modulering av ønsket celletype eller nevronale kretser i musehjernen.Ved å kombinere denne prosedyren med egnede atferdstester for din forskning, kan en dypere innsikt i nevronale kretser involvert i atferd og sykdommer av interesse oppnås.

Research

JoVE Journal

Behavior

Long-term Potentiation of Perforant Pathway-dentate Gyrus Synapse in Freely Behaving Mice

Langsiktig Potensiering av Perforant Pathway-dentate gyrus Synapse i Fritt Oppfører Mus

Studies of long-term potentiation of synaptic efficacy, an activity-dependent synaptic phenomenon having properties that make it attractive as a potential ...

Uncovering Beat Deafness: Detecting Rhythm Disorders with Synchronized Finger Tapping and Perceptual Timing Tasks

Avdekke Beat døvhet: Oppdager rytmeforstyrrelser med Synkronisert Finger Tapping og Perceptual Timing Oppgaver

A set of behavioral tasks for assessing perceptual and sensorimotor timing abilities in the general population (i.e., non-musicians) is presented here ...

Flat-floored Air-lifted Platform: A New Method for Combining Behavior with Microscopy or Electrophysiology on Awake Freely Moving Rodents

Flat-floored Air-løftet Platform: En ny metode for å kombinere Behavior med Mikros eller Elektro på Awake fritt bevegelige Gnagere

It is widely acknowledged that the use of general anesthetics can undermine the relevance of electrophysiological or microscopical data obtained from a ...

A Novel Experimental and Analytical Approach to the Multimodal Neural Decoding of Intent During Social Interaction in Freely-behaving Human Infants

A Novel Experimental og analytisk tilnærming til Multimodal Neural dekoding av Intent Under sosial samhandling i Fritt-oppfører menneske Spedbarn

Understanding typical and atypical development remains one of the fundamental questions in developmental human neuroscience. Traditionally, experimental ...

Visualizing Motion Patterns in Acupuncture Manipulation

Visualisering bevegelsesmønstre i Akupunktur Manipulasjon

Acupuncture manipulation varies widely among practitioners in clinical settings, and it is difficult to teach novice students how to perform acupuncture ...

The Rodent Psychomotor Vigilance Test (rPVT): A Method for Assessing Neurobehavioral Performance in Rats and Mice

The Rodent Psychomotor Vigilance Test rPVT: A Method for Assessing Neurobehavioral Performance in Rats and Mice

Den gnager Psyko Årvåkenhet Test (rPVT): En metode for å vurdere nevroevne hos rotter og mus

The human Psychomotor Vigilance Test (PVT) is a widely used procedure for measuring changes in fatigue and sustained attention. The present article ...

Manipulation of Epileptiform Electrocorticograms (ECoGs) and Sleep in Rats and Mice by Acupuncture

Manipulation of Epileptiform Electrocorticograms ECoGs and Sleep in Rats and Mice by Acupuncture

Manipulering av epileptiske Electrocorticograms (ECoGs) og Sov i rotter og mus med akupunktur

Ancient Chinese literature has documented that acupuncture possesses efficient therapeutic effects on epilepsy and insomnia. There is, however, little ...

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

Multi-lag Cortical Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Imaging i fritt bevegelige mus med prismeprober og miniatyrisert fluorescensmikroskopi

In vivo circuit and cellular level functional imaging is a critical tool for understanding the brain in action. High resolution imaging of mouse cortical ...

A Wireless, Bidirectional Interface for In Vivo Recording and Stimulation of Neural Activity in Freely Behaving Rats

A Wireless, Bidirectional Interface for In Vivo Recording and Stimulation of Neural Activity in Freely Behaving Rats

En trådløs, toveis grensesnitt for In Vivo -opptak og stimulering av nevrale aktivitet i fritt oppfører seg rotter

In vivo electrophysiology is a powerful technique to investigate the relationship between brain activity and behavior at a millisecond and micrometer ...

Assessing Activity-based Anorexia in Mice

Vurdere aktivitetsbaserte anoreksi i mus

Rodents develop activity-based anorexia (ABA) when exposed to a restricted feeding schedule and allowed free access to a running wheel. These conditions ...