Name: optogenetic manipulation of neuronal activity to modulate behavior in freely moving mice
Uploaded: 2020-10-27T12:30:00
Duration: 14 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity to Modulate Behavior in Freely Moving Mice at JoVE.com

Muito obrigado ao Prof Klaus-Armin Narve e à Dra. Além disso, agradecemos nossa equipe de vídeo Yunus Dikici e Ruben Wiesner pela gravação e processamento do vídeo do JoVE para este artigo. Além disso, muito obrigado a Kristin Claussen por sua dublagem e Kimberly Anne Go para a revisão do manuscrito.
Os resultados apresentados foram obtidos na Universidade Ruhr em Bochum e o vídeo foi gravado na Universidade de Bremen.
Este trabalho foi financiado pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) - Projektnummer 122679504 - SFB 874 e DFG MA 4692/3-2.

Os autores não têm nada a revelar.

Usar a luz para manipular a sinalização neuronal tem sido o método de escolha há quase uma década. Desde 2005, o número de artigos publicados sobre o desenvolvimento de novas ferramentas optogenéticas4,6,8,14,49,50,51 e estudos onde tais ferramentas são utilizadas para investigar circuitos cerebrais21,,23,,40,,43,52, altamente aumentado. Por um lado, com a enorme diversidade de ferramentas optogenéticas injetáveis, variantes de implantação, linhas de camundongos transgênicos e experimentos comportamentais, a possibilidade de experimentos é múltiplas e ilimitadas. Por outro lado, a possibilidade de cometer falhas na escolha de condições experimentais é muito alta e os experimentos são tão específicos, que muitas vezes a comparabilidade com outros estudos é difícil.
Passos críticos Um passo crítico importante deste protocolo é o planejamento adequado. A escolha da ferramenta optogenética deve corresponder à questão científica. É necessário apenas manipular a atividade geral de um neurônio ou sinapse? Em seguida, ferramentas comercialmente fornecidas como ChR221,,25,27 e Arch37 são uma boa escolha. Mas, além disso, se um sistema neurotransmissor especial ou mesmo um único receptor deve ser manipulado, uma quimera receptora individual é muitas vezes a melhor escolha3,6. Várias quimeras receptoras com GPCRs, as chamadas Opto-XRs e as diretrizes para produzi-las já estão disponíveis4,,50. Além da escolha de ferramentas optogenéticas, a linha do mouse em combinação com o experimento comportamental também é crítica. Diferentes cepas de fundo, como, por exemplo, C57Bl/6 e BALB/cByJ, exibem diferentes fenótipos comportamentais em alguns aspectos53,54. Os camundongos C57Bl/6 têm uma ansiedade de baixa linha de base e podem ser usados para manipulação ansiogênica, enquanto BALB/cByJ apresentam níveis de ansiedade mais altos e, portanto, são mais sensíveis a drogas ansiolíticas. Além disso, as variantes transgênicas dessas cepas de fundo também podem variar em seu fenótipo48. Com uma combinação adequada de promotores específicos em conjunto com uma ferramenta optogenética e linha de mouse transgênico, quase todas as populações de células desejadas podem ser alvo.
Um passo crítico durante a cirurgia é direcionar o local correto. Com a ajuda do atlas cerebral do camundongo, podem ser estabelecidas coordenadas adequadas para o eixo anterior-posterior e eixo medial-lateral, e a profundidade da estrutura pode ser estabelecida45. Na realidade, cada crânio tem uma forma e tamanho ligeiramente diferentes. Assim, o fator F46 para ajustar as coordenadas estereotáticas é bastante importante, assim como a fixação correta do nariz e da orelha durante a cirurgia estereotática. Se a cabeça do mouse estiver inclinada, a cânula de injeção não atingirá a região desejada de interesse.
Além disso, o diâmetro da cânula de injeção também é crítico. Se for muito pequeno, nenhum vírus pode ser liberado no tecido, se for muito largo, a cânula vazará solução de vírus a caminho da região de interesse. Se a fibra óptica implantada terminar diretamente acima da região alvo, a expressão do vírus nas regiões do córtex acima não importa. Mas se o implante for colocado acima de outras regiões para estimular os terminais de axônio, os axônios das regiões do córtex superior também serão ativados pela luz e falsificarão dados obtidos. Como exemplo: A região do IL e a região pré-círia (PrL) projetam a amígdala basal55,56, mas têm funções e papéis completamente diferentes na modulação da ansiedade26,57., Se o implante for colocado acima da amígdala para ativar terminais de axônio da região de IL, e durante a solução de vírus de injeção também foi colocado na PrL devido à cânula de injeção errada, o risco de também ativar terminais de axônio da RPR é muito alto.
Durante a preparação do crânio para a fixação do implante, o uso esparso de primer e ligação é crucial para uma fixação confiável e durável. Se o sistema de adesão de 2 componentes não for aplicado finamente, o cimento dental pode se soltar do crânio após alguns dias ou semanas. Além disso, o crânio também tem que ser completamente seco antes de consertar o implante, pois caso contrário, o cimento não se prenderá adequadamente ao crânio.
Passos críticos também existem na parte comportamental deste protocolo. Primeiro, a construção do labirinto é muito importante. Em cada configuração comportamental, existem diversas variantes na literatura em relação ao tamanho e forma, bem como para o procedimento em si58,59,,60. É importante escolher uma variante que torne os dados comparáveis e reprodutíveis. Além disso, os requisitos especiais para linhas de mouse utilizadas devem ser levados em conta43,48. Nos dados representativos do EPM pode-se ver que vários ratos Nex-Cre caíram do labirinto ou escorregaram várias vezes(Figura 2b). Para esses ratos, um labirinto com uma pequena parede ao redor dos braços abertos teria sido uma alternativa melhor.
Em segundo lugar, é fundamental manter todas as condições externas do quarto constantes61, caso contrário, diferentes grupos de camundongos não seriam comparáveis. Nesse sentido, é muito importante escolher o tempo do experimento como aquele em que a configuração experimental está vaga e o experimentador está sempre presente. Além disso, eventos no prédio, como obras, testes de qualquer sistema (alarme de incêndio) ou o dia de limpeza da instalação do mouse, devem ser considerados para evitar interferências nos dados obtidos.
Finalmente, as condições de manuseio e habitação são críticas para experimentos comportamentais. Quando uma implantação é realizada, os camundongos precisam ser alojados sozinhos devido ao risco de lesões de outros camundongos. Para garantir uma boa comparabilidade entre grupos e um erro baixo dentro de um grupo, cada mouse precisa ter o mesmo tamanho e enriquecimento da gaiola. Para experimentos relacionados à ansiedade, a moradia única tem algumas vantagens, pois os camundongos machos abrigados por singe apresentam menor nível de ansiedade na linha de base, menor variação em seu nível de ansiedade e sintomas menos depressivos15,,16. Camundongos machos alojados em grupo podem diferir fortemente em seu nível de ansiedade por causa da hierarquia entre os camundongos. Além da habitação, um manuseio constante e igualitário de todos os ratos e grupos também é importante. Pegar o mouse para conectar a fibra de luz no implante é muito estressante. Portanto, este procedimento tem que ser o mesmo para cada rato, ou seja, a mesma técnica e o mesmo experimentador. Além disso, o tempo de habituação na gaiola de espera, que se destina a acalmar o rato do procedimento de conexão estressante, também precisa ter condições iguais de duração, lixo e posição para o labirinto. O manuseio dentro da instalação do mouse também é fundamental para o desempenho comportamental posterior. Animais experimentais e de controle não devem ser limpos em dias diferentes ou por pessoas diferentes, pois isso também é estressante para ratos. Além disso, o dia da limpeza não deve ser o dia experimental para evitar diferenças de comportamento.
Solucionando problemas Há vários problemas que podem ocorrer durante o protocolo. Por exemplo, perfurar um todo no crânio durante a cirurgia estereotática pode danificar os vasos sanguíneos. Normalmente, ocorre um sangramento forte, especialmente acima de bregma e lambda. Se isso acontecer, não tente parar o sangramento com palitos de algodão, pois eles tendem a estender ainda mais sangramento para fora do vaso por causa de sua absorção, em vez disso, enxaguar diretamente com NaCl.
Também pode acontecer que a injeção de pressão da solução do vírus não está funcionando. Neste caso, pode ser que o parafilm, uma cicatriz do buraco da rebarba ou tecido cerebral, esteja entupindo a ponta da cânula. Neste caso, remova a cânula lentamente para fora do cérebro sem alterar o eixo x ou y e use uma pinça para remover 1-2 mm da parte frontal da ponta da cânula. Antes de baixar a cânula novamente, teste para funcionalidade aplicando uma pequena quantidade de pressão para ver se o vírus sai da ponta da cânula. Para evitar prisão de ventre, baixe a cânula com uma velocidade constante e não pare o movimento até que a profundidade mais profunda do lado da injeção seja atingida. Se muito da ponta da cula é removida e o diâmetro é muito grande, a cânula danificará o tecido e o risco de aplicar o vírus de uma só vez será aumentado. Assim, certifique-se de que apenas a parte entupida da ponta seja cuidadosamente removida.
Durante o experimento comportamental, a configuração do experimento no software de rastreamento de vídeo (por exemplo, Ethovision XT) pode causar problemas. Se, por exemplo, a saída de luz não estiver funcionando corretamente, isso pode ser devido a várias razões. O Pulser deve ser aberto, programado e iniciado antes que o Ethovision XT seja aberto. O hardware precisa ser selecionado corretamente na "configuração experimental" (etapa 3.2.2.4). Se a caixa de IO errada ou qualquer outra coisa que não seja "Hardware de Fantasia" for selecionada, o dispositivo Pulser não poderá ser controlado pela Ethovision. Se o teste da saída de luz for bem sucedido, mas o protocolo de luz programado em "Configurações de controle de teste" não funcionar durante a aquisição, a referência de sub-regra ou sub-regra pode estar localizada incorretamente ou as condições e ações não estão claras. Por exemplo: a referência pertence à sub-regra correta? A referência é programada corretamente (por exemplo, com que frequência a sub-regra é executada)?
Além disso, pode acontecer que durante as "configurações de detecção" o animal seja adequadamente rastreado, mas durante a aquisição há amostras onde o sujeito não é encontrado. Neste caso, verifique se a iluminação na sala experimental foi alterada, ou se alguma coisa produziu sombras indesejadas dentro do labirinto. Toda a parte inferior do labirinto tem que ter a mesma cor, pois a configuração só funcionará para uma combinação específica. Se por quaisquer razões diferentes cores inferiores ou sombras não puderem ser evitadas, defina a configuração de detecção na parte mais escura do labirinto.
Para alterar quaisquer configurações após a aquisição dos primeiros animais, não aplique essas alterações nas configurações já utilizadas. Duplique-os para ajustá-los. Isso também significa que o ensaio já registrado não é mais válido para análise de dados. Nesse caso, grave todos os animais para este grupo experimental com as configurações originais, e crie um novo experimento depois onde os vídeos gravados são analisados em vez de rastreamento ao vivo. Neste experimento "de vídeo", várias configurações podem ser usadas para análise sem perder a comparabilidade entre animais ou mesmo dados.
Limitações e aplicações futuras Esse método de manipulação do comportamento com optogenética em animais em movimento livre também inclui limitações. Durante a cirurgia, a proximidade dos dois implantes é restrita. Para a implantação dupla, a distância entre os dois implantes deve ser minimamente a largura do aparelho para segurar o implante. O aparelho precisa baixar o segundo implante para o orifício da rebarba, enquanto os primeiros implantes já estão fixos. Uma solução para isso pode ser uma implantação em ângulo, onde as pontas da fibra de vidro podem estar muito próximas, enquanto os ferules de cerâmica acima do crânio têm maior distância23,55,56,,57,62,63. Uma desvantagem de uma implantação em ângulo é a luz se espalhando. Quando a ponta de fibra é inclinada em vez de de cima, a área estimulada é diferente. No caso de duas regiões-alvo próximas, a posição alterada da estimulação da luz precisa ser considerada.
Durante o experimento comportamental, a construção do labirinto pode interferir com o cabo óptico conectado ao animal. Alguns testes comportamentais, como a caixa escura-clara, contêm uma área interna64,,65, e outros labirintos contêm compartimentos que o mouse precisa para entrar. Tais experimentos não podem ser realizados com esta configuração. Alternativamente, um sistema sem fio pode ser uma opção22,26,66. Mas, felizmente, alguns labirintos, como o Labirinto barnes, podem ser organizados de tal forma, que os ratos são capazes de entrar nos compartimentos relevantes67.
Além daqueles com zonas fechadas, labirintos muito largos podem causar também problemas. Quanto maior a área do labirinto, mais tempo o cabo tem que ser para permitir que o animal vá para cada posição do labirinto. É preciso ter cuidado para que o animal não seja capaz de pisar no cabo ou agarrá-lo e mordê-lo. Uma solução para isso pode ser uma construção que enrola o cabo redundante. Uma desvantagem é que o arrasto para desenrolar o cabo é difícil para ratos. Esta solução seria mais adequada para ratos. Outra opção possível poderia ser fazer a estimulação da luz com antecedência, em vez de durante o experimento, é claro que isso só é viável se um efeito de longo prazo devido à estimulação da luz ocorrer23.
Comparação com métodos existentes/alternativos Métodos alternativos seriam estimulação química ou elétrica durante o comportamento8,18. Agonistas químicos ou antagonistas são capazes de ativar ou silenciar neurônios através de receptores específicos e também podem manipular sistemas neurotransmissores únicos38,68. Por um lado, a especificidade do receptor é bastante alta para produtos químicos, pois agonista ou antagonista específico só ativa certos receptores39. Por outro lado, a especificidade para subtipos receptores do mesmo grupo neurotransmissor é muitas vezes insuficiente. A maioria dos produtos químicos se liga a pelo menos dois subtipos com probabilidades diferentes69. Além disso, os produtos químicos não podem distinguir entre os tipos de células neuronais, desde que possuam os mesmos tipos de receptores. Além disso, a resolução temporal e espacial é pobre para manipulações químicas em comparação com a optogenética. Agonistas ou antagonistas são frequentemente administrados oralmente35 ou através de injeções sistêmicas57,70. Se a infusão do produto químico for feita diretamente no tecido cerebral, os efeitos aparecem mais rápido do que com aplicações orais, mas ainda em uma escala de tempo mais lenta do que com estimulação de luz. Como os produtos químicos administrados se difundem no cérebro e não são específicos para tipos neuronais ou regiões cerebrais, a manipulação de circuitos cerebrais específicos não é possível.
A estimulação elétrica tem uma resolução temporal maior do que a estimulação química9,14. A disseminação no tecido neuronal é menor do que com estimulação química e a resolução espacial é melhor do que com estimulação química. No entanto, a estimulação elétrica não tem a possibilidade de abordar especificamente diferentes tipos de células neuronais ou tipos de receptores, pois cada neurônio próximo ao eletrodo responderá à estimulação elétrica.
Métodos alternativos ao comportamento em camundongos em movimento livre são, por exemplo, gravações eletrofisiológicas em fatias cerebrais, onde neurônios únicos ou axônios podem ser modulados com optogenética e efeitos provocados podem ser medidos através da gravação de eletrodos6,,71. Experimentos in vitro oferecem a possibilidade de investigar a base molecular e celular de estimulações optogenéticas, mas têm a limitação de que a conectividade intrínseca e a entrada de outras regiões cerebrais estão faltando. Outra opção é usar optogenética em conjunto com imagens multifotográficas1,72. Neste caso, os ratos têm a cabeça fixada e podem ser anestesiados ou estar acordados para resolver tarefas simples.
Para realizar um experimento optogenético bem-sucedido, uma ampla gama de ferramentas e aplicativos estão disponíveis hoje em dia. A seleção de ferramentas optogenéticas e a configuração comportamental são fundamentais para responder a questões específicas de pesquisa. Se a combinação certa de ferramentas e experimentos for escolhida, a optogenética permite uma investigação sem precedentes e aprofundada de circuitos neuronais com alta resolução temporal e espacial. Isso ajudará a entender e desenvolver novas estratégias terapêuticas para doenças psiquiátricas e cognição.

A modulação dos circuitos neuronais no sistema nervoso central e seus desfechos comportamentais são importantes para entender como o cérebro funciona, especialmente em doenças psiquiátricas e tarefas cognitivas, como aprendizado e memória. Com optogenética, células únicas ou populações de células até circuitos inteiros podem ser moduladas pela luz. Ferramentas optogenéticas comuns como Channelrhodopsin2 (ChR2) ou Archaerhodopsin (Arco) são capazes de ativar ou silenciar neurônios, ou aumentar ou inibir a liberação de transmissores em terminais de axônio projetando para regiões cerebrais distintas1,,2,,3,4. No entanto, o Arch precisa ser usado com cuidado, pois foi demonstrado que sua ativação em terminais pré-sinápticos aumenta a liberação espontânea do transmissor5. Arch é uma bomba de próton retificadora externa que altera o valor do pH dentro da célula. Este meio alcalino induz o fluxo de cálcio e aumenta a liberação do transmissor5. Para modular especificamente as vias de sinalização intracelulares, podem ser criadas quimeras receptoras compostas por uma ferramenta optogenética ativada à luz, como rhodopsina ou cone opsin, em conjunto com um receptor adequado de proteína G acoplado,6,,7,,8. A quantidade e variação das ferramentas optogenéticas disponíveis aumentou significativamente durante a última década9.
O objetivo da optogenética é manipular circuitos neuronais durante o comportamento. A optogenética permite, por exemplo, a medição de mudanças comportamentais agudas, como mudanças no comportamento da ansiedade. Ferramentas optogenéticas são entregues em regiões-alvo do cérebro através de vetores virais. Com a ajuda de promotores e intensificadores especiais, ou do sistema Cre-loxP, a especificidade do tipo celular pode ser garantida para a expressão de ferramentas optogenéticas(Figura 1A). Existem várias linhas de camundongos geneticamente modificadas expressando a enzima Cre-Recombinase apenas em tipos de células específicas. Por exemplo, os camundongos Nex-Cre expressam o Cre-Recombinase em neurônios piramifecionais no córtex e no hipocampo sob o controle do Nex-promotor10. Esta enzima é capaz de inverter sequências de DNA, que são flanqueadas pelos lados loxP11. Consequentemente, a sequência de DNA de uma ferramenta optogenética dupla floxed, que é invertida e flanqueada por lados loxP, só pode ser transcrita por neurônios que possuem o Cre-Recombinase,mas não por outros tipos neuronais12,,13. No caso dos camundongos Nex-Cre, a ferramenta optogenética será expressa exclusivamente em neurônios piramim. A estimulação leve de certas regiões cerebrais é então alcançada através da implantação crônica de fibras ópticas diretamente acima da região de interesse. Os animais podem então ser acoplado a uma fonte de luz adequada e se comportar livremente em quase todos os tipos de testes comportamentais.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61023/61023fig01.jpg"> Figura 1: Injeção e implantação. A) Sistema Cre-loxP para ChR2-YFP. A ferramenta optogenética floxada dupla é embalada em um vírus associado ao Adeno (AAV) para injeção no tecido cerebral. B) Visão sagital da injeção do vírus e implantação de uma interface neuronal óptica em/acima da região de IL do mPFC. A injeção e a implantação foram feitas de cima. Todas as regiões de interesse, IL, BLA e DRN, são mostradas. C) Visão detalhada da fibra óptica implantada, manga e fonte de luz. D) Disseminação da estimulação da luz laser azul e vermelha em tecido cerebral de matéria cinzenta a partir de uma fibra de luz de 200 μm (Yizhar et al. 2011). A luz azul se espalha, no máximo, 0,5 mm no tecido, luz vermelha de cerca de 1 mm. Codificação de cores: vermelho 50%, amarelo 10%, verde 5%, azul 1% se a luz atingir essa área. E) Visão coronal da implantação unilateral diretamente acima da IL esquerda com uma fibra óptica de 200 μm. A região de IL tem uma largura de 0,25 mm em cada hemisfério e uma profundidade de 0,2 mm. Lâmpadas azuis e vermelhas são o pensionista de 5% de propagação da luz e são transferidas de Yizhar et al para o tamanho certo. LoxP: lócus de X-over P1; ChR2: Channelrhodopsin; YFP: proteína fluorescente amarela; dflox: floxado duplo; IL: córtex infralimico; BLA: amígdala basolateral; DRN: núcleos de raphe dorsal; PrL: região pré-cíbica. Este número foi modificado a partir de Berg 201948. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61023/61023fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Abordagens optogenéticas são utilizadas, pois permitem a alta resolução temporal e espacial14 e a modulação específica do tipo celular. Além disso, é possível usar repetidamente o dispositivo implantado sem maior tratamento. Após uma cirurgia estereotática, onde a injeção de um vírus associado ao adeno carregando a ferramenta optogenética e a implantação da fibra óptica é realizada, os camundongos podem se recuperar por duas semanas. Escolhemos um tempo de recuperação de apenas 2 semanas, porque este é tempo suficiente para se recuperar da cirurgia e para o vírus se expressar. Como os experimentos comportamentais são seguidos pela imunohistoquímica, temos que garantir que os ratos não fiquem muito velhos durante o experimento; caso contrário, a qualidade do tecido é diminuída. Eles não mostram prejuízos comportamentais óbvios do implante e se envolvem no comportamento típico da gaiola. É claro que a implantação é acompanhada de uma lesão cirúrgica significativa; portanto, os ratos são monitorados intensamente. Após a cirurgia, os ratos precisam ser alojados sozinhos, pois os ratos alojados em grupo tendem a ferir as feridas e implantes frescos uns dos outros. No entanto, as condições de moradia têm um grande impacto no nível de ansiedade dos camundongos machos, uma vez que os camundongos alojados individuais apresentam níveis de ansiedade mais baixos15 e, em geral, sintomas menos depressivos16.
A manipulação química ou elétrica dos circuitos cerebrais não tem a especificidade do tipo celular elevado da optogenética e tem uma resolução temporal e espacial mais baixa14,,17,,18. Dependendo da questão experimental, a estimulação elétrica ou química pode ter diferentes vantagens. Ao passar terminais de fibra em uma região específica também precisa ser estimulado, a estimulação elétrica é o melhor método. A estimulação química é uma boa escolha para quando os receptores específicos do transmissor em toda uma região devem ser ativados por agonistas. Outra grande vantagem da optogenética em comparação com a estimulação química ou elétrica é que, endógeno, os neurônios não são sensíveis à luz, o que evita a ocorrência de efeitos colaterais19. De fato, altas intensidades de luz podem induzir efeitos de aquecimento8,,20, mas devido a grupos de controle adequados, os efeitos comportamentais devido à manipulação optogenética podem ser eliminados.
A investigação do comportamento dos roedores, especialmente no que diz respeito às doenças psiquiátricas, melhorou muito com a optogenética em animais em movimento livre, pois permite a modulação direta de receptores únicos até populações celulares específicas21 e circuitos22. A possibilidade de medir os efeitos agudos dessas modulações, bem como os efeitos comportamentais de longo prazo após um tempo definido23 ou após a estimulação crônica24,permite uma ampla flexibilidade de projetos experimentais e fornece insights muito detalhados sobre circuitos cerebrais. A estimulação da luz pode ser usada para modular neurônios localizados no local de injeção da ferramenta optogenética. Quando tanto a injeção quanto a implantação abordam a mesma região cerebral, corpos celulares e parte de trás projetando axônios de neurônios de princípios e interneurônios nesta região podem ser direcionados3,,6,,8. No entanto, a fibra de luz também pode ser implantada em uma região diferente da injetada. Neste caso, a estimulação da luz pode modular a liberação do transmissor nos terminais de axônio em áreas de projeção da região injetada25,,26,,27.
No estudo aqui, a optogenética é usada em combinação com experimentos para analisar comportamentos relacionados à ansiedade. As doenças psiquiátricas relacionadas à ansiedade afetam mais de um terço da população mundial28,29,30 e causam uma alta carga econômica31. Os afetados sofrem de um sentimento de excitação, tensão e preocupação seguidos pelo comportamento de evasão32,33. Essas emoções negativas que ocorrem cronicamente, que são principalmente focadas em eventos futuros34,interferem fortemente no cotidiano dos pacientes. Tratamentos comuns como benzodiazepínicos ou inibidores seletivos de recaptação de serotonina (SSRIs) só são bem sucedidos em alguns dos pacientes. Uma grande quantidade de pessoas não responde ao tratamento em todos os35anos, mostrando que o mecanismo subjacente a tais doenças ainda não é totalmente compreendido. O córtex pré-frontal medial (mPFC) é conhecido por desempenhar um papel importante no desenvolvimento e manifestação da ansiedade21,25,27,36,37,38. Especificamente, a superativação do córtex infralímbico (IL) na região do mPFC pode fazer parte dos transtornos relacionados à ansiedade39,40. O experimento de exemplo descrito aqui poderia ajudar a entender como as modulações na região de IL do mPFC influenciam o comportamento de ansiedade. Além disso, o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para doenças psiquiátricas relacionadas à ansiedade também pode ser potencialmente apoiado.
Camundongos Nex-Cre machos de 2 a 6 meses de idade são usados para expressar ChR2 especificamente em neurônios piramimatais dentro da região IL do mPFC41. Os camundongos Nex-Cre têm um fundo C57Bl/6 e expressam a enzima Cre-recombinase especificamente em neurônios piramifeais. Durante uma cirurgia estereotática, o CHR2-DNA floxado duplo é injetado na região do IL através de vetores virais associados ao Adeno. O implante óptico é colocado diretamente acima da região de interesse(Figura 1B)e o implante é fixado com cimento dental. Os animais de controle recebem uma injeção de tdTomato-DNA floxado duplo na mesma região para imitar a expressão específica das células.
Os animais são alojados em grupo até o dia da cirurgia e depois são alojados para evitar ferimentos de outros camundongos. Os ratos são alojados em racks de gaiola ventilada individual (IVC) em gaiolas TypI-L para ratos alojados. O ciclo claro-escuro segue um ritmo de 12:12 h, a fase de luz começando às 10:00. Todos os experimentos comportamentais são realizados na fase escura, que se assemelha à fase ativa dos roedores. Pelotas de água e alimentos padrão estão disponíveis ad libitum. Após duas semanas de recuperação, o que garante uma expressão suficiente de ChR2 em neurônios piramidários, os camundongos são usados para experimentos comportamentais.
O Campo Aberto (OF) é um labirinto quadrado de 50 cm x 50 cm com paredes de 40 cm de altura. O solo é dividido em 16 praças onde o interior 4 representa o centro. O comportamento medido é: 1) tempo gasto no centro, 2) número de entradas centrais e 3) distância total movida. Durante este experimento, há 4 ensaios totalizando 20 minutos. Nos ensaios 1 e 3, não ocorre estimulação de luz, e nos ensaios 2 e 4, é realizada uma estimulação de 20 Hz com pulso de luz de 5 ms e intensidade de luz de 1 mW de 473 nm(Figura 2A). Nos ensaios posteriores, a habitação na área de testes foi levada em conta, mas o uso de animais de controle injetados em farsas indica como a habitação é expressa.
O Labirinto Barnes é um experimento para aprendizado e memória. É uma plataforma circular de 92 cm de diâmetro e contém 20 orifícios equidistantes ao redor da circunferência. 19 dos buracos estão fechados e sob um buraco uma caixa de escape é apresentada. Por 4 dias consecutivos, os ratos têm 4 testes de treinamento para saber a localização da caixa de escape. No5º dia, a caixa de escape é removida, e os ratos são testados sobre quanto tempo precisam para encontrar o buraco correto. O comportamento medido é: 1) Tempo até que a caixa de escape/orifício correto seja encontrado, 2) Número de visitas e erros de destino e 3) Distância movida até na caixa de escape. A estimulação leve em diferentes grupos é feita durante a aquisição ou consolidação, que ocorrem nos dias de treinamento 1-4, ou durante a recuperação no dia do teste, que é o dia 5(Figura 2D).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61023/61023fig2v2.jpg"> Figura 2: Experimentos comportamentais com protocolos optogenéticos. A) Desenho esquemático do experimento Campo Aberto com o protocolo de estimulação de luz correspondente. C) Desenho esquemático do experimento Elevated-Plus Maze com o protocolo correspondente de estimulação da luz. D) Desenho esquemático do experimento do Labirinto barnes com o protocolo de estimulação de luz correspondente. EPM: Labirinto de elevação; DE: Campo Aberto; BM: Teste do Labirinto barnes. Este número foi modificado a partir de Berg 201948. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61023/61023fig2v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Para a estimulação optogenética, a intensidade e a frequência da luz devem ser adaptadas à ferramenta optogenética e ao tipo neuronal que está sob investigação. A menor intensidade de luz possível deve ser usada para evitar danos ao tecido, pois vários estudos têm demonstrado que há possíveis efeitos de aquecimento devido à forte intensidade da luz8,,20. Para ChR2, uma estimulação de 20 Hz com pulso de luz de 5 ms é comumente usada2. Como o ChR2 é bastante sensível à luz, a intensidade da luz de 1 mW é suficiente. O protocolo de estimulação da luz alterna entre a luz desligada e os ensaios para medir diretamente as mudanças comportamentais. As condições externas do quarto para experimentos comportamentais devem permanecer estáveis para todo o grupo de animais. Condições importantes a serem consideradas são o ruído (tenha em mente que os próprios dispositivos podem fazer barulho), o cheiro (sempre limpe as configurações comportamentais com etanol), a intensidade da luz e o experimentador. O experimentador deve ser sempre a mesma pessoa. Além disso, a hora do dia dos experimentos deve ser a mesma para todos os animais em um grupo, poucas horas após o início da fase escura na instalação é preferível.
O objetivo deste experimento é aumentar a proporção excitação/inibição (E/I) na região de IL através da forte ativação de neurônios piramimais excitatórios. Uma relação E/I aprimorada nesta região especial do córtex é conhecida por aumentar os níveis de ansiedade em camundongos40,42,43,44.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ketamin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K2753-64</td>
			<td>Anestasia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 % Glucose</td>
			<td>AlleMan Pharma</td>
			<td></td>
			<td>Injection s.c. for fast recovery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Behavioral mazes</td>
			<td>Costum made</td>
			<td></td>
			<td>Measure anxiety</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bepanthen</td>
			<td>Bayer</td>
			<td></td>
			<td>Ophthalmic oinment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betaisodona</td>
			<td>Monodipharma</td>
			<td></td>
			<td>Sterilant containing iodine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betaisodona</td>
			<td>Monodipharma</td>
			<td></td>
			<td>Iodine oinment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ52, 110AL0.62x WD160</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic ferrules</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CFLC230-10</td>
			<td>Implant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic Fiber Scribe</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CSW12.5</td>
			<td>Cutting of the glass fiber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Channelrhodopsin2-YFP virus</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>Addgene 20298</td>
			<td>Optogenetic tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed air</td>
			<td>Kontakt Chemie</td>
			<td>Druckluft 67</td>
			<td>Drying of the skull</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coordinate system</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td></td>
			<td>Stereotactic coordinates for the surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Correl Draw</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Graphical software version 13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryoslicer</td>
			<td>MICROM</td>
			<td>HM500OM</td>
			<td>Production of brain slices for staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethovision XT 14</td>
			<td>Noldus</td>
			<td></td>
			<td>Software for behavioral tracking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Statistical Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferrule Polishing Puck</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>D50-F</td>
			<td>Polishing implants round side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Patch Cord dual</td>
			<td>Prizmatix</td>
			<td>Optogenetics-Fiber 500, 1,20 m, Ferrule core 1,25 mm</td>
			<td>Cables, which are connected with the two implants of a bilateral implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Patch Cord single</td>
			<td>Prizmatix</td>
			<td>Optogenetics-Fiber 500, 1,20 m, Ferrule core 1,25 mm</td>
			<td>Cable, which is connected with the implant via a sleeve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Stripping Tool</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>T06S13</td>
			<td>Stripping glass fiber for implant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>VWR European</td>
			<td>516-0300</td>
			<td>Cut into pieces for the Novelty-Suppressed Feeding test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food pellets</td>
			<td>M&#252;hle Levers</td>
			<td>H&#246;veler Nagerfutter</td>
			<td>Nutrition for the mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipettes</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>GC150-10</td>
			<td>Injection pipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gradia direct-Flo</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>103322</td>
			<td>Fluid dental cementum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating lamp</td>
			<td>efbe-Schott/Phillips</td>
			<td>R95E</td>
			<td>Prevent the mice from cooling after the surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating plate</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td></td>
			<td>Integrated into coordinate system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection canula</td>
			<td>Braun</td>
			<td>100 Sterican, 0,4 x 20 mm, Gr. 20</td>
			<td>All injections and to bore hole into the skull</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Litter</td>
			<td></td>
			<td>T 1350</td>
			<td>Grounding for the Novelty-Supressed Feeding test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse cages</td>
			<td>Zoonlab</td>
			<td>405 cm^2</td>
			<td>Single housing for experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optibond FL</td>
			<td>Kerr</td>
			<td>26684E</td>
			<td>Preparation of the skull for implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical glass fiber</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FT200EMT</td>
			<td>Light fiber for implant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optogenetics-LED.STSI</td>
			<td>Prizmatix</td>
			<td></td>
			<td>Optogenetic toolbox for light stimulation during behavioral experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>16005-1KG-R</td>
			<td>Perfusion of mice to remove the brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polishing sheet 0.02 &#181;m grit</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LFCF</td>
			<td>Polishing implants round side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polishing sheet 1 &#181;m grit</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LF1D</td>
			<td>Polishing implants round side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polishing sheet 30 &#181;m grit</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LF30D</td>
			<td>Polishing implants round side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polishing sheet 6 &#181;m grit</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LF6D</td>
			<td>Polishing implants round side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulser Software</td>
			<td>Prizmatix</td>
			<td></td>
			<td>Software for light device control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rimadyl-Carprofen</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td></td>
			<td>Analgesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma Plot</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Software for statistics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sleeve</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FT200EMT</td>
			<td>Connection of implant and light cable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SodiumCloride (NaCl)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>3570410</td>
			<td>Rinsing of the skull</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superglue</td>
			<td>Pattex Henkel</td>
			<td></td>
			<td>To Fix the glass fiber in the ferrule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>td-Tomato virus</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>Addgene 51503</td>
			<td>Optogenetic tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV light</td>
			<td>KoQGHJ</td>
			<td>wireless, 1200 mW/cm^2</td>
			<td>Polymeration lamp for dental cementum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylavet-Xylazin</td>
			<td>cp pharma</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optogenetic manipulation of neuronal activity to modulate behavior in freely moving mice

A modulação optogenética dos circuitos neuronais em camundongos em movimento livre afeta o comportamento agudo e de longo prazo. Este método é capaz de realizar manipulações de neurônios únicos e liberação de transmissor específico da região, até circuitos neuronais inteiros no sistema nervoso central, e permite a medição direta dos desfechos comportamentais. Os neurônios expressam ferramentas optogenéticas através de uma injeção de vetores virais que carregam o DNA de escolha, como o Channelrhodopsin2 (ChR2). A luz é trazida para regiões cerebrais específicas através de implantes ópticos crônicos que terminam diretamente acima da região alvo. Após duas semanas de recuperação e expressão adequada da ferramenta, os camundongos podem ser usados repetidamente para testes comportamentais com estimulação optogenética dos neurônios de interesse.
A modulação optogenética tem uma alta resolução temporal e espacial que pode ser realizada com alta especificidade celular, em comparação com os métodos comumente utilizados, como estimulação química ou elétrica. A luz não prejudica o tecido neuronal e, portanto, pode ser usada para experimentos de longo prazo, bem como para múltiplos experimentos comportamentais em um rato. As possibilidades de ferramentas optogenéticas são quase ilimitadas e permitem a ativação ou silenciamento de neurônios inteiros, ou mesmo a manipulação de um tipo específico de receptor por luz.
Os resultados desses experimentos comportamentais com estimulação optogenética integrada visualizam diretamente as mudanças de comportamento causadas pela manipulação. O comportamento do mesmo animal sem estimulação de luz como base é um bom controle para mudanças induzidas. Isso permite uma visão geral detalhada dos tipos neuronais ou sistemas neurotransmissores envolvidos em comportamentos específicos, como a ansiedade. A plasticidade das redes neuronais também pode ser investigada em grande detalhe através de estimulação de longo prazo ou observações comportamentais após estimulação óptica. A optogenética ajudará a iluminar a sinalização neuronal em vários tipos de doenças neurológicas.

O objetivo deste protocolo é medir mudanças no comportamento de camundongos geneticamente modificados durante um experimento optogenético. A manipulação optogenética é feita por injeção de um vetor viral associado a adeno. A estimulação leve em camundongos em movimento livre é possível através da implantação de uma fibra de luz diretamente acima da região de interesse.
Na Figura 4,são apresentados os resultados de um experimento optogenético. Uma forte ativação de neurônios piramimatais excitatórios na região do IL via ChR2 aumentou o comportamento relacionado à ansiedade no Campo Aberto. ChR2 foi injetado na região IL do mPFC em camundongos Nex-Cre para expressão em neurônios piramimatais(Figura 4A). Durante dois testes de ansiedade, o Campo Aberto (Figura 4B,C) e o teste de Alimentação Suprimida da Novidade(Figura 4F,G), ChR2 é estimulado com luz azul e ativa neurônios piramimatais. Como controle, outro grupo de camundongos recebeu uma injeção do fluorohore tdTomato em vez de ChR2 (Figura 4D,G). Em tal experimento, a ansiedade é definida como evitar a área central mais brilhante. Os ratos mostram uma evitação intrínseca de áreas abertas porque estão ansiosos por predadores.
No experimento Open Field, mostrado na Figura 4B,os ratos executaram 4 ensaios de 5 minutos cada. Nos ensaios 1 e 3 não ocorreu estimulação de luz (Off1,2) e nos ensaios 2 e 4, foi realizada estimulação de luz azul com 20 Hz (pulso de luz de 5 ms) e intensidade de 1 mW (On1,2). Os heatmaps mostram que, no grupo experimental, a duração central difere entre os ensaios Off e On. Durante a estimulação da luz, os ratos ficam preferencialmente na zona de fronteira. Os animais de controle também preferem a fronteira, mas não mudam seu comportamento em vez de estimulação de luz. Na Figura 4C,as principais medidas comportamentais durante o experimento open field são mostradas para o grupo experimental. Se os dados passaram no teste Shapiro-Wilk para normalidade, as estatísticas foram feitas com um teste t independente de duas caudas. Se o teste de normalidade falhou, o teste Mann-Whitney-Rank Sum foi usado como alternativa não paramétrica. Para esses tipos de experimentos, foi escolhida uma comparação dentro do grupo para investigar se a estimulação da luz pode mudar diretamente o comportamento de ansiedade ao longo do tempo, independente da ansiedade da linha de base dos animais experimentais e de controle. A duração do centro diminuiu significativamente durante ambos os ensaios de estimulação da luz, indicando aumento dos níveis de ansiedade. A distância total movida não foi alterada, mostrando que o comportamento locomotor não foi afetado. O número de entradas do centro aumentou, embora não significativamente. Na Figura 4D,os dados do grupo controle são mostrados. Os animais de controle não apresentaram alterações comportamentais entre ensaios Off e On em nenhum dos parâmetros analisados, mostrando que a estimulação ou implantação da luz não causaram os efeitos observados. Em suma, este teste mostra aumento da ansiedade durante a estimulação leve de neurônios piramimatais il via ChR2.
Na Figura 5,os dados de um experimento optogenético mal sucedido são mostrados para o Labirinto Elevated-Plus. Durante o experimento Elevated-Plus Maze, que é apresentado na Figura 5A,os ratos completaram 6 ensaios de 3 minutos cada. Nos ensaios 1, 3 e 5 não foi realizada estimulação de luz (Off1, Off2, Off3) e nos ensaios 2, 4 e 6, estimulação de luz azul com 20 Hz (pulso de luz de 5 ms) e intensidade de 1 mW (On1, On2, On3). Nestes resultados exemplares, o comprimento do protocolo optogenético e a construção do labirinto em si não foram adequados para a linha de camundongos transgênicos. Na Figura 5B,pode-se ver que vários ratos escorregaram do labirinto com suas patas traseiras ou até mesmo caíram. Quando isso aconteceu, os ratos tiveram uma segunda chance de realizar o EPM um dia depois. Se caíssem novamente, foram excluídos da análise. Quando os ratos escorregaram várias vezes, mas conseguiram ficar no labirinto, os dados foram analisados normalmente. No entanto, os dados devem ser interpretados com muito cuidado e controlar os animais ganha maior importância. Os ratos Nex-Cre tiveram dificuldades motoras para ficar em braços abertos estreitos. Para evitar isso, pequenas paredes, com uma altura de 1 cm, teriam ajudado a segurar as patas traseiras nos braços do labirinto. Tanto os mapas de calor quanto os gráficos mostram que os ratos experimentais, bem como os de controle, começaram a evitar o braços abertos do ensaio 2 (On1) on(Figura 5C-E). O tempo em braços abertos é significativamente reduzido para ambos os grupos, assim como as entradas de braço aberto. A análise do grupo experimental obteve apenas dados implicando um grande efeito ansiogênico da estimulação da luz, uma vez que o tempo no braço aberto e as entradas do braço aberto são significativamente diminuídos durante o ensaio On1. No entanto, ao comparar esses dados com o grupo controle, que mostram o mesmo comportamento, fica claro que o comportamento observado não é mediado pela estimulação optogenética, mas pela evasão dos braços abertos em geral devido à habitação ao labirinto. Esses dados ressaltam a importância de um grupo de controle adequado para distinguir entre efeitos comportamentais mediados pela estimulação optogenética e possível adaptação comportamental. Além disso, esses dados esclarecem a importância de adaptar adequadamente uma configuração experimental para se adequar à linha de mousse específica e à questão experimental.
Para validar e fortalecer os dados comportamentais coletados, os cérebros dos camundongos são removidos após o último experimento para controlar a injeção e implantação corretas(Figura 6). Cérebros são fixados em 4% de paraformaldeído e removidos do crânio. Cérebros são desidratados em 30% de sacarose por 1-2 dias e crioslicados depois. As fatias cerebrais coronal de 40 μm de espessura são lavadas e montadas em lâminas objetivas superfrost com um meio de montagem contendo DAPI, que mancha núcleos celulares. Isso permite a identificação de áreas alvo nas fatias coronais. A fluorescência da tag YFP ou do próprio tdTomato indica a localização da injeção do vírus. Na Figura 6B são apresentados os locais de injeção exemplar de ChR2-YFP à esquerda (amarelo) e tdTomato à direita (vermelho). Com a ajuda de um modelo, adaptado do atlas cerebral do rato Paxinos e Franklin45, a região do IL pode ser identificada. Em ambos os slides, a ferramenta optogenética é expressa na região de IL, mas também em regiões cerebrais adjacentes. Para uma interpretação adequada, a disseminação da luz azul no tecido cerebral é consultada8 (Figura 1D,E). Observa-se que a luz azul atingirá a região DP abaixo da IL com apenas menos de 5% da intensidade inicial de luz de 1 mW na ponta de fibra (linha azul na Figura 1D)8. Além disso, uma pequena quantidade de luz pode ir para cima para a região da PrL devido à dispersão de47. Consequentemente, pode-se dizer que a região do IL é mais fortemente iluminada, porém regiões adjacentes como a DP e a região da PrL também podem ser ligeiramente estimuladas. Portanto, a estimulação específica das células IL não é garantida e a análise imunohistoquímica das regiões adjacentes deve ser realizada, para ver se a atividade das células prl e DP é modulada via luz. Na Figura 6C,outro controle importante é mostrado: a especificidade da linha de mouse Nex-Cre. Através da coloração de anticorpos contra os dois tipos de células na região do IL, neurônios princípio glutamatergic e interneurônios GABAérgicos, pode-se ver que a expressão ChR2-YFP só ocorre em neurônios glutamatericos e não com os gabaérgicos.
Em suma, nossos experimentos mostram que, com a manipulação optogenética durante os testes comportamentais, mudanças no comportamento relacionado à ansiedade poderiam ser observadas. Ao usar mais de um teste para o mesmo comportamento, uma conclusão confiável pode ser tirada. Além disso, a análise imunohistoquímica confirma os dados obtidos. Nossos experimentos sugerem que a ativação específica de neurônios piramidários no córtex infralímbico aumentou o comportamento relacionado à ansiedade em certos ensaios.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61023/61023fig04v4.jpg"> Figura 4: Ativação optogenética de neurônios piramiheiros il aumenta o comportamento de ansiedade. Estimulação de luz durante experimentos: 473 nm, 1 mW, estimulação de 20 Hz. A) Desenho esquemático do local de injeção e implantação para ChR2-YFP ou tdTomato no IL. Durante o experimento, os neurônios piramihados na região il do mPFC são ativados por ChR2. Fatias cerebrais saggitais adaptadas do atlas cerebral do rato Paxinos e Franklin, saggital: lateral o,6. B) Labirinto de campo aberto com protocolo de estimulação de luz (20 min com 4x5 min alternando Off e On trials; esquerda) e mapas de calor de camundongos exemplares injetados chr2(EXP) e tdTomato-injected (CT) em todos os 4 ensaios do experimento (à direita). Os animais EXP passam menos tempo no centro do OF quando estimulados com luz laser azul. Para os animais de tomografia, o tempo gasto no centro não difere entre os ensaios Light Off e On. C) Dados do grupo para animais EXP no OF, n=11. Os camundongos passam significativamente menos tempo no centro do OF quando estimulados com luz azul (Off1 39.49±6.9 s, On1 19.87±4.47 s, Off2 28.13±8.55 s, On2 23.42±9.32 s, Off1:On1, t-test, p = 0,033, *; Off1:On2, MWRS, p=0,049, *). A distância movida não é afetada (Off1 2703.09±292,65 cm, On1 3113.4±491,15 cm, Off2 3331,86 ±482,62 cm, On2 3082,17±658,61 cm). # de entradas centrais diminuem com o tempo, mas não mostram diferenças significativas (Off 1 22.36±3.78, On1 18.45±3.95, Off2 17.36±1.99, On2 13.27±2.64). D) Dados do grupo para animais de tomografia no OF, n=15. Tempo que os ratos passam no centro do OF, a distância movida, # de entradas centrais não muda entre os ensaios light On and Off (Time in center Off116.73±2.65 s, On1 16.02±1.89 s, Off2 12.02±1.76 s, On2 13.04±2.58 s; Distância Off1 3399,69±296,77 cm, On1 3210,6±446,9 cm, Off2 3030,28±513,83 cm, On2 2955±617,7 cm; # das entradas centrais Off1 14.2±1.98, On1 13.6±2.02, Off2 10.8±1.88, On2 11.67±2.5). Os camundongos ct apresentam ansiedade de linha de base significativamente maior (Off1 EXP:CT, MWRS, p=0,005, **). Os valores são médios±S.E.M. * indicam diferenças significativas (p≤0,05), ** indicam diferenças significativas (p≤0,01). t-test sempre duas caudas, MWRS: Teste Mann-Whitney Rank Sum; IL: córtex infralimico; BLA: amígdala basolateral; DRN: núcleos de raphe dorsal; DE: Campo Aberto; CT: controlar animais; EXP: animal experimental; L: luz. Este número foi modificado a partir de Berg et al. 2019, PLoS One43 e de Berg 201948. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61023/61023fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61023/61023fig5v4.jpg"> Figura 5: O experimento EPM falhou em mostrar efeitos comportamentais em camundongos Nex-Cre. Estimulação de luz durante experimentos: 473 nm, 1 mW, estimulação de 20 Hz. A) Labirinto de Elevação-Plus com protocolo de estimulação de luz (18 min, 6x3 min, alternando off e on trials). B) Os dados do grupo dos camundongos que "escorregam" estão incluídos nos dados, total n=23. Os ratos Nex-Cre tinham a tendência de escorregar do braço aberto com as patas traseiras, independente do grupo experimental (esquerda). Apenas ratos que permaneceram no labirinto para todos os 6 ensaios foram considerados em análises posteriores. Os deslizes na primeira fase Off1 são motivo para evitar os braços abertos (Off1 EXP 1.63±0.6, CT 2.2±0.79, Off2+3 EXP 0.125±0.125, CT 0±0, On1+2+3 EXP 0.625±0.26, CT 0.1±0.1). Gráfico de tortas (à direita) mostra ratos caindo do labirinto durante os 18 minutos com 42,42%. Apenas 57,57% terminaram o experimento. C) Mapas de calor de exp exemplar e camundongos CT em todos os 6 ensaios do experimento. Ambos os grupos mostram uma diminuição na duração do braço aberto após o teste Off1. D) Dados do grupo para animais EXP no EPM, n=12. O tempo gasto em braços abertos diminuiu significativamente durante os dois primeiros ensaios e constantemente depois (Off1 73.91±12.22 s, On1 36.15±14.65 s, Off2 15.61±6.23 s, On2 19.49±7.51 s, Off3 9.36±4.44 s, On3 7.96±3.47 s. Off1:On1, t-test, p=0,041, *). A distância movida não é afetada (Off1 679,96±71,63 cm, On1 712,24±112,82 cm, Off2 717,49±97,39 cm, On2 782,51±81,11 cm, Off3 722,11±68,60 cm, On3 663,90±106,57 cm). A quantidade de entradas de braço aberto diminui significativamente de Off1 para On1 e, em seguida, permanece constante (Off1 8.08±1.08, On1 3.33±0.76, Off2 2.16±0.69, On2 2.91±1.09, Off3 1.73±0.75, On3 1.73±0.66. Off1:On1, t-test, p=0,002, **). O tempo gasto no centro do EPM diminui ao longo dos ensaios, mas não mostra diferença significativa de Off to On trial (Off1 41.71±5.34 s, On1 31.2±4.59 s, Off2 19.8±3.44 s, On2 24.49±3.38 s, Off3 20.37±4.77 s, On3 18.85±4.07 s). E) Dados do grupo para animais de tomografia no EPM, n=11. Os dados da CT mostram as mesmas reduções significativas dos dados exp, indicando que o experimento não funcionou corretamente (Tempo em braços abertos Off1 86,92±12,74 s, On1 33.78±14.38 s, Off2 18.01±11.61 s, On2 16.41±9.61 s, Off3 11.36±4.01 s, On3 5.43±2.07 s. Off1:On1, MWRS, p=0.009, **; Distância Off1 705,11±88,36 cm, On1 789,45±77,53 cm, Off2 724,74±80,49 cm, On2 676,57±111,99 cm, Off3 716,99±132,47 cm, On3 663,03±132,46 cm; Inscrições abertas de braço Off1 7.09±1, On1 3.72±1.17, Off2 1.45±0.47, On2 1.36±0.58, Off3 0.91±0.43, Off3 1.64±0.59. Off1:On1, MWRS, p=0,01, *; Tempo de passar no centro Off1 35.89 s, On1 29.25±3.96 s, Off2 22.17±3.58 s, On2 15.9±2.57 s, Off3 13.86±4.2 s, On3 16.89±5.75 s). Os valores são médios ± S.E.M. * indicam diferenças significativas (p≤0,05), ** indicam diferenças significativas (p≤0,01). t-test é sempre de duas caudas, MWRS: Mann-Whitney Rank Sum teste; EPM: Labirinto de elevação; CT: controlar animais; EXP: animal experimental; Braços abertos. Este número foi modificado a partir de Berg et al. 2019, PLoS One43 e de Berg 201948. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61023/61023fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61023/61023fig06.jpg"> Figura 6: Lado de injeção de ChR2 e tdTomato na especificidade IL e Nex-Cre. A) Desenho esquemático do local de implantação em fatias cerebrais coronais em AP + 1,66 mm, mL 0,3 mm, DV -1,8 mm, com injeção e implantação unilaterais (adaptado do atlas cerebral do rato, Paxinos e Franklin, Bregma +1,54 mm). B) Locais de injeção exemplar de ChR2-YFP (esquerda, amarelo) e tdTomato (direita, vermelho) fundidos com núcleos celulares manchados de DAPI (azul) em camundongos Nex-Cre. Barra de escala 1 mm. Os insets mostram alta ampliação da região de IL. Barra de escala 150 μm. Caixas brancas indicam localização deentradas. C) Linha superior: imagens confocal da região il esquerda de um mouse Nex-Cre manchado com CamKII como um marcador para neurônios glutamatericos (azul), e ChR2-YFP (amarelo) ou Gad67 como um marcador para neurônios GABAérgic (verde), de um rato Nex-Cre. Linha inferior: colocalização de ChR2-YFP (amarelo) com CamKII (esquerda, azul), mas não com Gad67 (direita, verde), mostrando especificidade dos camundongos Nex-Cre para neurônios glutamatericos. Barra de escala 50 μm. PrL: córtex pré-limítromico; IL: córtex infralimico; DP: córtex peduncular dorsal. Este número foi modificado a partir de Berg et al. 2019, PLoS One43 e de Berg 201948. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61023/61023fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity to Modulate Behavior in Freely Moving Mice

Com a manipulação optogenética de populações neuronais específicas ou regiões cerebrais, o comportamento pode ser modificado com alta resolução temporal e espacial em animais em movimento livre. Usando diferentes ferramentas optogenéticas em combinação com fibras ópticas cronicamente implantadas, uma variedade de modulações neuronais e testes comportamentais podem ser realizados.

Manipulação optogenética da atividade neuronal para modular o comportamento em camundongos em movimento livre

Optogenetic modulation of neuronal circuits in freely moving mice affects acute and long-term behavior. This method is able to perform manipulations of ...

Com a manipulação optogenética de populações neuronais específicas ou regiões cerebrais, o comportamento pode ser modificado com alta resolução temporal e espacial em animais em movimento livre. Usando diferentes ferramentas optogenéticas em combinação com fibras ópticas cronicamente implantadas, uma variedade de modulações neuronais e testes comportamentais podem ser realizados. O objetivo final da optogenética é a modulação de circuitos neuronais com alta resolução temporal e espacial no animal comportado.Em contraste com as manipulações farmacológicas ou elétricas, a optogenética permite o controle preciso de tipos celulares específicos em circuitos neuronais. A optogenética é a maneira perfeita de atingir tipos de células específicas em regiões especialmente definidas durante o comportamento, e examinar o efeito direto das mudanças nesses microcircuitos. Apresentaremos agora um passo para orientar como preparar e plantar e conduzir a optogenética em um camundongo em movimento livre.Para a preparação do implante óptico, coloque um lado plano de ferrule de cerâmica em um torno de banco. Retire o código de uma fibra de vidro de 200 micrômetros de diâmetro, com uma ferramenta de descascamento de fibras e corte de dois a três centímetros não peças com um escriba de fibra cerâmica. Coloque o pedaço de fibra de vidro na ferrule cerâmica e coloque uma gota de uma supercola no lado plano com um cannular de injeção.No lado redondo da ferrule cerâmica, corte a fibra de vidro o mais curto possível e coloque o pré-implante em um disco de polimento de ferrule para polir o lado redondo em quatro artigos de publicação diferentes. Em seguida, corte a fibra de vidro no lado plano da ferrule cerâmica, ao comprimento necessário para a implantação. Use um atlas cerebral do rato para calcular o comprimento do implante.O implante tem que terminar diretamente acima da região de interesse. Antes da implantação, a anestesia é aplicada. A técnica precisa e estética é descrita no manuscrito.Quando o mouse atingir um estado profundo de anestesia, coloque-o em uma placa de aquecimento e fixe a cabeça em um quadro estereotático. Conserte o nariz e os dentes na frente e as orelhas de ambos os lados. Aplique uma algesia com um cuprofen subcuntanesamente na parte de trás do mouse e aplique pomada opaca nos olhos em ambos os olhos para protegê-los da secagem.Umedeça o cabelo no couro cabeludo com uma toalha de papel molhada e depois corte-o usando uma tesoura. Certifique-se de remover todos os cabelos soltos com uma toalha de papel molhada. Use uma vara de algodão para desinfetar o couro cabeludo com uma tintura contendo iodo.Levante o couro cabeludo sobre a região de interesse com uma pinça e corte um centímetro ao longo da linha média. Para endurecer o crânio para implantação, aplique uma pequena quantidade de ácido fosfórico na cicatriz e deixe-o fazer efeito por 15 segundos. Remova todo o ácido com uma vara de algodão e enxágue a cicatriz com cloreto de sódio duas vezes.Para uma injeção adequada, calcule o fator F para coordenadas individuais. Coloque um cannular de vidro na estrutura estereoctática e localize-o diretamente acima do bregma. Agora zero o sistema de coordenadas e mova a cânula de vidro para Lambda.Calcule o fator F com a seguinte fórmula. Bregma menos Lambda dividido por 4,2 é igual ao fator F. Coordenadas exatas são muito importantes para injeção e implantação porque caso contrário, se a estrutura errada é estimulada, então os efeitos comportamentais são inespecíficos.Todos os ratos têm desvios mínimos no tamanho de seu crânio, portanto, o coeficiente é absolutamente obrigatório. Use as coordenadas ajustadas para encontrar a localização da cicatriz diretamente acima da estrutura de interesse. Use uma cânula de injeção para fazer um buraco no crânio, girando a cânula no local.Para levar uma solução de vírus para a cânula de vidro conectada à seringa, coloque uma gota de cloreto de sódio no crânio e um pedaço de pirofeno em cima. Coloque uma gota de duas soluçãos de vírus microliter no pirófeno e baixe a ponta da cânula de vidro no vírus. Aplique pressão negativa e espere até que a solução do vírus seja tomada pela cânula.Zero para essa coordenada quando a ponta do vírus com cânula está no nível do crânio e lentamente abaixa-lo para o furo para a posição mais baixa do lado da injeção. Aplique uma pequena quantidade de pressão positiva com a seringa até que o menisco seja reduzido. Deixe o vírus se espalhar por dois a três minutos antes de mover a cânula de vidro para cima para a próxima posição.Remova a cânula de vidro muito lentamente e descarte-a após a injeção final. Agora prepare o crânio para implantação. Seque o crânio com ar comprimido, aplique o primer com esta vara correspondente e deixe secar por 15 segundos.Aplique o vínculo com a mesma vara e cure-o por 20 segundos com luz UV. Coloque o implante no suporte correspondente e posicione a ponta da fibra de vidro diretamente acima do furo e abaixe-o cuidadosamente. Pare de baixar o implante quando a válvula restante da supercola tocar o crânio.A implantação de fibras ópticas também pode ser feita para estruturas bilaterais como o hipocampo. Isso permite uma leve estimulação em ambos os hemisférios ao mesmo tempo ou permite a estimulação de duas estruturas diferentes. Também é possível injetar o vírus em um local diferente do implante de fibra óptica.Se a injeção e a implantação estiverem sendo feitas em diferentes regiões, faça todos os orifícios necessários após a aplicação do ácido fosfórico, mas antes da adesão dos dois componentes. Verifique novamente se o crânio ainda está completamente seco, em seguida, aplique cimento dental fluido ao redor do implante e na área circundante, em seguida, cure por 20 segundos com luz UV Aplique mais dois cimento menor em área de crânio completamente livre de peles e seca. Cure cada camada com luz UV.Para terminar a cirurgia aplique unção de iodo em toda a ferida. Solte a fixação do nariz e da orelha, leve o mouse para uma gaiola fresca e coloque-o sob uma lâmpada de aquecimento para evitar a perda de calor corporal. Verifique seu estado de saúde pelo menos uma vez por dia e ele seguirá o posto operacional e algesia após três dias, se necessário.Após duas semanas de recuperação, os ratos podem ser usados para experimentos comportamentais. Abra o Software Pulser e selecione a porta USB com na sua origem de luz. Escolha o modo de operação três para permitir que um software externo controle a fonte de luz.Escolha o ajuste correto para 20 estimulação hertz com pulso de luz de cinco milissegundos. Para localizar a divisão para se comunicar com o pulsador, pressione a sequência inicial. Este status permanecerá até que os experimentos estejam concluídos.Agora, crie um novo experimento no EthoVision XT, vá para o arquivo, escolha novo do modelo e selecione aplicar um modelo predefinido. Escolha o rastreamento ao vivo e selecione a câmera com origem e confirme a câmera Puslar Gen-Eye conectada. Escolha o mouse como o animal que deve ser gravado.Selecione o modelo de arena, praça de campo aberto e o centro de modelo de zona, borda, cantos. Confirme um assunto que deve ser rastreado e selecione o ponto central, o ponto do nariz e a base da cauda. Confirme a cor animal em comparação com o fundo é mais escura e a taxa de amostra recomendada para terminar a etapa.Nomeie o experimento apropriado e escolha um local para salvar. Até encontrar as configurações da arena, a câmera abrirá automaticamente uma imagem de fundo. Adapte as zonas predefinidas à arena real usando a seta e os dois símbolos em seu direito.Se algumas zonas forem desnecessárias, exclua-as. Pressione a escala de desenho para calibrar e coloque uma linha de um canto do labirinto para o outro. Digite o comprimento da distância real em centímetros.Repita isso para o outro eixo. Para definir as configurações de controle de ensaio, prepare a regra principal ajustando o tempo de condição para 20 minutos. A condição para Star Trek deve ser, quando o assunto está na arena por dois segundos, para um status automático do rastreamento quando o mouse está na arena.Para criar uma sub-regra para a estimulação da luz, vá para estruturas, mais e selecione sub-regra. Coloque-o abaixo da regra principal e espalhe as duas caixas. Vá para condições, tempo e dê-lhe um nome como luz em um, ajustar a condição é atendida após cinco minutos.Coloque a caixa logo atrás da regra Comece a caixa da sub-regra. Vá para ação hardware personalizado e nomeie-o com luz em um. Selecione ação para executar como:Vou colocar uma alta.Coloque a caixa diretamente atrás da caixa de condição. Repita os passos para programar a luz acesa. Agora vá para estruturas, sub-regra referência e verifique se a referência pertence à sub-regra correta.Escolha condições de partida sem demora e inicie condições como executar uma vez por condição de partida. Coloque a caixa de referência entre os livros extras um e os livros de condição dois da regra principal. Agora defina as configurações de detecção para mostrar ao sistema o que ele deve rastrear.Coloque uma milhas de teste na arena e selecione a configuração automatizada. Escolha roedor como tipo animal e use o cursor do mouse para desenhar uma caixa ao redor dos ratos na arena. Confirme os resultados da pergunta de cuidado com sim.Para o experimento de campo aberto, leve o mouse experimental para a sala de comportamento logo antes do experimento para garantir um nível adequado de ansiedade. Acoplado o rato ser uma fenda da fonte de luz pressionando-o suavemente para a grade da gaiola. Coloque-o em uma gaiola de espera com lixo fresco por 10 minutos para se aclimatar ao cabo de luz.Inicie a aquisição pressionando o botão stop e você para a visão XT. Transfira o mouse da gaiola de espera para o canto superior esquerdo do campo aberto. Deixe o campo visual do mouse durante o experimento e mantenha a calma. Após 20 minutos, quando o experimento estiver concluído, remova o mouse do labirinto, desconecte o cabo de luz e coloque-o de volta em sua própria gaiola.Por uma visualização de verificação, as diferenças no tempo central entre a luz desligada e a luz nos rostos podem ser vistas diretamente. O rato passa menos tempo no centro quando a luz está acesa. Para o experimento do labirinto Barnes, traga todos os ratos experimentais para a sala de comportamento cerca de uma hora antes do experimento.Prepare o labirinto barnes fechando todos os buracos, exceto um, e agora que uma caixa de fuga é colocada. Conecte um rato na fonte de luz em ambos os implantes e coloque-o diretamente no meio do labirinto Barnes. Pressione o start e precisa visitar o próximo T e remover a caixa de caixa.Esteja preparado para parar o teste manualmente apenas no caso de o software não reconhecer toda a transição. Retire o mouse do labirinto e remova a conexão com o cabo de luz. Ao realizar, aprender e fazer a tarefa de memória, não apenas o efeito imediato da manipulação é investigado, mas também o efeito a longo prazo da manipulação durante a aquisição, consolidação ou recuperação.Para análise de dados, você encontra a condição de tratamento tratada ou controlada, vai para o ninho e seleciona o estado de controle de ensaio. Escolha o intervalo de estado do elemento de ação Star Trek para o elemento luz de ação que acende um. Coloque a caixa de aninhamento entre o tratamento da caixa do filtro e a caixa de resultado correspondente.Este intervalo definido é de um. Repita as etapas para intervalos em um de dois e em dois como também para o grupo de controle. Também defina os parâmetros a serem analisados no perfil de análise.Escolha a variável dependente na zona e selecione o centro da zona, o ponto do corpo, o ponto central e vá para as estatísticas de ensaio. Selecione frequência, duração cumulativa e deixe lá para ver o primeiro. Adicione também o movimento de distância como variável.Com esse perfil, os dados do tempo gasto no centro, entradas do centro e ditos para a mudança à distância estão disponíveis. Para extrair dados de cada divisão, vá para resultados e selecione estatísticas e gráficos, pressione calcular para ver os dados analisados. Pressione os dados de exportação e selecione as estatísticas de teste e o local a ser salvo.Os dados exportados são salvos como um arquivo excel e com valores individuais para cada mouse. Além disso, vá para visualização de mapas de calor e pressione mapas de calor do gráfico, selecione testes à direita para ver mapas de calor individuais para cada mouse e teste. Faça um clique com o botão direito do mouse e exporte os mapas de calor como imagens.Posteriormente, abra o arquivo excel do computador e calcule o SCM médio e padrão de euros para todos os quatro ensaios e cada grupo de condicionamento medido. Para gerar gráficos e plotagem Sigma, copie os meios e o SCM na ordem correta do arquivo extra para o gráfico Sigma. As linhas têm que conter os dados para fora um, em um, e as colunas contêm ensaio, médio e hertz SCM.Selecione as três colunas e vá para criar gráficos. Selecione a caixa de barras e escolha a caixa não agrupada com seta. Rotule todo o gráfico, vá para casa, selecione a caixa de gráfico e pressione a exportação.Selecione a pasta de destino e escolha meta arquivo como formato. Para calcular as estatísticas dos dados obtidos, copie os dados certos de Xcel um contra um, etc. e para colunas únicas do plot Sigma. Marque as colunas que deseja comparar e vá para análise, escolha o teste T e pressione.Finalmente, os dados comportamentais podem ser mostrados divididos em desapontação e em teste com especialização adicional do mapa de calor. No experimento de campo aberto, durante a estimulação leve de Channelrhodopsin2 e neurônios piramidários, a duração central é diminuída, o que indica aumento dos níveis de ansiedade. Através da imunohistoquímica, o local de injeção e a expressão do vírus podem ser determinados, também na especificidade da linha especial de camundongos dependentes de Cre pode ser validado.Pode-se ver claramente que a estimulação leve de Channelrhodopsin2 melhora os neurônios mentais desta região específica do córtex aumenta os níveis de ansiedade, em comparação com a ansiedade da linha de base antes dessa estimulação. Esse efeito imediato da manipulação do comportamento é a razão pela qual a optogenética é usada hoje em dia para tantas questões de pesquisa sobre o comportamento. Este procedimento pode ser usado para modulação optogenética de qualquer tipo de célula desejada ou circuitos neuronais no cérebro do camundongo.Ao combinar este procedimento com testes comportamentais adequados para sua pesquisa, uma visão mais profunda dos circuitos neuronais envolvidos em comportamentos e doenças de interesse pode ser adquirida.

Research

JoVE Journal

Behavior

Long-term Potentiation of Perforant Pathway-dentate Gyrus Synapse in Freely Behaving Mice

Potenciação de longo prazo da Via Perfurante-giro denteado Synapse em Livremente Comportando Ratos

Studies of long-term potentiation of synaptic efficacy, an activity-dependent synaptic phenomenon having properties that make it attractive as a potential ...

Comportamento

Uncovering Beat Deafness: Detecting Rhythm Disorders with Synchronized Finger Tapping and Perceptual Timing Tasks

Descobrindo batida Surdez: Distúrbios Detecção de ritmo com o dedo Sincronizado Tapping e Tarefas de temporização da Percepção

A set of behavioral tasks for assessing perceptual and sensorimotor timing abilities in the general population (i.e., non-musicians) is presented here ...

Flat-floored Air-lifted Platform: A New Method for Combining Behavior with Microscopy or Electrophysiology on Awake Freely Moving Rodents

Plataforma Ar levantou Flat-pavimentado: Um Novo Método para Combinando Comportamento com Microscopia ou Eletrofisiologia em Awake Roedores movendo-se livremente

It is widely acknowledged that the use of general anesthetics can undermine the relevance of electrophysiological or microscopical data obtained from a ...

A Novel Experimental and Analytical Approach to the Multimodal Neural Decoding of Intent During Social Interaction in Freely-behaving Human Infants

Uma nova abordagem experimental e analítico ao Neural Decodificação de Intenções Multimodal Durante Interação Social no Livremente-comportando bebês humanos

Understanding typical and atypical development remains one of the fundamental questions in developmental human neuroscience. Traditionally, experimental ...

Visualizing Motion Patterns in Acupuncture Manipulation

Visualizando padrões de movimento em Manipulação Acupuntura

Acupuncture manipulation varies widely among practitioners in clinical settings, and it is difficult to teach novice students how to perform acupuncture ...

The Rodent Psychomotor Vigilance Test (rPVT): A Method for Assessing Neurobehavioral Performance in Rats and Mice

The Rodent Psychomotor Vigilance Test rPVT: A Method for Assessing Neurobehavioral Performance in Rats and Mice

O psicomotora Teste Rodent Vigilância (rPVT): um método para avaliar Neurobehavioral Desempenho em ratos e camundongos

The human Psychomotor Vigilance Test (PVT) is a widely used procedure for measuring changes in fatigue and sustained attention. The present article ...

Manipulation of Epileptiform Electrocorticograms (ECoGs) and Sleep in Rats and Mice by Acupuncture

Manipulation of Epileptiform Electrocorticograms ECoGs and Sleep in Rats and Mice by Acupuncture

Manipulação de epileptiforme Electrocorticograms (ECoGs) e do sono em ratos e camundongos por Acupuntura

Ancient Chinese literature has documented that acupuncture possesses efficient therapeutic effects on epilepsy and insomnia. There is, however, little ...

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

Multi-layer Cortical Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Imaging em ratos com movimento livre com sondas de prisma e microscopia de fluorescência miniaturizada

In vivo circuit and cellular level functional imaging is a critical tool for understanding the brain in action. High resolution imaging of mouse cortical ...

A Wireless, Bidirectional Interface for In Vivo Recording and Stimulation of Neural Activity in Freely Behaving Rats

A Wireless, Bidirectional Interface for In Vivo Recording and Stimulation of Neural Activity in Freely Behaving Rats

Uma rede sem fio, Interface bidirecional para gravação na Vivo e estimulação da atividade Neural em livremente, comportando-se ratos

In vivo electrophysiology is a powerful technique to investigate the relationship between brain activity and behavior at a millisecond and micrometer ...

Assessing Activity-based Anorexia in Mice

Avaliar a Anorexia baseado na atividade em ratos

Rodents develop activity-based anorexia (ABA) when exposed to a restricted feeding schedule and allowed free access to a running wheel. These conditions ...