Name: optogenetic manipulation of neuronal activity to modulate behavior in freely moving mice
Uploaded: 2020-10-27T12:30:00
Duration: 14 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity to Modulate Behavior in Freely Moving Mice at JoVE.com

Gran agradecimiento al profesor Klaus-Armin Narve y a la Dra. Sandra Goebbels (Max-Plank-Institute of Experimental Medicine, Goettingen, Alemania) por proporcionar ratones Nex-Cre amablemente. Además, agradecemos a nuestro equipo de vídeo Yunus Dikici y Ruben Wiesner por la grabación y procesamiento del video de JoVE para este artículo. Además, gran agradecimiento a Kristin Claussen por su voz en off y Kimberly Anne Go por la corrección del manuscrito.
Los resultados presentados se obtuvieron en la Universidad Ruhr en Bochum y el video fue grabado en la Universidad de Bremen.
Este trabajo fue financiado por Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) - Projektnummer 122679504 - SFB 874 y DFG MA 4692/3-2.

Los autores no tienen nada que revelar.

La modulación de los circuitos neuronales en el sistema nervioso central y sus resultados conductuales son importantes para entender cómo funciona el cerebro, especialmente en enfermedades psiquiátricas y tareas cognitivas como el aprendizaje y la memoria. Con la optogenética, las células individuales o las poblaciones celulares hasta circuitos enteros pueden ser moduladas por la luz. Las herramientas optogenéticas comunes como Channelrhodopsin2 (ChR2) o Archaerhodopsin (Arch) son capaces de activar o silenciar las neuronas, o aumentar o inhibir la liberación del transmisor en terminales de axón que se proyectan a regiones cerebrales distintas1,,2,,3,,4. Sin embargo, Arch debe utilizarse cuidadosamente, ya que se demostró que su activación en terminales presinápticos aumenta la liberación espontánea del transmisor5. Arch es una bomba de protones rectificadora hacia afuera que cambia el valor de pH dentro de la célula. Este ambiente alcalino induce la afluencia de calcio y mejora la liberación del transmisor5. Para modular específicamente las vías de señalización intracelular, se pueden crear quimeras receptoras compuestas por una herramienta optogenética activable ligera, como rhodopsin o cono opsin, junto con un receptor acoplado adecuada a la proteína G,6,7,8. La cantidad y variación de las herramientas optogenéticas disponibles ha aumentado significativamente durante la última década9.
El propósito de la optogenética es manipular los circuitos neuronales durante el comportamiento. La optogenética permite, por ejemplo, la medición de cambios agudos de comportamiento, como cambios en el comportamiento de ansiedad. Las herramientas optogenéticas se entregan en las regiones diana del cerebro a través de vectores virales. Con la ayuda de promotores y potenciadores especiales, o el sistema Cre-loxP, se puede garantizar la especificidad del tipo de célula para la expresión de herramientas optogenéticas(Figura 1A). Hay varias líneas de ratón modificadas genéticamente que expresan la enzima Cre-Recombinase en tipos celulares específicos solamente. Por ejemplo, los ratones Nex-Cre expresan la Cre-Recombinase en neuronas piramidales en la corteza y el hipocampo bajo el control del Nex-promotor10. Esta enzima es capaz de invertir secuencias de ADN, que están flanqueadas por lados loxP11. En consecuencia, la secuencia de ADN de una herramienta optogenética de doble hilo uterino, que está invertida y flanqueada por lados loxP, sólo puede ser transcrita por neuronas que poseen la Cre-Recombinase,pero no por otros tipos neuronales12,,13. En el caso de los ratones Nex-Cre, la herramienta optogenética se expresará únicamente en neuronas piramidales. La estimulación lumítica de ciertas regiones cerebrales se logra a través de la implantación crónica de fibras ópticas directamente por encima de la región de interés. Los animales pueden entonces ser acoplados a una fuente de luz adecuada y comportarse libremente en casi todo tipo de pruebas de comportamiento.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61023/61023fig01.jpg"> Figura 1: Inyección e implantación. A) Sistema Cre-loxP para ChR2-YFP. La herramienta optogenética de doble floxado se embala en un virus asociado al adeno (AAV) para inyección en el tejido cerebral. B) Vista sagitular de la inyección e implantación del virus de una interfaz neuronal óptica dentro/por encima de la región IL del mPFC. La inyección y la implantación se realizaron desde arriba. Se muestran todas las regiones de interés, IL, BLA y DRN. C) Vista detallada de la fibra óptica implantada, manguito y fuente de luz. D) Difusión de la estimulación de la luz láser azul y roja en el tejido cerebral de materia gris a partir de una fibra de luz de 200 m (Yizhar et al. 2011). La luz azul se extiende, como máximo, 0,5 mm en el tejido, luz roja de aproximadamente 1 mm. Codificación de color: rojo 50%, amarillo 10%, verde 5%, azul 1% si la luz llega a esta área. E) Vista coronal de la implantación unilateral directamente por encima de la IL izquierda con una fibra óptica de 200 m. La región IL tiene una anchura de 0,25 mm en cada hemisferio y una profundidad de 0,2 mm. Las bombillas azules y rojas son la placa de 5% de propagación de luz y se transfieren de Yizhar et al al al tamaño correcto. LoxP: locus de X-over P1; ChR2: Channelrhodopsin; YFP: proteína fluorescente amarilla; dflox: doble floxado; IL: corteza inmórbida; BLA: amígdala basolateral; DRN: núcleos de raphe dorsal; PrL: región prelímpico. Esta cifra ha sido modificada de Berg 201948. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61023/61023fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Se utilizan enfoques optogenéticos, ya que permite una alta resolución temporal y espacial14 y una modulación específica del tipo de celda. Además, es posible utilizar repetitivamente el dispositivo implantado sin tratamiento adicional. Después de una cirugía estereotáctica, donde se realiza la inyección de un virus adeno-asociado que lleva la herramienta optogenética y la implantación de la fibra óptica, los ratones pueden recuperarse durante dos semanas. Hemos elegido un tiempo de recuperación de sólo 2 semanas, porque este es el tiempo suficiente para recuperarse de la cirugía y para que el virus se exprese. Como los experimentos conductuales son seguidos por inmunohistoquímica, tenemos que asegurarnos de que los ratones no se envejezcas demasiado durante el experimento; de lo contrario, la calidad del tejido disminuye. No muestran impedimentos de comportamiento evidentes del implante y se involucran en el comportamiento típico de la jaula. Por supuesto, la implantación se acompaña de una lesión quirúrgica significativa; por lo tanto, los ratones son monitoreados intensivamente. Después de la cirugía, los ratones necesitan ser alojados en un solo lugar, ya que los ratones alojados en grupo tienden a herirse a las heridas e implantes frescos de los demás. Sin embargo, las condiciones de la vivienda tienen un gran impacto en el nivel de ansiedad de los ratones machos, ya que los ratones de una sola casa muestran niveles de ansiedad más bajos15 y en general síntomas menos depresivos16.
La manipulación química o eléctrica de los circuitos cerebrales carece de la alta especificidad del tipo celular de la optogenética y tiene una resolución temporal y espacial más baja14,17,18. Dependiendo de la pregunta experimental, la estimulación eléctrica o química puede tener diferentes ventajas. Cuando también es necesario estimular los terminales de fibra en una región específica, la estimulación eléctrica es el mejor método. La estimulación química es una buena opción para cuando los receptores específicos del transmisor en toda una región deben ser activados por agonistas. Otra gran ventaja de la optogenética en comparación con la estimulación química o eléctrica es que endógenamente, las neuronas no son sensibles a la luz, lo que evita la aparición de efectos secundarios19. De hecho, altas intensidades de luz pueden inducir efectos de calentamiento8,20, pero debido a los grupos de control adecuados, los efectos conductuales debido a la manipulación optogenética pueden ser eliminados.
La investigación del comportamiento de los roedores, especialmente en lo que respecta a las enfermedades psiquiátricas, ha mejorado considerablemente con la optogenética en animales que se mueven libremente, ya que permite la modulación directa de receptores individuales hasta poblaciones celulares específicas21 y circuitos22. La posibilidad de medir los efectos agudos de tales modulaciones, así como los efectos conductuales a largo plazo después de un tiempo definido23 o después de la estimulación crónica24, permite una amplia flexibilidad de los diseños experimentales y proporciona información muy detallada sobre los circuitos cerebrales. La estimulación de la luz se puede utilizar para modular las neuronas situadas en el lugar de inyección de la herramienta optogenética. Cuando tanto la inyección como la implantación abordan la misma región cerebral, los cuerpos celulares y los axones que se proyectan de principios de neuronas e interneuronas en esta región pueden dirigirsea 3,,6,,8. Sin embargo, la fibra ligera también se puede implantar en una región diferente de la inyectada. En este caso, la estimulación de la luz puede modular la liberación del transmisor en terminales de axón en áreas de proyección de la región inyectada25,26,27.
En el estudio aquí, optogenética se utiliza en combinación con experimentos para analizar el comportamiento relacionado con la ansiedad. Las enfermedades psiquiátricas relacionadas con la ansiedad afectan a más de un tercio de la población mundial28,29,30 y causan una alta carga económica31. Los afectados sufren de una sensación de excitación, tensión y preocupación seguida de comportamiento de evasión32,,33. Estas emociones negativas de origen crónico, que se centran principalmente en eventos futuros34,interfieren fuertemente con la vida diaria de los pacientes. Tratamientos comunes como benzodiazepinas o inhibidores selectivos de la recaptación de serotonina (ISRS) sólo son exitosos en algunos de los pacientes. Una gran cantidad de personas no responden al tratamiento en los35años, lo que demuestra que el mecanismo subyacente a tales enfermedades aún no se entiende completamente. La corteza prefrontal medial (mPFC) es conocida por desempeñar un papel importante en el desarrollo y manifestación de la ansiedad21,,25,27,36,37,38. Específicamente, la sobreactivación de la región de la corteza infralimbia (IL) en el mPFC podría ser parte de trastornos relacionados con la ansiedad39,,40. El experimento de ejemplo descrito aquí podría ayudar a entender cómo las modulaciones en la región IL del mPFC influyen en el comportamiento de ansiedad. Además, el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas para enfermedades psiquiátricas relacionadas con la ansiedad también puede ser apoyado potencialmente.
Los ratones Nex-Cre macho de 2-6 meses de edad se utilizan para expresar ChR2 específicamente en neuronas piramidales dentro de la región IL del mPFC41. Los ratones Nex-Cre tienen un fondo C57Bl/6 y expresan la enzima Cre-recombinase específicamente en las neuronas piramidales. Durante una cirugía estereotáctica, se inyecta ADN ChR2 de doble flox en la región de IL a través de vectores virales asociados con adeno. El implante óptico se coloca directamente encima de la región de interés (Figura 1B) y el implante se fija con cemento dental. Los animales de control reciben una inyección de tdTomato-DNA de doble flox en la misma región para imitar la expresión específica de la célula.
Los animales son alojados en grupo hasta el día de la cirugía y después son alojados en una sola casa para evitar lesiones de otros ratones. Los ratones se alojan en bastidores individuales de jaula ventilada (IVC) en jaulas TypI-L para ratones de una sola casa. El ciclo luz-oscuridad sigue un ritmo de 12:12 h, la fase de luz a partir de las 10 AM. Todos los experimentos conductuales se realizan en la fase oscura, que se asemeja a la fase activa de los roedores. El agua y los pellets de alimentos estándar están disponibles ad libitum. Después de dos semanas de recuperación, lo que garantiza una expresión suficiente de ChR2 en las neuronas piramidales, los ratones se utilizan para experimentos conductuales.
El Campo Abierto (OF) es un laberinto cuadrado de 50 cm x 50 cm con paredes de 40 cm de altura. El suelo se divide en 16 cuadrados donde el interior 4 representa el centro. El comportamiento medido es: 1) tiempo invertido en el centro, 2) número de entradas centrales y 3) distancia total movida. Durante este experimento, hay 4 ensayos que suman 20 minutos. En los ensayos 1 y 3, no se produce estimulación lumínica, y en los ensayos 2 y 4, se realiza una estimulación de 20 Hz con pulso de luz de 5 ms y 1 mW de intensidad de luz de 473 nm (Figura 2A). En los ensayos posteriores, se tuvo en cuenta la habituación en el área de prueba, pero el uso de animales de control inyectados falsas indican cómo se expresa la habituación.
El Laberinto de Barnes es un experimento para el aprendizaje y la memoria. Es una plataforma circular de 92 cm de diámetro y contiene 20 agujeros equidistantes alrededor de la circunferencia. 19 de los agujeros están cerrados y debajo de un agujero se presenta una caja de escape. Durante 4 días consecutivos, los ratones tienen 4 ensayos de entrenamiento para aprender la ubicación de la caja de escape. El día 5, se retira la cajade escape, y se prueba a los ratones en cuanto a cuánto tiempo necesitan encontrar el agujero correcto. El comportamiento medido es: 1) Tiempo hasta que se encuentre el cuadro de escape/agujero correcto, 2) Número de visitas y errores de destino, y 3) Distancia movida hasta que se encuentre en el cuadro de escape. La estimulación lumítica en diferentes grupos se realiza ya sea durante la adquisición o consolidación, que tienen lugar en los días de entrenamiento 1-4, o durante la recuperación el día de la prueba, que es el día 5 (Figura 2D).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61023/61023fig2v2.jpg"> Figura 2: Experimentos conductuales con protocolos optogenéticos. A) Dibujo esquemático del experimento Campo Abierto con el protocolo de estimulación de luz correspondiente. C) Dibujo esquemático del experimento Elevated-Plus Maze con el protocolo de estimulación de la luz correspondiente. D) Dibujo esquemático del experimento Barnes Maze con el protocolo de estimulación de la luz correspondiente. EPM: Laberinto Elevado-Plus; OF: Campo abierto; BM: Prueba de laberinto de Barnes. Esta cifra ha sido modificada de Berg 201948. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61023/61023fig2v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Para la estimulación optogenética, la intensidad y frecuencia de la luz deben adaptarse a la herramienta optogenética y al tipo neuronal que se está investigando. La menor intensidad lumínica posible debe utilizarse para evitar daños en el tejido, ya que varios estudios han demostrado que hay posibles efectos de calentamiento debido a la intensidad de la luz fuerte8,20. Para ChR2, una estimulación de 20 Hz con un pulso de luz de 5 ms se utiliza comúnmente2. Como ChR2 es bastante sensible a la luz, la intensidad de la luz de 1 mW es suficiente. El protocolo de estimulación de la luz alterna entre la luz apagada y los ensayos para medir directamente los cambios de comportamiento. Las condiciones externas de la habitación para los experimentos conductuales deben permanecer estables para todo el grupo de animales. Las condiciones importantes a tener en cuenta son el ruido (tenga en cuenta que los propios dispositivos pueden hacer ruido), el olor (limpiar siempre las configuraciones de comportamiento con etanol), la intensidad de la luz y el experimentador. El experimentador siempre debe ser la misma persona. Además, la hora del día de los experimentos debe ser la misma para todos los animales de un grupo, se prefiere unas horas después del inicio de la fase oscura en la instalación.
El objetivo de este experimento es aumentar la relación excitación/inhibición (E/I) en la región de IL a través de una fuerte activación de las neuronas piramidales excitatorias. Una relación E/I mejorada en esta región especial de la corteza se sabe para aumentar los niveles de ansiedad en ratones40,42,43,44.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ketamin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K2753-64</td>
			<td>Anestasia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 % Glucose</td>
			<td>AlleMan Pharma</td>
			<td></td>
			<td>Injection s.c. for fast recovery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Behavioral mazes</td>
			<td>Costum made</td>
			<td></td>
			<td>Measure anxiety</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bepanthen</td>
			<td>Bayer</td>
			<td></td>
			<td>Ophthalmic oinment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betaisodona</td>
			<td>Monodipharma</td>
			<td></td>
			<td>Sterilant containing iodine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betaisodona</td>
			<td>Monodipharma</td>
			<td></td>
			<td>Iodine oinment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ52, 110AL0.62x WD160</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic ferrules</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CFLC230-10</td>
			<td>Implant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic Fiber Scribe</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CSW12.5</td>
			<td>Cutting of the glass fiber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Channelrhodopsin2-YFP virus</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>Addgene 20298</td>
			<td>Optogenetic tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed air</td>
			<td>Kontakt Chemie</td>
			<td>Druckluft 67</td>
			<td>Drying of the skull</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coordinate system</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td></td>
			<td>Stereotactic coordinates for the surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Correl Draw</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Graphical software version 13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryoslicer</td>
			<td>MICROM</td>
			<td>HM500OM</td>
			<td>Production of brain slices for staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethovision XT 14</td>
			<td>Noldus</td>
			<td></td>
			<td>Software for behavioral tracking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Statistical Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferrule Polishing Puck</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>D50-F</td>
			<td>Polishing implants round side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Patch Cord dual</td>
			<td>Prizmatix</td>
			<td>Optogenetics-Fiber 500, 1,20 m, Ferrule core 1,25 mm</td>
			<td>Cables, which are connected with the two implants of a bilateral implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Patch Cord single</td>
			<td>Prizmatix</td>
			<td>Optogenetics-Fiber 500, 1,20 m, Ferrule core 1,25 mm</td>
			<td>Cable, which is connected with the implant via a sleeve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Stripping Tool</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>T06S13</td>
			<td>Stripping glass fiber for implant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>VWR European</td>
			<td>516-0300</td>
			<td>Cut into pieces for the Novelty-Suppressed Feeding test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food pellets</td>
			<td>M&#252;hle Levers</td>
			<td>H&#246;veler Nagerfutter</td>
			<td>Nutrition for the mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipettes</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>GC150-10</td>
			<td>Injection pipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gradia direct-Flo</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>103322</td>
			<td>Fluid dental cementum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating lamp</td>
			<td>efbe-Schott/Phillips</td>
			<td>R95E</td>
			<td>Prevent the mice from cooling after the surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating plate</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td></td>
			<td>Integrated into coordinate system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection canula</td>
			<td>Braun</td>
			<td>100 Sterican, 0,4 x 20 mm, Gr. 20</td>
			<td>All injections and to bore hole into the skull</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Litter</td>
			<td></td>
			<td>T 1350</td>
			<td>Grounding for the Novelty-Supressed Feeding test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse cages</td>
			<td>Zoonlab</td>
			<td>405 cm^2</td>
			<td>Single housing for experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optibond FL</td>
			<td>Kerr</td>
			<td>26684E</td>
			<td>Preparation of the skull for implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical glass fiber</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FT200EMT</td>
			<td>Light fiber for implant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optogenetics-LED.STSI</td>
			<td>Prizmatix</td>
			<td></td>
			<td>Optogenetic toolbox for light stimulation during behavioral experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>16005-1KG-R</td>
			<td>Perfusion of mice to remove the brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polishing sheet 0.02 &#181;m grit</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LFCF</td>
			<td>Polishing implants round side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polishing sheet 1 &#181;m grit</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LF1D</td>
			<td>Polishing implants round side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polishing sheet 30 &#181;m grit</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LF30D</td>
			<td>Polishing implants round side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polishing sheet 6 &#181;m grit</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LF6D</td>
			<td>Polishing implants round side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulser Software</td>
			<td>Prizmatix</td>
			<td></td>
			<td>Software for light device control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rimadyl-Carprofen</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td></td>
			<td>Analgesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma Plot</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Software for statistics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sleeve</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FT200EMT</td>
			<td>Connection of implant and light cable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SodiumCloride (NaCl)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>3570410</td>
			<td>Rinsing of the skull</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superglue</td>
			<td>Pattex Henkel</td>
			<td></td>
			<td>To Fix the glass fiber in the ferrule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>td-Tomato virus</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>Addgene 51503</td>
			<td>Optogenetic tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV light</td>
			<td>KoQGHJ</td>
			<td>wireless, 1200 mW/cm^2</td>
			<td>Polymeration lamp for dental cementum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylavet-Xylazin</td>
			<td>cp pharma</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optogenetic manipulation of neuronal activity to modulate behavior in freely moving mice

La modulación optogenética de los circuitos neuronales en ratones que se mueven libremente afecta el comportamiento agudo y a largo plazo. Este método es capaz de realizar manipulaciones de neuronas individuales y liberación de transmisor específico de la región, hasta circuitos neuronales enteros en el sistema nervioso central, y permite la medición directa de los resultados conductuales. Las neuronas expresan herramientas optogenéticas a través de una inyección de vectores virales que llevan el ADN de elección, como Channelrhodopsin2 (ChR2). La luz se introduce en regiones cerebrales específicas a través de implantes ópticos crónicos que terminan directamente por encima de la región objetivo. Después de dos semanas de recuperación y expresión de herramienta adecuada, los ratones se pueden utilizar repetidamente para pruebas conductuales con estimulación optogenética de las neuronas de interés.
La modulación optogenética tiene una alta resolución temporal y espacial que se puede lograr con alta especificidad celular, en comparación con los métodos comúnmente utilizados, como la estimulación química o eléctrica. La luz no daña el tejido neuronal y por lo tanto se puede utilizar para experimentos a largo plazo, así como para múltiples experimentos de comportamiento en un ratón. Las posibilidades de las herramientas optogenéticas son casi ilimitadas y permiten la activación o silenciamiento de neuronas enteras, o incluso la manipulación de un tipo de receptor específico por la luz.
Los resultados de tales experimentos conductuales con estimulación optogenética integrada visualizan directamente los cambios en el comportamiento causados por la manipulación. El comportamiento del mismo animal sin estimulación lumítica como línea de base es un buen control para los cambios inducidos. Esto permite una descripción detallada de los tipos neuronales o sistemas de neurotransmisores implicados en comportamientos específicos, como la ansiedad. La plasticidad de las redes neuronales también se puede investigar con gran detalle a través de la estimulación a largo plazo o observaciones conductuales después de la estimulación óptica. La optogenética ayudará a iluminar la señalización neuronal en varios tipos de enfermedades neurológicas.

El objetivo de este protocolo es medir los cambios en el comportamiento de los ratones modificados genéticamente durante un experimento optogenético. La manipulación optogenética se realiza mediante la inyección de un vector viral asociado a adeno. La estimulación de la luz en ratones que se mueven libremente es posible mediante la implantación de una fibra ligera directamente por encima de la región de interés.
En la Figura 4,se presentan los resultados de un experimento optogenético. Una fuerte activación de las neuronas piramidales excitatorias en la región de IL a través de ChR2 aumentó el comportamiento relacionado con la ansiedad en el campo abierto. ChR2 se inyectó en la región IL del mPFC en ratones Nex-Cre para su expresión en neuronas piramidales (Figura 4A). Durante dos pruebas de ansiedad, el Campo Abierto (Figura 4B,C) y la prueba de alimentación suprimida por la novedad (Figura 4F, G), ChR2 se estimula con luz azul y activa las neuronas piramidales. Como control, otro grupo de ratones recibió una inyección del fluoróforo tdTomato en lugar de ChR2 (Figura 4D,G). En tal experimento, la ansiedad se define como la evitación de la zona central más brillante. Los ratones muestran una evitación intrínseca de las áreas abiertas porque están ansiosos por los depredadores.
En el experimento Campo abierto, que se muestra en la Figura 4B,los ratones ejecutaron 4 ensayos de 5 minutos cada uno. En los ensayos 1 y 3 no se produjo estimulación lumínica (Off1,2) y en los ensayos 2 y 4, se realizó estimulación de luz azul con 20 Hz (pulso de luz de 5 ms) y 1 mW (On1,2). Los mapas de calor muestran que, en el grupo experimental, la duración del centro difería entre los ensayos Off y On. Durante la estimulación de la luz, los ratones permanecen preferentemente en la zona fronteriza. Los animales de control también prefieren la frontera, pero no cambian su comportamiento en la estimulación de la luz. En la Figura 4C,se muestran las principales mediciones de comportamiento durante el experimento Campo Abierto para el grupo experimental. Si los datos pasaron la prueba Shapiro-Wilk para la normalidad, las estadísticas se hicieron con una prueba t independiente de dos colas. Si la prueba de normalidad falló, la prueba Mann-Whitney-Rank Sum se utilizó como alternativa no paramétrica. Para este tipo de experimentos, se eligió una comparación dentro del grupo para investigar si la estimulación de la luz puede cambiar directamente el comportamiento de ansiedad con el tiempo, independientemente de la ansiedad basal de los animales experimentales y de control. La duración del centro disminuyó significativamente durante ambos ensayos de estimulación de la luz, lo que indica un aumento de los niveles de ansiedad. La distancia total movida no se alteró, lo que demuestra que el comportamiento locomotor no se vio afectado. El número de entradas de centro se incrementó, aunque no significativamente. En la Figura 4D,se muestran los datos del grupo de control. Los animales de control no mostraron ningún cambio de comportamiento entre los ensayos Off y On en ninguno de los parámetros analizados, lo que demuestra que la estimulación o implantación de la luz no causó los efectos observados. En resumen, esta prueba muestra aumento de la ansiedad durante la estimulación ligera de las neuronas piramidales IL a través de ChR2.
En la Figura 5, los datos de un experimento optogenético sin éxito se muestran para el Laberinto Elevado-Plus. Durante el experimento Elevated-Plus Maze, que se presenta en la Figura 5A,los ratones completaron 6 ensayos de 3 minutos cada uno. En los ensayos 1, 3 y 5 no se realizó estimulación lumínica (Off1, Off2, Off3) y en los ensayos 2, 4 y 6, se realizó estimulación de luz azul con 20 Hz (pulso de luz de 5 ms) y 1 mW de intensidad (On1, On2, On3). En estos resultados ejemplares, la longitud del protocolo optogenético y la construcción del laberinto en sí no eran adecuados para la línea de ratón transgénico. En la Figura 5B,se puede ver, que varios ratones se deslizaron del laberinto con sus patas traseras o incluso se cayeron. Cuando esto sucedió, los ratones tienen una segunda oportunidad de realizar el EPM un día después. Si se caían de nuevo, fueron excluidos del análisis. Cuando los ratones se deslizó varias veces, pero lograron permanecer en el laberinto, los datos se analizaron normalmente. Sin embargo, los datos tienen que ser interpretados con mucho cuidado y controlar a los animales obtener una mayor importancia. Los ratones Nex-Cre tenían dificultades motoras para permanecer en los brazos estrechos abiertos. Para evitar esto, pequeñas paredes, con una altura de 1 cm, habrían ayudado a una sujeción segura de las patas traseras en los brazos del laberinto. Tanto los mapas de calor como los gráficos muestran que los ratones experimentales, así como los ratones de control, comenzaron a evitar los brazos abiertos del ensayo 2 (On1) en(Figura 5C-E). El tiempo en los brazos abiertos se reduce significativamente para ambos grupos, al igual que las entradas del brazo abierto. El análisis del grupo experimental sólo obtuvo datos que implican un gran efecto ansiogénico de la estimulación de la luz, ya que el tiempo en el brazo abierto y las entradas del brazo abierto disminuyen significativamente durante el ensayo On1. Sin embargo, al comparar estos datos con el grupo de control, que muestran el mismo comportamiento, queda claro que el comportamiento observado no está mediado por la estimulación optogenética, sino por la evitación de los brazos abiertos en general debido a la habituación al laberinto. Estos datos subrayan la importancia de un grupo de control adecuado para distinguir entre los efectos conductuales mediados por la estimulación optogenética y la posible adaptación conductual. Además, estos datos arrojan luz sobre la importancia de adaptar adecuadamente una configuración experimental para adaptarse a la línea de mousse específica y la pregunta experimental.
Para validar y fortalecer los datos de comportamiento recopilados, los cerebros de los ratones se eliminan después del último experimento para controlar la inyección e implantación correctas (Figura 6). Los cerebros se fijan en un 4% de paraformaldehído y se extraen del cráneo. Los cerebros se deshidratan en 30% de sacarosa durante 1-2 días y se crion después. Las rebanadas cerebrales coronales de 40 m de espesor se lavan y montan en diapositivas objetivos de superfrost con un medio de montaje que contiene DAPI, que mancha los núcleos celulares. Esto permite la identificación de áreas objetivo en las rodajas coronales. La fluorescencia de la etiqueta YFP o tdTomato indica la ubicación de la inyección de virus. En la Figura 6B se presentan los sitios ejemplares de inyección de ChR2-YFP a la izquierda (amarillo) y tdTomato a la derecha (rojo). Con la ayuda de una plantilla, adaptada del atlas cerebral de ratón Paxinos y Franklin45, se puede identificar la región IL. En ambas diapositivas, la herramienta optogenética se expresa en la región IL, pero también en las regiones cerebrales adyacentes. Para una interpretación adecuada, se consulta la propagación de la luz azul en el tejido cerebral8 (Figura 1D,E). Se puede ver que la luz azul alcanzará la región DP por debajo de la IL con sólo menos del 5% de la intensidad de luz inicial de 1 mW en la punta de fibra (línea azul en la figura 1D)8. Además, una pequeña cantidad de luz puede ir hacia arriba a la región prL debido a la dispersión posterior47. En consecuencia, se puede decir que la región de IL está iluminada con mayor fuerza, sin embargo, las regiones adyacentes como el PD y la región prL también pueden ser ligeramente estimuladas. Por lo tanto, la estimulación específica de las células IL no está garantizada y se debe realizar un análisis inmunohistoquímico de las regiones adyacentes, para ver si la actividad de las células PrL y DP se modula a través de la luz. En la Figura 6C, se muestra otro control importante: la especificidad de la línea del ratón Nex-Cre. A través de la tinción de anticuerpos contra los dos tipos de células en la región de IL, las neuronas de principio glutamatérgica e interneuronas GABAérgicas, se puede ver, que la expresión ChR2-YFP sólo se produce en las neuronas glutamatérgicas y no con las GABAérgicas.
Con todo, nuestros experimentos muestran que con la manipulación optogenética durante las pruebas de comportamiento, se podrían observar cambios en el comportamiento relacionado con la ansiedad. Mediante el uso de más de una prueba para el mismo comportamiento, se puede extraer una conclusión confiable. Además, el análisis inmunohistoquímico confirma los datos obtenidos. Nuestros experimentos sugieren.que la activación específica de las neuronas piramidales en la corteza infralimbica aumentó el comportamiento relacionado con la ansiedad en ciertos ensayos.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61023/61023fig04v4.jpg"> Figura 4: La activación optogenética de las neuronas piramidales IL aumenta el comportamiento de ansiedad. Estimulación lumítica durante los experimentos: 473 nm, 1 mW, estimulación de 20 Hz. A) Dibujo esquemático del lugar de inyección e implantación para ChR2-YFP o tdTomato en la IL. Durante el experimento, las neuronas piramidales en la región IL del mPFC son activadas por ChR2. Rebanadas cerebrales saggital adaptadas del atlas cerebral de ratón Paxinos y Franklin, saggital: lateral o,6. B) laberinto de campo abierto con protocolo de estimulación de la luz (20 min con 4x5 min alternando Off y On trials; left) y mapas de calor de ratones ejemplares ChR2-injected(EXP) y tdTomato-injected (CT) en los 4 ensayos del experimento (derecha). Los animales EXP pasan menos tiempo en el centro de la OF cuando se estimulan con luz láser azul. Para los animales con TC, el tiempo que pasa en el centro no difiere entre los ensayos light Off y On. C) Datos de grupo para animales EXP en el OF, n.o 11. Los ratones pasan mucho menos tiempo en el centro de la OF cuando se estimulan con luz azul (Off1 39.49±6.9 s, On1 19.87±4.47 s, Off2 28.13±8.55 s, On2 23.42±9.32 s, Off1:On1, t-test, p á 0.033, *; Off1:On2, MWRS, p-0,049, *). La distancia movida no se ve afectada (Off1 2703.09±292.65 cm, On1 3113.4±491.15 cm, Off2 3331.86 ±482.62 cm, On2 3082.17±658,61 cm). Las entradas del centro disminuyen con el tiempo, pero no muestran diferencias significativas (Off 1 22.36±3.78, On1 18.45±3.95, Off2 17.36±1.99, On2 13.27±2.64). D) Datos de grupo para animales CT en el OF, n.o 15. Tiempo que los ratones pasan en el centro de la OF, la distancia movida, el número de entradas centrales no cambia entre las pruebas de encendido y apagado de luz (Tiempo en el centro Off116.73±2.65 s, On1 16.02±1.89 s, Off2 12.02±1.76 s, On2 13.04±2.58 s; Distancia 1 3399.69±296.77 cm, On1 3210.6±446.9 cm, Off2 3030.28±513.83 cm, On2 2955±617.7 cm; N.o de entradas centrales Off1 14.2±1.98, On1 13.6±2.02, Off2 10.8±1.88, On2 11.67±2.5). Los ratones con TC muestran una ansiedad basal significativamente mayor (Off1 EXP:CT, MWRS, p-0.005, **). Los valores son medios±S.E.M. * indican diferencias significativas (p≤0.05), ** indican diferencias significativas (p≤0.01). t-test siempre de dos colas, MWRS: Mann-Whitney Rank Sum prueba; IL: corteza inmórbida; BLA: amígdala basolateral; DRN: núcleos de raphe dorsal; OF: Campo abierto; TC: animales de control; EXP: animal experimental; L: luz. Esta cifra ha sido modificada de Berg et al. 2019, PLoS One43 y de Berg 201948. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61023/61023fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61023/61023fig5v4.jpg"> Figura 5: El experimento EPM no mostró efectos conductuales en ratones Nex-Cre. Estimulación lumítica durante los experimentos: 473 nm, 1 mW, estimulación de 20 Hz. A) Laberinto Elevado-Plus con protocolo de estimulación de la luz (18 min, 6x3 min, alternando Off y En ensayos). B) Los datos de grupo para los ratones que "se deslizan" se incluyen en los datos, total n.o 23. Los ratones Nex-Cre tenían una tendencia a deslizarse del brazo abierto con sus patas traseras, independientemente del grupo experimental (izquierda). Sólo los ratones que se quedaron en el laberinto durante los 6 ensayos fueron considerados en análisis posteriores. Slip off's en la primera fase Off1 son razones para evitar más tarde los brazos abiertos (Off1 EXP 1.63±0.6, CT 2.2±0.79, Off2+3 EXP 0.125±0.125, CT 0±0, On1+2+3 EXP 0.625±0.26, CT 0.1±0.1). Gráfico circular (derecha) muestra ratones cayendo desde el laberinto durante los 18 min con 42.42%. Sólo el 57,57% terminó el experimento. C) Mapas de calor de ratones EXP y CT ejemplares en los 6 ensayos del experimento. Ambos grupos muestran una disminución en la duración del brazo abierto después de la prueba Off1. D) Datos de grupo para animales EXP en el EPM, n.o 12. El tiempo dedicado a los brazos abiertos disminuyó significativamente durante las dos primeras pruebas y constantemente después (Off1 73.91±12.22 s, On1 36.15±14.65 s, Off2 15.61±6.23 s, On2 19.49±7.51 s, Off3 9.36±4.44 s, On3 7.96±3.47 s. Off1:On1, t-test, p-0,041, *). La distancia movida no se ve afectada (Off1 679.96±71.63 cm, On1 712.24±112.82 cm, Off2 717.49±97.39 cm, On2 782.51±81.11 cm, Off3 722.11±68.60 cm, On3 663.90±106.57 cm). La cantidad de entradas de brazo abierto disminuye significativamente de Off1 a On1 y, a continuación, permanece constante (Off1 8.08±1.08, En 1 3.33±0.76, Off2 2.16±0.69, On2 2.91±1.09, Off3 1.73±0.75, On3 1.73±0.66. Off1:On1, t-test, p-0.002, **). El tiempo que pasa en el centro del EPM disminuye a lo largo de los ensayos, pero no muestra ninguna diferencia significativa entre Off a On trial (Off1 41.71±5.34 s, On1 31.2±4.59 s, Off2 19.8±3.44 s, On2 24.49±3.38 s, Off3 20.37±4.77 s, On3 18.85±4.07 s). E) Agrupar los datos de los animales CT en el EPM, n.o 11. Los datos de TC muestran las mismas disminuciones significativas que los datos de EXP, lo que indica que el experimento no ha funcionado correctamente (Tiempo en brazos abiertos Off1 86.92±12.74 s, On1 33.78±14.38 s, Off2 18.01±11.61 s, On2 16.41±9.61 s, Off3 11.36±4.01 s, On3 5.43±2.07 s. Off1:On1, MWRS, p-0.009, **; Distancia Fuera1 705.11±88.36 cm, On1 789.45±77.53 cm, Apagado2 724.74±80.49 cm, On2 676.57±111.99 cm, Off3 716.99±132.47 cm, On3 663.03±132.46 cm; Entradas de brazo abierto Apagado1 7.09±1, On1 3.72±1.17, Off2 1.45±0.47, On2 1.36±0.58, Off3 0.91±0.43, Off3 1.64±0.0.59. Off1:On1, MWRS, p-0.01, *; Tiempo pasado en el centro Off1 35.89 s, En 1 29.25±3.96 s, Off2 22.17±3.58 s, On2 15.9±2.57 s, Off3 13.86±4.2 s, On3 16.89±5.75 s). Los valores son medios ± S.E.M. * indican diferencias significativas (p≤0.05), ** indican diferencias significativas (p≤0.01). La prueba t es siempre de dos colas, MWRS: Mann-Whitney Rank Sum prueba; EPM: Laberinto Elevado-Plus; TC: animales de control; EXP: animal experimental; OA: brazos abiertos. Esta cifra ha sido modificada de Berg et al. 2019, PLoS One43 y de Berg 201948. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61023/61023fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61023/61023fig06.jpg"> Figura 6: Lado de inyección de ChR2 y tdTomato en la especificidad de IL y Nex-Cre. A) Dibujo esquemático del sitio de implantación en rebanadas cerebrales coronales a AP + 1,66 mm, ml 0,3 mm, DV -1,8 mm, con inyección unilateral e implantación (adaptado a partir del atlas cerebral del ratón, Paxinos y Franklin, Bregma +1,54 mm). B) Sitios ejemplares de inyección de ChR2-YFP (izquierda, amarillo) y tdTomato (derecha, rojo) se fusionaron con núcleos celulares manchados DAPI (azul) en ratones Nex-Cre. Barra de escala 1 mm. Los recuadros muestran un alto aumento de la región de IL. Barra de escala de 150 m. Las casillas blancas indican la ubicación de los insertos. C) Fila superior: imágenes confocales de la región IL izquierda de un ratón Nex-Cre manchado con CamKII como marcador para las neuronas glutamatérgicas (azul), y ChR2-YFP (amarillo) o Gad67 como marcador para los neurógicos GABAer (verde), de un ratón Nex-Cre. Fila inferior: colocación de ChR2-YFP (amarillo) con CamKII (izquierda, azul), pero no con Gad67 (derecha, verde), mostrando especificidad de ratones Nex-Cre para neuronas glutamatérgicas. Barra de escala de 50 m. PrL: corteza prelímpico; IL: corteza inmórbida; DP: corteza peduncular dorsal. Esta cifra ha sido modificada de Berg et al. 2019, PLoS One43 y de Berg 201948. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61023/61023fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity to Modulate Behavior in Freely Moving Mice

Con la manipulación optogenética de poblaciones neuronales específicas o regiones cerebrales, el comportamiento se puede modificar con alta resolución temporal y espacial en animales en movimiento libre. Mediante el uso de diferentes herramientas optogenéticas en combinación con fibras ópticas implantadas crónicamente, se puede realizar una variedad de modulaciones neuronales y pruebas de comportamiento.

Manipulación optogenética de la actividad neuronal para modular el comportamiento en ratones que se mueven libremente

Optogenetic modulation of neuronal circuits in freely moving mice affects acute and long-term behavior. This method is able to perform manipulations of ...

Con la manipulación optogenética de poblaciones neuronales específicas o regiones cerebrales, el comportamiento se puede modificar con alta resolución temporal y espacial en animales en movimiento libre. Mediante el uso de diferentes herramientas optogenéticas en combinación con fibras ópticas implantadas crónicamente, se puede realizar una variedad de modulaciones neuronales y pruebas de comportamiento. El objetivo final de la optogenética es la modulación de circuitos neuronales con alta resolución temporal y espacial en el animal que se comporta.A diferencia de las manipulaciones farmacológicas o eléctricas, la optogenética permite el control preciso de tipos celulares específicos en circuitos neuronales. Optogenetics es la manera perfecta de apuntar a tipos de células específicos en regiones especialmente definidas durante el comportamiento, y examinar el efecto directo de los cambios en dichos microcircuitos. Ahora presentaremos un paso a paso de guía de cómo preparar y plantar y llevar a cabo la optogenética en ratones que se mueven libremente.Para la preparación del implante óptico, coloque una férula de cerámica plana hacia arriba en una visera de banco. Despoje el código de una fibra de vidrio de 200 micrómetros de diámetro, con una herramienta de desmontaje de fibra y corta de dos a tres centímetros piezas no con un escriba de fibra cerámica. Coloque la pieza de fibra de vidrio en la férula de cerámica y luego coloque una gota de superpegamento en el lado plano con una inyección cannular.En el lado redondo de la férula de cerámica, corte la fibra de vidrio lo más corta posible y coloque el preimplantaxamiento en un disco de pulido de férula para pulir el lado redondo en cuatro papeles de publicación diferentes. Después, cortar la fibra de vidrio en el lado plano de la férula de cerámica, a la longitud necesaria para la implantación. Utilice un atlas cerebral de ratón para calcular la longitud del implante.El implante tiene que terminar directamente por encima de la región de interés. Antes de la implantación, se aplica anestesia. La técnica precisa y estética se describe en el manuscrito.Cuando el ratón alcance un estado profundo de anestesia, colóquelo en una placa calefactora y fije la cabeza en un marco estereotáctico. Fijar la nariz y los dientes en la parte delantera y las orejas en ambos lados. Aplicar una algesia con un cuprofeno subcuntáneamente en la parte posterior del ratón y aplicar un ung ón opaco en ambos ojos para protegerlos del secado.Humedezca el cabello del cuero cabelludo con una toalla de papel húmeda y luego córtelo con tijeras. Asegúrese de quitar todo el cabello suelto con una toalla de papel húmeda. Use un palo de algodón para desinfectar el cuero cabelludo con una tintura que contenga yodo.Levante el cuero cabelludo sobre la región de interés con una pinza y corte un centímetro a lo largo de la línea media. Para ásperar el cráneo para su implantación, aplicar una pequeña cantidad de ácido fosfórico en la cicatriz y dejar que surta efecto durante 15 segundos. Retire todo el ácido con un palo de algodón y enjuague la cicatriz con cloruro de sodio dos veces.Para la inyección adecuada, calcule el factor F para coordenadas individuales. Coloque un cannular de vidrio en el marco estereotácta y localícelo directamente sobre el bregma. Ahora cero el sistema de coordenadas y mover la cánula de vidrio a Lambda.Calcule el factor F con la siguiente fórmula. Bregma menos Lambda dividido por 4.2 es igual al factor F. Las coordenadas exactas son muy importantes para la inyección y la implantación porque de lo contrario, si se estimula la estructura incorrecta, entonces los efectos conductuales son inespecíficos.Todos los ratones tienen desviaciones mínimas en el tamaño de su cráneo, por lo tanto, el coeficiente es absolutamente obligatorio. Utilice las coordenadas ajustadas para encontrar la ubicación en la cicatriz directamente por encima de la estructura de interés. Utilice una cánula de inyección para perforar un agujero en el cráneo, girando la cánula en el lugar.Para tomar una solución vímica en la cánula de vidrio conectada a la jeringa, coloque una gota de cloruro de sodio en el cráneo y un pedazo de pirofeno en la parte superior. Coloque una gota de dos solución de virus microlitsión en el pirofeno y baje la punta de la cánula de vidrio en el virus. Aplique presión negativa y espere hasta que la cánula tome la solución del virus.Cero a esa coordenada cuando la punta del virus con cánula está en el nivel del cráneo y lentamente bajarlo en el agujero a la posición más baja del lado de inyección. Aplique una pequeña cantidad de presión positiva con la jeringa hasta que se reduzca el menisco. Deje que el virus se propague durante dos o tres minutos antes de mover la cánula de vidrio hacia arriba a la siguiente posición.Retire la cánula de vidrio muy lentamente y deséchela después de la inyección final. Ahora prepara el cráneo para la implantación. Seque el cráneo con aire comprimido, aplique la imprimación con este palo correspondiente y déjelo secar durante 15 segundos.Aplicar el enlace con el mismo palo y curarlo durante 20 segundos con luz UV. Coloque el implante en el soporte correspondiente y coloque la punta de la fibra de vidrio directamente por encima del agujero y ósbralo cuidadosamente. Deja de bajar el implante cuando la válvula restante de superpegamento toque el cráneo.La implantación de fibras ópticas también se puede hacer para estructuras bilaterales como el hipocampo. Esto permite una ligera estimulación en ambos hemisferios al mismo tiempo o permite la estimulación de dos estructuras diferentes. También es posible inyectar el virus en un lugar diferente del implante de fibra óptica.Si la inyección y la implantación se están realizando en diferentes regiones, taladre todos los orificios necesarios después de aplicar ácido fosfórico pero antes de la adhesión de los dos componentes. Compruebe de nuevo si el cráneo todavía está completamente seco, luego aplique cemento dental fluido alrededor del implante y en el área circundante y luego cure durante 20 segundos con luz UV Aplique dos cemento más menos en el área del cráneo completamente libre de piel y seca. Cura cada capa con luz UV.Para terminar la cirugía aplicar un ungido de yodo en toda la herida. Suelte la nariz y la fijación del oído, lleve el ratón a una jaula fresca y colóquelo debajo de una lámpara de calentamiento para evitar la pérdida de calor corporal. Compruebe su estado de salud al menos una vez al día y postoperatorio y algesia después de tres días si es necesario.Después de dos semanas de recuperación, los ratones se pueden utilizar para experimentos de comportamiento. Abra pulser software y seleccione el puerto de comunicación USB en el que está conectada la fuente de luz. Elija el modo de operación tres para permitir que un software externo controle la fuente de luz.Elija el ajuste correcto para la estimulación de 20 hercios con un pulso de luz de cinco milisegundos. Para localizar la división para comunicarse con el pulsador, pulse en la secuencia de inicio. Este estado permanecerá hasta que finalicen los experimentos.Ahora, cree un nuevo experimento en EthoVision XT, vaya a archivo, elija nuevo de la plantilla y seleccione aplicar una plantilla predefinida. Elija el seguimiento en vivo y seleccione la cámara con la fuente y confirme la cámara Puslar Gen-Eye conectada. Elija el ratón como el animal que se debe grabar.Seleccione la plantilla de arena, el cuadrado de campo abierto y el centro de la plantilla de zona, el borde, las esquinas. Confirme un sujeto que debe ser rastreado y seleccione el punto central, el punto de la nariz y la base de la cola. Confirme que el color del animal en comparación con el fondo es más oscuro y la frecuencia de muestreo recomendada para terminar el paso.Asigne el nombre apropiado al experimento y elija una ubicación para guardar. Hasta que encuentres los ajustes de la arena, la cámara abrirá automáticamente una imagen de fondo. Adapta las zonas predefinidas a la arena real usando la flecha y los dos símbolos a su derecha.Si algunas zonas no son necesarias, elimínelas. Presione la escala de dibujo para calibrar y poner una línea de una esquina del laberinto a la otra. Introduzca la longitud de la distancia real en centímetros.Repita eso para el otro eje. Para definir la configuración del control de prueba, prepare la regla principal ajustando el tiempo de condición a 20 minutos. La condición de Star Trek debe ser, cuando el sujeto está en la arena durante dos segundos, para un estado automático del seguimiento cuando el ratón está en la arena.Para crear una subreberción para la estimulación de la luz, vaya a estructuras, más y seleccione subreberción. Colóquelo debajo de la regla principal y extienda las dos cajas. Ir a las condiciones, tiempo y darle un nombre como la luz en uno, ajustar la condición se cumple con después de cinco minutos.Coloque el cuadro directamente detrás del cuadro de inicio de la regla de la subreberción. Vaya a la acción de hardware personalizado y asígnelo con luz en uno. Seleccione la acción para realizar como: Voy a poner una alta.Coloque la caja directamente detrás del cuadro de condiciones. Repita los pasos para programar la luz a la luz. Ahora vaya a estructuras, referencia de subreberción y compruebe que la referencia pertenece a la subreberción correcta.Elija las condiciones de inicio como sin demora y las condiciones de inicio como ejecutar una vez por condición de inicio. Coloque el cuadro de referencia entre los libros adicionales uno y acondicione los libros dos de la regla principal. Ahora defina los ajustes de detección para mostrar el sistema de lo que debe rastrear.Coloque una prueba de millas en la arena y seleccione la configuración automatizada. Elige el roedor como tipo de animal y usa el cursor del ratón para dibujar un cuadro alrededor de los ratones en la arena. Confirme los resultados de la pregunta de atención con sí.Para el experimento de campo abierto, lleve el ratón experimental a la sala de comportamiento justo antes del experimento para garantizar un nivel adecuado de ansiedad. Acoplar el ratón ser una hendidura de la fuente de luz presionando suavemente a la rejilla de la jaula. Colóquelo en una jaula de espera con camada fresca durante 10 minutos para aclimatarse al cable de luz.Comience la adquisición pulsando el botón de parada y usted para la visión XT. Transfiera el ratón de la jaula de espera a la esquina superior izquierda del campo abierto. Deje el campo visual del ratón durante el experimento y mantenga la calma. Después de 20 minutos, cuando termine el experimento, retire el ratón del laberinto, desconecte el cable de luz y vuelva a colocarlo en su propia jaula.Mediante una visualización de comprobación, las diferencias en el tiempo central entre la luz apagada y la luz en las caras se pueden ver directamente. El ratón pasa menos tiempo en el centro cuando la luz está encendida. Para el experimento de laberinto de Barnes, lleve todos los ratones experimentales a la sala de comportamiento alrededor de una hora antes del experimento.Prepara el laberinto de Barnes cerrando todos los agujeros excepto uno, y ahora que se coloca una caja de escape. Conecte un ratón en la fuente de luz en ambos implantes y colóquelo directamente en el centro del laberinto de Barnes. Pulse start y necesite visitar la siguiente T y retire la caja de cartón.Esté preparado para detener el ensayo manualmente en caso de que el software no reconozca toda la transición. Saque el ratón del laberinto y retire la conexión al cable de luz. Al realizar, aprender y realizar tareas de memoria, no sólo se investiga el efecto inmediato de la manipulación, sino también el efecto a largo plazo de la manipulación durante la adquisición, consolidación o recuperación.Para el análisis de datos, encontrará la condición de tratamiento tratada o controlada, vaya a anidamiento y seleccione el estado de control de prueba. Elige el intervalo de estado de la acción de elemento Star Trek a la luz de acción del elemento que se enciende en uno. Coloque la caja de anidación entre el tratamiento de la caja de filtro y el cuadro de resultados correspondiente.Este intervalo definido es de uno. Repita los pasos para los intervalos en uno de dos y en dos como también para el grupo de control. Defina también los parámetros que se analizarán en el perfil de análisis.Elija la variable dependiente en la zona y seleccione el centro de la zona, el punto del cuerpo, el punto central y vaya a las estadísticas de prueba. Seleccione la frecuencia, la duración acumulativa y deje allí para ver la primera. Agregue también el movimiento de distancia como variable.Con este perfil, los datos del tiempo pasado en el centro, las entradas de centro y las entradas de distancia se les permite moverse a distancia. Para extraer datos de cada división, vaya a los resultados y seleccione estadísticas y gráficos, pulse calcular para ver los datos analizados. Pulse exportar datos y seleccione las estadísticas de prueba y la ubicación que desea guardar.Los datos exportados se guardan como un archivo de Excel y con valores individuales para cada ratón. Además, vaya a la visualización del mapa de calor y presione los mapas de calor de la gráfica, seleccione las pruebas a la derecha para ver los mapas de calor individuales para cada ratón y prueba. Haga clic derecho en el ratón y exporte los mapas de calor como imágenes.Más tarde, abra el archivo de Excel en el ordenador y calcule la media y los euros estándar SCM para los cuatro ensayos y cada grupo de acondicionamiento medido. Para generar gráficos y trazado Sigma, copie los medios y SCM en el orden correcto desde el archivo adicional a la gráfica Sigma. Las filas tienen que contener los datos de fuera de uno, en uno, y las columnas contienen hercios de prueba, media y SCM.Seleccione las tres columnas y vaya a crear gráficos. Seleccione el cuadro de barra y elija el cuadro no agrupado con flecha. Etiquete todo el gráfico, vaya a casa, seleccione el cuadro de gráfico y presione exportar.Seleccione la carpeta de destino y elija el metaarcháculo como formato. Para calcular las estadísticas de los datos obtenidos, copie los datos correctos de Xcel uno en uno, etc. y en columnas individuales de la gráfica Sigma. Marque las columnas que desea comparar e ir al análisis, elija Prueba T y pulse Ejecutar.Por último, los datos de comportamiento se pueden mostrar divididos en let off y en trial con especialización adicional en mapas de calor. En el experimento de campo abierto, durante la estimulación de la luz de Channelrhodopsin2 y las neuronas piramidales, la duración del centro disminuye, lo que indica un aumento de los niveles de ansiedad. A través de la inmunohistoquímica, se puede determinar el lugar de inyección y la expresión del virus, también en la especificidad en la línea especial del ratón dependiente de Cre.Se puede ver claramente que la estimulación ligera de Channelrhodopsin2 mejorar las neuronas mentales de esta región corteja específica aumenta los niveles de ansiedad, en comparación con la ansiedad basal antes de esa estimulación. Este efecto inmediato de la manipulación en el comportamiento es la razón por la que optogenético se utiliza hoy en día para tantas preguntas de investigación con respecto al comportamiento. Este procedimiento se puede utilizar para la modulación optogenética de cualquier tipo de célula deseada o circuito neuronal en el cerebro del ratón.Mediante la combinación de este procedimiento con pruebas de comportamiento adecuadas para su investigación, se puede obtener una visión más profunda de los circuitos neuronales involucrados en comportamientos y enfermedades de interés.

Research

JoVE Journal

Behavior

Long-term Potentiation of Perforant Pathway-dentate Gyrus Synapse in Freely Behaving Mice

La potenciación a largo plazo de la Vía Perforante-giro dentado sinapsis en comportarse libremente Ratones

Studies of long-term potentiation of synaptic efficacy, an activity-dependent synaptic phenomenon having properties that make it attractive as a potential ...

Investigación

Comportamiento

Uncovering Beat Deafness: Detecting Rhythm Disorders with Synchronized Finger Tapping and Perceptual Timing Tasks

El descubrimiento de golpe Sordera: Trastornos Detección de ritmo con los dedos sincronizada Tapping y tareas de sincronización de percepción

A set of behavioral tasks for assessing perceptual and sensorimotor timing abilities in the general population (i.e., non-musicians) is presented here ...

Flat-floored Air-lifted Platform: A New Method for Combining Behavior with Microscopy or Electrophysiology on Awake Freely Moving Rodents

Plataforma levantado-Air-plana con piso: un nuevo método para combinar Comportamiento con Microscopía o Electrofisiología en Awake moviéndose libremente Roedores

It is widely acknowledged that the use of general anesthetics can undermine the relevance of electrophysiological or microscopical data obtained from a ...

A Novel Experimental and Analytical Approach to the Multimodal Neural Decoding of Intent During Social Interaction in Freely-behaving Human Infants

Un nuevo enfoque experimental y analítico al Multimodal Neural Decodificación de Intención Durante interacción social en Libremente-comportarse Infantes Humanos

Understanding typical and atypical development remains one of the fundamental questions in developmental human neuroscience. Traditionally, experimental ...

Visualizing Motion Patterns in Acupuncture Manipulation

La visualización de patrones de movimiento en la manipulación de la acupuntura

Acupuncture manipulation varies widely among practitioners in clinical settings, and it is difficult to teach novice students how to perform acupuncture ...

The Rodent Psychomotor Vigilance Test (rPVT): A Method for Assessing Neurobehavioral Performance in Rats and Mice

The Rodent Psychomotor Vigilance Test rPVT: A Method for Assessing Neurobehavioral Performance in Rats and Mice

La prueba de roedores psicomotor Vigilancia (rPVT): Un método para evaluar el rendimiento neuroconductual en ratas y ratones

The human Psychomotor Vigilance Test (PVT) is a widely used procedure for measuring changes in fatigue and sustained attention. The present article ...

Manipulation of Epileptiform Electrocorticograms (ECoGs) and Sleep in Rats and Mice by Acupuncture

Manipulation of Epileptiform Electrocorticograms ECoGs and Sleep in Rats and Mice by Acupuncture

La manipulación de epileptiforme Electrocorticograms (ECoGs) y del sueño en ratas y ratones por acupuntura

Ancient Chinese literature has documented that acupuncture possesses efficient therapeutic effects on epilepsy and insomnia. There is, however, little ...

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

Ca Cortical Multi-capa<sup&gt; 2+</sup&gt; Imágenes en ratones con movimientos libres con sondas de prisma y microscopía de fluorescencia miniaturizada

In vivo circuit and cellular level functional imaging is a critical tool for understanding the brain in action. High resolution imaging of mouse cortical ...

A Wireless, Bidirectional Interface for In Vivo Recording and Stimulation of Neural Activity in Freely Behaving Rats

A Wireless, Bidirectional Interface for In Vivo Recording and Stimulation of Neural Activity in Freely Behaving Rats

Un inalámbrico, interfaz bidireccional para la grabación en Vivo y estimulación de la actividad Neural en comportarse libremente las ratas

In vivo electrophysiology is a powerful technique to investigate the relationship between brain activity and behavior at a millisecond and micrometer ...

Assessing Activity-based Anorexia in Mice

Evaluación de Anorexia basada en actividad en ratones

Rodents develop activity-based anorexia (ABA) when exposed to a restricted feeding schedule and allowed free access to a running wheel. These conditions ...