Name: optogenetic manipulation of neuronal activity to modulate behavior in freely moving mice
Uploaded: 2020-10-27T12:30:00
Duration: 14 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity to Modulate Behavior in Freely Moving Mice at JoVE.com

Stort tack till prof Klaus-Armin Narve och Dr Sandra Goebbels (Max-Plank-Institute of Experimental Medicine, Goettingen, Tyskland) för vänligt tillhandahållaNde Nex-Cre möss. Också, Vi tackar vår video-team Yunus Dikici och Ruben Wiesner för inspelning och bearbetning av JoVE video för den här artikeln. Dessutom, stort tack till Kristin Claussen för hennes voice-over och Kimberly Anne Go för korrekturläsning av manuskriptet.
De presenterade resultaten erhölls vid Ruhr-universitetet i Bochum och videon spelades in vid universitetet i Bremen.
Detta arbete finansierades av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Tyska forskningsstiftelsen) - Projektnummer 122679504 - SFB 874 och DFG MA 4692/3-2.

Författarna har inget att avslöja.

Använda ljus för att manipulera neuronal signalering har varit metoden för val för nästan ett decennium nu. Sedan 2005, antalet publicerade artiklar om utvecklingen av nya optogenetiska verktyg 4,6,8,8,14,49,50,51 och studier där sådana verktyg utnyttjas för att undersöka hjärnkretsar21,23,40,43,52, kraftigt ökat. Å ena sidan, med den enorma mångfalden av injicerbara optogenetiska verktyg, implantationsvarianter, transgena muslinjer och beteendeexperiment, är möjligheten till experiment mångfald och obegränsad. Å andra sidan är möjligheten att göra fel i valet av experimentella förhållanden mycket hög och experimenten är så specifika, att ofta är jämförbarheten med andra studier svår.
Kritiska steg Ett viktigt kritiskt steg i detta protokoll är korrekt planering. Valet av det optogenetiska verktyget bör matcha den vetenskapliga frågan. Är det bara nödvändigt att manipulera den totala aktiviteten hos en neuron eller synaps? Sedan kommersiellt tillhandahållna verktyg som ChR221,25,27 och Arch37 är ett bra val. Men bortsett från det, om en speciell signalsubstans system eller ens en enda receptor bör manipuleras, en individuell receptor chimera är ofta det bättre valet3,6. Flera receptor chimärer med GPCRs, den så kallade Opto-XRs, och riktlinjer för att producera dem finns redan4,50. Andra än valet av optogenetiska verktyg, muslinjen i kombination med beteendeexperimentet är också kritisk. Olika bakgrundsstammar, som till exempel C57Bl/6 och BALB/cByJ, visar olika beteendemässiga fenotyper i vissa avseenden53,54. C57Bl/6-möss har en låg baslinjeångest och kan användas för ångestdämpande manipulation, medan BALB/cByJ uppvisar högre ångestnivåer och därför är mer känsliga för ångestdämpande läkemedel. Dessutom kan de transgena varianterna av dessa bakgrundsstammar också variera i sin fenotyp48. Med en korrekt kombination av specifika initiativtagare i samband med ett optogenetiskt verktyg och transgen muslinje, kan nästan varje önskad cellpopulation riktas.
Ett kritiskt steg under operation riktar sig till rätt plats. Med hjälp av musen hjärnan atlas, korrekt koordinater för den främre-posterior axeln, och mediala-laterala axeln, och djup av strukturen kan upprättas45. I verkligheten har varje skalle en något annorlunda form och storlek. Således är F-faktor46 för att justera stereotaktiska koordinaterna ganska viktigt, liksom korrekt näsa och öra fixering under stereotaktisk kirurgi. Om musens huvud lutas, kommer injektionsbyulan att misslyckas med att rikta den önskade regionen av intresse.
Dessutom är injektionsbygelns diameter också kritisk. Om den är för liten kan inget virus släppas ut i vävnaden, om den är för bred kommer kanylen att läcka viruslösning på väg till intresseområdet. Om den implanterade optiska fibern upphör direkt över målregionen spelar virusuttrycket i cortexregionerna ovan ingen roll. Men om implantatet placeras över andra regioner för att stimulera axonterminaler, kommer axoner i övre hjärnbarken regioner också aktiveras av ljus och förfalska erhållna data. Som ett exempel: IL-regionen och den prelimba (PrL) regionen både projektet till den basala amygdala55,56 men har helt olika funktioner och roller i moduleringen av ångest26,57. Om implantatet placeras ovanför amygdala för att aktivera axonterminaler från IL-regionen, och under injektionsviruslösningen också placerades i PrL på grund av fel injektionskanula, är risken för att även aktivera axonterminaler från PrL mycket hög.
Under beredningen av skallen för fixering av implantatet är den glesa användningen av primer och bindning avgörande för en tillförlitlig och hållbar fixering. Om 2-komponenten vidhäftningssystemet inte appliceras tunt, kan tandcement lossna från skallen efter ett par dagar eller veckor. Dessutom måste skallen också torkas helt innan implantatet fixeras, eftersom cementen annars inte kommer att fästa ordentligt på skallen.
Kritiska steg finns också i beteendedelen av det här protokollet. Först är byggandet av labyrinten mycket viktigt. I varje beteendemässiga setup, finns flera varianter i litteraturen angående storlek och form, liksom för själva förfarandet58,59,60. Det är viktigt att välja en variant som gör uppgifterna jämförbara och reproducerbara. Också, särskilda krav för utnyttjade muslinjer bör beaktas43,48. I de representativa uppgifterna för EPM kan man se att flera Nex-Cre-möss föll från labyrinten eller halkade av flera gånger (Figur 2b). För dessa möss, en labyrint med en liten vägg runt de öppna armarna skulle ha varit ett bättre alternativ.
För det andra är det viktigt att hålla alla yttrerumsförhållanden konstant 61, annars skulle olika grupper av möss inte vara jämförbara alls. I detta avseende är det mycket viktigt att välja tidpunkten för experimentet som en där den experimentella setup är ledig och experimentören är alltid närvarande. Vidare bör händelser i byggnaden, såsom byggnadsarbeten, provning av eventuella system (brandlarm) eller rengöringsdagen för musanläggningen, övervägas för att undvika störningar i erhållna data.
Slutligen, hantering och bostäder villkor är avgörande för beteendemässiga experiment. När en implantation utförs, möss måste vara singel inrymt på grund av risken för skador från andra möss. För att säkerställa god jämförbarhet mellan grupper och ett lågt fel inom en grupp, måste varje mus ha samma burstorlek och berikning. För ångest-relaterade experiment, enda bostäder har vissa fördelar som singe inrymt manliga möss visar en lägre baslinje ångest nivå, mindre variation i deras ångest nivå, och mindre depressiva-liknande symtom15,16. Grupp inrymt manliga möss kan starkt skilja sig i sin ångest nivå på grund av hierarkin bland mössen. Förutom bostäder, en konstant och lika hantering av alla möss och grupper är också viktigt. Att ta tag i musen för att kunna koppla ihop ljusfibern på implantatet är mycket stressande. Därför måste denna procedur vara densamma för varje mus, vilket betyder samma teknik och samma experimenter. Dessutom måste tillvänjningstiden i vänteburen, som är tänkt att lugna ner musen från det stressiga anslutningsproceduren, också ha lika förhållanden i varaktighet, kull och position till labyrinten. Hanteringen inom musanläggningen är också avgörande för senare beteendeprestanda. Försöks- och kontrolldjur bör inte rengöras på olika dagar eller av olika människor, eftersom detta också är påfrestande för möss. Dessutom bör rengöringsdagen inte vara den experimentella dagen för att undvika skillnader i beteende.
Felsökning Det finns flera problem som kan uppstå under protokollet. Till exempel, borrning en hel i skallen under stereotaktisk kirurgi kan skada blodkärlen. Vanligtvis uppträder stark blödning, särskilt ovanför bregma och lambda. Om detta händer, försök inte att stoppa blödningen med bomullspinnar eftersom de tenderar att förlänga ännu mer blödning ur kärlet på grund av deras absorbens, istället, direkt skölj med NaCl.
Det kan också hända att tryckinjektionen av viruslösningen inte fungerar. I det här fallet kan det vara så att parafilm, en sårskorpa från burrhålet eller hjärnvävnaden, täpper igen kanylens spets. I detta fall, ta bort kanylen långsamt ut ur hjärnan utan att ändra x- eller y-axeln och använd en pincett för att ta bort 1-2 mm av den främre delen av kanulaspetsen. Innan du sänker kanylen igen, testa för funktionalitet genom att applicera liten mängd tryck för att se om virus kommer ut ur kanulaspetsen. För att undvika förstoppning, sänk kanylen med en konstant hastighet och stoppa inte rörelsen förrän injektionssidans djupaste djup har uppnåtts. Om för mycket av kanylspetsen avlägsnas och diametern är för stor kommer kanylen att skada vävnaden och risken att applicera viruset på en gång kommer att ökas. Se således till att endast den igensatta delen av spetsen avlägsnas försiktigt.
Under beteendeexperimentet kan inställningen av experimentet i videospårningsprogrammet (t.ex. Ethovision XT) orsaka problem. Om ljusutmatningen till exempel inte fungerar som den ska kan detta bero på flera orsaker. Pulser måste öppnas, programmeras och startas innan Ethovision XT öppnas. Maskinvaran behöver väljas korrekt i "Experimental setup" (steg 3.2.2.4). Om fel IO-Box, eller något annat än "Costume Hardware" är valt, kan Pulser-enheten inte styras av Ethovision. Om testet av ljusutgången lyckas, men det programmerade ljusprotokollet i "Inställningar för kontroll av försök" inte fungerar under anskaffningen, kanske underregeln eller underregelreferensen finns felaktigt eller villkoren och åtgärderna är oklara. Till exempel: tillhör referensen rätt underregel? Är referensen korrekt programmerad (t.ex. hur ofta utförs underregeln)?
Dessutom kan det hända att under "detektionsinställningar" djuret spåras tillräckligt, men under förvärvet finns det prover där ämnet inte hittas. I det här fallet, kontrollera om belysningen i experimentrummet var förändrat, eller om något producerade oönskade skuggor i labyrinten. Hela botten av labyrinten måste ha samma färg, eftersom inställningen bara kommer att fungera för en specifik kombination. Om av någon anledning olika botten färger eller skuggor inte kan undvikas, definiera detektionsinställningen i den mörkaste delen av labyrinten.
För att ändra eventuella inställningar efter förvärvet av de första djuren, tillämpa inte dessa ändringar i de redan använda inställningarna. Duplicera dem för att justera dem. Detta innebär också att den redan registrerade rättegången inte är giltig längre för dataanalys. I ett sådant fall, spela in alla djur för denna experimentella grupp med de ursprungliga inställningarna, och skapa ett nytt experiment efteråt där de inspelade videorna analyseras i stället för livespårning. I detta "från video"-experiment kan flera inställningar användas för analys utan att förlora jämförbarheten mellan djur eller ens data.
Begränsningar och framtida tillämpningar Denna metod att manipulera beteende med optogenetik i fritt rörliga djur inkluderar också begränsningar. Under operationen är närheten till de två implantaten begränsad. För dubbel implantation måste avståndet mellan de två implantaten minimalt vara bredden på apparaten för att hålla implantatet. Apparaten måste sänka det andra implantatet i burrhålet, medan de första implantaten redan är fixerade. En lösning för detta kan vara en vinklad implantation, där glasfiberns spetsar kan vara mycket nära medan de keramiska ferulesna ovanför skallen har störreavstånd 23,55,56,57,62,63. En nackdel med en vinklad implantation är ljuset sprider sig. När fiberspetsen är snedställd istället för rakt ovanifrån är det stimulerade området annorlunda. Vid två målregioner i nära anslutning behöver den ändrade positionen för ljusstimuleringen beaktas.
Under beteendeexperimentet kan labyrintens konstruktion störa den optiska kabeln som är ansluten till djuret. Vissa beteendetester, som den ljus-mörka lådan, innehåller ettinomhusområde 64,65, och andra labyrinter innehåller fack som musen behöver ange. Sådana experiment kan inte utföras med den här inställningen. Alternativt kan ett trådlöst system vara ett alternativ22,26,66. Men lyckligtvis vissa labyrinter, såsom Barnes Maze, kan ordnas på ett sådant sätt, att mössen kan komma in i relevanta fack67.
Förutom de med slutna zoner, labyrinter som är för breda kan orsaka också problem. Ju större område i labyrinten, desto längre kabel måste vara att låta djuret att gå till varje position i labyrinten. Försiktighet måste vidtas att djuret inte kan trampa på kabeln eller ta tag i den och bita den. En lösning för det kan vara en konstruktion som rullar upp den överflödiga kabeln. En nackdel är att dra för att rulla kabeln är svårt för möss. Denna lösning skulle bättre lämpad för råttor. Ett annat möjligt alternativ skulle kunna vara att göra ljusstimuleringen i förväg, istället för under försöket, naturligtvis är detta endast möjligt om en långsiktig effekt på grund av den lätta stimuleringensker 23.
Jämförelse med befintliga/alternativa metoder Alternativa metoder skulle vara kemisk eller elektrisk stimulering underbeteende 8,18. Kemiska agonister eller antagonister har möjlighet att aktivera eller tysta nervceller via specifika receptorer och kan också manipulera enstaka signalsubstanssystem38,68. På ena sidan är receptor-specificiteten ganska hög för kemikalier, eftersom specifik agonist eller antagonist bara aktiverar vissa receptorer39. Å andra sidan är specificiteten för receptorsubtyper av samma neurotransmittorgrupp ofta otillräcklig. De flesta kemikalier binder till minst två undertyper med olika sannolikheter69. Dessutom, kemikalier kan inte skilja mellan neuronala celltyper så länge de har samma receptortyper. Utöver detta är tidsmässig och rumslig upplösning dålig för kemiska manipulationer i jämförelse med optogenetik. Agonister eller antagonister administreras ofta oralt35 eller via systemiska injektioner57,70. Om infusionen av kemikalien sker direkt i hjärnvävnaden, visas effekter snabbare än med orala tillämpningar, men fortfarande på en långsammare tidsskala än med ljusstimulering. Som de administrerade kemikalierna diffusa i hjärnan och är inte specifika för neuronala typer eller regioner hjärnan, manipulation av specifika hjärnkretsar det inte möjligt.
Elektrisk stimulering har en högre temporal upplösning än kemiskstimulering 9,14. Spridningen inom i neuronal vävnad är mindre än med kemisk stimulering och den rumsliga upplösningen är bättre än med kemisk stimulering. Emellertid, elektrisk stimulering saknar möjlighet att specifikt ta itu med olika neuronala celltyper eller receptortyper, som varje neuron i närheten av elektroden kommer att svara på den elektriska stimulering.
Alternativa metoder till uppförandet i fritt röra möss är for example electrophysiological inspelningar i hjärnsegment, var singel- neurons eller axons kan moduleras med optogenetics och elicited verkställer kan mätas via inspelningelektroder6,71. In vitro-experiment ger möjlighet att undersöka den molekylära och cellulära grunden för optogenetiska stimulering men har den begränsningen att inneboende anslutning och input från andra hjärnregioner saknas. Ett annat alternativ är att använda optogenetisk i samband med multiphotonbildbehandling 1,72. I det här fallet har möss huvudet fast och kan sövas eller vara vaken för att lösa enkla uppgifter.
För att utföra ett framgångsrikt optogenetiskt experiment finns ett brett utbud av verktyg och applikationer nuförtiden. Valet av optogenetiska verktyg och beteendemässiga set-up är avgörande för att besvara specifika forskningsfrågor. Om rätt kombination av verktyg och experiment väljs, optogenetik tillåter en aldrig tidigare skådad, djupgående undersökning av neuronala kretsar med hög tidsmässiga och rumsliga upplösning. Detta kommer att bidra till att förstå och utveckla nya terapeutiska strategier för psykiatriska sjukdomar och kognition.

Moduleringen av neuronala kretsar i centrala nervsystemet och deras beteendemässiga resultat är viktiga för att förstå hur hjärnan fungerar, särskilt vid psykiatriska sjukdomar och kognitiva uppgifter som inlärning och minne. Med optogenetik kan enstaka celler eller cellpopulationer upp till hela kretsar moduleras av ljus. Vanliga optogenetiska verktyg som Channelrhodopsin2 (ChR2) eller Archaerhodopsin (Arch) kan aktivera eller tysta nervceller, eller öka eller hämma sändarutgåvan vid axonterminaler som projicerar till distinkta hjärnregioner1,2,3,4. Dock måste Arch användas försiktigt eftersom det visades att dess aktivering vid presynaptiska terminaler ökar spontan sändare release5. Arch är en utåt rättande protonpump som ändrar pH-värdet inuti cellen. Denna alkaliska miljö inducerar kalciumtillströmningen och förbättrar sändarutgåvan5. För att specifikt modulera intracellulära signalvägar, receptor chimeras består av ett ljus aktiveras optogenetiskt verktyg, såsom rhodopsin eller kon opsin, i samband med en adekvat G-protein kopplade receptor, kan skapas6,7,8. Mängden och variationen av optogenetiska verktyg som finns har ökat betydligt under det senaste decenniet9.
Syftet med optogenetik är att manipulera neuronal kretsar under beteende. Optogenetik möjliggör till exempel mätning av akuta beteendeförändringar såsom förändringar i ångestbeteende. Optogenetiska verktyg levereras till målregioner i hjärnan via virala vektorer. Med hjälp av särskilda tillskyndare och förstärkare, eller Cre-loxP-systemet, kan man säkerställa celltypsspecialitet för uttrycket av optogenetiska verktyg (Figur 1A). Det finns flera genetiskt modifierade muslinjer som uttrycker enzymet Cre-Recombinase i specifika celltyper endast. Till exempel, Nex-Cre möss uttrycka Cre-Rekombinas i pyramidala nervceller i cortex och hippocampus under kontroll av Nex-promotor10. Detta enzym är kompetent att invertera DNA-ordnar, som flankeras av loxP-sidor11. Följaktligen kan DNA-sekvensen av en dubbel-floxed optogenetiska verktyg, som är inverterad och flankerad av loxP sidor, endast transkriberas av nervceller som besitter Cre-Rekombinas, men inte av andra neuronala typer12,13. När det gäller Nex-Cre-möss kommer det optogenetiska verktyget enbart att uttryckas i pyramidala nervceller. Ljusstimulering av vissa hjärnregioner uppnås sedan via kronisk implantation av optiska fibrer direkt ovanför den region av intresse. Djur kan sedan kopplas till en lämplig ljuskälla och fritt bete sig i nästan alla typer av beteendemässiga tester.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61023/61023fig01.jpg"> Bild 1: Injektion och implantation. A) Cre-loxP-system för ChR2-YFP. Dubbel floxed optogenetiska verktyget är förpackad i en adeno associerade virus (AAV) för injektion i hjärnvävnaden. B) Sagittal syn på virusinjektionen och implantationen av ett optiskt neuronalt gränssnitt in i/ovanför IL-regionen i mPFC. Injektion och implantation gjordes ovanifrån. Alla regioner av intresse, IL, BLA och DRN, visas. C) Detaljerad vy över den implanterade optiska fibern, hylsan och ljuskällan. D) Spridning av blå och röd laserljusstimulering i grå substans hjärnvävnad från en 200 μm ljusfiber (Yizhar et al. 2011). Blått ljus sprider sig, vid maximum, 0,5 mm in i vävnaden, rött ljus ca 1 mm. Färgkodning: röd 50%, gul 10%, grön 5%, blå 1% om ljus når detta område. E) Koronal syn på den ensidiga implantationen direkt ovanför vänster IL med en optisk fiber på 200 μm. IL-regionen har en bredd på 0,25 mm på varje halvklot och ett djup på 0,2 mm. Blå och röda glödlampor är boarder av 5% ljus spridning och överförs från Yizhar et al till rätt storlek. LoxP: locus av X-over P1; ChR2: Channelrhodopsin; YFP: gult fluorescerande protein; dflox: dubbel floxed; IL: infralimbic cortex; BLA: basolateral amygdala; DRN: dorsala raphe kärnor; PrL: prelimbic region. Denna siffra har ändrats från Berg 201948. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61023/61023fig01large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.</a>
Optogenetiska tillvägagångssätt utnyttjas eftersom det möjliggör både hög tidsmässig och rumslig upplösning14 och celltyp specifik modulering. Dessutom är det möjligt att upprepat använda den implanterade enheten utan ytterligare behandling. Efter en stereotaktisk kirurgi, där injektionen av ett adeno-associerat virus som bär på det optogenetiska verktyget och implantationen av den optiska fibern utförs, kan möss återhämta sig i två veckor. Vi har valt en återhämtningstid på endast 2 veckor, eftersom detta är tillräckligt med tid att återhämta sig från operationen och för viruset att uttrycka. Eftersom beteendeexperimenten följs av immunohistokemi måste vi se till att möss inte blir för gamla under experimentet; annars minskas vävnadskvaliteten. De visar inga uppenbara beteendemässiga funktionsnedsättningar från implantatet och engagera sig i typiska bur beteende. Naturligtvis är implantationen åtföljd av en betydande kirurgisk lesion; därför övervakas mössen intensivt. Efter operationen måste möss enstaka inhysas, eftersom grupphusmöss tenderar att skada varandras färska sår och implantat. Men bostadsförhållanden har en stor inverkan på ångestnivån hos manliga möss, som enda inrymt möss visar lägre ångest nivåer15 och i allmänhet mindre depressiva-liknande symtom16.
Kemisk eller elektrisk manipulation av hjärnkretsar saknar optogenetikens höga celltypssärkalitet och har en lägre tidsmässig och rumslig upplösning14,17,18. Beroende på den experimentella frågan kan elektrisk eller kemisk stimulering ha olika fördelar. När passerar fiber terminaler i en specifik region måste också stimuleras, elektrisk stimulering är den bästa metoden. Kemisk stimulering är ett bra val för när sändarspecifika receptorer i en hel region ska aktiveras av agonister. En annan stor fördel med optogenetik jämfört med kemisk eller elektrisk stimulering är att endogent, nervceller är inte känsliga för ljus, som undviker förekomsten av biverkningar19. Faktum är att höga ljusintensiteter kan inducera värmeeffekter8,20, men på grund av rätt kontrollgrupper, de beteendemässiga effekter på grund av optogenetisk manipulation kan elimineras.
Undersökande gnagare beteende, särskilt i fråga om psykiatriska sjukdomar, har kraftigt förbättrats med optogenetik i fritt rörliga djur, eftersom det möjliggör direkt modulering av enstaka receptorer upp till specifika cellpopulationer21 och kretsar22. Möjligheten att mäta de akuta effekterna av sådana modulationer, liksom de långsiktiga beteendeeffekterna efter en definierad tid23 eller efter kroniskstimulering 24, möjliggör en bred flexibilitet av experimentella konstruktioner och ger mycket detaljerade insikter i hjärnkretsar. Ljusstimulering kan användas för att modulera nervceller som finns vid injektionsstället för det optogenetiska verktyget. När både injektion och implantation adress samma hjärnregionen, cell organ och tillbaka projicera axons av princip nervceller och interneurons i denna region kan riktas3,6,8. Men, den lätta fibern kan också implanteras i en region som skiljer sig från den injicerade. I detta fall kan ljusstimulering modulera sändarutgåva vid axonterminaler i projektionsområdena i den injicerade regionen25,26,27.
I studien här används optogenetik i kombination med experiment för att analysera ångestrelaterat beteende. Ångestrelaterade psykiatriska sjukdomar drabbar mer än en tredjedel av världens befolkning28,29,30 och orsakar en hög ekonomisk börda31. De som drabbas lider av en känsla av upphetsning, spänning och oro följt av undvikandebeteende 32,33. Dessa kroniskt förekommande negativa känslor, som huvudsakligen är inriktade på framtida händelser34, starkt störa det dagliga livet för patienter. Vanliga behandlingar som bensodiazepiner eller selektiva serotoninåterupptagshämmare (SSRI) är endast framgångsrika hos några av patienterna. En stor mängd människor svarar inte på behandlingen alls35, visar att den mekanism som ligger bakom sådana sjukdomar är ännu inte helt klarlagt. Den mediala prefrontala cortex (mPFC) är känd för att spela en viktig roll i utvecklingen och manifestation av ångest21,25,27,36,37,38. Specifikt kan överaktiveringen av den infralimbic cortex (IL) regionen i mPFC vara en del av ångest-relaterade sjukdomar39,40. Exemplet experimentet som beskrivs här skulle kunna bidra till att förstå hur modulationer i regionen IL i mPFC påverka ångest beteende. Dessutom kan utvecklingen av nya terapeutiska strategier för ångestrelaterade psykiatriska sjukdomar också potentiellt stödjas.
2-6 månader gamla manliga Nex-Cre möss används för att uttrycka ChR2 specifikt i pyramidala nervceller inom IL regionen av mPFC41. Nex-Cre möss har en C57Bl/6 bakgrund och uttrycka enzymet Cre-rekombinas specifikt i pyramidala nervceller. Under en stereotaktisk kirurgi injiceras dubbel floxed ChR2-DNA i IL-regionen via adeno associerade virala vektorer. Det optiska implantatet placeras direkt ovanför den region av intresse (Figur 1B) och implantatet är fast med tandcement. Kontroll djur får en injektion av dubbel floxed tdTomato-DNA i samma region att efterlikna cell specifika uttryck.
Djur är grupphus fram till operationsdagen och efteråt är enda inrymt för att undvika skador från andra möss. Möss är inhyst i enskilda ventilerade bur (IVC) rack i TypI-L burar för enkelhus möss. Den ljus-mörka cykeln följer en 12:12 h rytm, den ljusfas som börjar vid 10 AM. Alla beteendeexperiment utförs i den mörka fasen, som liknar den aktiva fasen av gnagare. Vatten och standardmatpellets finns ad libitum. Efter två veckors återhämtning, vilket säkerställer ett tillräckligt uttryck av ChR2 i pyramidala nervceller, används möss för beteendeexperiment.
Öppet fält (OF) är en 50 cm x 50 cm i kvadrat labyrint med sandblästrat 40 cm höga väggar. Marken är uppdelad i 16 rutor där den inre 4 representerar centrum. Det uppmätta beteendet är: 1) tid som tillbringas i centrum, 2) antal mittposter och 3) totalt avstånd flyttas. Under detta experiment, det finns 4 försök totalt 20 minuter. I försök 1 och 3 sker ingen ljusstimulering, och i försöken 2 och 4 utförs en 20 Hz-stimulering med 5 ms ljuspuls och 1 mW ljusintensitet på 473 nm (Figur 2A). I de senare försöken beaktades tillvänjning till testområdet, men användningen av skeninsprutade kontrolldjur anger hur tillvänjning uttrycks.
Barnes maze är ett experiment för inlärning och minne. Det är en cirkulär plattform som är 92 cm i diameter och innehåller 20 ekvidsliga hål runt omkretsen. 19 av hålen är stängda och under ett hål presenteras en utrymningsbox. För 4 dagar i följd har möss 4 träningsförsök för att lära sig platsen för utrymningslådan. På den5:e dagen tas utrymningsrutan bort, och möss testas på hur mycket tid de behöver för att hitta rätt hål. Det uppmätta beteendet är: 1) Tid tills utrymningsrutan/rätt hål hittas, 2) Antal målbesök och fel, och 3) Avstånd flyttat tills i utrymningsrutan. Ljusstimuleringen i olika grupper görs antingen under förvärv eller konsolidering, som sker på träningsdagarna 1-4, eller under hämtning på testdagen, som är dag 5 (Figur 2D).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61023/61023fig2v2.jpg"> Figur 2: Beteendeexperiment med optogenetiska protokoll. A) Schematisk ritning av Open Field-experimentet med motsvarande ljusstimuleringsprotokoll. C) Schematisk ritning av Elevated-Plus Maze-experimentet med motsvarande ljusstimuleringsprotokoll. D) Schematisk ritning av Barnes Maze-experimentet med motsvarande ljusstimuleringsprotokoll. EPM: Förhöjd-Plus-labyrint; AV: Öppet sätta in; BM: Barnes labyrint test. Denna siffra har ändrats från Berg 201948. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61023/61023fig2v2large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.</a>
För optogenetisk stimulering måste ljusintensiteten och frekvensen anpassas till det optogenetiska verktyg och neuronal typ som är under utredning. Lägsta möjliga ljusintensitet bör användas för att undvika skador på vävnaden, eftersom flera studier har visat att det finns möjliga uppvärmningseffekter på grund av stark ljusintensitet8,20. För ChR2 används vanligen en 20 Hz-stimulering med en 5 ms ljuspuls2. Som ChR2 är ganska ljuskänslig, är 1 mW ljusintensitet tillräcklig. Ljusstimuleringsprotokollet växlar mellan ljus från och på försök för att direkt mäta beteendeförändringar. De yttre rumsförhållandena för beteendeexperiment bör förbli stabila för hela gruppen av djur. Viktiga förutsättningar att tänka på är bullret (tänk på att enheterna själva kan göra ljud), lukten (rengör alltid beteendeuppställningarna med etanol), ljusintensiteten och experimentören. Försökspersonen ska alltid vara samma person. Dessutom bör tiden på dagen för experimenten vara densamma för alla djur i en grupp, några timmar efter starten av den mörka fasen i anläggningen är att föredra.
Målet med detta experiment är att öka excitation/ hämning (E / I) förhållandet i IL regionen genom stark aktivering av excitatoriska pyramidala nervceller. En förbättrad E / I-förhållande i denna speciella cortex regionen är känt för att öka ångest nivåer hos möss40,42,43,44.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ketamin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K2753-64</td>
			<td>Anestasia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 % Glucose</td>
			<td>AlleMan Pharma</td>
			<td></td>
			<td>Injection s.c. for fast recovery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Behavioral mazes</td>
			<td>Costum made</td>
			<td></td>
			<td>Measure anxiety</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bepanthen</td>
			<td>Bayer</td>
			<td></td>
			<td>Ophthalmic oinment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betaisodona</td>
			<td>Monodipharma</td>
			<td></td>
			<td>Sterilant containing iodine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betaisodona</td>
			<td>Monodipharma</td>
			<td></td>
			<td>Iodine oinment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ52, 110AL0.62x WD160</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic ferrules</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CFLC230-10</td>
			<td>Implant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic Fiber Scribe</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CSW12.5</td>
			<td>Cutting of the glass fiber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Channelrhodopsin2-YFP virus</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>Addgene 20298</td>
			<td>Optogenetic tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed air</td>
			<td>Kontakt Chemie</td>
			<td>Druckluft 67</td>
			<td>Drying of the skull</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coordinate system</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td></td>
			<td>Stereotactic coordinates for the surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Correl Draw</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Graphical software version 13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryoslicer</td>
			<td>MICROM</td>
			<td>HM500OM</td>
			<td>Production of brain slices for staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethovision XT 14</td>
			<td>Noldus</td>
			<td></td>
			<td>Software for behavioral tracking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Statistical Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferrule Polishing Puck</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>D50-F</td>
			<td>Polishing implants round side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Patch Cord dual</td>
			<td>Prizmatix</td>
			<td>Optogenetics-Fiber 500, 1,20 m, Ferrule core 1,25 mm</td>
			<td>Cables, which are connected with the two implants of a bilateral implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Patch Cord single</td>
			<td>Prizmatix</td>
			<td>Optogenetics-Fiber 500, 1,20 m, Ferrule core 1,25 mm</td>
			<td>Cable, which is connected with the implant via a sleeve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Stripping Tool</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>T06S13</td>
			<td>Stripping glass fiber for implant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>VWR European</td>
			<td>516-0300</td>
			<td>Cut into pieces for the Novelty-Suppressed Feeding test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food pellets</td>
			<td>M&#252;hle Levers</td>
			<td>H&#246;veler Nagerfutter</td>
			<td>Nutrition for the mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipettes</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>GC150-10</td>
			<td>Injection pipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gradia direct-Flo</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>103322</td>
			<td>Fluid dental cementum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating lamp</td>
			<td>efbe-Schott/Phillips</td>
			<td>R95E</td>
			<td>Prevent the mice from cooling after the surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating plate</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td></td>
			<td>Integrated into coordinate system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection canula</td>
			<td>Braun</td>
			<td>100 Sterican, 0,4 x 20 mm, Gr. 20</td>
			<td>All injections and to bore hole into the skull</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Litter</td>
			<td></td>
			<td>T 1350</td>
			<td>Grounding for the Novelty-Supressed Feeding test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse cages</td>
			<td>Zoonlab</td>
			<td>405 cm^2</td>
			<td>Single housing for experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optibond FL</td>
			<td>Kerr</td>
			<td>26684E</td>
			<td>Preparation of the skull for implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical glass fiber</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FT200EMT</td>
			<td>Light fiber for implant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optogenetics-LED.STSI</td>
			<td>Prizmatix</td>
			<td></td>
			<td>Optogenetic toolbox for light stimulation during behavioral experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>16005-1KG-R</td>
			<td>Perfusion of mice to remove the brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polishing sheet 0.02 &#181;m grit</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LFCF</td>
			<td>Polishing implants round side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polishing sheet 1 &#181;m grit</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LF1D</td>
			<td>Polishing implants round side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polishing sheet 30 &#181;m grit</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LF30D</td>
			<td>Polishing implants round side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polishing sheet 6 &#181;m grit</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LF6D</td>
			<td>Polishing implants round side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulser Software</td>
			<td>Prizmatix</td>
			<td></td>
			<td>Software for light device control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rimadyl-Carprofen</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td></td>
			<td>Analgesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma Plot</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Software for statistics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sleeve</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FT200EMT</td>
			<td>Connection of implant and light cable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SodiumCloride (NaCl)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>3570410</td>
			<td>Rinsing of the skull</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superglue</td>
			<td>Pattex Henkel</td>
			<td></td>
			<td>To Fix the glass fiber in the ferrule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>td-Tomato virus</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>Addgene 51503</td>
			<td>Optogenetic tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV light</td>
			<td>KoQGHJ</td>
			<td>wireless, 1200 mW/cm^2</td>
			<td>Polymeration lamp for dental cementum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylavet-Xylazin</td>
			<td>cp pharma</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optogenetic manipulation of neuronal activity to modulate behavior in freely moving mice

Optogenetiska modulering av neuronal kretsar i fritt rörliga möss påverkar akut och långsiktigt beteende. Denna metod är i stånd att utföra manipulationer av enstaka nervceller och region-specifika sändare release, upp till hela neuronala kretsar i centrala nervsystemet, och möjliggör direkt mätning av beteendemässiga resultat. Nervceller uttrycker optogenetiska verktyg via en injektion av virala vektorer som bär DNA val, såsom Channelrhodopsin2 (ChR2). Ljus förs in i specifika hjärnregioner via kroniska optiska implantat som slutar direkt över målregionen. Efter två veckors återhämtning och korrekt verktyg-uttryck, möss kan upprepade gånger användas för beteendemässiga tester med optogenetisk stimulering av nervceller av intresse.
Optogenetiska modulation har en hög tidsmässig och rumslig upplösning som kan åstadkommas med hög cell specificitet, jämfört med de vanliga metoder som kemisk eller elektrisk stimulering. Ljuset skadar inte neuronal vävnad och kan därför användas för långsiktiga experiment samt för flera beteendeexperiment i en mus. Möjligheterna med optogenetiska verktyg är nästan obegränsade och möjliggör aktivering eller ljuddämpning av hela nervceller, eller till och med manipulering av en specifik receptortyp av ljus.
Resultaten av sådana beteendeexperiment med integrerad optogenetisk stimulering visualiserar direkt förändringar i beteende som orsakas av manipulationen. Beteendet hos samma djur utan ljusstimulering som en baslinje är en bra kontroll för inducerade förändringar. Detta möjliggör en detaljerad översikt av neuronala typer eller signalsubstanssystem som är involverade i specifika beteenden, såsom ångest. Den plasticitet av neuronala nätverk kan också undersökas i stor detalj genom långsiktig stimulering eller beteendemässiga observationer efter optisk stimulering. Optogenetik kommer att bidra till att upplysa neuronal signalering i flera typer av neurologiska sjukdomar.

Syftet med detta protokoll är att mäta förändringar i beteendet hos genetiskt modifierade möss under ett optogenetiskt experiment. Optogenetisk manipulation görs genom injektion av en adeno associerad viral vektor. Ljusstimulering i fritt rörliga möss är möjlig via implantation av en ljusfiber direkt ovanför den region av intresse.
I figur 4presenteras resultaten av ett optogenetiskt experiment. En stark aktivering av excitatoriska pyramidal nervceller i IL regionen via ChR2 ökad ångest-relaterade beteende i det öppna fältet. ChR2 injicerades i IL-regionen i mPFC i Nex-Cre möss för uttryck i pyramidala nervceller (Figur 4A). Under två ångesttester stimuleras Open Field (Figur 4B,C) och testet Novelty-Suppressed Feeding (Figur 4F,G), ChR2 med blått ljus och aktiverar pyramidiska nervceller. Som kontroll fick en annan grupp möss en injektion av fluorophore tdTomato istället för ChR2 (Figur 4D,G). I ett sådant experiment definieras ångest som undvikande av det ljusare centrala området. Möss visar en inneboende undvikande av öppna områden eftersom de är oroliga för rovdjur.
I open field-experimentet, som visas i figur 4B,utförde möss 4 försök på 5 minuter vardera. I försöken 1 och 3 inträffade ingen ljusstimulering (Off1,2) och i försöken 2 och 4 utfördes blå ljusstimulering med 20 Hz (5 ms ljuspuls) och 1 mW-intensitet (On1,2). Heatmapsna visar att, i den experimentella gruppen, den mitterv varaktigheten skilja sig åt mellan Av och På försök. Under ljusstimulering stannar möss företrädesvis i gränszonen. Kontrollera djur föredrar också gränsen, men ändrar inte sitt beteende vid ljusstimulering. I Figur 4Cvisas de huvudsakliga beteendemätningarna under försöket Med öppet fält för försöksgruppen. Om data passerade Shapiro-Wilk testet för normalitet, statistik gjordes med en oberoende två-tailed t-test. Om normalitetstestet misslyckades användes Mann-Whitney-Rank Sum-testet som icke-parametriskt alternativ. För dessa typer av experiment valdes en inom gruppjämförelse för att undersöka om ljusstimulering direkt kan förändra ångestbeteende över tid, oberoende av försöks- och kontrolldjurens baslinjeångest. Centrum varaktighet minskade betydligt under båda ljus stimulering prövningar, vilket indikerar ökad ångest nivåer. Det totala avståndet som flyttades ändrades inte, vilket visar att det rörelsemotoriska beteendet inte påverkades. Antalet centerposter ökades, men inte signifikant. I Figur 4Dvisas kontrollgruppens data. Kontrolldjur visade inte några beteendeförändringar mellan Off och On-försök i någon av de analyserade parametrarna, vilket visar att ljusstimulering eller implantation inte orsakade de observerade effekterna. Sammanfattningsvis visar detta test ökad ångest under ljusstimulering av IL pyramidala nervceller via ChR2.
I figur 5visas data från ett misslyckat optogenetiskt experiment för Elevated-Plus Maze. Under det förhöjda-Plus Maze-experimentet, som presenteras i figur 5A,slutförde möss 6 försök på 3 minuter vardera. I försök 1, 3 och 5 utfördes ingen ljusstimulering (Off1, Off2, Off3) och i försöken 2, 4 och 6 utfördes blå ljusstimulering med 20 Hz (5 ms ljuspuls) och 1 mW-intensitet (On1, On2, On3). I dessa exemplariska resultat var längden på det optogenetiska protokollet och själva labyrintens konstruktion inte lämplig för den transgena muslinjen. I Figur 5B, kan det ses, att flera möss halkade av labyrinten med ryggen tassar eller till och med föll ner. När detta hände, möss fick en andra chans att utföra EPM en dag senare. Om de föll ner igen, var de utestängda från analys. När möss gled av flera gånger men lyckades stanna på labyrinten analyserades data normalt. Trots detta måste uppgifterna tolkas mycket noggrant och kontrolldjur får större betydelse. Nex-Cre möss hade motoriska svårigheter att stanna på den smala öppna armar. För att undvika detta skulle små väggar, med en höjd av 1 cm, ha hjälpt till ett säkert grepp om ryggtassarna på labyrintens armar. Både heatmaps och graferna visar att experimentella, liksom kontrollmöss, började undvika de öppna armarna från försök 2 (On1) på (Figur 5C-E). Tiden på öppna armar minskas betydligt för båda grupperna, liksom de öppna armposterna. Analysera den experimentella gruppen endast erhållna data som antyder en stor ångestogen effekt av ljusstimulering, eftersom tiden på den öppna armen och öppna arm poster minskas avsevärt under On1 rättegången. Men när man jämför dessa data med kontrollgruppen, som visar samma beteende, blir det tydligt att det observerade beteendet inte förmedlas av den optogenetiska stimuleringen, utan genom att undvika de öppna armarna i allmänhet på grund av tillvänjning till labyrinten. Dessa data understryker vikten av en ordentlig kontrollgrupp för att skilja mellan beteendemässiga effekter medierad av optogenetisk stimulering och eventuell beteendemässiga anpassning. Dessutom belyser dessa data vikten av att korrekt anpassa en experimentell inställning för att passa den specifika mousse linjen och experimentell fråga.
För att validera och stärka insamlad beteendedata, avlägsnas hjärnor av möss efter det sista experimentet för att kontrollera för korrekt injektion och implantation (Figur 6). Hjärnor är fast i 4% paraformaldehyd och avlägsnas från skallen. Hjärnor är uttorkade i 30% sackaros i 1-2 dagar och kryoslicerad efteråt. De 40 μm tjocka koronahjärnskivorna tvättas och monteras på superfrost objektiva diabilder med ett monteringsmedium som innehåller DAPI, som fläckar cellkärnor. Detta möjliggör identifiering av målområden i koronaskivorna. Fluorescens av YFP-taggen eller tdTomato själv anger platsen för virusinjektionen. I Figur 6B de föredömliga injektionsställen av ChR2-YFP till vänster (gul), och tdTomato till höger (röd) presenteras. Med hjälp av en mall, anpassad från Paxinos och Franklin45 mus hjärn atlas, il regionen kan identifieras. I båda bilderna uttrycks det optogenetiska verktyget i IL-regionen, men även i angränsande hjärnregioner. För en korrekt tolkning konsulteras spridning av blått ljus i hjärnvävnad8 (Figur 1D,E). Det kan ses att det blå ljuset kommer att nå DP-regionen under IL med endast mindre än 5% av den initiala 1 mW ljusintensiteten vid fiberspetsen (Blå linje i figur 1D)8. Dessutom kan liten mängd ljus gå uppåt till PrL-regionen på grund av back-spridning47. Följaktligen kan man säga att IL-regionen är upplyst den starkast, men angränsande regioner som DP och PrL regionen kan också stimuleras något. Därför är IL-cell specifik stimulering garanteras inte och immunohistochemical analys av de angränsande regionerna bör utföras, för att se om aktiviteten av PrL och DP celler är modulerade via ljus. I figur 6Cvisas en annan viktig kontroll: nex-Cre-muslinjens specificitet. Via antikropp färgning mot de två celltyperna i IL-regionen, glutamatergic princip nervceller och GABAergic interneurons, Det kan ses, att den ChR2-YFP uttryck endast förekommer i glutamatergic nervceller och inte med GABAergic sådana.
Allt som allt visar våra experiment att med optogenetisk manipulation under beteendetestning kunde förändringar i ångestrelaterat beteende observeras. Genom att använda mer än ett test för samma beteende kan man dra en tillförlitlig slutsats. Dessutom bekräftar immunohistokemisk analys erhållna data. Våra experiment tyder på, att den specifika aktiveringen av pyramidala nervceller i infralimbic cortex ökade ångest-relaterade beteende i vissa analyser.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61023/61023fig04v4.jpg"> Figur 4: Optogenetisk aktivering av IL pyramidala nervceller ökar ångestbeteende. Ljusstimulering under experiment: 473 nm, 1 mW, 20 Hz stimulering. A) Schematisk ritning av injektions- och implantationsstället för ChR2-YFP eller tdTomato in i IL. Under experimentet aktiveras pyramidala nervceller i regionen IL i mPFC av ChR2. Saggital hjärnan skivor anpassade från Paxinos och Franklin mus hjärnan atlas, saggital: lateral o,6. B) Open Field labyrint med ljus stimulering protokoll (20 min med 4x5 min omväxlande Off och På försök; vänster) och värme kartor över exemplariska ChR2-injiceras(EXP) och tdTomato-injiceras (CT) möss i alla 4 försök av experimentet (höger). EXP-djur spenderar mindre tid i centrera av AV NÄR stimuleras med blåttlaserljus. För CT djur, tid som tillbringas i centrum skiljer sig inte mellan ljus Off och På försök. C) Gruppdata för EXP-djur i OF, n=11. Möss tillbringar betydligt mindre tid i mitten av OF när stimuleras med blått ljus (Off1 39,49±6,9 s, On1 19.87±4.47 s, Off2 28.13±8.55 s, On2 23.42±9.32 s, Off1:On1, t-test, p = 0.033, *; Av1:On2, MWRS, p=0,049, *). Flyttad avstånd påverkas inte (Off1 2703.09±292.65 cm, On1 3113.4±491.15 cm, Off2 3331.86 ±482.62 cm, On2 3082.17±658,61 cm). # av center poster minska med tiden, men visar inga betydande skillnader (Off 1 22.36±3.78, On1 18.45±3.95, Off2 17.36±1.99, On2 13.27±2.64). D) Gruppdata för CT-djur i OF, n=15. Tidmöss spenderar i centrera av AV, avståndet flyttas, # av mittposter ändras inte mellan ljus På och Av prövningar (Tid i centrum Off116.73±2.65 s, On1 16.02±1.89 s, Off2 12.02±1.76 s, On2 13.04±2.58 s; Avstånd Off1 3399,69±296,77 cm, On1 3210.6±446,9 cm, Off2 3030.28±513.83 cm, On2 2955±617.7 cm; # av mittposter Off1 14.2±1.98, On1 13.6±2.02, Off2 10.8±1.88, On2 11.67±2.5). CT-möss uppvisar signifikant högre baslinjeångest (Off1 EXP:CT, MWRS, p=0,005, **). Värden är medelvärde±S.E.M. * ange betydande skillnader (s≤0,05), ** indikerar betydande skillnader (s≤0,01). t-test alltid tvåstjärtad, MWRS: Mann-Whitney Rank Sum test; IL: infralimbic cortex; BLA: basolateral amygdala; DRN: dorsala raphe kärnor; AV: Öppet sätta in; CT: kontrolldjur; EXP: försöksdjur; L: ljus. Denna siffra har modifierats från Berg et al. 2019, PLoS One43 och från Berg 201948. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61023/61023fig04large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61023/61023fig5v4.jpg"> Figur 5: EPM-experimentet misslyckades med att visa beteendemässiga effekter hos Nex-Cre-möss. Ljusstimulering under experiment: 473 nm, 1 mW, 20 Hz stimulering. A) Förhöjd-Plus Maze med ljus stimulering protokoll (18 min, 6x3 min, omväxlande Off och På prövningar). B) Gruppdata för de möss som "glider av" ingår i data, totalt n=23. Nex-Cre möss hade en tendens att glida av den öppna armen med sina ryggtassar, oberoende av den experimentella gruppen (vänster). Endast möss som stannade på labyrinten för alla 6 försök övervägdes i senare analyser. Slip off's i den första Off1 fasen är orsak till senare undvikande av de öppna armarna (Off1 EXP 1.63±0.6, CT 2.2±0.79, Off2+3 EXP 0.125±0.125, CT 0±0, On1+2+3 EXP 0.625±0.26, CT 0.1±0.1). Cirkeldiagram (höger) visar möss som faller från labyrinten under 18 min med 42,42%. Endast 57,57% avslutade experimentet. C) Värme kartor av exemplariska EXP och CT möss i alla 6 försök av experimentet. Båda grupperna visar en minskning av öppen arm varaktighet efter Off1 rättegången. D) Gruppdata för EXP-djur i EPM, n=12. Tid i öppna armar minskade betydligt under de två första försöken och ständigt efteråt (Off1 73.91±12.22 s, On1 36.15±14.65 s, Off2 15.61±6.23 s, On2 19.49±7.51 s, Off3 9.36±4.44 s, On3 7.96±3.47 s. Off1:On1, t-test, p=0,041, *). Den förflyttade sträckan påverkas inte (Off1 679.96±71.63 cm, On1 712.24±112.82 cm, Off2 717,49±97,39 cm, On2 782,51±81,11 cm, Off3 722,11±68,60 cm, On3 663,90±106,57 cm). Mängden öppna armposter minskar betydligt från Off1 till On1 och förblir sedan konstant (Off1 8.08±1.08, Den1 3.33±0.76, Off2 2.16±0.69, On2 2.91±1.09, Off3 1.73±0.75, On3 1.73±0.66. Av1:On1, t-test, p=0.002, **). Tiden i mitten av EPM minskar längs försök men visar ingen signifikant skillnad från Off to On trial (Off1 41.71±5.34 s, On1 31.2±4.59 s, Off2 19.8±3.44 s, On2 24.49±3.38 s, Off3 20.37±4.77 s, On3 18.85±4.07 s). E) Gruppdata för CT-djur i EPM, n=11. CT-data visar samma signifikanta minskningar som EXP-data, vilket indikerar att experimentet inte har fungerat som det ska (Tid i öppna armar Off1 86,92±12,74 s, On1 33,78±14,38 s, Off2 18.01±11.61 s, On2 16.41±9.61 s, Off3 11.36±4.01 s, On3 5.43±2.07 s. Off1:On1, MWRS, p=0.009, **; Avstånd Off1 705,11±88,36 cm, On1 789,45±77,53 cm, Off2 724,74±80,49 cm, On2 676,57±111,99 cm, Off3 716,99±132,47 cm, On3 663,03±132,46 cm; Öppna armposter Off1 7.09±1, On1 3.72±1.17, Off2 1.45±0.47, On2 1.36±0.58, Off3 0.91±0.43, Off3 1.64±0.59. Av1:On1, MWRS, p=0.01, *; Tid spendera i centrum Off1 35,89 s, På1 29.25±3.96 s, Off2 22.17±3.58 s, On2 15.9±2.57 s, Off3 13.86±4.2 s, On3 16.89±5.75 s). Värden är medelvärde ± S.E.M. * anger betydande skillnader (s≤0,05), ** indikerar signifikanta skillnader (s≤0,01). t-test är alltid tvåstjärtad, MWRS: Mann-Whitney Rank Sum test; EPM: Förhöjd-Plus-labyrint; CT: kontrolldjur; EXP: försöksdjur; OA: öppna armar. Denna siffra har modifierats från Berg et al. 2019, PLoS One43 och från Berg 201948. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61023/61023fig05large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61023/61023fig06.jpg"> Figur 6: Injektionssidan av ChR2 och tdTomato i IL- och Nex-Cre-specificiteten. A) Schematisk ritning av implantationsstället på koronal hjärnskivor vid AP + 1,66 mm, mL 0,3 mm, DV -1,8 mm, med ensidig injektion och implantation (anpassad från mushjärnatlas, Paxinos och Franklin, Bregma +1,54 mm). B) Exemplariska injektionsställen av ChR2-YFP (vänster, gul) och tdTomato (höger, röd) samman med DAPI-färgade cellkärnor (blå) i Nex-Cre möss. Skalstång 1 mm. Insets visar hög förstoring av IL-region. Skala bar 150 μm. Vita rutor anger placering av insets. C) Översta raden: confocal bilder av den vänstra IL regionen av en Nex-Cre mus färgas med CamKII som en markör för glutamatergic nervceller (blå), och ChR2-YFP (gul) eller Gad67 som en markör för GABAergic nervceller (grön), av en Nex-Cre mus. Nedre raden: colocalization av ChR2-YFP (gul) med CamKII (vänster, blå), men inte med Gad67 (höger, grön), som visar specificitet av Nex-Cre möss för glutamaterga nervceller. Skala bar 50 μm. PrL: prelimbic cortex; IL: infralimbic cortex; DP: dorsala peduncular cortex. Denna siffra har modifierats från Berg et al. 2019, PLoS One43 och från Berg 201948. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61023/61023fig06large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity to Modulate Behavior in Freely Moving Mice at JoVE.com

Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity to Modulate Behavior in Freely Moving Mice

Med optogenetisk manipulation av specifika neuronala populationer eller regioner hjärnan, beteende kan ändras med hög tidsmässiga och rumsliga upplösning i fritt rörliga djur. Genom att använda olika optogenetiska verktyg i kombination med kroniskt implanterade optiska fibrer kan en mängd neuronal modulationer och beteendetestning utföras.

Optogenetisk manipulation av neuronal aktivitet för att modulera beteende i fritt rörliga möss

Optogenetic modulation of neuronal circuits in freely moving mice affects acute and long-term behavior. This method is able to perform manipulations of ...

Med optogenetisk manipulation av specifika neuronala populationer eller regioner hjärnan, beteende kan ändras med hög tidsmässiga och rumsliga upplösning i fritt rörliga djur. Genom att använda olika optogenetiska verktyg i kombination med kroniskt implanterade optiska fibrer kan en mängd neuronal modulationer och beteendetestning utföras. Det slutliga målet för optogenetik är moduleringen av neuronala kretsar med hög tidsmässig och rumslig upplösning i beter djur.I motsats till farmakologiska eller elektriska manipulationer, optogenetik möjliggör exakt kontroll av specifika celltyper på neuronala kretsar. Optogenetik är det perfekta sättet att rikta specifika celltyper i speciellt definierade regionen under beteende, och att granska den direkta effekten av förändringar i sådana mikrokretsar. Vi kommer nu att presentera ett steg för att steg styra hur man förbereder och planterar och genomför optogenetik i en fritt rörliga möss.För framställning av det optiska implantatet, placera en keramisk ferrule platt sida upp i en bänk ning. Strip koden för en 200 mikrometer diameter glasfiber, med en fiber strippning verktyg och skär två till tre centimeter icke bitar med en keramisk fiber skrivare. Placera bit glasfiber i den keramiska ferrule sedan placera en droppe en superlim vid den platta sidan med en injektion kannular.På den runda sidan av den keramiska ferrule, skär glasfibern så kort som möjligt och placera pre-implantatet på en ferrulepoleringspuck för att polera den runda sidan på fyra olika publiceringspapper. Efteråt, skär glasfibern på den platta sidan av den keramiska ferrule, till den längd som behövs för implantation. Använd en mushjärnatlas för att beräkna implantatets längd.Implantatet måste sluta direkt ovanför den region av intresse. Före implantationen appliceras anestesi. Den exakta och estetiska tekniken beskrivs i manuskriptet.När musen når ett djupt tillstånd av anestesi, placera den på en värmeplatta och fixa huvudet i en stereotaktisk ram. Fixera näsan och tänderna i fronten och öronen på båda sidor. Applicera en algesi med en cuprofen subcuntaneously i baksidan av musen och tillämpa ogenomskinlig ögonsalva på båda ögonen för att skydda dem från torkning.Fukta håret i hårbotten med en våt pappershandduk och skär sedan av det med hjälp av sax. Se till att ta bort allt löst hår med en våt pappershandduk. Använd en bomullspinne för att desinficera hårbotten med en tinktur som innehåller jod.Höj hårbotten om regionen av intresse med en pincett och skär en centimeter längs mittlinjen. För att rugga skallen för implantation, applicera en liten mängd fosforsyra på ärret och låt den träda i kraft i 15 sekunder. Ta bort all syra med en bomullspinne och skölj ärret med natriumklorid två gånger.För korrekt injektion, beräkna F-faktorn för enskilda koordinater. Placera en glaskantär i stereoctatic ram och lokalisera den direkt ovanför bregma. Nu noll koordinatsystemet och flytta glas kanyl till Lambda.Beräkna F-faktorn med följande formel. Bregma minus Lambda dividerat med 4,2 är lika med F-faktorn. Avkräva koordinater är mycket viktiga för injektion och implantation därför att annorlunda, om fel strukturerar stimuleras därefter de beteende- verkställer är unspecific.Alla möss har minsta avvikelser i storleken på deras skalle, därför är koefficienten absolut obligatorisk. Använd de justerade koordinaterna för att hitta platsen på ärret direkt ovanför intressestrukturen. Använd en injektions kanyl för att borra ett hål i skallen, genom att rotera kanylen på plats.För att ta en viruslösning i glaskantylen ansluten till sprutan, placera en droppe natriumklorid på skallen och en bit pirophen ovanpå. Placera en droppe två microliter viruslösning på pirofen och sänka spetsen av glas kanyl i viruset. Applicera undertryck och vänta tills viruslösningen tas upp av kanylen.Noll till den koordinaten när spetsen på viruset med kanyl är på nivån av skallen och långsamt sänka den i borrhålet till den lägsta positionen av injektionssidan. Applicera en liten mängd positivt tryck med sprutan tills menisken är sänkt. Låt viruset spridas i två till tre minuter innan glasburken flyttas uppåt till nästa läge.Ta bort glasbehållaren mycket långsamt och kassera den efter den slutliga injektionen. Förbered nu skallen för implantation. Torka skallen med tryckluft, applicera primern med denna motsvarande pinne och låt den torka i 15 sekunder.Applicera bindningen med samma pinne och bota den i 20 sekunder med UV-ljus. Placera implantatet i motsvarande hållare och placera glasfiberns spets direkt ovanför borrhålet och sänk den försiktigt. Sluta sänka implantatet när den återstående ventilen av superlim vidrör skallen.Implantation av optiska fibrer kan också göras för bilaterala strukturer som hippocampus. Detta möjliggör lätt stimulering i båda halvkloten samtidigt eller möjliggör stimulering av två olika strukturer. Det är också möjligt att injicera viruset på en plats som skiljer sig från det optiska fiberimplantatet.Om injektionen och implantationen görs i olika regioner, borra alla nödvändiga hål efter applicering av fosforsyra men före de två komponenten vidhäftning. Kontrollera igen om skallen fortfarande är helt torr, applicera sedan fluid dentalcement runt implantatet och i närområdet och bota sedan i 20 sekunder med UV-ljus Applicera ytterligare två mindre cement i helt pälsfritt och torkat skallområde. Bota varje lager med UV-ljus.För att avsluta operationen tillämpa jodanvaj på hela såret. Släpp näsan och örat fixering, föra musen i en fräsch bur och placera den under en värmelampa för att undvika förlust av kroppsvärme. Kontrollera det är hälsostatus minst en gång om dagen och det kommer att posta operativa och algesi efter tre dagar om det behövs.Efter två veckors återhämtning kan möss användas för beteendeexperiment. Öppna Pulser Software och välj USB com-porten som ljuskällan är ansluten till. Välj driftläge tre för att tillåta en extern programvara för att styra ljuskällan.Välj rätt justering för 20 Hertz-stimulering med fem millisekkunders ljuspuls. För att lokalisera division för att kommunicera med pulsern, tryck på startsekvens. Denna status kommer att finnas kvar tills experimenten är färdiga.Nu, skapa ett nytt experiment i EthoVision XT, gå till fil, välj ny från mall och välj tillämpa en fördefinierad mall. Välj livespårning och välj kameran med källa och bekräfta den anslutna Puslar Gen-Eye-cam. Välj mus som djuret som ska registreras.Välj arenamallen, öppna fältet kvadrat och zonen mallen centrum, kantlinje, hörn. Bekräfta ett ämne som ska spåras och välj mittpunkt, nospunkt och svansbas. Bekräfta djurfärgen jämfört med bakgrunden är mörkare och den rekommenderade provfrekvensen för att avsluta steget.Namnge experimentet lämpligt och välj en plats att spara. Tills du hittar arenainställningarna kommer kameran automatiskt att öppna en bakgrundsbild. Anpassa de fördefinierade zonerna till den riktiga arenan genom att använda pilen och de två symbolerna på den är rätt.Om vissa zoner är onödiga tar du bort dem. Tryck på rita skala för att kalibrera och sätta en linje från ett hörn av labyrinten till den andra. Ange längden på det verkliga avståndet i centimeter.Upprepa det för den andra axeln. Om du vill definiera inställningarna för testkontroll förbereder du huvudregeln genom att anpassa villkorstiden till 20 minuter. Villkoret för Star Trek bör vara, när motivet är i arena i två sekunder, för en automatisk status för spårningen när musen är i arenan.Om du vill skapa en underregel för ljusstimuleringen går du till strukturer, mer och väljer underregel. Placera den under huvudregeln och sprid ut de två rutorna. Gå till villkor, tid och ge det ett namn som ljus på en, justera villkor är uppfyllt med efter fem minuter.Placera rutan direkt bakom regelbörjarrutan för underregeln. Gå till åtgärd anpassad hårdvara och namnge den med ljus på en. Välj åtgärd att utföra som:Jag ska sätta en hög.Placera lådan direkt bakom skickslådan. Upprepa stegen för att programmera ljus av för att i ljus på. Gå nu till strukturer, sub regelreferens och kontrollera att referensen hör till rätt underregel.Välj startvillkor som utan fördröjning och startvillkor som körning en gång per start-villkor. Placera referensrutan mellan de extra böckerna en och villkorsböcker två av huvudregeln. Nu definiera detekteringsinställningarna för att visa systemet vad det ska spåra.Placera ett test miles in i arenan och välj automatiserad setup. Välj gnagare som djurtyp och använd musmarkören för att rita en ruta runt mössen i arenan. Bekräfta resultaten av vård fråga med ja.För det öppna fältet experiment, ta med den experimentella musen till beteenderummet precis före experimentet för att säkerställa en korrekt nivå av ångest. Par musen vara en slits av ljuskällan genom att trycka den försiktigt till gallret i buren. Placera den i en väntande bur med färsk kull i 10 minuter för att få acklimatiseras till ljuskabeln.Börja förvärvet genom att trycka på stoppknappen och du till vision XT. Överföra musen från den väntande buren i det övre vänstra hörnet av det öppna fältet. Lämna synfältet på musen under experimentet och hålla sig lugn. Efter 20 minuter, när experimentet är klart, ta bort musen från labyrinten, koppla bort ljuskabeln och sätta tillbaka den i sin egen bur.Genom en kontrollera visualisering, skillnaderna i centrum tid mellan ljus av och ljus på ansikten kan direkt ses. Musen tillbringar mindre tid i centrum när ljuset är på. För Barnes labyrintexperiment, ta alla experimentella möss i beteenderummet cirka en timme före experimentet.Förbered Barnes labyrint genom att stänga alla hål utom en, och nu som en flykt låda är placerad. Anslut en mus i ljuskällan vid båda implantaten och placera den direkt i mitten av Barnes labyrint. Tryck på start och behöver besöka nästa T och ta bort kartonglådan.Var beredd att stoppa rättegången manuellt ifall programvaran inte känner igen hela övergången. Ta ut musen ur labyrinten och ta bort anslutningen till ljuskabeln. När du utför, inlärning och minne uppgift, inte bara den omedelbara effekten av manipulationen undersöks, men också den långsiktiga effekten av manipulation under förvärv, konsolidering eller hämtning.För dataanalys, du hitta behandlingstillståndet behandlas eller kontrolleras, gå till häckning och välj prövningskontroll tillstånd. Välj tillståndsintervallet från elementet action Star Trek till elementet åtgärd ljus går på en. Placera holken mellan filterboxens behandling och motsvarande resultatruta.Detta definierade intervall är av ett. Upprepa stegen för intervall på en av två och på två som också för kontrollgruppen. Definiera även vilka parametrar som ska analyseras i analysprofilen.Välj den beroende variabeln i zon och välj zoncentrum, kroppspunkt, mittpunkt och gå på provstatistik. Välj frekvens, kumulativ varaktighet och låt det se den första. Lägg också till avstånd flytta som variabel.Med denna profil, data för den tid som tillbringas i centrum, centrum poster och berättade att avstånd flytta är tillgänglig. För att extrahera data från varje division, gå till resultat och välj statistik och diagram, tryck på beräkna för att se de analyserade data. Tryck på exportdata och välj teststatistiken och platsen som ska sparas.De exporterade data sparas som en excel-fil och med individuella värden för varje mus. Dessutom, gå till värme karta visualisering och tryck tomt värme kartor, välj försök till höger för att se enskilda värme kartor för varje mus och rättegång. Gör ett högerklick på musen och exportera värme kartor som bilder.Senare, öppna excel-filen datorn och beräkna medelvärdet och standard euro SCM för alla fyra försök och varje uppmätt konditionering grupp. För att generera grafer och Sigma tomt, kopiera medel och SCM i rätt ordning från extra fil till Sigma tomt. Raderna måste innehålla data för off one, på en, och kolumnerna innehåller rättegång, medelvärde och SCM hertz.Välj alla tre kolumner och gå för att skapa grafer. Markera stapelrutan och välj ogrupperad ruta med pil. Märk hela grafen, gå hem, välj rutagra i graf och tryck på export.Välj målmapp och välj metafil som format. För att beräkna statistik för erhållna data, kopiera rätt data från Xcel av en på en, et cetera, och till enstaka kolumner av Sigma tomt. Markera de kolumner du vill jämföra och gå till analys, välj T-test och tryck köra.Slutligen kan beteendedata visas uppdelad i låt av och på försök med ytterligare värme karta specialisering. I det öppna fältet experiment, under ljus stimulering av Channelrhodopsin2 och pyramidala nervceller, är centrum varaktigheten minskade, vilket indikerar ökad ångest nivåer. Via immunohistochemistry, kan injektionsstället och uttryck av viruset vara beslutsamt, också på specificityen på den speciala Cre-anhörigmusen fodrar kan valideras.Man kan tydligt se att den lätta stimuleringen av Channelrhodopsin2 förbättra sinnet nervceller i denna specifika cortex regionen ökar ångest nivåer, jämfört med baslinjen ångest innan denna stimulering. Denna omedelbara effekt av manipuleringen på beteende är anledningen till att optogenetic används idag för så mycket forskning frågor om beteende. Detta förfarande kan användas för Optogenetiska modulering av någon önskad celltyp eller neuronal kretsar i musen hjärnan.Genom att kombinera detta förfarande med lämpliga beteendetester för din forskning, en djupare insikt i neuronal kretsar som deltar i beteenden och sjukdomar av intresse kan vinnas.

Research

JoVE Journal

Behavior

Long-term Potentiation of Perforant Pathway-dentate Gyrus Synapse in Freely Behaving Mice

Långsiktigt Potentiering av perforanta Pathway-gyrus dentatus Synapse i fritt uppför Möss

Studies of long-term potentiation of synaptic efficacy, an activity-dependent synaptic phenomenon having properties that make it attractive as a potential ...

Uncovering Beat Deafness: Detecting Rhythm Disorders with Synchronized Finger Tapping and Perceptual Timing Tasks

Avslöjande Vispa Dövhet: Upptäcka rytmrubbningar med Synkroniserad Finger Tapping och Perceptuella Timing Uppgifter

A set of behavioral tasks for assessing perceptual and sensorimotor timing abilities in the general population (i.e., non-musicians) is presented here ...

Flat-floored Air-lifted Platform: A New Method for Combining Behavior with Microscopy or Electrophysiology on Awake Freely Moving Rodents

Platt-golv Luft lyfte Plattform: En ny metod för att kombinera Beteende med mikroskopi eller elektrofysiologi på Awake Fritt Moving Gnagare

It is widely acknowledged that the use of general anesthetics can undermine the relevance of electrophysiological or microscopical data obtained from a ...

A Novel Experimental and Analytical Approach to the Multimodal Neural Decoding of Intent During Social Interaction in Freely-behaving Human Infants

A Novel Experimental och analytiskt förhållningssätt till Multimodal Neural avkodning of Intent Under social interaktion i fritt bete Human Spädbarn

Understanding typical and atypical development remains one of the fundamental questions in developmental human neuroscience. Traditionally, experimental ...

Visualizing Motion Patterns in Acupuncture Manipulation

Visualisera rörelsemönster i akupunktur Manipulation

Acupuncture manipulation varies widely among practitioners in clinical settings, and it is difficult to teach novice students how to perform acupuncture ...

The Rodent Psychomotor Vigilance Test (rPVT): A Method for Assessing Neurobehavioral Performance in Rats and Mice

The Rodent Psychomotor Vigilance Test rPVT: A Method for Assessing Neurobehavioral Performance in Rats and Mice

Gnagare Psyko Vigilance Test (rPVT): En metod för bedömning neurobehavioral Performance i råttor och möss

The human Psychomotor Vigilance Test (PVT) is a widely used procedure for measuring changes in fatigue and sustained attention. The present article ...

Manipulation of Epileptiform Electrocorticograms (ECoGs) and Sleep in Rats and Mice by Acupuncture

Manipulation of Epileptiform Electrocorticograms ECoGs and Sleep in Rats and Mice by Acupuncture

Manipulering av Epileptiforma Electrocorticograms (ECoGs) och sömn hos råttor och möss genom akupunktur

Ancient Chinese literature has documented that acupuncture possesses efficient therapeutic effects on epilepsy and insomnia. There is, however, little ...

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

Flerskikts Cortical Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Imaging i fritt rörliga möss med prismprober och miniatyriserad fluorescensmikroskopi

In vivo circuit and cellular level functional imaging is a critical tool for understanding the brain in action. High resolution imaging of mouse cortical ...

A Wireless, Bidirectional Interface for In Vivo Recording and Stimulation of Neural Activity in Freely Behaving Rats

A Wireless, Bidirectional Interface for In Vivo Recording and Stimulation of Neural Activity in Freely Behaving Rats

En trådlös, dubbelriktad Interface för In Vivo inspelning och stimulering av Neural aktivitet i fritt bete råtta

In vivo electrophysiology is a powerful technique to investigate the relationship between brain activity and behavior at a millisecond and micrometer ...

Assessing Activity-based Anorexia in Mice

Bedömningen av verksamhetsbaserad anorexi hos möss

Rodents develop activity-based anorexia (ABA) when exposed to a restricted feeding schedule and allowed free access to a running wheel. These conditions ...