Name: optogenetic manipulation of neuronal activity to modulate behavior in freely moving mice
Uploaded: 2020-10-27T12:30:00
Duration: 14 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity to Modulate Behavior in Freely Moving Mice at JoVE.com

Prof Klaus-Armin Narve ve Dr Sandra Goebbels (Max-Plank-Deneysel Tıp Enstitüsü, Goettingen, Almanya) nazik Nex-Cre fareler sağlamak için büyük teşekkür ederiz. Ayrıca, video ekibimiz Yunus Dikici ve Ruben Wiesner'e bu makale için JoVE videosunun kaydedilmesi ve işlenmesi için teşekkür ederiz. Buna ek olarak, kristin Claussen onu seslendirme ve Kimberly Anne Go için el yazması redreading için büyük teşekkürler.
Sunulan sonuçlar Bochum'daki Ruhr-Üniversitesi'nde elde edildi ve video Bremen Üniversitesi'nde kaydedildi.
Bu çalışma Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Alman Araştırma Vakfı) - Projektnummer 122679504 - SFB 874 ve DFG MA 4692/3-2 tarafından finanse edilmiştir.

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Nöronal sinyalizasyon işlemek için ışık kullanarak yaklaşık on yıldır tercih edilen bir yöntem olmuştur. 2005 yılından bu yana, yeni optogenetik araçların geliştirilmesi ile ilgili yayınlanan makalelerin sayısı4,6,8,14,49,50,51 ve bu tür araçların beyin devreleri araştırmak için kullanılan çalışmalar21,23,40,43,52, yüksek artmıştır. Bir yandan, enjekte edilebilir optogenetik aletlerin muazzam çeşitliliği, implantasyon varyantları, transgenik fare çizgileri ve davranışsal deneyler, deneyler için olasılık manifoldu ve sınırsızdır. Öte yandan, deneysel koşulların seçiminde hata yapma olasılığı çok yüksektir ve deneyler o kadar spesifiktir ki, genellikle diğer çalışmalarla karşılaştırılabilirlik zordur.
Kritik adımlar Bu protokolün önemli bir kritik adımı doğru planlamadır. Optogenetik aracın seçimi bilimsel soruyla eşleşmelidir. Sadece bir nöron veya sinaps genel aktivitesini işlemek için gerekli mi? Sonra ticari ChR221,25,,27 ve Arch37 gibi araçlar sağlanan iyi bir seçimdir. Ama bunun dışında, eğer özel bir nörotransmitter sistemi ya da tek bir reseptör manipüle edilmelidir, bireysel bir reseptör chimera genellikle daha iyi birseçim3,6. GPCR ile çeşitli reseptör chimeras, sözde Opto-XRs denir, ve bunları üretmek için kurallar zaten mevcuttur4,50. Optogenetik araçların seçimi dışında, davranışsal deney ile birlikte fare hattı da önemlidir. Farklı arka plan suşları, örneğin C57Bl/6 ve BALB / cByJ gibi, bazı açılardan farklı davranışsal fenotipler görüntülemek53,54. C57Bl/6 farelerdüşük bazal anksiyeteye sahiptir ve anksiyojenik manipülasyon için kullanılabilirken, BALB/cByJ daha yüksek anksiyete düzeyleri gösterir ve bu nedenle anksiyolitik ilaçlara karşı daha duyarlıdır. Ayrıca, bu arka plan suşlarının transgenik varyantları da kendi fenotip48değişebilir. Optogenetik bir alet ve transgenik fare hattı ile birlikte spesifik organizatörlerin uygun bir kombinasyonu ile, hemen hemen her istenilen hücre popülasyonu hedeflenebilir.
Ameliyat sırasında kritik bir adım doğru yeri hedeflemektir. Fare beyin atlası yardımıyla, ön-posterior eksen için uygun koordinatlar, ve medial-lateral eksen, ve yapının derinliği45kurulabilir . Gerçekte, her kafatası biraz farklı bir form ve boyuta sahiptir. Bu nedenle, Stereotaktik koordinatları ayarlamak için F-faktör46 stereotaktik cerrahi sırasında doğru burun ve kulak fiksasyonu olduğu gibi oldukça önemlidir. Farenin başı eğikse, enjeksiyon kanulası istenilen ilgi bölgesini hedeflemede başarısız olur.
Ayrıca, enjeksiyon kanula çapı da önemlidir. Çok küçükse, dokuya virüs salınamaz, çok genişse, kanula virüs çözeltisi sızdıracaktır. İmplante edilen optik fiber hedef bölgenin hemen üzerinde sonlanırsa, yukarıdaki korteks bölgelerindeki virüs ifadesi önemli değildir. Ancak implant akson terminallerini uyarmak için diğer bölgelerin üzerine yerleştirilirse, üst korteks bölgelerinin aksonlarında ışıkla aktive edilecek ve elde edilen verileri tahrif edecektir. Örnek olarak: IL bölgesi ve prelimbic (PrL) bölge bazal amigdala hem proje55,56 ama anksiyete modülasyonu tamamen farklı işlevleri ve rolleri var26,57. İmplant IL bölgesinden akson terminallerini aktive etmek için amigdalanın üzerine yerleştirilirse ve enjeksiyon virüsü çözeltisi de yanlış enjeksiyon kanulası nedeniyle PrL'ye yerleştirilirse, PrL'den akson terminallerinin aktive edilme riski de çok yüksektir.
İmplantfiksasyon için kafatası hazırlanması sırasında, astar ve bağ seyrek kullanımı güvenilir ve dayanıklı bir fiksasyon için çok önemlidir. 2 bileşenli yapışma sistemi ince uygulanmazsa, diş çimentosu birkaç gün veya hafta sonra kafatasından kopabilir. Buna ek olarak, kafatası da tamamen implant sabitleme önce kurutulmalıdır, aksi takdirde çimento kafatası düzgün eklemek olmaz gibi.
Bu protokolün davranışsal kısmında da kritik adımlar vardır. İlk olarak, labirentin inşası çok önemlidir. Her davranışsal kurulumda, çeşitli varyantları literatürde boyut ve form ile ilgili olarak, hem de yordamın kendisi için58,59,60var . Verileri karşılaştırılabilir ve tekrarlanabilir kılan bir varyant seçmek önemlidir. Ayrıca, kullanılan fare hatları için özel gereksinimler dikkate alınmalıdır43,48. EPM'nin temsili verilerinde birkaç Nex-Cre faresinin labirentten düştüğü veya birkaç kez kaydığı görülebilir(Şekil 2b). Bu fareler için, açık kollar etrafında küçük bir duvar ile bir labirent daha iyi bir alternatif olurdu.
İkincisi, tüm dış oda koşulları sabit tutmak için önemlidir61, aksi takdirde farelerin farklı gruplar hiç karşılaştırılabilir olmaz. Bu bakımdan, deney düzeninin boş olduğu ve deneycinin her zaman mevcut olduğu bir zaman olarak deneme zamanını seçmek çok önemlidir. Ayrıca, elde edilen verilere müdahale edilmemesi için binadaki inşaat çalışmaları, herhangi bir sistemlerin test edilmesi (yangın alarmı) veya fare tesisinin temizleme günü gibi olaylar göz önünde bulundurulmalıdır.
Son olarak, kullanım ve barınma koşulları davranışsal deneyler için çok önemlidir. İmplantasyon yapıldığında, diğer farelerin yaralanma riski nedeniyle farelerin tek kişilik olması gerekir. Gruplar arasında iyi bir karşılaştırma ve bir grup içinde düşük hata sağlamak için, her fareaynı kafes boyutu ve zenginleştirme olması gerekir. Anksiyete ile ilgili deneyler için, tek konut singe ev erkek fareler olarak bazı avantajları vardır daha düşük bir temel anksiyete düzeyi göstermek, onların anksiyete düzeyinde daha az varyasyon, ve daha az depresif benzeri belirtiler15,16. Grup erkek fareler güçlü fareler arasındaki hiyerarşi nedeniyle anksiyete düzeyi farklı olabilir. Gövdenin yanı sıra, tüm fare ve grupların sürekli ve eşit şekilde kullanılması da önemlidir. İmplant üzerindeki ışık lifini bağlamak için fareyi kapmak çok streslidir. Bu nedenle, bu yordam her fare için aynı olması gerekir, aynı teknik ve aynı deneyci anlamına gelir. Ayrıca, stresli bağlantı prosedürü aşağı fare sakinleştirmek içindir bekleme kafesi, alışma süresi, aynı zamanda süre, çöp ve labirente pozisyon eşit koşullara sahip olması gerekir. Fare tesisi içinde işleme de daha sonraki davranışsal performans için önemlidir. Deneysel ve kontrol hayvanları farklı günlerde veya farklı insanlar tarafından temizlenmemelidir, bu da fareler için stresli olduğu için. Ayrıca, temizlik günü davranış farklılıklarını önlemek için deneysel gün olmamalıdır.
Sorun giderme Protokol sırasında oluşabilecek çeşitli sorunlar vardır. Örneğin, stereotaktik cerrahi sırasında kafatasında bir bütün delme kan damarlarızarar verebilir. Genellikle, güçlü kanama oluşur, özellikle bregma ve lambda yukarıda. Bu durumda, onlar emicilik nedeniyle damar dışında daha fazla kanama uzatmak eğilimindedir gibi pamuk çubukları ile kanama durdurmaya çalışmayın, bunun yerine, doğrudan NaCl ile durulamak.
Ayrıca virüs çözeltisinin basınç enjeksiyonu çalışmıyor olabilir. Bu durumda, parafilm olabilir, çapak deliğinden veya beyin dokusundan bir yara, kanula nın ucunu tıkıyor. Bu durumda, x veya y-eksenini değiştirmeden kanula'yı yavaşça beynden çıkarın ve kanula ucunun ön kısmının 1-2 mm'sini çıkarmak için bir cızırtı kullanın. Tekrar kanula düşürmeden önce, virüs canula ucu çıkar olmadığını görmek için basınç küçük miktarda uygulayarak işlevsellik için test edin. Kabızlık önlemek için, sabit bir hız ile kanula düşürmek ve enjeksiyon tarafının en derin derinliğine ulaşılana kadar hareketi durdurmayın. Kanula ucuçok fazla kaldırılır ve çapı çok büyük ise, kanula doku zarar ve aynı anda virüs uygulama riski artacaktır. Böylece, ucun yalnızca tıkanmış kısmının dikkatlice çıkarıldığından emin olun.
Davranışsal deney sırasında, video izleme yazılımındaki (örneğin, Ethovision XT) deneyin kurulumu sorunlara neden olabilir. Örneğin, ışık çıkışı düzgün çalışmıyorsa, bunun nedeni çeşitli nedenlerden olabilir. Pulser, Ethovision XT açılmadan önce açılmalı, programlanmalıdır ve başlatılmalıdır. Donanımın "Deneysel kurulum" (adım 3.2.2.4) doğru şekilde seçilmesi gerekir. Yanlış IO-Box veya "Kostüm Donanımı" dışında bir şey seçilirse, Pulser cihazı Ethovision tarafından kontrol edilemez. Işık çıkışının testi başarılı olursa, ancak "Deneme denetimi ayarları"ndaki programlanmış ışık protokolü satın alma sırasında çalışmıyorsa, alt kural veya alt kural başvurusu yanlış bulunabilir veya koşullar ve eylemler belirsiz olabilir. Örneğin: başvuru doğru alt kurala mı ait? Başvuru doğru programlandı mı (örn. alt kural ne sıklıkta yürütülür)?
Ayrıca, bu "algılama ayarları" sırasında hayvan yeterince izlenir, ancak satın alma sırasında konu bulunamadı örnekleri vardır olabilir. Bu durumda, deney odasındaki aydınlatmanın değiştirilip değiştirilmediğini veya labirentin içinde istenmeyen gölgeler üretilip üretilmediğini kontrol edin. Labirentin tüm alt kısmı aynı renge sahip olmalı, çünkü ayar yalnızca belirli bir kombinasyon için çalışacaktır. Her ne sebeple olursa olsun farklı alt renkler veya gölgeler kaçınılamaz ise, labirentin en karanlık kısmında algılama ayarı tanımlayın.
İlk hayvanların edinimi nden sonra herhangi bir ayarı değiştirmek için, bu değişiklikleri zaten kullanılan ayarlarda uygulamayın. Ayarlamak için kopyalayın. Bu, zaten kaydedilmiş deneme veri çözümlemesi için artık geçerli olmadığı anlamına gelir. Böyle bir durumda, orijinal ayarları ile bu deneysel grup için tüm hayvanları kaydedin ve daha sonra kaydedilen videolar canlı izleme yerine analiz yeni bir deney oluşturun. Bu "videodan" denemesinde, hayvanlar ve hatta veriler arasındaki karşılaştırılabilirliği kaybetmeden analiz için çeşitli ayarlar kullanılabilir.
Sınırlamalar ve gelecekteki uygulamalar Serbestçe hareket eden hayvanlarda optogenetik ile davranış manipüle Bu yöntem de sınırlamalar içerir. Ameliyat sırasında iki implantın yakınlığı kısıtlanır. Çift implantasyon için, iki implant arasındaki mesafe en az implanttutmak için cihazın genişliği olmalıdır. Cihaz, ilk implantlar zaten sabit iken, çapak deliğine ikinci implant ı düşürmeli. Bunun için bir çözüm açılı bir implantasyon olabilir, cam elyaf uçları çok yakın olabilir kafatası üzerinde seramik ferules daha büyük mesafe varken23,55,56,57,62,63. Açılı bir implantasyonun dezavantajı ışığın yayılmasıdır. Lif ucu düz yukarıdan yerine eğimli olduğunda, uyarılmış alan farklıdır. Yakın mesafede iki hedef bölge olması durumunda, ışık stimülasyonunun değişen konumu göz önünde bulundurulmalıdır.
Davranışsal deney sırasında, labirentin inşası hayvana bağlı optik kabloyu etkileyebilir. Açık-koyu kutu gibi bazı davranış testleri kapalı alan64,65ve diğer labirentler fare nin girmesi gereken bölmeleri içerir. Bu tür denemeler bu kurulumla gerçekleştirilemez. Alternatif olarak, kablosuz sistem bir seçenek22,,26,66olabilir. Ama neyse ki bazı labirentler, Barnes Maze gibi, böyle bir şekilde düzenlenebilir, fareler ilgili bölmeleri girmek edebiliyoruz67.
Kapalı bölgeleri olanların yanı sıra, çok geniş labirentler de sorunlara neden olabilir. Labirentin alanı ne kadar genişse, kablonun hayvanın labirentteki her pozisyona gitmesine izin vermek için o kadar uzun olması gerekir. Hayvanın kabloya basamaz, yakap ısıramaz. Bunun için bir çözüm gereksiz kablo yuvarlanır bir yapı olabilir. Bir dezavantajı kabloyu boşaltmak için sürükleme fareler için zor olmasıdır. Bu çözüm fareler için uygun daha iyi olur. Başka bir olası seçenek önceden ışık stimülasyon yapmak olabilir, deneme sırasında yerine, tabii ki bu sadece ışık stimülasyonu nedeniyle uzun vadeli bir etki oluşur seve si uygulanabilir23.
Mevcut/alternatif yöntemlerle karşılaştırma Alternatif yöntemler davranış sırasında kimyasal veya elektriksel stimülasyon olacaktır8,18. Kimyasal agonistler veya antagonistler ivel reseptörler aracılığıyla nöronları etkinleştirmek veya susturmak edebiliyoruz ve aynı zamanda tek nörotransmitter sistemleri,38,68manipüle edebilirsiniz. Bir yandan, reseptör özgüllüğü kimyasallar için oldukça yüksektir, çünkü spesifik agonist veya antagonist sadece bazı reseptörleri etkinleştirmek39. Öte yandan, aynı nörotransmitter grubunun reseptör alt tipleri için özgüllük genellikle yetersizdir. Çoğu kimyasal farklı olasılıklar69ile en az iki alt tipe bağlanır. Ayrıca, kimyasallar aynı reseptör tiplerine sahip oldukları sürece nöronal hücre tiplerini ayırt edemezler. Bunun ötesinde, zamansal ve mekansal çözünürlük optogenetik göre kimyasal manipülasyonlar için kötüdür. Agonistler veya antagonistler genellikle sözlü olarak uygulanır35 veya sistemik enjeksiyonlar yoluyla57,70. Kimyasal infüzyon doğrudan beyin dokusunda yapılırsa, etkileri oral uygulamalar ile daha hızlı görünür, ama yine de ışık stimülasyonu ile daha yavaş bir zaman ölçeğinde. Uygulanan kimyasallar beyinde yaygın ve nöronal türleri veya beyin bölgeleri için özel değildir gibi, belirli beyin devrelerinin manipülasyon mümkün değildir.
Elektriksel stimülasyon, kimyasal stimülasyondan daha yüksek bir zamansal çözünürlüğe sahiptir9,14. Nöronal doku içinde yayılması kimyasal stimülasyon ile daha az dır ve mekansal çözünürlük kimyasal stimülasyon ile daha iyidir. Ancak, elektrikstimülasyon özellikle farklı nöronal hücre tipleri veya reseptör tipleri ele olasılığı yoksun, elektrot yakın her nöron elektriksel uyarılma yanıt verecektir gibi.
Serbestçe hareket eden farelerde davranışa alternatif yöntemler, örneğin tek nöronların veya aksonların optogenetik ile modüle edilebildiği ve ortaya çıkarılan etkilerin kayıt elektrotları6,71ile ölçülebildiği beyin dilimlerindeki elektrofizyolojik kayıtlardır. In vitro deneyler optogenetik stimülasyonların moleküler ve hücresel temelini araştırma olanağı sunar, ancak diğer beyin bölgelerinden gelen içsel bağlantı ve girdinin eksik olduğu sınırlamasına sahiptir. Başka bir seçenek multifotongörüntüleme,1 ,72ile birlikte optogenetik kullanmaktır. Bu durumda, farelerin başsabit ve anestezi veya basit görevleri çözmek için uyanık olabilir.
Başarılı bir optogenetik deney gerçekleştirmek için, araç ve uygulamalar geniş bir yelpazede günümüzde mevcuttur. Optogenetik araçların seçimi ve davranışsal kurulum belirli araştırma sorularını yanıtlamak için çok önemlidir. Eğer aletlerin ve deneylerin doğru kombinasyonu seçilirse, optogenetik yüksek zamansal ve uzamsal çözünürlüğe sahip nöronal devrelerin daha önce görülmemiş, derinlemesine araştırılmasına olanak sağlar. Bu anlamak ve psikiyatrik hastalıklar ve biliş için yeni tedavi stratejileri geliştirmeye yardımcı olacaktır.

Merkezi sinir sisteminde nöronal devrelerin modülasyonu ve davranışsal sonuçları beynin nasıl çalıştığını anlamak için önemlidir, özellikle psikiyatrik hastalıklar ve öğrenme ve hafıza gibi bilişsel görevler. Optogenetik ile, tek hücre veya hücre popülasyonları kadar tüm devreler ışık tarafından modüle edilebilir. Channelrhodopsin2 (ChR2) veya Archaerhodopsin (Arch) gibi yaygın optogenetik araçlar nöronları etkinleştirmek veya susturmak, ya da artırmak veya farklı beyin bölgelerine projektör terminallerinde verici salınımı inhibe edebiliyoruz1,2,3,4. Ancak, Arch presinaptik terminallerde aktivasyonu spontan vericisalınımınıartırır gösterildiği gibi dikkatle kullanılması gerekir 5 . Arch, hücre içindeki pH değerini değiştiren dışa doğru düzeltici bir proton pompasıdır. Bu alkali ortam kalsiyum akını neden olur ve verici serbestartırır 5. Özellikle hücre içi sinyal yollarını modüle etmek için, rodopsin veya koni opsin gibi hafif bir aktive optogenetik araçtan oluşan reseptör kimeraları, yeterli bir G-protein birleştirilmiş reseptör ile birlikte, oluşturulabilir6,7,8. Mevcut optogenetik araçların miktarı ve varyasyonu son on yılda önemli ölçüde artmıştır9.
Optogenetik amacı davranış sırasında nöronal devreleri manipüle etmektir. Optogenetik, örneğin anksiyete davranışındaki değişiklikler gibi akut davranış değişikliklerinin ölçülmesini sağlar. Optogenetik aletler viral vektörler aracılığıyla beynin hedef bölgelerine ulaştırıldı. Özel organizatörler ve arttırıcılar veya Cre-loxP sistemi yardımıyla, optogenetik araçların ekspresyonu için hücre tipi özgüllüğü sağlanabilir (Şekil 1A). Sadece belirli hücre tiplerinde Cre-Rekombinaz enzimini ifade eden birkaç genetiği değiştirilmiş fare hattı vardır. Örneğin, Nex-Cre fareler Nex-promotor kontrolü altında korteks ve hipokampus piramidal nöronlarda Cre-Rekombimaz ifade10. Bu enzim, loxP kenarları11ile çevrili DNA dizilerini tersine çevirebilir. Sonuç olarak, ters ve loxP taraf tarafından çevrili bir çift floxed optogenetik aracın DNA dizisi, sadece Cre-Rekombinazsahip nöronlar tarafından transkripsiyonu olabilir , ama diğer nöronal türleri tarafından12,13. Nex-Cre fareler durumunda, optogenetik araç sadece piramidal nöronlar ifade edilecektir. Bazı beyin bölgelerinin ışık stimülasyonu daha sonra optik liflerin doğrudan ilgi alanının üzerinde kronik implantasyonu ile elde edilir. Hayvanlar daha sonra uygun bir ışık kaynağına birleştiğinde ve serbestçe davranış testleri hemen hemen her türlü davranış.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61023/61023fig01.jpg"> Şekil 1: Enjeksiyon ve implantasyon. A) ChR2-YFP için cre-loxP sistemi. Çift floxed optogenetik araç beyin dokusuiçine enjeksiyon için bir adeno ilişkili virüs (AAV) içinde paketlenir. B) MPFC'nin IL bölgesine/üstüne optik nöronal arayüz enjeksiyonunun ve implantasyonunun sagittal görünümü. Enjeksiyon ve implantasyon yukarıdan yapıldı. Tüm ilgi alanları IL, BLA ve DRN gösterilir. C)İmplante edilen optik fiber, kol ve ışık kaynağının ayrıntılı görünümü. D) Gri madde beyin dokusunda 200 μm ışık lifi ile mavi ve kırmızı lazer ışık stimülasyonunun yayılması (Yizhar ve ark. 2011). Mavi ışık, maksimum, doku içine 0,5 mm, yaklaşık 1 mm kırmızı ışık yayılır. Renk kodlaması: kırmızı %50, sarı %10, yeşil %5, ışık bu alana ulaşırsa mavi %1. E)200 μm optik fiber ile sol IL'nin hemen üzerinde tek taraflı implantasyonun koronal görünümü. IL bölgesi her yarımkürede 0,25 mm genişliğe ve 0,2 mm derinliğe sahiptir. Mavi ve kırmızı ampuller % 5 ışık yayılan yatılı ve Doğru boyuta Yizhar ve ark aktarılır. LoxP: X-over P1 locus; ChR2: Channelrhodopsin; YFP: sarı floresan protein; dflox: çift floxed; IL: infralimbic korteks; BLA: basolateral amigdala; DRN: dorsal raphe çekirdekleri; PrL: prelimbic bölge. Bu rakam Berg 201948'dendeğiştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61023/61023fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Hem yüksek zamansal hem de mekansal çözünürlük14 ve hücre tipine özgü modülasyon sağlayan optogenetik yaklaşımlardan yararlanılır. Ayrıca, implante edilen cihazı daha fazla tedavi edilmeden tekrar tekrar kullanmak mümkündür. Optogenetik alettaşıyan adeno-ilişkili bir virüsün enjeksiyonu ve optik fiber inplantasyonunun yapıldığı stereotaktik cerrahiden sonra fareler iki hafta boyunca iyileşebilir. Biz sadece 2 haftalık bir iyileşme süresi seçtik, bu ameliyat tan kurtarmak için yeterli zaman çünkü ve virüs ifade etmek için. Davranışsal deneyler immünohistokimya tarafından takip edilir gibi, fareler deney sırasında çok yaşlı olsun emin olmak gerekir; aksi takdirde doku kalitesi azalır. İmplanttan belirgin davranış bozuklukları göstermez ler ve tipik kafes davranışlarına girişinler. Tabii ki, implantasyon önemli bir cerrahi lezyon eşlik eder; bu nedenle, fareler yoğun bir şekilde izlenir. Ameliyattan sonra, grup fareler birbirlerinin taze yaraları ve implantları zarar eğilimindedir gibi, fareler, tek ev olması gerekir. Ancak, konut koşulları erkek farelerin anksiyete düzeyi üzerinde büyük bir etkisi var, tek ev fareler düşük anksiyete düzeyleri göstermek gibi15 ve genel olarak daha az depresif benzeri belirtiler16.
Beyin devrelerinin kimyasal veya elektriksel manipülasyon optogenetik yüksek hücre tipi özgüllüğü eksikliği ve daha düşük bir zamansal ve mekansal çözünürlükvar 14,17,18. Deneysel soruya bağlı olarak, elektrikveya kimyasal stimülasyon farklı avantajlara sahip olabilir. Belirli bir bölgede lif terminalleri geçerken de uyarılması gerekir, elektrikstimülasyon en iyi yöntemdir. Kimyasal stimülasyon, tüm bölgedeki vericiye özgü reseptörlerin agonistler tarafından aktive edilmesi için iyi bir seçimdir. Optogenetik kimyasal veya elektrikstimülasyon ile karşılaştırıldığında bir diğer büyük avantajı, endojen, nöronlar ışığa duyarlı değildir, hangi yan etkilerin oluşumunu önler19. Gerçekten de, yüksek ışık yoğunlukları ısıtma etkileri neden olabilir8,20, ama uygun kontrol grupları nedeniyle, optogenetik manipülasyon nedeniyle davranışsal etkileri ortadan kaldırılabilir.
Kemirgen davranışlarını araştırmak, özellikle psikiyatrik hastalıklar açısından, serbestçe hareket eden hayvanlarda optogenetik ile büyük ölçüde düzelmiştir, belirli hücre popülasyonlarına kadar tek reseptörlerin doğrudan modülasyonu sağlar gibi21 ve devreler22. Bu tür modülasyonların akut etkilerini ölçme imkanı, ayrıca tanımlanmış bir süre23 veya kronik stimülasyon24sonra uzun vadeli davranışsal etkileri , deneysel tasarımları geniş bir esneklik sağlar ve beyin devreleri içine çok ayrıntılı anlayışlar sağlar. Işık stimülasyonu optogenetik aracın enjeksiyon yerinde bulunan nöronları modüle etmek için kullanılabilir. Enjeksiyon ve implantasyon aynı beyin bölgesine hitap ettiğinde, hücre organları ve bu bölgedeki ilke nöronve internöronların aksonları projelendirme3,6,,8hedeflenebilir. Ancak, ışık lifi de enjekte edilenden farklı bir bölgeye yerleştirilmesi olabilir. Bu durumda, ışık stimülasyonu enjekte edilen bölgenin projeksiyon alanlarında akson terminallerinde verici salınımını modüle edebilir25,26,27.
Burada yapılan çalışmada, optogenetik anksiyete ile ilgili davranışları analiz etmek için deneyler ile birlikte kullanılır. Anksiyete ile ilgili psikiyatrik hastalıklar dünya nüfusunun üçte birinden fazlasını etkiler28,29,30 ve yüksek bir ekonomik yük neden31. Bu etkilenen uyarılma hissi muzdarip, gerginlik ve endişe kaçınma davranışı takip32,33. Bu kronik olarak meydana gelen olumsuz duygular, esas olarak gelecekteki olaylar a odaklanmıştır34, güçlü hastaların günlük yaşam ını müdahale. Benzodiazepinler veya selektif serotonin geri alım inhibitörleri gibi yaygın tedaviler (SSRI) sadece bazı hastalarda başarılı. İnsanların büyük bir kısmı tedaviye35yaşında yanıt vermez , bu tür hastalıkların altında yatan mekanizmanın henüz tam olarak anlaşılamadığını gösterir. Medial prefrontal korteks (mPFC) anksiyete gelişimi ve tezahürü önemli bir rol oynadığı bilinmektedir21,25,27,36,37,38. Özellikle, mPFC infralimbic korteks (IL) bölgenin aşırı aktivasyonu anksiyete ile ilgili bozuklukların bir parçası olabilir39,40. Burada açıklanan örnek deney, mPFC'nin IL bölgesindeki modülasyonların anksiyete davranışını nasıl etkilediğini anlamanızda yardımcı olabilir. Ayrıca, anksiyete ile ilgili psikiyatrik hastalıklar için yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesi de potansiyel olarak desteklenebilir.
2-6 aylık erkek Nex-Cre fareler mPFC41IL bölge içinde piramidal nöronlar özellikle ChR2 ifade etmek için kullanılır. Nex-Cre fareler c57Bl/6 arka plana sahiptir ve özellikle piramidal nöronlarda Cre-rekombinaz enzimini ifade eder. Stereotaktik cerrahi sırasında, çift floxed ChR2-DNA adeno ilişkili viral vektörler ile IL bölgeye enjekte edilir. Optik implant ilgi alanının(Şekil 1B)üzerine yerleştirilir ve implant diş çimentosu ile sabitlenir. Kontrol hayvanları hücreye özgü ifadeyi taklit etmek için aynı bölgede çift floxed tdTomato-DNA enjeksiyonu alırlar.
Hayvanlar ameliyat gününe kadar grup içinde dirve daha sonra diğer farelerin yaralanmalarını önlemek için tek kişilik tir. Fareler tek ev fareler için TypI-L kafeslerde bireysel havalandırmalı kafes (IVC) raflarda yer almaktadır. Açık-koyu çevrim 12:12 saat ritmi, 10 başlayan ışık fazı izler. Tüm davranışsal deneyler, kemirgenlerin aktif evresini andıran karanlık evrede gerçekleştirilir. Su ve standart gıda peletleri reklam libitum mevcuttur. Piramidal nöronlarda ChR2'nin yeterli bir ekspresyonunu sağlayan iki haftalık iyileşmeden sonra, fareler davranışsal deneyler için kullanılır.
Açık Alan (OF), 50 cm x 50 cm kare lik bir labirent ve 40 cm yüksekliğinde kum püskürtmeli bir labirenttir. Zemin iç 4 merkezi temsil 16 kareler ayrılmıştır. Ölçülen davranış: 1) merkezde harcanan zaman, 2) merkez girişsayısı ve 3) toplam mesafe taşındı. Bu deney sırasında, toplam 20 dakika süren 4 deneme vardır. 1 ve 3 numaralı çalışmalarda ışık stimülasyonu yapılmaz ve 2 ve 4 numaralı çalışmalarda 5 ms ışık darbesi ve 1 mW ışık yoğunluğu 473 nm olan 20 Hz stimülasyon gerçekleştirilir(Şekil 2A). Daha sonraki çalışmalarda, test alanına alışma dikkate alınmıştır, ancak sahte enjekte kontrol hayvanlarının kullanımı nasıl alışkanlık ifade edilir gösterir.
Barnes Labirent öğrenme ve bellek için bir deneydir. Çapı 92 cm olan ve çevresi etrafında 20 eşit uzaklıkta delik bulunan dairesel bir platformdur. Deliklerden 19'u kapatılır ve bir deliğin altında bir kaçış kutusu sunulur. 4 gün üst üste, fareler kaçış kutusunun yerini öğrenmek için 4 eğitim denemeleri var. 5.th günde, kaçış kutusu kaldırılır ve fareler doğru deliği bulmak için ne kadar zamana ihtiyaçları olduğu test edilir. Ölçülen davranış: 1) Kaçış kutusu/doğru delik bulunana kadar olan süre, 2) Hedef ziyaret ve hata sayısı ve 3) Mesafe kaçış kutusuna kadar taşınır. Farklı gruplardaki ışık stimülasyonu ya 1-4 eğitim günlerinde gerçekleşen satın alma veya konsolidasyon sırasında ya da 5. gün olan test gününde geri alma sırasında yapılır(Şekil 2D).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61023/61023fig2v2.jpg"> Şekil 2: Optogenetik protokollerle davranışsal deneyler. A) Açık Alan deneyinin ilgili ışık stimülasyon protokolü ile şematik çizimi. C) İlgili ışık stimülasyon protokolü ile Yükseltilmiş Artı Labirent deneyinşematik çizimi. D) Ilgili ışık stimülasyon protokolü ile Barnes Maze deney şematik çizim. EPM: Yükseltilmiş-Plus Labirent; OF: Açık Alan; BM: Barnes Labirent Testi. Bu rakam Berg 201948'dendeğiştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61023/61023fig2v2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Optogenetik stimülasyon için ışık yoğunluğu ve sıklığının araştırılan optogenetik araca ve nöronal tipe uyarlanmalıdır. Dokuya zarar vermemek için mümkün olan en düşük ışık yoğunluğu kullanılmalıdır, çünkü çeşitli çalışmalar güçlü ışık yoğunluğu nedeniyle olası ısıtma etkileri olduğunu göstermiştir8,20. ChR2 için, 5 ms ışık darbesi ile 20 Hz stimülasyon yaygın olarak kullanılır2. ChR2 ışığa oldukça duyarlı olduğundan, 1 mW ışık yoğunluğu yeterlidir. Işık stimülasyon protokolü, davranış değişikliklerini doğrudan ölçmek için ışık kapalı ve denemeler arasında değişir. Davranışsal deneyler için dış oda koşulları hayvanların tüm grup için istikrarlı kalmalıdır. Dikkate alınması gereken önemli koşullar gürültü (cihazların kendilerini gürültü yapabilir akılda tutmak), koku (her zaman etanol ile davranış kurulumları temiz), ışık yoğunluğu, ve deneyci. Deneyci her zaman aynı kişi olmalıdır. Ayrıca, deneylerin gün saati bir gruptaki tüm hayvanlar için aynı olmalıdır, tesiste karanlık fazBaşladıktan birkaç saat sonra tercih edilir.
Bu deneyin amacı, uyarıcı piramidal nöronların güçlü aktivasyonu ile IL bölgesindeki uyarma/inhibisyon (E/I) oranını artırmaktır. Bu özel korteks bölgesinde gelişmiş bir E / I oranı farelerde anksiyete düzeylerini artırmak için bilinmektedir40,42,43,44.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ketamin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K2753-64</td>
			<td>Anestasia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 % Glucose</td>
			<td>AlleMan Pharma</td>
			<td></td>
			<td>Injection s.c. for fast recovery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Behavioral mazes</td>
			<td>Costum made</td>
			<td></td>
			<td>Measure anxiety</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bepanthen</td>
			<td>Bayer</td>
			<td></td>
			<td>Ophthalmic oinment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betaisodona</td>
			<td>Monodipharma</td>
			<td></td>
			<td>Sterilant containing iodine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betaisodona</td>
			<td>Monodipharma</td>
			<td></td>
			<td>Iodine oinment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ52, 110AL0.62x WD160</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic ferrules</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CFLC230-10</td>
			<td>Implant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic Fiber Scribe</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CSW12.5</td>
			<td>Cutting of the glass fiber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Channelrhodopsin2-YFP virus</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>Addgene 20298</td>
			<td>Optogenetic tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed air</td>
			<td>Kontakt Chemie</td>
			<td>Druckluft 67</td>
			<td>Drying of the skull</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coordinate system</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td></td>
			<td>Stereotactic coordinates for the surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Correl Draw</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Graphical software version 13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryoslicer</td>
			<td>MICROM</td>
			<td>HM500OM</td>
			<td>Production of brain slices for staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethovision XT 14</td>
			<td>Noldus</td>
			<td></td>
			<td>Software for behavioral tracking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Statistical Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferrule Polishing Puck</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>D50-F</td>
			<td>Polishing implants round side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Patch Cord dual</td>
			<td>Prizmatix</td>
			<td>Optogenetics-Fiber 500, 1,20 m, Ferrule core 1,25 mm</td>
			<td>Cables, which are connected with the two implants of a bilateral implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Patch Cord single</td>
			<td>Prizmatix</td>
			<td>Optogenetics-Fiber 500, 1,20 m, Ferrule core 1,25 mm</td>
			<td>Cable, which is connected with the implant via a sleeve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Stripping Tool</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>T06S13</td>
			<td>Stripping glass fiber for implant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>VWR European</td>
			<td>516-0300</td>
			<td>Cut into pieces for the Novelty-Suppressed Feeding test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food pellets</td>
			<td>M&#252;hle Levers</td>
			<td>H&#246;veler Nagerfutter</td>
			<td>Nutrition for the mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipettes</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>GC150-10</td>
			<td>Injection pipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gradia direct-Flo</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>103322</td>
			<td>Fluid dental cementum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating lamp</td>
			<td>efbe-Schott/Phillips</td>
			<td>R95E</td>
			<td>Prevent the mice from cooling after the surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating plate</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td></td>
			<td>Integrated into coordinate system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection canula</td>
			<td>Braun</td>
			<td>100 Sterican, 0,4 x 20 mm, Gr. 20</td>
			<td>All injections and to bore hole into the skull</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Litter</td>
			<td></td>
			<td>T 1350</td>
			<td>Grounding for the Novelty-Supressed Feeding test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse cages</td>
			<td>Zoonlab</td>
			<td>405 cm^2</td>
			<td>Single housing for experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optibond FL</td>
			<td>Kerr</td>
			<td>26684E</td>
			<td>Preparation of the skull for implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical glass fiber</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FT200EMT</td>
			<td>Light fiber for implant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optogenetics-LED.STSI</td>
			<td>Prizmatix</td>
			<td></td>
			<td>Optogenetic toolbox for light stimulation during behavioral experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>16005-1KG-R</td>
			<td>Perfusion of mice to remove the brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polishing sheet 0.02 &#181;m grit</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LFCF</td>
			<td>Polishing implants round side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polishing sheet 1 &#181;m grit</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LF1D</td>
			<td>Polishing implants round side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polishing sheet 30 &#181;m grit</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LF30D</td>
			<td>Polishing implants round side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polishing sheet 6 &#181;m grit</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LF6D</td>
			<td>Polishing implants round side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulser Software</td>
			<td>Prizmatix</td>
			<td></td>
			<td>Software for light device control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rimadyl-Carprofen</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td></td>
			<td>Analgesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma Plot</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Software for statistics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sleeve</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FT200EMT</td>
			<td>Connection of implant and light cable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SodiumCloride (NaCl)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>3570410</td>
			<td>Rinsing of the skull</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superglue</td>
			<td>Pattex Henkel</td>
			<td></td>
			<td>To Fix the glass fiber in the ferrule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>td-Tomato virus</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>Addgene 51503</td>
			<td>Optogenetic tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV light</td>
			<td>KoQGHJ</td>
			<td>wireless, 1200 mW/cm^2</td>
			<td>Polymeration lamp for dental cementum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylavet-Xylazin</td>
			<td>cp pharma</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optogenetic manipulation of neuronal activity to modulate behavior in freely moving mice

Serbestçe hareket eden farelerde nöronal devrelerin optogenetik modülasyonu akut ve uzun süreli davranışları etkiler. Bu yöntem, merkezi sinir sisteminde ki tüm nöronal devrelere kadar tek nöronların ve bölgeye özgü verici salınımının manipülasyonlarını gerçekleştirebilmekte ve davranışsal sonuçların doğrudan ölçülmesine olanak sağlamaktadır. Nöronlar, Channelrhodopsin2 (ChR2) gibi tercih edilen DNA'yı taşıyan viral vektörlerin enjeksiyonu yla optogenetik araçları ifade eder. Işık, hedef bölgenin hemen üzerinde sonlandırılabilen kronik optik implantlar aracılığıyla belirli beyin bölgelerine getirilir. Kurtarma ve uygun araç ekspresyonu iki hafta sonra, fareler tekrar tekrar ilgi nöronların optogenetik stimülasyon ile davranıştestleri için kullanılabilir.
Optogenetik modülasyon, kimyasal veya elektriksel stimülasyon gibi yaygın olarak kullanılan yöntemlerle karşılaştırıldığında, yüksek hücre özgüllüğü ile gerçekleştirilebilir yüksek zamansal ve mekansal çözünürlüğe sahiptir. Işık nöronal dokuya zarar vermez ve bu nedenle uzun süreli deneylerin yanı sıra bir farede birden fazla davranışsal deney için de kullanılabilir. Optogenetik araçların olanakları neredeyse sınırsızdır ve tüm nöronların aktivasyonuna veya susturulmasını, hatta belirli bir reseptör tipinin ışıkla manipüle edilmesini sağlar.
Entegre optogenetik stimülasyon ile yapılan bu tür davranışsal deneylerin sonuçları, manipülasyonun neden olduğu davranış değişikliklerini doğrudan görselleştirir. Bir temel olarak ışık stimülasyonu olmadan aynı hayvanın davranışı indüklenen değişiklikler için iyi bir kontrol. Bu nöronal türleri veya nörotransmitter sistemlerinbelirli davranışlar dahil ayrıntılı bir bakış sağlar, anksiyete gibi. Nöronal ağların plastisite de optik stimülasyon sonra uzun vadeli stimülasyon veya davranışsal gözlemler yoluyla ayrıntılı olarak araştırılabilir. Optogenetik nörolojik hastalıkların çeşitli nöronal sinyal aydınlatmak için yardımcı olacaktır.

Bu protokolün amacı, bir optogenetik deney sırasında genetiği değiştirilmiş farelerin davranışlarındaki değişiklikleri ölçmektir. Optogenetik manipülasyon bir adeno ilişkili viral vektör enjeksiyonu ile yapılır. Serbestçe hareket eden farelerde ışık stimülasyonu, ilgi alanının hemen üzerinde bir ışık lifi implantasyonu ile mümkündür.
Şekil 4'teoptogenetik deneyin sonuçları sunulmuştur. ChR2 ile IL bölgesinde uyarıcı piramidal nöronların güçlü bir aktivasyonu Açık Alanda anksiyete ile ilgili davranış arttı. ChR2 piramidal nöronlarda ekspresyon için Nex-Cre farelerde mPFC IL bölgesinde enjekte edildi(Şekil 4A). İki anksiyete testi sırasında, Açık Alan(Şekil 4B,C)ve Yenilik-Bastırılmış Beslenme testi (Şekil 4F,G), ChR2 mavi ışık ile uyarılır ve piramidal nöronları aktive eder. Kontrol olarak, farelerin başka bir grup ChR2 yerine florofor tdTomato bir enjeksiyon aldı(Şekil 4D,G). Böyle bir deneyde, anksiyete parlak merkezi alankaçınma olarak tanımlanır. Fareler, yırtıcılardan endişe ettikleri için açık alanlardan içsel bir kaçınma gösterirler.
Şekil 4B'degösterilen Açık Alan deneyinde, fareler her biri 5 dakikalık 4 deneme gerçekleştirmiştir. 1 ve 3 numaralı çalışmalarda ışık stimülasyonu (Off1,2) ve 2 ve 4 numaralı çalışmalarda, 20 Hz (5 ms ışık darbesi) ve 1 mW yoğunlukta mavi ışık stimülasyonu yapıldı (On1,2). Isı haritaları, deney grubunda, merkez süresinin Off ve On denemeleri arasında farklılık gösterdiğini göstermektedir. Işık stimülasyonu sırasında, fareler tercihen sınır bölgesinde kalırlar. Kontrol hayvanları da sınırı tercih ederler, ancak ışık uyarımı üzerine davranışlarını değiştirmezler. Şekil 4C'de,Açık Alan deneyi sırasındaki ana davranış ölçümleri deney grubu için gösterilmiştir. Veriler normallik için Shapiro-Wilk testini geçtiyse, istatistikler bağımsız iki kuyruklu t-testi ile yapılmıştır. Normallik testi başarısız olduysa, Mann-Whitney-Rank Sum testi parametrik olmayan alternatif olarak kullanılmıştır. Bu tür deneyler için, ışık stimülasyonunun zaman içinde anksiyete davranışını doğrudan değiştirip değiştirip değiştiremeyebileceğini araştırmak için, deneysel ve kontrol hayvanlarının temel kaygılarından bağımsız olarak grup karşılaştırması seçilmiştir. Merkezi süresi önemli ölçüde her iki ışık stimülasyon denemeleri sırasında azaldı, artan anksiyete düzeyleri gösteren. Taşınan toplam mesafe değiştirilmeerek lokomotor davranışın etkilenmediğini gösterdi. Merkez girişlerinin sayısı önemli olmasa da artırıldı. Şekil 4D'dekontrol grubunun verileri gösterilmiştir. Kontrol hayvanları, analiz edilen parametrelerin hiçbirinde Off ve On denemeleri arasında herhangi bir davranış değişikliği göstermemiş, ışık stimülasyonu nun veya implantasyonun gözlenen etkilere neden olmadığını göstermektedir. Özetle, Bu test ChR2 ile IL piramidal nöronların ışık stimülasyonu sırasında artan anksiyete gösterir.
Şekil5'te, Başarısız bir optogenetik deneyin verileri Yükseltilmiş Artı Labirentiçin gösterilmiştir. Şekil 5A'dasunulan Yükseltilmiş Artı Labirent deneyi sırasında fareler her biri 3 dakikalık 6 denemeyi tamamladılar. 1, 3 ve 5 numaralı çalışmalarda ışık stimülasyonu yapılmadı (Off1, Off2, Off3) ve 2, 4 ve 6 numaralı çalışmalarda, 20 Hz (5 ms ışık darbesi) ve 1 mW yoğunlukta mavi ışık stimülasyonu yapıldı (On1, On2, On3). Bu örnek sonuçlarda, optogenetik protokolün uzunluğu ve labirentin kendisi yapımı transgenik fare hattı için uygun değildi. Şekil 5B'de,birkaç farenin arka pençeleriyle labirentten kaydığı, hatta düştüğü görülebilir. Bu olduğunda, fareler bir gün sonra EPM gerçekleştirmek için ikinci bir şans var. Eğer tekrar düştülerse, analizden çıkarıldılar. Fareler birkaç kez kayıp ama labirentte kalmayı başardığında, veriler normal analiz edildi. Yine de, veriler çok dikkatli yorumlanmalıdır ve kontrol hayvanları daha fazla önem kazanır. Nex-Cre farelerdar açık kollarda kalmak için motor zorluklar yaşadı. Bunu önlemek için, küçük duvarlar, 1 cm yüksekliğinde, labirentin kollarında arka pençeleri güvenli bir tutun için yardımcı olurdu. Hem ısı haritaları hem de grafikler deneysel ve kontrol fareleri, deneme 2 (On1) açık kollar önlemek için başladı göstermektedir (Şekil 5C-E). Açık kollarda zaman önemli ölçüde her iki grup için azalır, açık kol girişleri gibi. Deney grubunun analizi, On1 denemesi sırasında açık kol ve açık kol girişlerinde zaman önemli ölçüde azaldığından, sadece ışık stimülasyonunun büyük bir anksiyojenik etkisini gösteren veriler elde etti. Ancak, bu verileri aynı davranışı gösteren kontrol grubuyla karşılaştırırken, gözlenen davranışın optogenetik uyarım tarafından değil, labirente alışma nedeniyle genel olarak açık kollardan kaçınılmasıyla ortaya çıktığı açıktır. Bu veriler, optogenetik stimülasyon un aracılık ettiği davranışsal etkiler ile olası davranışsal adaptasyon uyruklarını ayırt etmek için uygun bir kontrol grubunun öneminivurgulamaktadır. Ayrıca, bu veriler, belirli bir mus hattı ve deneysel soru uygun bir deneysel kurulum düzgün adapte önemine ışık tutuyor.
Toplanan davranışsal verileri doğrulamak ve güçlendirmek için, farelerin beyinleri doğru enjeksiyon ve implantasyon için kontrol etmek için son deneyden sonra çıkarılır(Şekil 6). Beyinler %4 paraformaldehitle sabitlenir ve kafatasından çıkarılır. Beyinler 1-2 gün boyunca %30 sakarozda susuz kalır ve daha sonra kriyodilimlenir. 40 μm kalınlığındaki koronal beyin dilimleri yıkanır ve hücre çekirdeklerini lekeler DAPI içeren bir montaj ortamı ile superfrost nesnel slaytlar üzerine monte edilir. Bu, koronal dilimlerde hedef alanların belirlenmesini sağlar. YFP-tag veya tdTomato kendisi floresan virüs enjeksiyonyerini gösterir. Şekil 6B'de solda ChR2-YFP ve sağda tdTomato (kırmızı) örnek enjeksiyon bölgeleri sunulmuştur. Paxinos ve Franklin45 fare beyin atlasından uyarlanan bir şablon yardımıyla IL bölgesi tanımlanabilir. Her iki slaytta da optogenetik araç IL bölgesinde değil, komşu beyin bölgelerinde de ifade edilir. Doğru bir yorum için, beyin dokusunda mavi ışığınyayılmasına 8 danışılır (Şekil 1D,E). Mavi ışığın IL'nin altındaki DP bölgesine fiber uçtaki ilk 1 mW ışık yoğunluğunun sadece %5'inden daha az (Şekil 1D'dekiMaviçizgi)8 ile ulaşacağı görülmektedir. Ayrıca, hafif miktarda ışık geri saçılma nedeniyle PrL bölgeye yukarı gidebilir47. Sonuç olarak, IL bölgesinin en güçlü şekilde aydınlatılmış olduğu, ancak DP ve PrL bölgesi gibi komşu bölgelerin de biraz uyarılabileceği söylenebilir. Bu nedenle, IL-hücre spesifik stimülasyon garanti edilmez ve komşu bölgelerin immünohistokimyasal analizi yapılmalıdır, PrL ve DP hücrelerinin aktivitesi ışık yoluyla modüle olup olmadığını görmek için. Şekil 6C'de,başka bir önemli denetim gösterilir: Nex-Cre fare çizgisinin özgüllüğü. IL bölgesinde iki hücre tipleri karşı antikor boyama yoluyla, glutamaterjik ilke nöronlar ve GABAerjik internöronlar, bu görülebilir, ChR2-YFP ekspresyonu sadece glutamaterjik nöronlarda değil, GABAerjik olanlar oluşur.
Sonuç olarak, deneylerimiz davranış saldirisi sırasında optogenetik manipülasyonla anksiyeteye bağlı davranislarda degisiklikler inebilecegini göstermektedir. Aynı davranış için birden fazla test kullanılarak, güvenilir bir sonuç çizilebilir. Buna ek olarak, immünohistokimyasal analiz elde edilen verileri doğrular. Deneylerimiz, infralimbik korteksteki piramidal nöronların spesifik aktivasyonunun bazı tahlillerde anksiyeteye bağlı davranışları artırdığını gösteriyor.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61023/61023fig04v4.jpg"> Şekil 4: IL piramidal nöronların optogenetik aktivasyonu anksiyete davranışını artırır. Deneyler sırasında ışık stimülasyonu: 473 nm, 1 mW, 20 Hz stimülasyon. A)ChR2-YFP veya tdTomato için enjeksiyon ve implantasyon bölgesinin IL'ye şematik çizimi. Deney sırasında, mPFC IL bölgesinde piramidal nöronlar ChR2 tarafından aktive edilir. Paxinos ve Franklin fare beyin atlası uyarlanmış Saggital beyin dilimleri, saggital: lateral o,6. B) Açık Alan labirent ışık stimülasyon protokolü ile (20 dk ile 4x5 dk kapalı ve denemeler de alternatif; sol) ve örnek ChR2 enjekte (EXP) ve tdTomato enjekte (CT) deneme (sağ) tüm 4 denemede ısı haritaları. EXP hayvanlar mavi lazer ışığı ile uyarıldığında OF merkezinde daha az zaman harcamak. CT hayvanlar için, merkezinde harcanan zaman ışık Kapalı ve On denemeler arasında farklılık göstermez. C) EXP hayvanlar için grup verileri OF, n=11. Fareler mavi ışık (Off1 39,49±6,9 s, On1 11,87±4,47 s, Off2 28,13±8,55 s, On2 23,42±9,32 s, Off1:On1, t-test, p = 0,033, *; Kapalı1:On2, MWRS, p=0,049, *). Taşınan mesafe etkilenmez (Off1 2703.09±292.65 cm, On1 3113.4±491.15 cm, Off2 3331.86 ±482.62 cm, On2 3082.17±658,61 cm). # merkezi girişleri zamanla azalır, ancak önemli bir fark göstermez (Kapalı 1 22,36±3,78, On1 18,45±3,95, Off2 17,36±1,99, On2 13,27±2,64). D) OF'deki CT hayvanlar için grup verileri, n=15. Zaman fareler OF merkezinde harcamak, mesafe taşındı, # merkezi girişleri ışık On ve Off denemeler arasında değişmez (Zaman merkezoff116.73±2.65 s, On1 11.02±1.89 s, Off2 12.02±1.76 s, On2 13.04±2.58 s; Mesafe Off1 3399.69±296.77 cm, On1 3210.6±446.9 cm, Off2 3030.28±513.83 cm, On2 2955±617.7 cm; # merkezi girişleri Off1 14±1,98, On1 13±6±2,02, Off2 10,8±1,88, On2 11,67±2,5). BT farelerde önemli ölçüde daha yüksek temel anksiyete (Off1 EXP:CT, MWRS, p=0.005, **). Değerler ortalamadır±S.E.M. * önemli farklılıkları gösterir (p≤0.05), ** önemli farklılıkları gösterir (p≤0.01). t-test her zaman iki kuyruklu, MWRS: Mann-Whitney Rank Sum testi; IL: infralimbic korteks; BLA: basolateral amigdala; DRN: dorsal raphe çekirdekleri; OF: Açık Alan; CT: kontrol hayvanları; EXP: deneysel hayvan; L: ışık. Bu rakam Berg ve ark. 2019, PLoS One43 ve Berg 201948'dendeğiştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61023/61023fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61023/61023fig5v4.jpg"> Şekil 5: EPM deneyi Nex-Cre farelerde davranışsal etkiler gösteremedi. Deneyler sırasında ışık stimülasyonu: 473 nm, 1 mW, 20 Hz stimülasyon. A) Yüksek-Artı Maze ışık stimülasyon protokolü ile (18 dk, 6x3 dk, kapalı ve denemeler üzerinde alternatif). B) Farelerin "kayma" verilerini, toplam n=23'ü veriye dahil eden grup verileri. Nex-Cre fareler, deneysel gruptan bağımsız olarak arka pençeleriyle açık koldan kayma eğilimine sahiptiler (solda). Daha sonraki analizlerde sadece 6 denemede de labirentte kalan fareler ele alındı. Slip off ilk Off1 aşamasında açık kollar (Off1 EXP 1.63±0.6, CT 2.2±0.79, Off2+3 EXP 0.125±0.125, CT 0±0, On1+2+3 EXP 0.625±0.26, CT 0.1±0.1) kaçınma nedenidir. Pasta grafiği (sağda) farelerin 18 dakika boyunca %42,42 ile labirentten düştüğünü gösterir. Sadece %57,57'si deneyi tamamladı. C)Deneyin 6 denemesinde örnek EXP ve CT farelerin ısı haritaları. Her iki grup da Off1 denemesinden sonra açık kol süresinde bir azalma gösterir. D) EPM'deki EXP hayvanları için grup verileri, n=12. Açık kollarda geçirilen süre ilk iki denemede ve sonrasında sürekli olarak önemli ölçüde azaldı (Off1 73.91±12.22 s, On1 36.15±14.65 s, Off2 15.61±6.23 s, On2 19.49±7.51 s, Off3 9.36±4.44 s, On3 7.96±3.47 s. Off1:On1, t-test, p=0,041, *). Taşınan mesafe etkilenmez (Off1 679,96±71,63 cm, On1 712,24±112,82 cm, Off2 717,49±97,39 cm, On2 782,51±81,11 cm, Off3 722,11±68,60 cm, On3 663,9±010cm,57 cm). Açık kol girişlerinin miktarı Off1'den On1'e önemli ölçüde düşer ve sabit kalır (Off1 8.08±1.08, On1 3.33±0.76, Off2 2.16±0.69, On2 2.91±1.09, Off3 1.73±0.75, On3 1.73±0,66. Kapalı1:On1, t-testi, p=0.002, **). EPM'nin merkezinde geçirilen süre denemeler boyunca azalır ancak Off'tan Deneme Sürümüne kadar anlamlı bir fark göstermez (Off1 41.71±5.34 s, On1 31.2±4.59 s, Off2 19.8±3.44 s, On2 24.49±3.38 s, Off3 20.37±4.77 s, On3 18.85± s± 07. E) EPM'deki CT hayvanlar için grup verileri, n=11. BT verileri EXP verileriyle aynı önemli düşüşleri gösterir ve denemenin düzgün çalışmadığını gösterir (Açık kollarda süre Off1 86.92±12.74 s, On1 33.78±14.38 s, Off2 18.01±111.61 s, On2 16.41±9.61 s, Off3 11.36±4.01 s, On3 5.43±2.07 s. Off1:On1, MWRS, p=0.009, **; Mesafe Off1 705.11±888.36 cm, On1 789.45±7777.53 cm, Off2 724.74±80.49 cm, On2 676.57±1111.99 cm, Off3 716.99±132.47 cm, On3 663.03±132.cm; Açık kol girişleri Off1 7.09±1, On1 3.72±1.17, Off2 1.45±0.47, On2 1.36±0.58, Off3 0.91±0.43, Off3 1.64±0.59. Kapalı1:On1, MWRS, p=0.01, *; Merkezde zaman harcaması Off1 35,89 s, On1 29,25±3,96 s, Off2 22,17±3,58 s, On2 15,9±2,57 s, Off3 13,86±4,2 s, On3 16,89±5,75 s). Değerler s.e.m. * ± anlamlı farklar (p≤0.05), ** önemli farkları (p≤0.01) gösterir. t-testi her zaman iki kuyruklu, MWRS: Mann-Whitney Rank Sum testi; EPM: Yükseltilmiş-Plus Labirent; CT: kontrol hayvanları; EXP: deneysel hayvan; OA: açık kollar. Bu rakam Berg ve ark. 2019, PLoS One43 ve Berg 201948'dendeğiştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61023/61023fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61023/61023fig06.jpg"> Şekil 6: IL ve Nex-Cre özgüllükch2 ve tdTomato enjeksiyon tarafı. A)Ap + 1.66 mm, mL 0.3 mm, DV -1.8 mm, tek taraflı enjeksiyon ve implantasyon (fare beyin atlası, Paxinos ve Franklin, Bregma +1.54 mm uyarlanmıştır) koronal beyin dilimleri üzerinde implantasyon sitenin şematik çizim. B) Nex-Cre farelerde DAPI lekeli hücre çekirdekleri (mavi) ile birleştirilmiş ChR2-YFP (sol, sarı) ve tdTomato (sağ, kırmızı) örnek enjeksiyon siteleri. Ölçek çubuğu 1 mm. Insets IL bölgenin yüksek büyütme gösterir. Ölçek çubuğu 150 μm. Beyaz kutular insets yerinigösterir. C) Üst satır: glutamaterjik nöronlar için bir belirteç olarak CamKII ile boyanmış bir Nex-Cre fare sol IL bölgenin konfokal görüntüleri (mavi), ve ChR2-YFP (sarı) veya Gad67 GABAerjik nöronlar için bir belirteç olarak (yeşil), Bir Nex-Cre fare. Alt satır: CamKII (sol, mavi) ile ChR2-YFP (sarı) colocalization, ama Gad67 ile değil (sağ, yeşil), glutamaterjik nöronlar için Nex-Cre farelerin özgüllük gösteren. Ölçek çubuğu 50 μm. PrL: prelimbik korteks; IL: infralimbic korteks; DP: dorsal pedunküler korteks. Bu rakam Berg ve ark. 2019, PLoS One43 ve Berg 201948'dendeğiştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61023/61023fig06large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity to Modulate Behavior in Freely Moving Mice at JoVE.com

Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity to Modulate Behavior in Freely Moving Mice

Belirli nöronal popülasyonların veya beyin bölgelerinin optogenetik manipülasyonu ile, davranış serbestçe hareket eden hayvanlarda yüksek zamansal ve mekansal çözünürlük ile değiştirilebilir. Kronik implante optik lifler ile birlikte farklı optogenetik araçlar kullanılarak, nöronal modülasyonlar ve davranışsal testler çeşitli yapılabilir.

SerbestÇe Hareket Eden Farelerde Davranışı Modüle Etmek Için Nöronal Aktivitenin Optogenetik Manipülasyonu

Optogenetic modulation of neuronal circuits in freely moving mice affects acute and long-term behavior. This method is able to perform manipulations of ...

Belirli nöronal popülasyonların veya beyin bölgelerinin optogenetik manipülasyonu ile, davranış serbestçe hareket eden hayvanlarda yüksek zamansal ve mekansal çözünürlük ile değiştirilebilir. Kronik implante optik lifler ile birlikte farklı optogenetik araçlar kullanılarak, nöronal modülasyonlar ve davranışsal testler çeşitli yapılabilir. Optogenetik nihai hedefi, davranan hayvan yüksek zamansal ve mekansal çözünürlük ile nöronal devrelerin modülasyonu.Farmakolojik veya elektriksel manipülasyonların aksine, optogenetik nöronal devrelerde belirli hücre tiplerinin hassas bir şekilde kontrol altına alınışını sağlar. Optogenetik, davranış sırasında özel olarak tanımlanmış bölgede belirli hücre tiplerini hedeflemenin ve bu mikro devrelerde meydana gelen değişikliklerin doğrudan etkisini incelemenin mükemmel bir yoludur. Şimdi serbestçe hareket eden farelerde optogenetiği nasıl hazırlayıp, yerleştireceğimiz ve nasıl yöneteceğimiz konusunda adım atmak için bir adım atacağız.Optik implantın hazırlanması için, bir tezgah mengeneye seramik ferrule düz tarafı yerleştirin. Bir lif sıyırma aracı ile 200 mikrometre çapında cam elyaf kodu şerit ve bir seramik elyaf katip ile 2-3 santimetre olmayan parçalar kesti. Seramik ferrule içine cam elyaf parçası yerleştirin sonra bir enjeksiyon kanül ile düz tarafında bir superglue bir damla yerleştirin.Seramik ferrule yuvarlak tarafında, mümkün olduğunca kısa cam elyaf kesilmiş ve dört farklı yayın kağıtları yuvarlak tarafı parlatmak için bir ferrule parlatma diski ön implant yerleştirin. Daha sonra, seramik ferrule düz tarafında cam elyaf kesilmiş, implantasyon için gerekli uzunluğa. İmplantın uzunluğunu hesaplamak için fare beyin atlası kullanın.İmplant, ilgi alanının hemen üzerinde sona ermeli. İmplantasyondan önce anestezi uygulanır. El yazmasında kesin ve estetik teknik açıklanmıştır.Fare derin bir anestezi durumuna ulaştığında, bir ısıtma plakası üzerine yerleştirin ve stereotaktik çerçeve içinde kafa düzeltmek. Burun ve ön ve her iki tarafta kulakları dişleri düzeltin. Farenin arkasına subcuntaneously bir cuprofen ile bir algesia uygulayın ve kurutma onları korumak için her iki göz de opak göz merhemi uygulayın.Islak bir kağıt havlu ile kafa derisi üzerinde saç nemlendirin ve sonra makas kullanarak kesti. Islık bir kağıt havlu ile tüm gevşek saç ları kaldırmaya özen güvendir İyot içeren bir tentür ile kafa derisi dezenfekte etmek için bir pamuk sopa kullanın.Bir cızırtacı ile ilgi bölgesi hakkında kafa derisi yükseltmek ve orta hat boyunca bir santimetre kesti. İmplantasyon için kafatasını pürüzlendirmek için, yara nın üzerine az miktarda fosforik asit uygulayın ve 15 saniye boyunca etkisini gösterdi. Bir pamuk sopa ile tüm asit çıkarın ve iki kez sodyum klorür ile yara durular.Uygun enjeksiyon için, bireysel koordinatlar için F faktörünü hesaplayın. Stereoctatic çerçeve içinde bir cam kanül yerleştirin ve bregma üzerinde doğrudan bulmak. Şimdi koordinat sistemini sıfırlayın ve cam kanülü Lambda'ya taşıyın.Aşağıdaki formülle F faktörlerini hesaplayın. Bregma eksi Lambda 4.2 ile bölünür F faktörüne eşittir. Tam koordinatlar enjeksiyon ve implantasyon için çok önemlidir, aksi takdirde, yanlış yapı uyarılırsa o zaman davranışsal etkileri spesifik değildir.Tüm farelerin kafatası büyüklüğünde minimum sapmaları vardır, bu nedenle katsayı kesinlikle zorunludur. İlgi alanının hemen üstündeki yara parçasının konumunu bulmak için ayarlanmış koordinatları kullanın. Yerinde kanül döndürerek, kafatası içine bir delik delmek için bir enjeksiyon kanül kullanın.Şırıngaya bağlı cam kanülün içine bir virüs çözeltisi almak için kafatasına bir damla sodyum klorür ve üstüne bir parça pirofen yerleştirin. Pirofenüzerine iki mikrolitre lik virüs çözeltisi yerleştirin ve cam kanonun ucunu virüse indirin. Negatif basınç uygulayın ve virüs çözeltisi kanül tarafından alınana kadar bekleyin.Kanüllü virüsün ucu kafatası seviyesinde olduğunda bu koordinata sıfır ve yavaşça sondaj kenarına kadar enjeksiyon tarafının en düşük konumuna indirin. Menisküs indirilir kadar şırınga ile pozitif basınç küçük bir miktar uygulayın. Bir sonraki konuma cam kanül yukarı taşımadan önce virüs 2-3 dakika boyunca yayıldı sağlar.Cam kanülünü çok yavaş çıkarın ve son enjeksiyondan sonra atın. Şimdi kafatasını implantasyona hazırlayın. Basınçlı hava ile kafatası kuru, bu ilgili sopa ile astar uygulayın ve 15 saniye kuru izin.Aynı sopa ile bağ uygulayın ve UV ışığı ile 20 saniye boyunca tedavi. İmplantı ilgili tutucuya yerleştirin ve cam elyafın ucunu doğrudan sondaj deliğinin üzerine yerleştirin ve dikkatlice indirin. Süper yapıştırıcının kalan vanası kafatasına değdiğinde implantı düşürmeyi bırakın.Optik liflerin implantasyonu hipokampus gibi ikili yapılar için de yapılabilir. Bu aynı anda her iki hemisferde hafif stimülasyon sağlar veya iki farklı yapıların uyarılması sağlar. Virüsü optik fiber implanttan farklı bir yerde enjekte etmek de mümkündür.Enjeksiyon ve implantasyon farklı bölgelerde yapılıyorsa, fosforik asit uygulandıktan sonra ancak iki bileşenli yapışmadan önce gerekli tüm delikleri delin. Kafatası hala tamamen kuru olup olmadığını tekrar kontrol edin, sonra implant etrafında sıvı diş çimentosu uygulamak ve çevresinde uv ışığı ile 20 saniye boyunca tedavi tamamen kürk ücretsiz ve kurutulmuş kafatası alanında iki daha az çimento uygulayın. Uv ışığı ile her katmanı tedavi edin.Ameliyatı bitirmek için tüm yara üzerinde iyot anointment uygulayın. Burun ve kulak fiksasyon bırakın, taze bir kafes içine fare getirmek ve vücut ısı kaybını önlemek için bir ısıtma lambası altına yerleştirin. Günde en az bir kez sağlık durumunu kontrol edin ve gerekirse üç gün sonra ameliyat ve algezi sonrası olacaktır.Kurtarma iki hafta sonra, fareler davranışdeneyleri için kullanılabilir. Pulser Yazılımını açın ve ışık kaynağının takılmış olduğu USB com bağlantı noktasını seçin. Harici bir yazılımın ışık kaynağını denetlemesine izin vermek için üç işlem modunu seçin.Beş milisaniyelik ışık darbesi ile 20 Hertz stimülasyon için doğru ayarlamayı seçin. Darbeci ile iletişim kurmak için bölümü bulmak için başlangıç sırasına basın. Bu durum, denemeler tamamlanana kadar kalır.Şimdi, EthoVision XT'de yeni bir deneme oluşturun, dosyaya gidin, şablondan yeni sini seçin ve önceden tanımlanmış bir şablon uygulayın'ı seçin. Canlı izleme yi seçin ve kamerayı kaynakla seçin ve bağlı Puslar Gen-Eye kamerasını onaylayın. Kaydedilmesi gereken hayvan olarak fareyi seçin.Arena şablonu, açık alan kareve bölge şablon merkezi, kenarlık, köşeleri seçin. İzlenmesi gereken bir konuyu onaylayın ve merkez noktası, burun noktası ve kuyruk tabanını seçin. Arka plana göre hayvan renginin daha koyu olduğunu ve adımı bitirmek için önerilen örnek oranını onaylayın.Denemeyi uygun adlayın ve kaydetmek için bir konum seçin. Arena ayarlarını bulana kadar kamera otomatik olarak arka plan görüntüsünü açar. Önceden tanımlanmış bölgeleri ok ve iki sembolü kullanarak gerçek arenaya uyarla.Bazı bölgeler gereksizse, bunları silin. Kalibre etmek ve labirentin bir köşesinden diğerine bir çizgi koymak için çizim ölçeğine basın. Santimetre olarak gerçek mesafenin uzunluğunu girin.Bunu diğer eksen için tekrarlayın. Deneme denetimi ayarlarını tanımlamak için koşul süresini 20 dakikaya ayarlayarak ana kuralı hazırlayın. Star Trek için koşul, konu iki saniye için arenada olduğunda, fare arenada olduğunda izleme otomatik bir durum için olmalıdır.Işık stimülasyonu için bir alt kural oluşturmak için yapılara gidin, daha fazlasını ve alt kuralı seçin. Ana kuralın altına yerleştirin ve iki kutu yayıldı. Koşullara gidin, zaman ve bir ışık gibi bir isim vermek, durumu ayarlamak beş dakika sonra karşılanır.Kutuyu alt kuralın başlangıç kutusunun hemen arkasına yerleştirin. Eylem özel donanım gidin ve bir ışık ile adlandırın. Gerçekleştirmek için eylem seçin:Bir yüksek koyacağım.Kutuyu doğrudan durum kutusunun arkasına yerleştirin. Işığı üzerine doğru programlamak için adımları tekrarlayın. Şimdi yapılara gidin, alt kural başvurusu na başvurun ve başvurunun doğru alt kurala ait olup olmadığını kontrol edin.Başlangıç koşullarını gecikmeden başlatın ve başlangıç koşulu başına bir kez çalıştırılanın koşulları başlatın. Referans kutusunu, ana kuralın iki numaralı ve koşullu kitapların bir ve koşul kitapları arasına yerleştirin. Şimdi, sisteme ne izlemesi gerektiğini göstermek için algılama ayarlarını tanımlayın.Arenaya bir test mili yerleştirin ve otomatik kurulum seçin. Hayvan türü olarak kemirgen seçin ve arenada fareler etrafında bir kutu çizmek için fare imleci kullanın. Bakım sorusunun sonuçlarını evet ile onaylayın.Açık alan deneyi için, uygun bir anksiyete düzeyini sağlamak için deneyden hemen önce deney fareyi davranış odasına getirin. Çift fare kafesızgara hafifçe basarak ışık kaynağının bir yarık olabilir. Işık kablosuna alışmak için 10 dakika boyunca taze çöplü bir bekleme kafesine yerleştirin.Stop düğmesine basarak satın almaya başlayın ve XT'yi görmeniz için. Fareyi bekleme kafesinden açık alanın sol üst köşesine aktarın. Deneme sırasında farenin görsel alanını bırakın ve sakin olun. 20 dakika sonra, deneme bittiğinde, fareyi labirentten çıkarın, ışık kablosunu çıkarın ve kendi kafesine geri koyun.Bir kontrol görselleştirmesi ile, ışık kapalı ve yüzlerde ışık arasındaki merkezi zaman farklılıkları doğrudan görülebilir. Işık açıkken fare merkezde daha az zaman geçirir. Barnes labirent deneyi için, deneyden yaklaşık bir saat önce tüm deneysel fareleri davranış odasına getirin.Biri hariç tüm delikleri kapatarak Barnes labirent hazırlayın, ve şimdi bir kaçış kutusu yerleştirilir. Her iki implantta ışık kaynağında bir fare bağlayın ve doğrudan Barnes labirentinin ortasına yerleştirin. Başlat tuşuna basın ve bir sonraki T'yi ziyaret edip karton kutuyu kaldırmanız gerekir.Yazılımın tüm geçişi tanımaması durumunda denemeyi el ile durdurmaya hazır olun. Fareyi labirentten çıkarın ve ışık kablosuna olan bağlantıyı çıkarın. Gerçekleştirirken, öğrenme ve bellek görevi, manipülasyon hemen etkisi değil, aynı zamanda edinme, konsolidasyon veya alma sırasında manipülasyon uzun vadeli etkisi araştırılır.Veri analizi için, tedavi durumunu tedavi veya kontrollü bulursunuz, iç içe gidin ve deneme kontrol durumunu seçin. Element eylem Star Trek gelen durum aralığı seçin eleman eylem ışık bir gider. Yuvalama kutusunu filtre kutusu işleme sayıltıcı sıyrık ile ilgili sonuç kutusu arasına yerleştirin.Bu tanımlı aralık birdir. Kontrol grubu için de iki ve iki aralıklarla adımları yineleyin. Ayrıca analiz profilinde analiz edilecek parametreleri tanımlayın.Bölgede bağımlı değişkeni seçin ve bölge merkezini, gövde noktasını, merkez noktasını seçin ve deneme istatistiklerine gidin. Sıklığı, kümülatif süreyi seçin ve ilkini görelim. Ayrıca değişken olarak mesafe hareket ekleyin.Bu profille, merkezde harcanan zamana ait veriler, merkez girişleri ve mesafe taşıması söylendi. Her bölümden veri ayıklamak için sonuçlara gidin ve istatistikleri ve grafikleri seçin, analiz edilen verileri görmek için hesapla'ya basın. Dışa aktarma verilerine basın ve deneme istatistiklerini ve kaydedilen konumu seçin.Dışa aktarılan veriler bir excel dosyası olarak ve her fare için tek tek değerlerle kaydedilir. Ayrıca, ısı haritası görselleştirme gidin ve her fare ve deneme için bireysel ısı haritaları görmek için sağ daki çizim ısı haritaları basın. Fareye sağ tıklayın ve ısı haritalarını görüntü olarak dışa aktarın.Daha sonra, excel dosyasını bilgisayar açın ve dört deneme ve ölçülen her klima grubu için ortalama ve standart euro SCM hesaplayın. Grafikler ve Sigma çizimoluşturmak için, Sigma arsa için ekstra dosyadan doğru sıraya anlamına gelir ve SCM kopyalayın. Satırlar kapalı bir, bir için veri içermelidir ve sütunlar deneme, ortalama ve SCM hertz içerir.Üç sütunu da seçin ve grafikler oluşturmaya gidin. Çubuk kutusunu seçin ve ok ile gruplandırılmamış kutuyu seçin. Grafiğin tamamını etiketleyin, eve gidin, grafik kutusunu seçin ve dışa aktar'a basın.Hedef klasörü seçin ve biçim olarak meta dosyayı seçin. Elde edilen verilerin istatistiklerini hesaplamak için, Xcel'den gelen doğru verileri bire bir ve Sigma çiziminin tek sütunlarına kopyalayın. Karşılaştırmak istediğiniz sütunları işaretleyin ve çözümlemeyi yapın, T testi'ni seçin ve çalıştır'a basın.Son olarak, davranışsal veriler izin ve deneme ek ısı haritası uzmanlaşma ile bölünmüş gösterilebilir. Açık alan deneyinde, Channelrhodopsin2 ve piramidal nöronların ışık stimülasyonu sırasında, merkez süresi azalır, hangi artan anksiyete düzeyleri gösterir. İmmünohistokimya ile virüsün enjeksiyon yeri ve ekspresyonu belirlenebilir, ayrıca cre-bağımlı fare çizgisinin özgüllüğü de doğrulanabilir.Bir açıkça Channelrhodopsin ışık stimülasyonu görebilirsiniz2 Bu özel korteks bölgesinin zihin nöronları geliştirmek anksiyete düzeylerini artırır, Bu stimülasyon önce temel anksiyete ile karşılaştırıldığında. Manipülasyonun davranış üzerindeki bu hemen etkisi, optogenetik bugün davranışla ilgili bu kadar çok araştırma sorusu için kullanılmasının nedenidir. Bu işlem fare beyninde istenilen herhangi bir hücre tipi veya nöronal devre Optogenetik modülasyonu için kullanılabilir.Bu prosedürü araştırmanız için uygun davranış testleri ile birleştirerek, davranış ve ilgi hastalıkları ile ilgili nöronal devreler daha derin bir fikir elde edilebilir.

Research

JoVE Journal

Behavior

Long-term Potentiation of Perforant Pathway-dentate Gyrus Synapse in Freely Behaving Mice

Serbestçe Fareler davranmak içinde delici yol-kıvrımlarının Synapse Uzun vadeli Potentiation

Studies of long-term potentiation of synaptic efficacy, an activity-dependent synaptic phenomenon having properties that make it attractive as a potential ...

Uncovering Beat Deafness: Detecting Rhythm Disorders with Synchronized Finger Tapping and Perceptual Timing Tasks

The Beat Sağırlık Uncovering: Algılama Ritim Bozuklukları Vurma Senkronize Finger ve algısal Zamanlama Görevleri ile

A set of behavioral tasks for assessing perceptual and sensorimotor timing abilities in the general population (i.e., non-musicians) is presented here ...

Flat-floored Air-lifted Platform: A New Method for Combining Behavior with Microscopy or Electrophysiology on Awake Freely Moving Rodents

Düz zeminli Hava kaldırdı Platform: Yeni Bir Yöntem Awake üzerinde Mikroskopi veya Elektrofizyoloji ile davranışı birleştiren için serbestçe Kemirgenler Hareketli

It is widely acknowledged that the use of general anesthetics can undermine the relevance of electrophysiological or microscopical data obtained from a ...

A Novel Experimental and Analytical Approach to the Multimodal Neural Decoding of Intent During Social Interaction in Freely-behaving Human Infants

İnsan Bebekler Serbestçe-davrandığını Sosyal Etkileşim sırasında Niyet Multimodal Sinir Coded Yeni Bir Deneysel ve Analitik Bir Yaklaşım

Understanding typical and atypical development remains one of the fundamental questions in developmental human neuroscience. Traditionally, experimental ...

Visualizing Motion Patterns in Acupuncture Manipulation

Akupunktur Denetlemedeki Hareket Patterns görselleştirme

Acupuncture manipulation varies widely among practitioners in clinical settings, and it is difficult to teach novice students how to perform acupuncture ...

The Rodent Psychomotor Vigilance Test (rPVT): A Method for Assessing Neurobehavioral Performance in Rats and Mice

The Rodent Psychomotor Vigilance Test rPVT: A Method for Assessing Neurobehavioral Performance in Rats and Mice

Kemirgen Psikomotor teyakkuz Testi (rPVT): Sıçan ve Farelerde Nörodavranışsal Performans değerlendirilmesi için bir yöntem

The human Psychomotor Vigilance Test (PVT) is a widely used procedure for measuring changes in fatigue and sustained attention. The present article ...

Manipulation of Epileptiform Electrocorticograms (ECoGs) and Sleep in Rats and Mice by Acupuncture

Manipulation of Epileptiform Electrocorticograms ECoGs and Sleep in Rats and Mice by Acupuncture

Akupunktur ile Sıçan ve Farelerde Epileptiform Electrocorticograms (ECoGs) Manipülasyon ve Uyku

Ancient Chinese literature has documented that acupuncture possesses efficient therapeutic effects on epilepsy and insomnia. There is, however, little ...

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

Çok Katlı Kortikal Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Prizmatik Problar ve Minyatür Floresan Mikroskopi ile Serbestçe Hareketli Fare Görüntüleme

In vivo circuit and cellular level functional imaging is a critical tool for understanding the brain in action. High resolution imaging of mouse cortical ...

A Wireless, Bidirectional Interface for In Vivo Recording and Stimulation of Neural Activity in Freely Behaving Rats

A Wireless, Bidirectional Interface for In Vivo Recording and Stimulation of Neural Activity in Freely Behaving Rats

Kablosuz, Vivo içinde kayıt ve fareler serbestçe davranışlar içinde sinirsel aktivite uyarılması için çift yönlü arayüzü

In vivo electrophysiology is a powerful technique to investigate the relationship between brain activity and behavior at a millisecond and micrometer ...

Assessing Activity-based Anorexia in Mice

Etkinlik tabanlı anoreksiya farelerde değerlendirilmesi

Rodents develop activity-based anorexia (ABA) when exposed to a restricted feeding schedule and allowed free access to a running wheel. These conditions ...