Name: measuring ran peptide toxicity in c. elegans
Uploaded: 2020-04-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans at JoVE.com

المعاهد القومية للصحة R21NS107797

1. توليد codon المتنوعة RAN الببتيد التعبير يبني
<ol><li>تصميم تسلسل الترميز الببتيد RAN الفردية باستخدام codons مرادف للقضاء على بنية الحمض النووي المتكررة الأساسية / الحمض النووي الريبي ولكن الحفاظ على تسلسل الأحماض الأمينية المبالغ فيها.</li>
	<li>ترتيب تسلسل codon المخصصة تجاريا في أطوال تكرار اللازمة...

<ol>
	<li>Cleary, J. D., Ranum, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeat+associated+non-ATG+(RAN)+translation:+new+starts+in+microsatellite+expansion+disorders.">Repeat associated non-ATG (RAN) translation: new starts in microsatellite expansion disorders.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 26, 6-15 (2014).</li><li>The Huntington's Disease Collaborative Research Group. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+gene+containing+a+trinucleotide+repeat+that+is+expanded+and+unstable+on+Huntington's+disease+chromosomes.">A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes.</a> Cell. 72 (6), 971-983 (1993).</li><li>Scherzinger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntingtin-encoded+polyglutamine+expansions+form+amyloid-like+protein+aggregates+in+vitro+and+in+vivo.">Huntingtin-encoded polyglutamine expansions form amyloid-like protein aggregates in vitro and in vivo.</a> Cell. 90 (3), 549-558 (1997).</li><li>Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+threshold+for+polyglutamine-expansion+protein+aggregation+and+cellular+toxicity+is+dynamic+and+influenced+by+aging+in+Caenorhabditis+elegans.">The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99 (16), 10417-10422 (2002).</li><li>Genetic Modifiers of Huntington's Disease Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electronic+address,+g.+h.+m.+h.+e.,+Genetic+Modifiers+of+Huntington's+Disease,+C.+CAG+Repeat+Not+Polyglutamine+Length+Determines+Timing+of+Huntington's+Disease+Onset.">Electronic address, g. h. m. h. e., Genetic Modifiers of Huntington's Disease, C. CAG Repeat Not Polyglutamine Length Determines Timing of Huntington's Disease Onset.</a> Cell. 178 (4), 887-900 (2019).</li><li>Wright, G. E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Length+of+Uninterrupted+CAG,+Independent+of+Polyglutamine+Size,+Results+in+Increased+Somatic+Instability,+Hastening+Onset+of+Huntington+Disease.">Length of Uninterrupted CAG, Independent of Polyglutamine Size, Results in Increased Somatic Instability, Hastening Onset of Huntington Disease.</a> American Journal of Human Genetics. 104 (6), 1116-1126 (2019).</li><li>Cleary, J. D., Ranum, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeat-associated+non-ATG+(RAN)+translation+in+neurological+disease.">Repeat-associated non-ATG (RAN) translation in neurological disease.</a> Human Molecular Genetics. 22 (1), 45-51 (2013).</li><li>Banez-Coronel, M., Ranum, L. P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeat-associated+non-AUG+(RAN)+translation:+insights+from+pathology.">Repeat-associated non-AUG (RAN) translation: insights from pathology.</a> Laboratory Investigation. 99 (7), 929-942 (2019).</li><li>Banez-Coronel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAN+Translation+in+Huntington+Disease.">RAN Translation in Huntington Disease.</a> Neuron. 88 (4), 667-677 (2015).</li><li>Ash, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unconventional+translation+of+C9ORF72+GGGGCC+expansion+generates+insoluble+polypeptides+specific+to+c9FTD/ALS.">Unconventional translation of C9ORF72 GGGGCC expansion generates insoluble polypeptides specific to c9FTD/ALS.</a> Neuron. 77 (4), 639-646 (2013).</li><li>Kramer, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+screens+in+human+cells+and+primary+neurons+identify+modifiers+of+C9ORF72+dipeptide-repeat-protein+toxicity.">CRISPR-Cas9 screens in human cells and primary neurons identify modifiers of C9ORF72 dipeptide-repeat-protein toxicity.</a> Nature Genetics. 50 (4), 603-612 (2018).</li><li>Boeynaems, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+screen+connects+nuclear+transport+genes+to+DPR+pathology+in+c9ALS/FTD.">Drosophila screen connects nuclear transport genes to DPR pathology in c9ALS/FTD.</a> Scientific Reports. 6, 20877 (2016).</li><li>Jovicic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modifiers+of+C9orf72+dipeptide+repeat+toxicity+connect+nucleocytoplasmic+transport+defects+to+FTD/ALS.">Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS.</a> Nature Neuroscience. 18 (9), 1226-1229 (2015).</li><li>Boeynaems, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+Separation+of+C9orf72+Dipeptide+Repeats+Perturbs+Stress+Granule+Dynamics.">Phase Separation of C9orf72 Dipeptide Repeats Perturbs Stress Granule Dynamics.</a> Molecular Cell. 65 (6), 1044-1055 (2017).</li><li>Lee, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C9orf72+Dipeptide+Repeats+Impair+the+Assembly,+Dynamics,+and+Function+of+Membrane-Less+Organelles.">C9orf72 Dipeptide Repeats Impair the Assembly, Dynamics, and Function of Membrane-Less Organelles.</a> Cell. 167 (3), 717-788 (2016).</li><li>Hao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+dysfunction+and+neurodegeneration+in+a+C9orf72+mouse+line+expressing+poly-PR.">Motor dysfunction and neurodegeneration in a C9orf72 mouse line expressing poly-PR.</a> Nature Communications. 10 (1), 2906 (2019).</li><li>Scior, A., Preissler, S., Koch, M., Deuerling, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+PCR-free+engineering+of+highly+repetitive+DNA+sequences.">Directed PCR-free engineering of highly repetitive DNA sequences.</a> BMC Biotechnology. 11, 87 (2011).</li><li>Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+transformation.">DNA transformation.</a> Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).</li><li>Rudich, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+localized+C9orf72-associated+arginine-containing+dipeptides+exhibit+age-dependent+toxicity+in+C.+elegans.">Nuclear localized C9orf72-associated arginine-containing dipeptides exhibit age-dependent toxicity in C. elegans.</a> Human Molecular Genetics. 26 (24), 4916-4928 (2017).</li><li>Gidalevitz, T., Krupinski, T., Garcia, S., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Destabilizing+protein+polymorphisms+in+the+genetic+background+direct+phenotypic+expression+of+mutant+SOD1+toxicity.">Destabilizing protein polymorphisms in the genetic background direct phenotypic expression of mutant SOD1 toxicity.</a> PLoS Genetics. 5 (3), 1000399 (2009).</li><li>Nollen, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNA+interference+screen+identifies+previously+undescribed+regulators+of+polyglutamine+aggregation.">Genome-wide RNA interference screen identifies previously undescribed regulators of polyglutamine aggregation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 101 (17), 6403-6408 (2004).</li><li>Satyal, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyglutamine+aggregates+alter+protein+folding+homeostasis+in+Caenorhabditis+elegans.">Polyglutamine aggregates alter protein folding homeostasis in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (11), 5750-5755 (2000).</li><li>Boccitto, M., Lamitina, T., Kalb, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Daf-2+signaling+modifies+mutant+SOD1+toxicity+in+C.+elegans.">Daf-2 signaling modifies mutant SOD1 toxicity in C. elegans.</a> PLoS One. 7 (3), 33494 (2012).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C9orf72+BAC+Mouse+Model+with+Motor+Deficits+and+Neurodegenerative+Features+of+ALS/FTD.">C9orf72 BAC Mouse Model with Motor Deficits and Neurodegenerative Features of ALS/FTD.</a> Neuron. 90 (3), 521-534 (2016).</li><li>Peters, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+C9ORF72+Hexanucleotide+Expansion+Reproduces+RNA+Foci+and+Dipeptide+Repeat+Proteins+but+Not+Neurodegeneration+in+BAC+Transgenic+Mice.">Human C9ORF72 Hexanucleotide Expansion Reproduces RNA Foci and Dipeptide Repeat Proteins but Not Neurodegeneration in BAC Transgenic Mice.</a> Neuron. 88 (5), 902-909 (2015).</li><li>O'Rourke, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C9orf72+BAC+Transgenic+Mice+Display+Typical+Pathologic+Features+of+ALS/FTD.">C9orf72 BAC Transgenic Mice Display Typical Pathologic Features of ALS/FTD.</a> Neuron. 88 (5), 892-901 (2015).</li><li>Mizielinska, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C9orf72+repeat+expansions+cause+neurodegeneration+in+Drosophila+through+arginine-rich+proteins.">C9orf72 repeat expansions cause neurodegeneration in Drosophila through arginine-rich proteins.</a> Science. 345 (6201), 1192-1194 (2014).</li><li>Krajacic, P., Shen, X., Purohit, P. K., Arratia, P., Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanical+profiling+of+Caenorhabditis+elegans+motility.">Biomechanical profiling of Caenorhabditis elegans motility.</a> Genetics. 191 (3), 1015-1021 (2012).</li><li>Zhang, L., Ward, J. D., Cheng, Z., Dernburg, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+auxin-inducible+degradation+(AID)+system+enables+versatile+conditional+protein+depletion+in+C.+elegans.">The auxin-inducible degradation (AID) system enables versatile conditional protein depletion in C. elegans.</a> Development. 142 (24), 4374-4384 (2015).</li></ol>

هنا نبلغ عن الطرق التي يمكن استخدامها لاساي RAN الببتيد سمية على غرار في العضلات أو في الخلايا العصبية من C. elegans. في حين أن البروتينات العصبية التنكسية لها نمط ظاهري في بداية العمر في المرضى البشريين ، فإنها يمكن أن تظهر أيضًا سمية تنموية عندما يتم التعبير عنها بشكل مفرط في الأنظمة النم?...

التوسع غير المناسب لتسلسل تكرار الحمض النووي هو الأساس الوراثي للعديد من الأمراض العصبية مثل التصلب الجانبي الضموري (ALS) ، والخرف الجبهي الصدغي (FTD) ، ومرض هنتنغتون (HD)1. وفي حين أن هناك نماذج خلوية والحيوانات راسخة لهذه الأمراض، فإن الآليات التي تقوم عليها هذه الظروف ليست محددة بشكل جيد. على سبيل المثال، يحدث HD بسبب التوسعات في تسلسل تكرار CAG في تسلسل الترميز لبروتين هنتنغتين Htt2. لأن CAG ترميز الجلوتامين الأحماض الأمينية، والنتائج توسيع CAG تكرار في إدراج polyGlutamine، أو polyQ، تسلسل داخل Htt. البروتينات متعددة الجوانب الموسعة تشكل مجاميع البروتين تعتمد على الطول والعمر التي ترتبط مع سمية3،,4. ومن المدهش أن دراستين حديثتين تشيران إلى أن طول تسلسل البولي كيو ليس المحرك الرئيسي لظهور مرض HD ، مما يشير إلى أن العوامل المستقلة عن تعدد الحلقات قد تساهم أيضًا في المرض5،6.
تتضمن إحدى الآليات المستقلة الممكنة متعددة الحلقات نوعًا مكتشفًا حديثًا من ترجمة البروتين يسمى Repeat Associated Non-AUG-AUG-on-AUG-on-AUG-on-AUG-on-AUG-on-AUG-on-AUG-on-AUG-on-AUG-on.R- الترجمة7. كما يوحي اسمها، تحدث ترجمة RAN فقط عندما يكون تسلسل تكرار الموسعة موجودة ولا تتطلب codon بدء الكنسي. لذلك ، تحدث ترجمة RAN في جميع إطارات القراءة الثلاثة للتكرار لإنتاج ثلاثة polypeptides متميزة. بالإضافة إلى ذلك ، لأن العديد من الجينات تنتج أيضًا نسخة مضادة للمعنى تحتوي على تكملة عكسية لتسلسل التكرار الموسع ، تحدث ترجمة RAN أيضًا في جميع إطارات القراءة الثلاثة لنسخة antisense. معا، RAN الترجمة يوسع عدد البروتينات المنتجة من تسلسل الحمض النووي الموسعة التي تحتوي على تكرار من ببتيد واحد إلى ستة ببتيدات. حتى الآن، وقد لوحظ ترجمة RAN في ما لا يقل عن ثمانية اضطرابات مختلفة التوسع تكرار8. ويلاحظ الببتيدات RAN في عينات المريض بعد الوفاة وفقط في الحالات التي يحمل فيها المريض تكرار الموسعة9,10. في حين أن هذه الببتيدات موجودة بوضوح في خلايا المريض ، فإن مساهمتها في الفيزيولوجيا المرضية غير واضحة.
لتحديد أفضل سمية المحتملة المرتبطة الببتيدات RAN، وقد أعربت عدة مجموعات كل الببتيد في أنظمة نموذج مختلف، مثل الخميرة والذباب والفئران، وخلايا زراعة الأنسجة11،12،13،14،15،16. بدلا من استخدام تكرار تسلسل للتعبير، وتستخدم هذه النماذج نهج codon الاختلاف الذي يتم القضاء على تسلسل تكرار ولكن يتم الحفاظ على تسلسل الأحماض الأمينية. بدء الترجمة يحدث من خلال ATG الكنسي وعادة ما تنصهر الببتيد إلى بروتين الفلورسنت في إما N- أو C-terminus، لا يبدو أن أي منهما يتداخل مع سمية الببتيد RAN. لذلك ، كل بناء يبالغ في التعبير عن ببتيد RAN واحد. نمذجة منتجات RAN المختلفة في كائن متعدد الخلايا مع المقاييس البسيطة لقياس سمية الببتيد RAN أمر بالغ الأهمية لفهم كيف تساهم منتجات RAN المختلفة من كل توسع متكرر يسبب المرض في الخلل الوظيفي الخلوي وتوليد الأعصاب.
مثل الأنظمة النموذجية الأخرى، يوفر C. elegans منصة تجريبية مرنة وفعالة تمكن من إجراء دراسات لآليات المرض الجديدة، مثل سمية الببتيد RAN. الديدان تقدم العديد من السمات التجريبية الفريدة التي لا تتوفر حاليا في نماذج أخرى من سمية الببتيد RAN. أولاً، C. elegans شفافة بصرياً منذ الولادة حتى الموت. وهذا يسمح للتصور بسيطة من التعبير الببتيد RAN والتعريب، وكذلك في تحليل الحي من التنكس العصبي في الحيوانات الحية. ثانيا، الأساليب المعدلة وراثيا لتوليد نماذج التعبير الببتيد RAN غير مكلفة وسريعة. ونظرا لدورة حياة قصيرة لمدة ثلاثة أيام من C. elegans,خطوط المعدلة وراثيا مستقرة تعبر عن أي ببتيد ران معين بطريقة محددة من نوع الخلية يمكن إنتاجها في أقل من أسبوع. ثالثاً، يمكن الجمع بين النواتج البسيطة الفينوتيبية مع طرق الفحص الجيني، مثل الطفرات الكيميائية أو فحص الحمض النووي الريبي، لتحديد الجينات الضرورية بسرعة لسمية الببتيد RAN. وأخيرا، فإن عمر قصيرة من C. elegans (~ 20 يوما) يسمح للمحققين لتحديد كيفية الشيخوخة، والتي هي أكبر عامل خطر لمعظم أمراض التوسع المتكررة، ويؤثر على سمية الببتيد RAN. معا، هذا المزيج من الصفات التجريبية لا مثيل لها في أي نظام نموذج آخر، ويقدم منصة قوية لدراسة سمية الببتيد RAN.
هنا نصف العديد من المقالات التي تستفيد من المزايا التجريبية لC. elegans لقياس سمية الببتيدات RAN وتحديد المعدلات الوراثية لهذه السمية. يتم وضع علامة على الببتيدات RAN التي بدأتها ATG codon المتنوعة مع GFP ويتم التعبير عنها بشكل فردي في أي من خلايا العضلات تحت مروج myo-3 أو في الخلايا العصبية الحركية GABAergic تحت مروج UNC-47. للتعبير في خلايا العضلات، من المهم أن يتم وضع علامات على الببتيدات RAN السامة مع البروتين الفلوري الأخضر (GFP)، أو غيرها من البروتين الفلوري (FP) العلامة التي يمكن استهدافها مع ناقل تغذية RNAi. وذلك لأن التعبير الببتيد RAN السامة عادة ما يمنع النمو، مما يجعل مثل هذه السلالات غير قابلة للحياة. استخدام gfp (RNAi) يعطل بشكل مشروط التعبير الببتيد RAN ويسمح صيانة سلالة، والصلبان الوراثية، الخ. للمقالات ، تتم إزالة هذه الحيوانات من gfp (RNAi)، مما يسمح بالتعبير عن الببتيد RAN والأنماط الظاهرية الناتجة. بالإضافة إلى الاستراتيجية الجزيئية لتصميم الببتيد المتنوعة codon بنيات التعبير، ونحن وصف المقالات لقياس سمية النمو (حركية اليرقات والقدرة على النمو)، والسمية المرتبطة بالعمر بعد النمو (قياس الشلل)، والعيوب المورفولوجية العصبية (فحص commissure).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>35mm x 10mm Petri Dish, Sterile</td>
			<td>CELLTREAT Scientific Products</td>
			<td>50-202-036</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AGAR GRANULATED 2KILOGRAM</td>
			<td>BD DIAGNOSTIC SYSTEMS</td>
			<td>DF0145070</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AGAROSE ULTRAPURE</td>
			<td>LIFE TECHNOLOGIES</td>
			<td>16500500</td>
			<td>Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CARBENICILLIN 5G</td>
			<td>THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS</td>
			<td>BP26485</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COVER GLASSES NO 1 22MM 1OZ/PK</td>
			<td>THERMO SCI ERIE</td>
			<td>12542B</td>
			<td>Imaging for commissure assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FEMOTIPS DISPSBL MICROINJ 20CS</td>
			<td>EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS</td>
			<td>E5242952008</td>
			<td>Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FF COV GLASS NO1 40X22MM 1OZPK</td>
			<td>THERMO SCI ERIE</td>
			<td>125485C</td>
			<td>Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>THERMO SCI ERIE</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td>Imaging for commissure assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;Bacto Peptone&#160;</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>DF0118-17-0</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HALOCARBON OIL 700</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH INC</td>
			<td>H8898-50ML</td>
			<td>Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG BIOTECH 10G</td>
			<td>THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS</td>
			<td>BP162010</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Advanced Fluorescence imaging software</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>LAS-AF</td>
			<td>Image acquisition software for video speed analysis and commissure assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Immersion type N (Oil)</td>
			<td>W NUHSBAUM INC</td>
			<td>NC9547002</td>
			<td>Imaging for commissure assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEVAMISOLE HYDROCHLORIDE 10GR</td>
			<td>THERMO SCI ACROS ORGANICS</td>
			<td>AC187870100</td>
			<td>Imaging for commissure assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROLOADER TIPS 2 X 96 PCS</td>
			<td>EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS</td>
			<td>E5242956003</td>
			<td>Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			PETRI DISH, 60X15MM,500/CS</td>
			<td>CORNING LIFE SCIENCES PLASTIC</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TISSUE CULT PLATE 24WEL 50/CS</td>
			<td>CORNING LIFE SCIENCES DL</td>
			<td>87721</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring ran peptide toxicity in c. elegans

C. elegans يستخدم عادة لنموذج الأمراض العصبية المرتبطة بالعمر الناجمة عن الطفرات التوسع ية المتكررة, مثل التصلب الجانبي الضموري (ALS) ومرض هنتنغتون. في الآونة الأخيرة ، تبين أن تكرار التوسع الذي يحتوي على الحمض النووي الريبي هو الركيزة لنوع جديد من ترجمة البروتين يسمى تكرار المرتبطة AUG تعتمد (RAN) الترجمة. على عكس الترجمة الكنسية، لا تتطلب ترجمة RAN بدء codon ويحدث فقط عندما يتجاوز التكرار طول عتبة. نظرًا لعدم وجود codon بدء لتحديد إطار القراءة ، تحدث ترجمة RAN في جميع إطارات القراءة من كل من قوالب الحمض النووي الريبي المنطقية وantisense التي تحتوي على تسلسل توسيع متكرر. لذلك ، توسع ترجمة RAN عدد الببتيدات السامة المحتملة المرتبطة بالأمراض من واحد إلى ستة. حتى الآن، تم توثيق ترجمة RAN في ثمانية مختلفة تكرار التوسع القائم على الأمراض العصبية والعصبية العضلية. في كل حالة ، فك رموز المنتجات التي RAN سامة ، فضلا عن آليات ها من السمية ، هو خطوة حاسمة نحو فهم كيفية هذه الببتيدات تسهم في علم الفيزيولوجيا المرض. في هذه الورقة، ونحن نقدم استراتيجيات لقياس سمية الببتيدات RAN في النظام النموذجي C. elegans. أولا، نحن نصف إجراءات لقياس سمية الببتيد RAN على نمو وحركية تطوير C. elegans. ثانياً، نحن نفصّل فحصاً لقياس الآثار المعتمدة على العمر بعد النمو من الببتيدات RAN على الحركة. وأخيرا، نحن نصف السمية العصبية المقاهل لتقييم آثار الببتيدات RAN على مورفولوجيا الخلايا العصبية. توفر هذه المقالات تقييمًا واسعًا لسمية الببتيد RAN وقد تكون مفيدة في إجراء شاشات جزيئات وراثية أو صغيرة واسعة النطاق لتحديد آليات المرض أو العلاجات.

استخدمنا المقالات الموصوفة هنا لتقييم تأثير موانع الجينات المختلفة على سمية الـ RAN dipeptides الموجودة في مرضى ALS الذين يعانون من توسع تكرار G4C2. باستخدام قياس النمو لقياس سمية النمو، قمنا بتحليل آثار العديد من المسوخ الجينية بالضربة القاضية التي تم تحديدها في مثبطات شاشة RNAi على نطا...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans at JoVE.com

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

المنتجات المترجمة غير المعتمدة على ATG المتكررة هي ميزات مسببة للأمراض الناشئة للعديد من الأمراض المتكررة القائمة على التوسع. الهدف من البروتوكول الموصوف هو تقييم السمية الناجمة عن هذه الببتيدات باستخدام المقالات السلوكية والخلوية في النظام النموذجي C. elegans.

قياس سمية الببتيد RAN في C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis ...

إن الببتيدات ران هي سمة من سمات تكرار الاضطرابات العصبية مثل مرض هنتنغتون، والتصلب الجانبي الضموري، والخرف الجبهي الصدغي. وتوفر هذه البروتوكولات نهجاً معيارياً هاماً لقياس سمية الببتيد ران في نظام نموذج C.elegans. التقنيات الموصوفة بسيطة للتعلم وغير مكلفة ، ويمكن تنفيذها بسرعة ، والاستفادة من الميزات القابلة للتكرار لنظام C.elegans مثل الحركة والتكاثر.عند محاولة هذا البروتوكول، التحدي الرئيسي هو الحصول على متسقة ران الببتيد سمية والتعبير. وتشمل العوامل الرئيسية للسيطرة على درجة حرارة المخدرات، وتوقيت التحولات درجة الحرارة وإعداد لوحات المقايسة. من المهم للمجربين لتصنيف باستمرار الأنماط الظاهرية للحيوانات في هذه العملية التي تعتمد على العمر.عرض مرئي من هذه التقنية يظهر معايير التصنيف الخاصة بهم. تبدأ بصب الخيطية القياسية متوسطة النمو مع IPTG ملليمتر واحد و 25 ميكروغرام لكل ميليلتر كاربينسيلين في 24-جيدا لوحات. خط خارج RNAi تغذية المستنسخين في HT115 البكتيريا على LB كاربينيسيلين أجار وتنمو لهم في 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.في اليوم التالي، واختيار مستعمرة واحدة في ملليلتر واحد من وسائل الإعلام السائلة LB كاربينيسيلين وتنمو البكتيريا لمدة 18 ساعة في 37 درجة مئوية في حين تهتز في 250 دورة في الدقيقة. بقعة أربعة آبار فردية من RNAi NGM 24 جيدا لوحة مع 20 ميكرولترات من الثقافات البكتيرية بين عشية وضحاها كما هو موضح في مخطوطة النص والسماح للبكتيريا RNAi للحث على إنتاج الحمض النووي الريبي المزدوج بين عشية وضحاها. استخدام طريقة هيبوكلوريت القياسية لعزل البيض من يوم واحد الكبار C.elegans التعبير عن transtide RAN المتكاملة.ثم بذور حوالي 30 بيضة في كل بئر من لوحة 24 جيدا واحتضان لوحة في 20 درجة مئوية لمدة سبعة أيام. لإجراء تحليل سرعة الفيديو، احصل على شريطي فيديو من بئرين منفصلين لكل حالة RNAi باستخدام مجهر ستيريو تشريح مزودة بكاميرا أحادية اللون. تأكد من استخدام إعدادات الاكتساب الثابتة بين الآبار.لكل فيديو، قم بتعيين المدة لمدة 10 ثوانٍ والفاصل الزمني إلى 76 مللي ثانية. تعيين وقت تعرض الصورة إلى أربعة مللي ثانية واستخدم إعداد التكبير/التصغير 1.49. ثم حدد اثنين من قبل اثنين binning.تحقق من دقة 800 في 600 بكسل وبدء التسجيل. بعد الاستحواذ، تسمية كل فيديو على الفور مع سلالة، شرط RNAi وعدد جيد. ثم قياس المسافة المقطوعة وطول كل ل 20 حيوانا مختلفا لكل فيديو، وفحص ما مجموعه حوالي 40 ديدان لكل حالة RNAi.في البرنامج، حدد زر أدوات التعليق التوضيحي. ثم أداة النص التعادل. انقر على نقطة في وسط الدودة التي يتم قياسها في الإطار الأول من الفيديو ووضع علامة عليها برقم.تقدم الفيديو إلى النهاية أثناء تتبع بصريا دودة. ثم انقر فوق عليه ووضع علامة عليه مع الرقم المقابل التالي. استخدم أداة شريط مقياس الرسم لرسم خط من الرقم الأول إلى الرقم الثاني وتسجيل المسافة المقطوعة في جدول البيانات.كرر هذا القياس لـ 19 دودية أخرى في الفيديو مع الحفاظ على كل قياس فردي في نافذة التحليل. وبمجرد اكتمال القياسات، خذ لقطة من إطار الفيديو النهائي توضح جميع خطوط القياس بحيث يمكن تتبع البيانات إلى الحيوان الذي نشأت منه. بعد ذلك، تحليل البيانات باستخدام جدول بيانات أربعة أعمدة حيث العمود الأول هو معرف الفيروس المتنقل والعمود الثاني هو السرعة.يمكن العثور على وقت كل فيديو عن طريق النقر بزر الماوس الأيمن على الفيديو تحت التجربة والذهاب إلى الخصائص. لتطبيع قياس السرعة، العثور على طول كل. استخدام أداة رسم متعدد الخطوط لتتبع بحرية C.elegans من غيض من الرأس إلى طرف الذيل.ثم تأخذ لقطة من إطار الفيديو النهائي توضيح جميع خطوط متعددة. وسيسجل طول الخطوط تحت الإحصاءات. إضافة عمودين إلى جدول البيانات، أحدهما لطول الحيوان والأعمدة للسرعة التي تم تسويتها.وأخيراً، قم بتحليل بيانات السرعة التي تم تطبيعها باستخدام ANOVA في اتجاه واحد مع اختبار ما بعد المخصص مقابل RNAi المتجهات الفارغة. مكان أربعة إلى ستة L4 C.elegans المعدلة وراثيا التعبير عن RAN الببتيد GFP على ستة سنتيمتر GFP RNAi لوحة وتنمو لهم في 20 درجة مئوية. إذا كانت التجربة تستخدم RNAi لاختبار الآثار الوراثية على سمية الببتيد RAN، نقل 10 البالغين gravid المعدلة وراثيا إلى كل من اثنين من ناقلات فارغة RNAi GFP RNAi أو الجينات الخاصة RNAi لوحات.إذا كانت المسوخ تستخدم لتحليل الآثار الوراثية على سمية الببتيد RAN، ضع 10 نوع البرية جرافيد أو الحيوانات المتحولة التعبير عن نفس TRANSGENE RAN على كل من اثنين من ناقلات فارغة RNAi أو GFP RNAi لوحات. تنمو لهم في 20 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. اختيار 10 مجموعات من 10 L4s المعدلة وراثيا من لوحات RNAi ووضع كل مجموعة على لوحة RNAi سنتيمترية ثلاثة.تأكد من أن الديدان المحددة للمسايسة كلها حركية طبيعية سطحية. ضع اللوحات في كيس بلاستيكي للاحتفاظ بالرطوبة واحتضانها عند درجة حرارة 25 درجة مئوية. بعد 24 ساعة، وتحليل الحيوانات للتنقل عن طريق التنصت على لوحات على المجهر تشريح والتحقق من الحركة.إذا تحركت الدودة أكثر من طول الجسم، عدها على أنها متنقلة ونقلها إلى لوحة RNAi جديدة تبلغ ثلاثة سنتيمترات. استخدمي اختيار البلاتين للاستفادة من الديدان المتبقية على الرأس والذيل. إذا تحرك الحيوان أكثر من طول الجسم، عد الحيوان على أنه متنقل ونقله إلى لوحة RNAi جديدة لمدة ثلاثة سنتيمترات.إذا لم يلاحظ شلل كبير في مكافحة ناقلات فارغة بحلول اليوم الثاني، وإنهاء الفحص والبدء من جديد. تجميع جميع الديدان غير المنتقلة معا بحيث يمكن بسهولة الكشف عن حركة أكثر من طول الجسم. عد جميع مشلولة، معبأة، أو الديدان الميتة والتخلص من لوحة.مواصلة تسجيل الحيوانات للشلل كل يوم لمدة خمسة إلى سبعة أيام. تم استخدام قياس النمو لقياس تأثير الموانع الجينية على سمية DIPEptides RAN التي تم العثور عليها في المرضى ALS مع التوسع تكرار G4C2. أدى التعبير عن PR50 GFP وحده إلى اعتقال النمو الكامل ، ولكن الضربة القاضية للعديد من الجينات قمعت السمية التنموية.تم قياس تأثير الضربات السريعة الجينية المحددة على الحركة التنموية للحيوانات المعبرة عن PR50 باستخدام طريقة تحليل سرعة الفيديو. وكما هو متوقع، أدى تثبيط تعبير PR50 GFP إلى زيادة كبيرة في الحركة مقارنة بالمتجه الفارغ RNAi. وعلاوة على ذلك، أدى RNAi ضد الوحدة الفرعية proteasome RPN7 إلى زيادة كبيرة في حركة PR50.عندما تم تحليل الأنماط الظاهرية للبالغين مع مقايسة الشلل المعتمدة على العمر ، أظهر PR50 GFP شللًا يصل إلى 80٪ بحلول خمسة أيام من العمر. ومع ذلك، RNAi موجهة إلى الشلل الذي تأخر كثيراً في الشلل الجيني الذي تأخر كثيراً مما يشير إلى أن الـ cul-6 مطلوب لسمية PR50 GFP. لتحديد ما إذا كانت بروتينات RAN تسبب علم الأعصاب عندما يتم التعبير عنه في الخلايا العصبية C.elegans ، تم فحص السمية الخاصة بالخلايا العصبية باستخدام مقايسة commissure.في اليوم الثاني من البالغين, PR50 GFP التعبير في الخلايا العصبية الحركية أدى إلى زيادة كبيرة في الخلايا العصبية الحركية blebbing. تم قمع هذا علم الأمراض العصبية بشكل كبير من قبل طفرة في مستقبلات الأنسولين IGF الجينات هومولوغ DAF-2 الذي يؤخر الخصائص السامة للعديد من البروتينات العصبية. بالنسبة للمقايسة السلوكية، من المهم أن تنتج الببتيدات RAN نمط ظاهري مخترق للغاية.ويمكن لهذه الجينات أو الأدوية أن توفر مؤشرات بيولوجية جديدة أو خيارات علاجية لأمراض الببتيد ران. باستخدام هذه المقايسات، قمنا بإجراء شاشة RNAi على نطاق الجينوم لمثبطات C9ORF72 المرتبطة RAN الببتيد البرولين-أرجينين. الجينات التي تم تحديدها في هذه الشاشة تشمل العديد من الجينات الجديدة والمحفظة التي ستكون موضوع دراسات ميكانيكية في المستقبل.

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

توليد مستقرة ايليجانس جيم المعدلة وراثيا عن طريق Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

جيل المعدلة وراثيا C. ايليجانس عن طريق تحويل Biolistic

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

قياس انواع معينة ايليجانس الحياة سبان في 96 لوحات Microtiter حسنا

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

[رني الفرز لتحديد الظواهر تال للمرحلة الجنينية في C. ايليجانس</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles

قياس إزفاء الببتيد في الحويصلات الكبيرة Unilamellar

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1.  Many of these are referred ...

C. elegans Chemotaxis Assay

C. elegans Chemotaxis Assay

C. ايليجانس الانجذاب الكيميائي الفحص

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

تلوين الأجسام المضادة في<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; عن طريق &quot;تجميد تكسير&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

قياس آثار البكتيريا على<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; السلوك باستخدام مقايسة الاحتفاظ البيض

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

نموذج نقص الأكسجين المجاعة لنقص التروية / ضخه في<em&gt; C. ايليجانس</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

طرق للبشرة إصابة وفحوصات لالردود الجرح في<em&gt; C. ايليجانس</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...