Name: measuring ran peptide toxicity in c. elegans
Uploaded: 2020-04-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans at JoVE.com

NIH R21NS107797

1. Generering codon-varieret RAN peptid udtryk konstruktioner
<ol><li>Design den individuelle RAN peptid kodning sekvens udnytte synonyme codons at fjerne den grundlæggende gentagne DNA / RNA struktur, men bevare den overliggende aminosyre sekvens.</li>
	<li>Bestil de brugerdefinerede codon sekvenser kommercielt på gentagelselængder er nødvendige for undersøgelserne (typisk 5-100 gentagelser). Medtag et HindIII-restriktionssted i 5's ende og et BamHI-restriktionssted i 3's ende for at lette kloning til C. eleg...

<ol>
	<li>Cleary, J. D., Ranum, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeat+associated+non-ATG+(RAN)+translation:+new+starts+in+microsatellite+expansion+disorders.">Repeat associated non-ATG (RAN) translation: new starts in microsatellite expansion disorders.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 26, 6-15 (2014).</li><li>The Huntington's Disease Collaborative Research Group. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+gene+containing+a+trinucleotide+repeat+that+is+expanded+and+unstable+on+Huntington's+disease+chromosomes.">A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes.</a> Cell. 72 (6), 971-983 (1993).</li><li>Scherzinger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntingtin-encoded+polyglutamine+expansions+form+amyloid-like+protein+aggregates+in+vitro+and+in+vivo.">Huntingtin-encoded polyglutamine expansions form amyloid-like protein aggregates in vitro and in vivo.</a> Cell. 90 (3), 549-558 (1997).</li><li>Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+threshold+for+polyglutamine-expansion+protein+aggregation+and+cellular+toxicity+is+dynamic+and+influenced+by+aging+in+Caenorhabditis+elegans.">The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99 (16), 10417-10422 (2002).</li><li>Genetic Modifiers of Huntington's Disease Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electronic+address,+g.+h.+m.+h.+e.,+Genetic+Modifiers+of+Huntington's+Disease,+C.+CAG+Repeat+Not+Polyglutamine+Length+Determines+Timing+of+Huntington's+Disease+Onset.">Electronic address, g. h. m. h. e., Genetic Modifiers of Huntington's Disease, C. CAG Repeat Not Polyglutamine Length Determines Timing of Huntington's Disease Onset.</a> Cell. 178 (4), 887-900 (2019).</li><li>Wright, G. E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Length+of+Uninterrupted+CAG,+Independent+of+Polyglutamine+Size,+Results+in+Increased+Somatic+Instability,+Hastening+Onset+of+Huntington+Disease.">Length of Uninterrupted CAG, Independent of Polyglutamine Size, Results in Increased Somatic Instability, Hastening Onset of Huntington Disease.</a> American Journal of Human Genetics. 104 (6), 1116-1126 (2019).</li><li>Cleary, J. D., Ranum, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeat-associated+non-ATG+(RAN)+translation+in+neurological+disease.">Repeat-associated non-ATG (RAN) translation in neurological disease.</a> Human Molecular Genetics. 22 (1), 45-51 (2013).</li><li>Banez-Coronel, M., Ranum, L. P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeat-associated+non-AUG+(RAN)+translation:+insights+from+pathology.">Repeat-associated non-AUG (RAN) translation: insights from pathology.</a> Laboratory Investigation. 99 (7), 929-942 (2019).</li><li>Banez-Coronel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAN+Translation+in+Huntington+Disease.">RAN Translation in Huntington Disease.</a> Neuron. 88 (4), 667-677 (2015).</li><li>Ash, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unconventional+translation+of+C9ORF72+GGGGCC+expansion+generates+insoluble+polypeptides+specific+to+c9FTD/ALS.">Unconventional translation of C9ORF72 GGGGCC expansion generates insoluble polypeptides specific to c9FTD/ALS.</a> Neuron. 77 (4), 639-646 (2013).</li><li>Kramer, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+screens+in+human+cells+and+primary+neurons+identify+modifiers+of+C9ORF72+dipeptide-repeat-protein+toxicity.">CRISPR-Cas9 screens in human cells and primary neurons identify modifiers of C9ORF72 dipeptide-repeat-protein toxicity.</a> Nature Genetics. 50 (4), 603-612 (2018).</li><li>Boeynaems, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+screen+connects+nuclear+transport+genes+to+DPR+pathology+in+c9ALS/FTD.">Drosophila screen connects nuclear transport genes to DPR pathology in c9ALS/FTD.</a> Scientific Reports. 6, 20877 (2016).</li><li>Jovicic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modifiers+of+C9orf72+dipeptide+repeat+toxicity+connect+nucleocytoplasmic+transport+defects+to+FTD/ALS.">Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS.</a> Nature Neuroscience. 18 (9), 1226-1229 (2015).</li><li>Boeynaems, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+Separation+of+C9orf72+Dipeptide+Repeats+Perturbs+Stress+Granule+Dynamics.">Phase Separation of C9orf72 Dipeptide Repeats Perturbs Stress Granule Dynamics.</a> Molecular Cell. 65 (6), 1044-1055 (2017).</li><li>Lee, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C9orf72+Dipeptide+Repeats+Impair+the+Assembly,+Dynamics,+and+Function+of+Membrane-Less+Organelles.">C9orf72 Dipeptide Repeats Impair the Assembly, Dynamics, and Function of Membrane-Less Organelles.</a> Cell. 167 (3), 717-788 (2016).</li><li>Hao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+dysfunction+and+neurodegeneration+in+a+C9orf72+mouse+line+expressing+poly-PR.">Motor dysfunction and neurodegeneration in a C9orf72 mouse line expressing poly-PR.</a> Nature Communications. 10 (1), 2906 (2019).</li><li>Scior, A., Preissler, S., Koch, M., Deuerling, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+PCR-free+engineering+of+highly+repetitive+DNA+sequences.">Directed PCR-free engineering of highly repetitive DNA sequences.</a> BMC Biotechnology. 11, 87 (2011).</li><li>Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+transformation.">DNA transformation.</a> Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).</li><li>Rudich, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+localized+C9orf72-associated+arginine-containing+dipeptides+exhibit+age-dependent+toxicity+in+C.+elegans.">Nuclear localized C9orf72-associated arginine-containing dipeptides exhibit age-dependent toxicity in C. elegans.</a> Human Molecular Genetics. 26 (24), 4916-4928 (2017).</li><li>Gidalevitz, T., Krupinski, T., Garcia, S., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Destabilizing+protein+polymorphisms+in+the+genetic+background+direct+phenotypic+expression+of+mutant+SOD1+toxicity.">Destabilizing protein polymorphisms in the genetic background direct phenotypic expression of mutant SOD1 toxicity.</a> PLoS Genetics. 5 (3), 1000399 (2009).</li><li>Nollen, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNA+interference+screen+identifies+previously+undescribed+regulators+of+polyglutamine+aggregation.">Genome-wide RNA interference screen identifies previously undescribed regulators of polyglutamine aggregation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 101 (17), 6403-6408 (2004).</li><li>Satyal, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyglutamine+aggregates+alter+protein+folding+homeostasis+in+Caenorhabditis+elegans.">Polyglutamine aggregates alter protein folding homeostasis in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (11), 5750-5755 (2000).</li><li>Boccitto, M., Lamitina, T., Kalb, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Daf-2+signaling+modifies+mutant+SOD1+toxicity+in+C.+elegans.">Daf-2 signaling modifies mutant SOD1 toxicity in C. elegans.</a> PLoS One. 7 (3), 33494 (2012).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C9orf72+BAC+Mouse+Model+with+Motor+Deficits+and+Neurodegenerative+Features+of+ALS/FTD.">C9orf72 BAC Mouse Model with Motor Deficits and Neurodegenerative Features of ALS/FTD.</a> Neuron. 90 (3), 521-534 (2016).</li><li>Peters, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+C9ORF72+Hexanucleotide+Expansion+Reproduces+RNA+Foci+and+Dipeptide+Repeat+Proteins+but+Not+Neurodegeneration+in+BAC+Transgenic+Mice.">Human C9ORF72 Hexanucleotide Expansion Reproduces RNA Foci and Dipeptide Repeat Proteins but Not Neurodegeneration in BAC Transgenic Mice.</a> Neuron. 88 (5), 902-909 (2015).</li><li>O'Rourke, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C9orf72+BAC+Transgenic+Mice+Display+Typical+Pathologic+Features+of+ALS/FTD.">C9orf72 BAC Transgenic Mice Display Typical Pathologic Features of ALS/FTD.</a> Neuron. 88 (5), 892-901 (2015).</li><li>Mizielinska, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C9orf72+repeat+expansions+cause+neurodegeneration+in+Drosophila+through+arginine-rich+proteins.">C9orf72 repeat expansions cause neurodegeneration in Drosophila through arginine-rich proteins.</a> Science. 345 (6201), 1192-1194 (2014).</li><li>Krajacic, P., Shen, X., Purohit, P. K., Arratia, P., Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanical+profiling+of+Caenorhabditis+elegans+motility.">Biomechanical profiling of Caenorhabditis elegans motility.</a> Genetics. 191 (3), 1015-1021 (2012).</li><li>Zhang, L., Ward, J. D., Cheng, Z., Dernburg, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+auxin-inducible+degradation+(AID)+system+enables+versatile+conditional+protein+depletion+in+C.+elegans.">The auxin-inducible degradation (AID) system enables versatile conditional protein depletion in C. elegans.</a> Development. 142 (24), 4374-4384 (2015).</li></ol>

Her rapporterer vi metoder, der kan bruges til at assay RAN peptid toksicitet modelleret i musklen eller i neuroner af C. elegans. Mens neurodegenerative proteiner har en aldersdebut fænotype hos menneskelige patienter, kan de også udvise udviklingstoksicitet, når de overudtrykkes i modelsystemer. Overekspression har betydelige fortolkende begrænsninger, men det giver også et stærkt udgangspunkt for genetiske eller farmakologiske skærme med henblik på at identificere gener eller lægemidler, der kan vend...

Den uhensigtsmæssige udvidelse af DNA-gentagelsessekvenser er det genetiske grundlag for flere neurodegenerative sygdomme såsom amyotrofisk lateral sklerose (ALS), frontotemporal demens (FTD) og Huntingtons Sygdom (HS)1. Mens der er etableret cellulære og animalske modeller for disse sygdomme, mekanismer, der ligger til grund for disse betingelser er ikke veldefineret. For eksempel er HS forårsaget af udvidelser af en CAG-gentagelsessekvens i kodningssekvensen for Huntingtinproteinet Htt2. Da CAG koder aminosyren glutamin, resulterer CAG-gentagne ekspansion i indsættelsen af et polyglutamin eller polyQ, sekvens i Htt. Ekspanderet polyQ-proteiner danner længde- og aldersafhængige proteinaggregater, der er forbundet med toksicitet3,4. Overraskende nok tyder to nylige undersøgelser på, at længden af polyQ-sekvensen ikke er den vigtigste drivkraft bag HS-sygdomsdebut, hvilket tyder på, at polyQ-uafhængige faktorer også kan bidrage til sygdommen5,6.
En mulig polyQ-uafhængig mekanisme indebærer en nyopdaget type protein oversættelse kaldet Repeat Associated Non-AUG-afhængige (RAN) oversættelse7. Som navnet antyder, ran oversættelse kun opstår, når en udvidet gentagelse sekvens er til stede og kræver ikke en kanonisk start codon. Derfor forekommer RAN-oversættelse i alle tre læserammer i gentagelsen for at producere tre forskellige polypeptider. Hertil kommer, fordi mange gener også producere en antisense udskrift, der indeholder det modsatte supplement af den udvidede gentage sekvens, RAN oversættelse forekommer også i alle tre læserammer af antisense udskrift. Sammen udvider RAN-oversættelsen antallet af proteiner, der er fremstillet af en udvidet repeat-holdige DNA-sekvens fra et peptid til seks peptider. Til dato, RAN oversættelse er blevet observeret i mindst otte forskellige gentage ekspansion lidelser8. RAN peptider er observeret i postmortem patient prøver og kun i tilfælde, hvor patienten bærer en udvidet gentagelse9,10. Mens disse peptider er klart til stede i patientceller, deres bidrag til sygdomspatofysiologi er uklart.
For bedre at definere den potentielle toksicitet forbundet med RAN peptider, flere grupper har udtrykt hvert peptid i forskellige modelsystemer, såsom gær, fluer, mus, og vævkultur celler11,,12,13,14,15,16. I stedet for at udnytte gentagelsessekvensen for udtryk anvender disse modeller en codon-variation-tilgang, hvor gentagelsessekvensen elimineres, men aminosyresekvensen bevares. Oversættelsesinitiering sker gennem en kanonisk ATG, og peptidet smeltes typisk til et fluorescerende protein ved enten N- eller C-endeinus, hvoraf ingen synes at forstyrre RAN peptidtoksicitet. Derfor overudtrykker hver konstruktion et enkelt RAN-peptid. Modellering af de forskellige RAN-produkter i en flercellet organisme med enkle analyser til måling af RAN peptidtoksicitet er af afgørende betydning for at forstå, hvordan de forskellige RAN-produkter fra hver sygdomsfremkaldende gentagne ekspansion bidrager til cellulær dysfunktion og neurodegeneration.
Ligesom andre modelsystemer giver C. elegans en fleksibel og effektiv eksperimentel platform, der muliggør undersøgelser af nye sygdomsmekanismer, såsom RAN peptidtoksicitet. Orme tilbyder flere unikke eksperimentelle egenskaber, der ikke i øjeblikket er tilgængelige i andre modeller af RAN peptid toksicitet. For det første er C. elegans optisk gennemsigtige fra fødslen til døden. Dette giver mulighed for simpel visualisering af RAN peptid udtryk og lokalisering, samt in vivo analyse af neurodegeneration i levende dyr. For det andet er transgene metoder til generering af RAN peptid udtryksmodeller billige og hurtige. I betragtning af C. eleganskorte tre-dages livscyklus kan stabile transgene linjer, der udtrykker et givet RAN-peptid på en celletypespecifik måde, fremstilles på under en uge. For det tredje kan simple fænotypiske output kombineres med genetiske screeningsmetoder, såsom kemisk mutagenese eller RNAi-screening, for hurtigt at identificere gener, der er afgørende for RAN-peptidtoksicitet. Endelig, den korte levetid af C. elegans (~ 20 dage) giver efterforskere til at bestemme, hvordan aldring, som er den største risikofaktor for de fleste gentage ekspansion sygdomme, påvirker RAN peptid toksicitet. Sammen er denne kombination af eksperimentelle egenskaber uovertruffen i ethvert andet modelsystem og tilbyder en kraftfuld platform for studiet af RAN peptid toksicitet.
Her beskriver vi flere analyser, der udnytter de eksperimentelle fordele ved C. elegans til at måle toksiciteten af RAN peptider og til at identificere genetiske modifikater af denne toksicitet. Den codon-varierede ATG-initierede RAN peptider er mærket med GFP og udtrykt individuelt i enten muskelceller under myo-3 promotor eller i GABAergic motor neuroner under unc-47 promotor. For udtryk i muskelceller er det vigtigt, at giftige RAN peptider er mærket med grønt fluorescerende protein (GFP), eller andre fluorescerende protein (FP) tag, der kan målrettes med en RNAi fodring vektor. Dette skyldes, at giftige RAN peptid udtryk normalt blokerer vækst, rendering sådanne stammer ikke-levedygtige. Brugen af gfp(RNAi) inaktiverer REGEL peptidudtryk på betinget vis og tillader stammevedligeholdelse, genetiske kors osv. For analyser fjernes disse dyr fra gfp(RNAi),som gør det muligt at udtrykke RAN-peptidet og de deraf følgende fænotyper. Ud over den molekylære strategi for design codon-varieret RAN peptid udtryk konstruktioner, beskriver vi analyser til måling af udviklingsmæssige toksicitet (larve motilitet og vækst analyse), post-udviklingsmæssige alder-associeret toksicitet (lammelse assay), og neuron morfologiske defekter (commissure assay).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>35mm x 10mm Petri Dish, Sterile</td>
			<td>CELLTREAT Scientific Products</td>
			<td>50-202-036</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AGAR GRANULATED 2KILOGRAM</td>
			<td>BD DIAGNOSTIC SYSTEMS</td>
			<td>DF0145070</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AGAROSE ULTRAPURE</td>
			<td>LIFE TECHNOLOGIES</td>
			<td>16500500</td>
			<td>Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CARBENICILLIN 5G</td>
			<td>THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS</td>
			<td>BP26485</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COVER GLASSES NO 1 22MM 1OZ/PK</td>
			<td>THERMO SCI ERIE</td>
			<td>12542B</td>
			<td>Imaging for commissure assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FEMOTIPS DISPSBL MICROINJ 20CS</td>
			<td>EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS</td>
			<td>E5242952008</td>
			<td>Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FF COV GLASS NO1 40X22MM 1OZPK</td>
			<td>THERMO SCI ERIE</td>
			<td>125485C</td>
			<td>Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>THERMO SCI ERIE</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td>Imaging for commissure assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;Bacto Peptone&#160;</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>DF0118-17-0</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HALOCARBON OIL 700</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH INC</td>
			<td>H8898-50ML</td>
			<td>Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG BIOTECH 10G</td>
			<td>THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS</td>
			<td>BP162010</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Advanced Fluorescence imaging software</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>LAS-AF</td>
			<td>Image acquisition software for video speed analysis and commissure assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Immersion type N (Oil)</td>
			<td>W NUHSBAUM INC</td>
			<td>NC9547002</td>
			<td>Imaging for commissure assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEVAMISOLE HYDROCHLORIDE 10GR</td>
			<td>THERMO SCI ACROS ORGANICS</td>
			<td>AC187870100</td>
			<td>Imaging for commissure assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROLOADER TIPS 2 X 96 PCS</td>
			<td>EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS</td>
			<td>E5242956003</td>
			<td>Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			PETRI DISH, 60X15MM,500/CS</td>
			<td>CORNING LIFE SCIENCES PLASTIC</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TISSUE CULT PLATE 24WEL 50/CS</td>
			<td>CORNING LIFE SCIENCES DL</td>
			<td>87721</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring ran peptide toxicity in c. elegans

C. elegans er almindeligt anvendt til at modellere aldersrelaterede neurodegenerative sygdomme forårsaget af gentagne ekspansionsmutationer, såsom amyotrofisk lateral sklerose (ALS) og Huntingtons Sygdom. For nylig viste det sig, at gentagne ekspansionsholdige RNA var substratet for en ny type proteinoversættelse kaldet genrelateret ikke-AUG-afhængig (RAN) oversættelse. I modsætning til kanonisk oversættelse kræver RAN-oversættelse ikke en start-codon og forekommer kun, når gentagelser overskrider en tærskellængde. Da der ikke er nogen startfarve til at bestemme læserammen, forekommer RAN-oversættelse i alle læserammer fra både sense- og antisense RNA-skabeloner, der indeholder en gentagelsesudvidelsessekvens. Derfor udvider RAN-oversættelse antallet af mulige sygdomsrelaterede giftige peptider fra en til seks. Hidtil har RAN oversættelse blevet dokumenteret i otte forskellige gentage ekspansion-baserede neurodegenerative og neuromuskulære sygdomme. I hvert tilfælde, dechifrere hvilke RAN produkter er giftige, samt deres mekanismer for toksicitet, er et kritisk skridt i retning af at forstå, hvordan disse peptider bidrager til sygdomspatofysiologi. I dette papir præsenterer vi strategier til at måle toksiciteten af RAN peptider i modelsystemet C. elegans. For det første beskriver vi procedurer til måling af RAN peptid toksicitet på vækst og motilitet af at udvikle C. elegans. For det andet beskriver vi en analyse til måling af postudviklingsmæssige, aldersafhængige virkninger af RAN-peptider på motilitet. Endelig beskriver vi en neurotoksicitetsanalyse til vurdering af virkningerne af RAN-peptider på neuronmorfologi. Disse analyser giver en bred vurdering af RAN peptid toksicitet og kan være nyttige for at udføre store genetiske eller små molekyle skærme til at identificere sygdomsmekanismer eller behandlinger.

Vi brugte de analyser, der er beskrevet her, til at vurdere effekten af forskellige genhæmninger på toksiciteten af RAN-dipeptider, der findes hos ALS-patienter med en G4C 2-gentagelsesudvidelse.2 Ved hjælp af vækstanalysen til at måle udviklingstoksicitet analyserede vi virkningerne af flere genetiske knockoutmutanter identificeret i en genomdækkende RNAi-skærmsuppressorer af muskel-udtrykt PR50-GFP toksicitet. Mens udtryk for PR50-GFP alene resulterede i en fuldstændig penetrant vækst anh...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans at JoVE.com

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Gentagne ikke-ATG-afhængige translationelle produkter er nye patogene træk ved flere gentage ekspansion-baserede sygdomme. Målet med den beskrevne protokol er at evaluere toksicitet forårsaget af disse peptider ved hjælp af adfærdsmæssige og cellulære analyser i modelsystemet C. elegans.

Måling ran peptid toksicitet i C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis ...

RAN-peptider er en funktion i gentagne ekspansionsneurdegenerative lidelser som Huntingtons Sygdom, amyotrofisk lateral sklerose og frontotemporal demens. Disse protokoller giver en vigtig standardiseret tilgang til kvantificering af RAN peptidtoksicitet i C.elegans modelsystem. De beskrevne teknikker er enkle at lære og billige, kan udføres hurtigt, og udnytte reproducerbare funktioner i C.elegans system såsom bevægelse og reproduktion.Når du forsøger denne protokol, den største udfordring er at opnå konsekvent RAN peptid toksicitet og udtryk. De vigtigste faktorer til at kontrollere omfatter narkotika temperatur, timing af temperaturskift og forberedelse af analyseplader. Det er vigtigt for forsøgsbesister til konsekvent at klassificere fænotyper af dyrene i denne aldersafhængige procesanalyse.Visuel demonstration af denne teknik viser deres klassificeringskriterier. Begynd med at hælde standard nematode vækstmed en millimolar IPTG og 25 mikrogram per milliliter carbenicillin i 24-brønd plader. Streak ud RNAi fodring kloner i HT115 bakterier på LB carbenicillin agar og dyrke dem ved 37 grader Celsius i 24 timer.På den næste dag, vælge en enkelt koloni i en milliliter LB carbenicillin flydende medier og dyrke bakterier i 18 timer ved 37 grader Celsius, mens ryster ved 250 rpm. Spot fire individuelle brønde af NGM RNAi 24-brønd plade med 20 mikroliter af natten bakteriekulturer som beskrevet i teksten manuskript og tillade RNAi bakterier til at fremkalde dobbeltstrenget RNA produktion natten over. Brug standardhypochloritmetoden til at isolere æg fra dag ét voksen c.elegans udtrykke den integrerede RAN peptid transgene.Derefter frø omkring 30 æg i hver brønd af 24-brønd plade og inkubere pladen ved 20 grader Celsius i syv dage. For at udføre video hastighed analyse, erhverve to videoer fra to separate brønde for hver RNAi tilstand ved hjælp af et stereo dissekere mikroskop udstyret med en monokrom kamera. Sørg for at bruge ensartede anskaffelsesindstillinger mellem brønde.For hver video skal du indstille varigheden i 10 sekunder og tidsintervallet til 76 millisekunder. Indstil billedeksponeringstiden til fire millisekunder, og brug zoomindstillingen 1,49. Vælg derefter to med to placeringer.Kontroller, at opløsningen er 800 ud af 600 pixel, og begynd at optage. Efter erhvervelse, mærke hver video straks med stammen, RNAi tilstand og godt nummer. Derefter måle den tilbagelagte afstand og længden af hvert dyr for 20 forskellige dyr pr video, undersøge i alt omkring 40 orme for hver RNAi tilstand.Vælg knappen anmærkningsværktøjer i softwaren. Derefter tegner tekstværktøjet. Klik på et punkt i midten af ormen, der måles i det første billede af videoen og markere det med et tal.Fremrykning videoen til slutningen, mens visuelt spore ormen. Klik derefter på det og markere det med det næste tilsvarende nummer. Brug værktøjet til trækningsskala til at tegne en streg fra det første tal til det andet tal og registrere den tilbagelagte distance i et regneark.Gentag denne måling for 19 andre orme i videoen, mens hver enkelt måling bevares i analysevinduet. Når målingerne er afsluttet, skal du tage et øjebliksbillede af den endelige videoramme, der illustrerer alle målelinjerne, således at dataene kan spores tilbage til det dyr, det stammer fra. Derefter skal du analysere dataene ved hjælp af et regneark med fire kolonner, hvor kolonne et er orme-id'et, og kolonne to er hastigheden.Tidspunktet for hver video kan findes ved at højreklikke på videoen under eksperimentet og gå til egenskaberne. For at normalisere hastighedsmålingen skal du finde længden af hvert dyr. Brug tegnepolylinværktøjet til frit at spore C.elegans fra spidsen af hovedet til spidsen af halen.Tag derefter et øjebliksbillede af den endelige videoramme, der illustrerer alle polylinerne. Linjernes længde registreres i henhold til statistikkerne. Føj to kolonner til regnearket, en for dyrs længde og en for normaliseret hastighed.Endelig analysere normaliserede hastighedsdata ved hjælp af en envejs ANOVA med post-hoc test versus tom vektor RNAi. Placer fire til seks transgene L4 C.elegans udtrykke RAN peptid GFP på en seks centimeter GFP RNAi plade og dyrke dem ved 20 grader Celsius. Hvis eksperimentet udnytter RNAi til at teste for genetiske virkninger på RAN-peptidtoksicitet, skal du flytte 10 transgene gravide voksne til hver af to tomme vektor RNAi GFP RNAi eller genspecifikke RNAi-plader.Hvis mutanter anvendes til at analysere genetiske virkninger på RAN-peptidtoksicitet, skal der anvendes 10 personers vilde eller mutante dyr, der udtrykker den samme RAN transgene på hver af to tomme vektor RNAi- eller GFP RNAi-plader. Dyrk dem ved 20 grader Celsius i 48 timer. Pick 10 sæt af 10 transgene L4s fra RNAi plader og placere hvert sæt på en tre centimeter RNAi plade.Sørg for, at de orme, der er udvalgt til analysen, alle har overfladisk normal motilitet. Læg pladerne i en plastikpose for at bevare fugt og inkubere dem ved 25 grader Celsius. Efter 24 timer analyseres dyrene for mobilitet ved at trykke på pladerne på dissekerende mikroskop og kontrollere for bevægelse.Hvis en orm bevæger sig mere end en kropslængde, skal du tælle den som mobil og overføre den til en ny 3 centimeter RNAi-plade. Brug en platin pick til at trykke på de resterende orme på hoved og hale. Hvis dyret bevæger sig mere end en kropslængde, tælle dyret som mobil og overføre det til en ny tre centimeter RNAi plade.Hvis der ikke observeres signifikant lammelse i den tomme vektorkontrol ved dag to, skal analysen afsluttes og starte forfra. Grupper alle ikke-bendem sammen, så bevægelsen af mere end en kropslængde let kan detekteres. Tæl alle lammede, sække, eller døde orme og kassér pladen.Fortsæt med at score dyrene for lammelse hver dag i fem til syv dage. Vækstanalysen blev anvendt til at måle effekten af genhæmninger på toksiciteten af RAN dipeptider, der findes hos ALS-patienter med en G4C2-gentagelsesekspion. Ekspression af PR50 GFP alene resulterede i en fuldstændig vækst anholdelse, men knockdown af flere gener undertrykt udviklingsmæssige toksicitet.Virkningen af specifikke gen knockdowns på udviklingsmæssige motilitet af PR50 udtrykke dyr blev målt ved hjælp af video hastighed analysemetode. Som forventet resulterede hæmning af PR50 GFP-ekspression i en stor stigning i motilitet sammenlignet med tom vektor RNAi. Desuden resulterede RNAi mod proteasom underenhed RPN7 i en betydelig stigning i PR50 motilitet.Når voksne fænotyper blev analyseret med aldersafhængig lammelse assay, PR50 GFP udstillet op til 80% lammelse ved fem dage. Men RNAi rettet mod genet cul-6 betydeligt forsinket lammelse tyder på, at cul-6 er nødvendig for PR50 GFP toksicitet. For at afgøre, om RAN proteiner forårsage neuropatologi, når udtrykt i C.elegans neuroner, neuron-specifikke toksicitet blev undersøgt ved hjælp af commissure assay.I dag to voksne, PR50 GFP udtryk i motoriske neuroner førte til en betydelig stigning i motor neuron blebbing. Denne neuropatologi blev betydeligt undertrykt af en mutation i insulin IGF receptor genet homolog DAF-2, som forsinker de toksiske egenskaber af flere neurodegenerative proteiner. For den adfærdsmæssige analyse, er det vigtigt, at RAN peptider producere en meget gennemtrængende fænotype.Sådanne gener eller lægemidler kan give nye biomarkører eller terapeutiske muligheder for RAN peptid sygdomme. Ved hjælp af disse analyser, vi har udført en genom-dækkende RNAi skærm for suppressors af C9ORF72 tilhørende RAN peptid proline-arginin. Gener identificeret i denne skærm omfatter mange nye og bevarede gener, der vil blive genstand for fremtidige mekanistiske undersøgelser.

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi screening for at identificere Postembryonic fænotyper i C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles

Måling peptid translokation i store Unilamellar Vesikler

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1.  Many of these are referred ...

C. elegans Chemotaxis Assay

C. elegans Chemotaxis Assay

C. elegans Kemotaksi Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

Antistoffarvning i<em&gt; C. Elegans</em&gt; Brug af &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

Måling Effekter af bakterier på<em&gt; C. Elegans</em&gt; Behavior Ved hjælp af en Egg Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

En Anoxia-sult Model for iskæmi / reperfusion i<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Metoder til Hud sårbarhed og Analyser for Wound Svar i<em&gt; C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...