Name: measuring ran peptide toxicity in c. elegans
Uploaded: 2020-04-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans at JoVE.com

NIH R21NS107797

1. Het genereren van codon-gevarieerde RAN peptide expressie constructies
<ol><li>Ontwerp de individuele RAN peptide codering sequentie met behulp van synoniem codons om de fundamentele repetitieve DNA / RNA-structuur te elimineren, maar het behoud van de bovenliggende aminozuur sequentie.</li>
	<li>Bestel de aangepaste codon sequenties commercieel op de herhalingslengtes die nodig zijn voor de studies (meestal 5-100 herhalingen). Neem een HindIII-beperkingssite op aan het einde van 5 en een BamHI-beperkingssite aan he...

<ol>
	<li>Cleary, J. D., Ranum, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeat+associated+non-ATG+(RAN)+translation:+new+starts+in+microsatellite+expansion+disorders.">Repeat associated non-ATG (RAN) translation: new starts in microsatellite expansion disorders.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 26, 6-15 (2014).</li><li>The Huntington's Disease Collaborative Research Group. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+gene+containing+a+trinucleotide+repeat+that+is+expanded+and+unstable+on+Huntington's+disease+chromosomes.">A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes.</a> Cell. 72 (6), 971-983 (1993).</li><li>Scherzinger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntingtin-encoded+polyglutamine+expansions+form+amyloid-like+protein+aggregates+in+vitro+and+in+vivo.">Huntingtin-encoded polyglutamine expansions form amyloid-like protein aggregates in vitro and in vivo.</a> Cell. 90 (3), 549-558 (1997).</li><li>Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+threshold+for+polyglutamine-expansion+protein+aggregation+and+cellular+toxicity+is+dynamic+and+influenced+by+aging+in+Caenorhabditis+elegans.">The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99 (16), 10417-10422 (2002).</li><li>Genetic Modifiers of Huntington's Disease Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electronic+address,+g.+h.+m.+h.+e.,+Genetic+Modifiers+of+Huntington's+Disease,+C.+CAG+Repeat+Not+Polyglutamine+Length+Determines+Timing+of+Huntington's+Disease+Onset.">Electronic address, g. h. m. h. e., Genetic Modifiers of Huntington's Disease, C. CAG Repeat Not Polyglutamine Length Determines Timing of Huntington's Disease Onset.</a> Cell. 178 (4), 887-900 (2019).</li><li>Wright, G. E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Length+of+Uninterrupted+CAG,+Independent+of+Polyglutamine+Size,+Results+in+Increased+Somatic+Instability,+Hastening+Onset+of+Huntington+Disease.">Length of Uninterrupted CAG, Independent of Polyglutamine Size, Results in Increased Somatic Instability, Hastening Onset of Huntington Disease.</a> American Journal of Human Genetics. 104 (6), 1116-1126 (2019).</li><li>Cleary, J. D., Ranum, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeat-associated+non-ATG+(RAN)+translation+in+neurological+disease.">Repeat-associated non-ATG (RAN) translation in neurological disease.</a> Human Molecular Genetics. 22 (1), 45-51 (2013).</li><li>Banez-Coronel, M., Ranum, L. P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeat-associated+non-AUG+(RAN)+translation:+insights+from+pathology.">Repeat-associated non-AUG (RAN) translation: insights from pathology.</a> Laboratory Investigation. 99 (7), 929-942 (2019).</li><li>Banez-Coronel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAN+Translation+in+Huntington+Disease.">RAN Translation in Huntington Disease.</a> Neuron. 88 (4), 667-677 (2015).</li><li>Ash, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unconventional+translation+of+C9ORF72+GGGGCC+expansion+generates+insoluble+polypeptides+specific+to+c9FTD/ALS.">Unconventional translation of C9ORF72 GGGGCC expansion generates insoluble polypeptides specific to c9FTD/ALS.</a> Neuron. 77 (4), 639-646 (2013).</li><li>Kramer, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+screens+in+human+cells+and+primary+neurons+identify+modifiers+of+C9ORF72+dipeptide-repeat-protein+toxicity.">CRISPR-Cas9 screens in human cells and primary neurons identify modifiers of C9ORF72 dipeptide-repeat-protein toxicity.</a> Nature Genetics. 50 (4), 603-612 (2018).</li><li>Boeynaems, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+screen+connects+nuclear+transport+genes+to+DPR+pathology+in+c9ALS/FTD.">Drosophila screen connects nuclear transport genes to DPR pathology in c9ALS/FTD.</a> Scientific Reports. 6, 20877 (2016).</li><li>Jovicic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modifiers+of+C9orf72+dipeptide+repeat+toxicity+connect+nucleocytoplasmic+transport+defects+to+FTD/ALS.">Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS.</a> Nature Neuroscience. 18 (9), 1226-1229 (2015).</li><li>Boeynaems, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+Separation+of+C9orf72+Dipeptide+Repeats+Perturbs+Stress+Granule+Dynamics.">Phase Separation of C9orf72 Dipeptide Repeats Perturbs Stress Granule Dynamics.</a> Molecular Cell. 65 (6), 1044-1055 (2017).</li><li>Lee, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C9orf72+Dipeptide+Repeats+Impair+the+Assembly,+Dynamics,+and+Function+of+Membrane-Less+Organelles.">C9orf72 Dipeptide Repeats Impair the Assembly, Dynamics, and Function of Membrane-Less Organelles.</a> Cell. 167 (3), 717-788 (2016).</li><li>Hao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+dysfunction+and+neurodegeneration+in+a+C9orf72+mouse+line+expressing+poly-PR.">Motor dysfunction and neurodegeneration in a C9orf72 mouse line expressing poly-PR.</a> Nature Communications. 10 (1), 2906 (2019).</li><li>Scior, A., Preissler, S., Koch, M., Deuerling, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+PCR-free+engineering+of+highly+repetitive+DNA+sequences.">Directed PCR-free engineering of highly repetitive DNA sequences.</a> BMC Biotechnology. 11, 87 (2011).</li><li>Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+transformation.">DNA transformation.</a> Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).</li><li>Rudich, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+localized+C9orf72-associated+arginine-containing+dipeptides+exhibit+age-dependent+toxicity+in+C.+elegans.">Nuclear localized C9orf72-associated arginine-containing dipeptides exhibit age-dependent toxicity in C. elegans.</a> Human Molecular Genetics. 26 (24), 4916-4928 (2017).</li><li>Gidalevitz, T., Krupinski, T., Garcia, S., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Destabilizing+protein+polymorphisms+in+the+genetic+background+direct+phenotypic+expression+of+mutant+SOD1+toxicity.">Destabilizing protein polymorphisms in the genetic background direct phenotypic expression of mutant SOD1 toxicity.</a> PLoS Genetics. 5 (3), 1000399 (2009).</li><li>Nollen, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNA+interference+screen+identifies+previously+undescribed+regulators+of+polyglutamine+aggregation.">Genome-wide RNA interference screen identifies previously undescribed regulators of polyglutamine aggregation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 101 (17), 6403-6408 (2004).</li><li>Satyal, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyglutamine+aggregates+alter+protein+folding+homeostasis+in+Caenorhabditis+elegans.">Polyglutamine aggregates alter protein folding homeostasis in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (11), 5750-5755 (2000).</li><li>Boccitto, M., Lamitina, T., Kalb, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Daf-2+signaling+modifies+mutant+SOD1+toxicity+in+C.+elegans.">Daf-2 signaling modifies mutant SOD1 toxicity in C. elegans.</a> PLoS One. 7 (3), 33494 (2012).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C9orf72+BAC+Mouse+Model+with+Motor+Deficits+and+Neurodegenerative+Features+of+ALS/FTD.">C9orf72 BAC Mouse Model with Motor Deficits and Neurodegenerative Features of ALS/FTD.</a> Neuron. 90 (3), 521-534 (2016).</li><li>Peters, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+C9ORF72+Hexanucleotide+Expansion+Reproduces+RNA+Foci+and+Dipeptide+Repeat+Proteins+but+Not+Neurodegeneration+in+BAC+Transgenic+Mice.">Human C9ORF72 Hexanucleotide Expansion Reproduces RNA Foci and Dipeptide Repeat Proteins but Not Neurodegeneration in BAC Transgenic Mice.</a> Neuron. 88 (5), 902-909 (2015).</li><li>O'Rourke, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C9orf72+BAC+Transgenic+Mice+Display+Typical+Pathologic+Features+of+ALS/FTD.">C9orf72 BAC Transgenic Mice Display Typical Pathologic Features of ALS/FTD.</a> Neuron. 88 (5), 892-901 (2015).</li><li>Mizielinska, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C9orf72+repeat+expansions+cause+neurodegeneration+in+Drosophila+through+arginine-rich+proteins.">C9orf72 repeat expansions cause neurodegeneration in Drosophila through arginine-rich proteins.</a> Science. 345 (6201), 1192-1194 (2014).</li><li>Krajacic, P., Shen, X., Purohit, P. K., Arratia, P., Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanical+profiling+of+Caenorhabditis+elegans+motility.">Biomechanical profiling of Caenorhabditis elegans motility.</a> Genetics. 191 (3), 1015-1021 (2012).</li><li>Zhang, L., Ward, J. D., Cheng, Z., Dernburg, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+auxin-inducible+degradation+(AID)+system+enables+versatile+conditional+protein+depletion+in+C.+elegans.">The auxin-inducible degradation (AID) system enables versatile conditional protein depletion in C. elegans.</a> Development. 142 (24), 4374-4384 (2015).</li></ol>

Hier rapporteren we methoden die kunnen worden gebruikt om RAN peptide toxiciteit gemodelleerd in de spier of in de neuronen van C. elegansassay. Terwijl neurodegeneratieve eiwitten een leeftijd begin fenotype bij menselijke patiënten hebben, kunnen ze ook ontwikkelingstoxiciteit vertonen wanneer overuitgedrukt in modelsystemen. Overexpressie heeft aanzienlijke interpretatieve beperkingen, maar het biedt ook een krachtig uitgangspunt voor genetische of farmacologische schermen gericht op het identificeren van g...

De ongepaste uitbreiding van DNA-herhalingssequenties is de genetische basis voor verschillende neurodegeneratieve ziekten zoals amyotrofische laterale sclerose (ALS), frontotemporale dementie (FTD) en de ziekte van Huntington (ZvH)1. Hoewel er gevestigde cellulaire en dierlijke modellen voor deze ziekten, mechanismen die ten grondslag liggen aan deze voorwaarden zijn niet goed gedefinieerd. De ZvH wordt bijvoorbeeld veroorzaakt door de uitbreidingen van een CAG herhalingssequentie in de coderingssequentie voor het Huntingtine eiwit Htt2. Omdat CAG codeert het aminozuur glutamine, de CAG herhalen expansie resulteert in het inbrengen van een polyGlutamine, of polyQ, sequentie binnen Htt. Uitgebreide polyQ eiwitten vormen lengte- en leeftijdsafhankelijke eiwitaggregaten die worden geassocieerd met toxiciteit3,4. Verrassend genoeg suggereren twee recente studies dat de lengte van de polyQ-sequentie niet de belangrijkste drijfveer is voor het begin van de ZvH ziekte, wat suggereert dat polyQ-onafhankelijke factoren ook kunnen bijdragen aan de ziekte5,6.
Een mogelijk polyQ-onafhankelijk mechanisme betreft een nieuw ontdekt type eiwitvertaling dat Repeat Associated Non-AUG-dependent (RAN) vertaling7wordt genoemd. Zoals de naam al aangeeft, ran vertaling treedt alleen op wanneer een uitgebreide herhaling sein en vereist geen canonieke start codon. Daarom vindt RAN-vertaling plaats in alle drie de leesframes van de herhaling om drie verschillende polypeptiden te produceren. Bovendien, omdat veel genen ook een antisense transcript produceren dat de omgekeerde aanvulling van de uitgebreide herhalingssequentie bevat, komt RAN-vertaling ook voor in alle drie de leesframes van het antisense transcript. Samen breidt RAN-vertaling het aantal eiwitten uit dat wordt geproduceerd uit een uitgebreide herhalende DNA-sequentie van één peptide naar zes peptiden. Tot op heden is ran-vertaling waargenomen in ten minste acht verschillende herhalingsstoornissen8. RAN peptiden worden waargenomen in postmortem patiënt monsters en alleen in gevallen waarin de patiënt draagt een uitgebreide herhaling9,10. Hoewel deze peptiden duidelijk aanwezig zijn in patiëntencellen, is hun bijdrage aan de pathofysiologie van de ziekte onduidelijk.
Om de potentiële toxiciteit in verband met RAN peptiden beter te definiëren, hebben verschillende groepen elk peptide uitgedrukt in verschillende modelsystemen, zoals gist, vliegen, muizen en weefselkweekcellen11,12,,13,14,15,16. In plaats van gebruik te maken van de herhalingsvolgorde voor expressie, maken deze modellen gebruik van een codon-variatie benadering waarbij de herhalingssequentie wordt geëlimineerd, maar de aminozuursequentie behouden blijft. Vertaling initiatie vindt plaats via een canonieke ATG en het peptide is meestal gesmolten tot een fluorescerend eiwit op ofwel de N- of C-eindpunt, geen van beide lijkt te interfereren met RAN peptide toxiciteit. Daarom drukt elke constructie een enkel RAN-peptide uit. Het modelleren van de verschillende RAN-producten in een meercellig organisme met eenvoudige tests om ran peptide toxiciteit te meten is van vitaal belang om te begrijpen hoe de verschillende RAN-producten van elke ziekte-veroorzakende herhaalde expansie bijdragen aan cellulaire disfunctie en neurodegeneratie.
Net als andere modelsystemen biedt C. elegans een flexibel en efficiënt experimenteel platform dat studies van nieuwe ziektemechanismen mogelijk maakt, zoals RAN peptide toxiciteit. Wormen bieden verschillende unieke experimentele attributen die momenteel niet beschikbaar zijn in andere modellen van RAN peptide toxiciteit. Ten eerste, C. elegans zijn optisch transparant vanaf de geboorte tot de dood. Dit zorgt voor eenvoudige visualisatie van RAN peptide expressie en lokalisatie, evenals in vivo analyse van neurodegeneratie bij levende dieren. Ten tweede, transgene methoden voor het genereren van RAN peptide expressie modellen zijn goedkoop en snel. Gezien de korte driedaagse levenscyclus van C. elegans,kunnen stabiele transgene lijnen die een bepaald RAN-peptide op een celtypespecifieke manier uitdrukken, in minder dan een week worden geproduceerd. Ten derde kunnen eenvoudige fenotypische uitgangen worden gecombineerd met genetische screeningsmethoden, zoals chemische mutagenese of RNAi-screening, om snel genen te identificeren die essentieel zijn voor ran peptidetoxiciteit. Tot slot, de korte levensduur van C. elegans (~ 20 dagen) stelt onderzoekers in staat om te bepalen hoe veroudering, dat is de grootste risicofactor voor de meeste herhalen expansieziekten, ran peptide toxiciteit beïnvloedt. Samen is deze combinatie van experimentele kenmerken ongeëvenaard in elk ander modelsysteem en biedt een krachtig platform voor de studie van RAN peptide toxiciteit.
Hier beschrijven we verschillende tests die gebruik maken van de experimentele voordelen van C. elegans om de toxiciteit van RAN peptiden te meten en om genetische modifiers van deze toxiciteit te identificeren. De codon-gevarieerde ATG-geïnitieerde RAN peptiden zijn gelabeld met GFP en individueel uitgedrukt in ofwel spiercellen onder de myo-3 promotor of in GABAergic motorneuronen onder de unc-47 promotor. Voor expressie in spiercellen is het belangrijk dat giftige RAN peptiden worden gelabeld met groene fluorescerende eiwitten (GFP), of andere fluorescerende eiwit (FP) tag die kan worden gericht met een RNAi voedingsvector. Dit komt omdat giftige RAN peptide expressie meestal blokkeert de groei, waardoor dergelijke stammen niet levensvatbaar. Het gebruik van gfp(RNAi) activeert voorwaardelijk RAN peptide expressie en maakt stam onderhoud, genetische kruisen, enz. Voor tests worden deze dieren verwijderd uit gfp(RNAi),waardoor het RAN peptide en de resulterende fenotypes kunnen worden expressie. Naast de moleculaire strategie voor het ontwerpen van codon-gevarieerde RAN peptide expressie constructies, beschrijven we assays voor het meten van ontwikkelingstoxiciteit (larval beweeglijkheid en groei test), post-ontwikkelingsleeftijd-geassocieerde toxiciteit (verlamming assay), en neuron morfologische gebreken (commissure assay).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>35mm x 10mm Petri Dish, Sterile</td>
			<td>CELLTREAT Scientific Products</td>
			<td>50-202-036</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AGAR GRANULATED 2KILOGRAM</td>
			<td>BD DIAGNOSTIC SYSTEMS</td>
			<td>DF0145070</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AGAROSE ULTRAPURE</td>
			<td>LIFE TECHNOLOGIES</td>
			<td>16500500</td>
			<td>Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CARBENICILLIN 5G</td>
			<td>THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS</td>
			<td>BP26485</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COVER GLASSES NO 1 22MM 1OZ/PK</td>
			<td>THERMO SCI ERIE</td>
			<td>12542B</td>
			<td>Imaging for commissure assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FEMOTIPS DISPSBL MICROINJ 20CS</td>
			<td>EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS</td>
			<td>E5242952008</td>
			<td>Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FF COV GLASS NO1 40X22MM 1OZPK</td>
			<td>THERMO SCI ERIE</td>
			<td>125485C</td>
			<td>Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>THERMO SCI ERIE</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td>Imaging for commissure assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;Bacto Peptone&#160;</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>DF0118-17-0</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HALOCARBON OIL 700</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH INC</td>
			<td>H8898-50ML</td>
			<td>Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG BIOTECH 10G</td>
			<td>THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS</td>
			<td>BP162010</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Advanced Fluorescence imaging software</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>LAS-AF</td>
			<td>Image acquisition software for video speed analysis and commissure assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Immersion type N (Oil)</td>
			<td>W NUHSBAUM INC</td>
			<td>NC9547002</td>
			<td>Imaging for commissure assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEVAMISOLE HYDROCHLORIDE 10GR</td>
			<td>THERMO SCI ACROS ORGANICS</td>
			<td>AC187870100</td>
			<td>Imaging for commissure assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROLOADER TIPS 2 X 96 PCS</td>
			<td>EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS</td>
			<td>E5242956003</td>
			<td>Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			PETRI DISH, 60X15MM,500/CS</td>
			<td>CORNING LIFE SCIENCES PLASTIC</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TISSUE CULT PLATE 24WEL 50/CS</td>
			<td>CORNING LIFE SCIENCES DL</td>
			<td>87721</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring ran peptide toxicity in c. elegans

C. elegans wordt vaak gebruikt voor het modelleren van leeftijdsgebonden neurodegeneratieve ziekten veroorzaakt door herhaalde expansiemutaties, zoals Amyotrofische Laterale Sclerose (ALS) en de ziekte van Huntington. Onlangs werd aangetoond dat herhaald expansiebevattend RNA het substraat is voor een nieuw type eiwitvertaling dat herhaal-geassocieerde niet-AUG-afhankelijke (RAN)-vertaling wordt genoemd. In tegenstelling tot canonieke vertaling vereist RAN-vertaling geen startcodon en treedt alleen op wanneer herhalingen een drempellengte overschrijden. Omdat er geen begincodon is om het leeskader te bepalen, vindt RAN-vertaling plaats in alle leesframes van zowel sense- als antisense RNA-sjablonen die een herhalingsuitbreidingsreeks bevatten. Daarom breidt RAN-vertaling het aantal mogelijke ziektegerelateerde toxische peptiden uit van één naar zes. Tot nu toe is ran vertaling gedocumenteerd in acht verschillende repeat expansion-based neurodegeneratieve en neuromusculaire ziekten. In elk geval is het ontcijferen van welke RAN-producten giftig zijn, evenals hun mechanismen van toxiciteit, een cruciale stap in de richting van inzicht in hoe deze peptiden bijdragen aan de pathofysiologie van de ziekte. In dit artikel presenteren we strategieën om de toxiciteit van RAN peptiden in het modelsysteem C. elegans te meten. Ten eerste beschrijven we procedures voor het meten van RAN peptide toxiciteit op de groei en beweeglijkheid van het ontwikkelen van C. elegans. Ten tweede detaileren we een test voor het meten van postontwikkelings-, leeftijdsafhankelijke effecten van RAN peptiden op beweeglijkheid. Ten slotte beschrijven we een neurotoxiciteitstest voor het evalueren van de effecten van RAN-peptiden op neuron morfologie. Deze tests bieden een brede beoordeling van ran peptide toxiciteit en kan nuttig zijn voor het uitvoeren van grootschalige genetische of kleine molecuul schermen om ziekte mechanismen of therapieën te identificeren.

We gebruikten de hier beschreven tests om het effect van verschillende genremmingen op de toxiciteit van RAN-dipeptiden te evalueren die worden aangetroffen bij ALS-patiënten met een herhaalexpansie van G4C2. Met behulp van de groeitest om ontwikkelingstoxiciteit te meten, analyseerden we de effecten van verschillende genetische knock-out mutanten die werden geïdentificeerd in een genoombrede RNAi-schermsuppressors van pr50-GFP-toxiciteit met spieruitgedrukt. Terwijl de expressie van PR50-GFP alle...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans at JoVE.com

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Herhaal-geassocieerde niet-ATG-afhankelijke translationele producten zijn opkomende pathogene kenmerken van verschillende herhaalde expansie-gebaseerde ziekten. Het doel van het beschreven protocol is om toxiciteit veroorzaakt door deze peptiden te evalueren met behulp van gedrags-en cellulaire testen in het modelsysteem C. elegans.

Meten RAN Peptide Toxiciteit in C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis ...

RAN peptiden zijn een kenmerk van herhaalde expansie neurodegeneratieve aandoeningen zoals de ZvH, amyotrofische laterale sclerose en frontotemporale dementie. Deze protocollen bieden een belangrijke gestandaardiseerde aanpak voor het kwantificeren van RAN peptide toxiciteit in de C.elegans model systeem. De beschreven technieken zijn eenvoudig te leren en goedkoop, kunnen snel worden uitgevoerd en maken gebruik van de reproduceerbare kenmerken van het C.elegans-systeem, zoals beweging en reproductie.Bij een poging dit protocol, de grootste uitdaging is het verkrijgen van consistente RAN peptide toxiciteit en expressie. De belangrijkste factoren om de temperatuur van geneesmiddelen te controleren, zijn de temperatuur van de temperatuur, de timing van temperatuurverschuivingen en de bereiding van testplaten. Het is belangrijk voor onderzoekers om de fenotypen van de dieren in deze leeftijdsafhankelijke procestest consequent te classificeren.Visuele demonstratie van deze techniek toont hun classificatiecriteria. Begin met het gieten van standaard nematode groeimedium met één millimolar IPTG en 25 microgram per milliliter carbenicilline in 24-put platen. Streep RNAi voederen klonen in HT115 bacteriën op LB carbenicillin agar en groeien ze op 37 graden Celsius voor 24 uur.Op de volgende dag, kies een enkele kolonie in een milliliter van LB carbenicillin vloeibare media en groeien de bacteriën voor 18 uur op 37 graden Celsius tijdens het schudden op 250 rpm. Spot vier afzonderlijke putten van de NGM RNAi 24-put plaat met 20 microliter van 's nachts bacteriële culturen zoals beschreven in het tekstmanuscript en laat RNAi-bacteriën 's nachts dubbelstrengde RNA-productie veroorzaken. Gebruik de standaard hypochlorietmethode om eieren te isoleren vanaf dag één volwassen C.elegans die het geïntegreerde RAN peptidetransgene uitdrukken.Dan zaad ongeveer 30 eieren in elke put van de 24-put plaat en broeden de plaat op 20 graden Celsius gedurende zeven dagen. Voor het uitvoeren van video snelheid analyse, verwerven twee video's van twee afzonderlijke putten voor elke RNAi conditie met behulp van een stereo ontleden microscoop uitgerust met een monochrome camera. Zorg ervoor dat u consistente acquisitie-instellingen tussen putten gebruikt.Stel voor elke video de duur in voor 10 seconden en het tijdsinterval op 76 milliseconden. Stel de belichtingstijd van de afbeelding in op vier milliseconden en gebruik de zoominstelling 1,49. Selecteer er vervolgens twee bij twee binning.Controleer of de resolutie 800 bij 600 pixels is en begin met opnemen. Na de overname, label elke video onmiddellijk met de stam, RNAi conditie en goed nummer. Meet vervolgens de afgelegde afstand en de lengte van elk dier voor 20 verschillende dieren per video, waarbij in totaal ongeveer 40 wormen voor elke RNAi-toestand worden onderzocht.Selecteer in de software de knop annotatiegereedschappen. Vervolgens het gereedschap Tekst tekenen. Klik op een punt in het midden van de worm wordt gemeten in het eerste frame van de video en markeer het met een nummer.Ga de video naar het einde terwijl je de worm visueel volgt. Klik er vervolgens op en markeer het met het volgende overeenkomstige nummer. Gebruik het gereedschap Tekenschaalbalk om een lijn te tekenen van het eerste getal naar het tweede getal en de afgelegde afstand in een spreadsheet vast te leggen.Herhaal deze meting voor 19 andere wormen in de video met behoud van elke individuele meting in het analysevenster. Zodra de metingen zijn voltooid, neemt u een momentopname van het uiteindelijke videoframe dat alle meetlijnen illustreert, zodat de gegevens kunnen worden herleid tot het dier waaruit het afkomstig is. Analyseer vervolgens de gegevens met behulp van een spreadsheet met vier kolommen waarin kolom één de worm-id is en kolom twee de snelheid is.De tijd van elke video kan worden gevonden door met de rechtermuisknop op de video onder het experiment te klikken en naar de eigenschappen te gaan. Om de snelheidsmeting te normaliseren, vindt u de lengte van elk dier. Gebruik het trekpolylinegereedschap om de C.elegans vrij te traceren vanaf het puntje van het hoofd tot het puntje van de staart.Maak vervolgens een momentopname van het uiteindelijke videoframe dat alle polylijnen illustreert. De lengte van de lijnen wordt geregistreerd onder de statistieken. Voeg twee kolommen toe aan de spreadsheet, een voor dierlengte en een voor genormaliseerde snelheid.Ten slotte, analyseren van de genormaliseerde snelheid gegevens met behulp van een one-way ANOVA met post-hoc testen versus lege vector RNAi. Plaats vier tot zes transgene L4 C.elegans uitdrukken RAN peptide GFP op een zes centimeter GFP RNAi plaat en groeien ze op 20 graden Celsius. Als het experiment RNAi gebruikt om te testen op genetische effecten op RAN peptide toxiciteit, verplaats dan 10 transgene gravid volwassenen naar elk van de twee lege vector RNAi GFP RNAi of gen-specifieke RNAi platen.Als mutanten worden gebruikt om genetische effecten op RAN peptide toxiciteit te analyseren, plaats 10 gravid wild type of mutant dieren uitdrukken van dezelfde RAN transgene op elk van de twee lege vector RNAi of GFP RNAi platen. Laat ze 48 uur lang groeien op 20 graden Celsius. Kies 10 sets van 10 transgene L4's uit de RNAi-platen en plaats elke set op een RNAi-plaat van drie centimeter.Zorg ervoor dat de wormen geselecteerd voor de test hebben allemaal oppervlakkig normale beweeglijkheid. Plaats de platen in een plastic zak om vocht vast te houden en uit te broeden op 25 graden Celsius. Na 24 uur, analyseren van de dieren voor mobiliteit door te tikken op de platen op de ontleden microscoop en controleren op beweging.Als een worm meer beweegt dan een lichaamslengte, tel het als mobiel en breng het naar een nieuwe drie centimeter RNAi plaat. Gebruik een platina pick om de resterende wormen op de kop en staart te tikken. Als het dier meer dan een lichaamslengte beweegt, tel het dier als mobiel en breng het over naar een nieuwe drie centimeter RNAi-plaat.Als significante verlamming niet wordt waargenomen in de lege vectorcontrole op dag twee, beëindigt u de test en begint u opnieuw. Groep alle niet-bewegende wormen samen, zodat de beweging van meer dan een lichaamslengte gemakkelijk kan worden gedetecteerd. Tel alle verlamde, inzakkende of dode wormen en gooi de plaat weg.Blijf de dieren vijf tot zeven dagen elke dag voor verlamming scoren. De groeitest werd gebruikt om het effect van genremmingen op de toxiciteit van RAN-diptiden te meten die worden gevonden bij ALS-patiënten met een G4C2-herhalingsuitbreiding. Expressie van PR50 GFP alleen resulteerde in een volledige groei arrestatie, maar knockdown van verschillende genen onderdrukt de ontwikkelingstoxiciteit.Het effect van specifieke gen knockdowns op de ontwikkelingsmotiliteit van PR50 uitdrukken van dieren werd gemeten met behulp van de video snelheid analyse methode. Zoals verwacht, remming van PR50 GFP expressie resulteerde in een grote toename van de beweeglijkheid in vergelijking met lege vector RNAi. Bovendien resulteerde de RNAi tegen de proteasoom subunit RPN7 in de aanzienlijke toename van pr50 beweeglijkheid.Toen volwassen fenotypes werden geanalyseerd met de leeftijdsafhankelijke verlammingstest, vertoonde PR50 GFP tot 80% verlamming door vijf dagen oud. Echter, RNAi gericht op het gen cul-6 aanzienlijk vertraagde verlamming suggereert dat cul-6 nodig is voor PR50 GFP toxiciteit. Om te bepalen of RAN-eiwitten neuropathologie veroorzaken wanneer ze worden uitgedrukt in C.elegans-neuronen, werd neuronspecifieke toxiciteit onderzocht met behulp van de commissure-test.In dag twee volwassenen, PR50 GFP expressie in de motorneuronen leidde tot een aanzienlijke toename van de motorische neuron blebbing. Deze neuropathologie werd aanzienlijk onderdrukt door een mutatie in het insuline IGF receptor gen homolog DAF-2 die de toxische eigenschappen van verschillende neurodegeneratieve eiwitten vertraagt. Voor de gedragstest is het belangrijk dat de RAN peptiden een zeer penetrerend fenotype produceren.Dergelijke genen of geneesmiddelen kunnen nieuwe biomarkers of therapeutische opties voor RAN peptide ziekten. Met behulp van deze testen hebben we een genoombreed RNAi-scherm uitgevoerd voor suppressors van de C9ORF72 geassocieerde RAN peptide proline-arginine. Genen geïdentificeerd in dit scherm bevatten veel nieuwe en geconserveerde genen die het onderwerp zullen zijn van toekomstige mechanistische studies.

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Generatie van Stable transgene C. elegans Met behulp van micro-injectie

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generatie van transgene C. elegans Door biolistische Transformatie

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Het meten van Caenorhabditis elegans Levensduur in 96 Well microtiterplaten

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi screening Postembryonic fenotypes Leg in C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles

Het meten van Peptide Translocatie in grote unilamellaire Blaasjes

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1.  Many of these are referred ...

C. elegans Chemotaxis Assay

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

Antilichaamkleuring in<em&gt; C. Elegans</em&gt; Een &#39;Freeze-Cracking &quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

Het meten van de effecten van bacteriën op<em&gt; C. Elegans</em&gt; Gedrag Met behulp van een Ei Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Een Anoxia-verhongering Model voor ischemie / reperfusie in<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Methoden voor de huid De verwondingen en Testen voor Wond Reacties in<em&gt; C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...