Name: measuring ran peptide toxicity in c. elegans
Uploaded: 2020-04-30T15:00:00
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NIH R21NS107797

1. Génération de constructions d’expression de peptide RAN codon-variées
<ol><li>Concevez la séquence individuelle de codage du peptide RAN en utilisant des codons synonymes pour éliminer la structure fondamentale répétitive de l’ADN et de l’ARN, mais préserver la séquence d’acides aminés qui surlyse.</li>
	<li>Commandez les séquences de codon personnalisées commercialement aux durées répétées nécessaires pour les études (généralement 5 à 100 répétitions). Inclure un site de restriction H...

<ol>
	<li>Cleary, J. D., Ranum, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeat+associated+non-ATG+(RAN)+translation:+new+starts+in+microsatellite+expansion+disorders.">Repeat associated non-ATG (RAN) translation: new starts in microsatellite expansion disorders.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 26, 6-15 (2014).</li><li>The Huntington's Disease Collaborative Research Group. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+gene+containing+a+trinucleotide+repeat+that+is+expanded+and+unstable+on+Huntington's+disease+chromosomes.">A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes.</a> Cell. 72 (6), 971-983 (1993).</li><li>Scherzinger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntingtin-encoded+polyglutamine+expansions+form+amyloid-like+protein+aggregates+in+vitro+and+in+vivo.">Huntingtin-encoded polyglutamine expansions form amyloid-like protein aggregates in vitro and in vivo.</a> Cell. 90 (3), 549-558 (1997).</li><li>Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+threshold+for+polyglutamine-expansion+protein+aggregation+and+cellular+toxicity+is+dynamic+and+influenced+by+aging+in+Caenorhabditis+elegans.">The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99 (16), 10417-10422 (2002).</li><li>Genetic Modifiers of Huntington's Disease Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electronic+address,+g.+h.+m.+h.+e.,+Genetic+Modifiers+of+Huntington's+Disease,+C.+CAG+Repeat+Not+Polyglutamine+Length+Determines+Timing+of+Huntington's+Disease+Onset.">Electronic address, g. h. m. h. e., Genetic Modifiers of Huntington's Disease, C. CAG Repeat Not Polyglutamine Length Determines Timing of Huntington's Disease Onset.</a> Cell. 178 (4), 887-900 (2019).</li><li>Wright, G. E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Length+of+Uninterrupted+CAG,+Independent+of+Polyglutamine+Size,+Results+in+Increased+Somatic+Instability,+Hastening+Onset+of+Huntington+Disease.">Length of Uninterrupted CAG, Independent of Polyglutamine Size, Results in Increased Somatic Instability, Hastening Onset of Huntington Disease.</a> American Journal of Human Genetics. 104 (6), 1116-1126 (2019).</li><li>Cleary, J. D., Ranum, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeat-associated+non-ATG+(RAN)+translation+in+neurological+disease.">Repeat-associated non-ATG (RAN) translation in neurological disease.</a> Human Molecular Genetics. 22 (1), 45-51 (2013).</li><li>Banez-Coronel, M., Ranum, L. P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeat-associated+non-AUG+(RAN)+translation:+insights+from+pathology.">Repeat-associated non-AUG (RAN) translation: insights from pathology.</a> Laboratory Investigation. 99 (7), 929-942 (2019).</li><li>Banez-Coronel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAN+Translation+in+Huntington+Disease.">RAN Translation in Huntington Disease.</a> Neuron. 88 (4), 667-677 (2015).</li><li>Ash, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unconventional+translation+of+C9ORF72+GGGGCC+expansion+generates+insoluble+polypeptides+specific+to+c9FTD/ALS.">Unconventional translation of C9ORF72 GGGGCC expansion generates insoluble polypeptides specific to c9FTD/ALS.</a> Neuron. 77 (4), 639-646 (2013).</li><li>Kramer, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+screens+in+human+cells+and+primary+neurons+identify+modifiers+of+C9ORF72+dipeptide-repeat-protein+toxicity.">CRISPR-Cas9 screens in human cells and primary neurons identify modifiers of C9ORF72 dipeptide-repeat-protein toxicity.</a> Nature Genetics. 50 (4), 603-612 (2018).</li><li>Boeynaems, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+screen+connects+nuclear+transport+genes+to+DPR+pathology+in+c9ALS/FTD.">Drosophila screen connects nuclear transport genes to DPR pathology in c9ALS/FTD.</a> Scientific Reports. 6, 20877 (2016).</li><li>Jovicic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modifiers+of+C9orf72+dipeptide+repeat+toxicity+connect+nucleocytoplasmic+transport+defects+to+FTD/ALS.">Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS.</a> Nature Neuroscience. 18 (9), 1226-1229 (2015).</li><li>Boeynaems, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+Separation+of+C9orf72+Dipeptide+Repeats+Perturbs+Stress+Granule+Dynamics.">Phase Separation of C9orf72 Dipeptide Repeats Perturbs Stress Granule Dynamics.</a> Molecular Cell. 65 (6), 1044-1055 (2017).</li><li>Lee, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C9orf72+Dipeptide+Repeats+Impair+the+Assembly,+Dynamics,+and+Function+of+Membrane-Less+Organelles.">C9orf72 Dipeptide Repeats Impair the Assembly, Dynamics, and Function of Membrane-Less Organelles.</a> Cell. 167 (3), 717-788 (2016).</li><li>Hao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+dysfunction+and+neurodegeneration+in+a+C9orf72+mouse+line+expressing+poly-PR.">Motor dysfunction and neurodegeneration in a C9orf72 mouse line expressing poly-PR.</a> Nature Communications. 10 (1), 2906 (2019).</li><li>Scior, A., Preissler, S., Koch, M., Deuerling, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+PCR-free+engineering+of+highly+repetitive+DNA+sequences.">Directed PCR-free engineering of highly repetitive DNA sequences.</a> BMC Biotechnology. 11, 87 (2011).</li><li>Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+transformation.">DNA transformation.</a> Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).</li><li>Rudich, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+localized+C9orf72-associated+arginine-containing+dipeptides+exhibit+age-dependent+toxicity+in+C.+elegans.">Nuclear localized C9orf72-associated arginine-containing dipeptides exhibit age-dependent toxicity in C. elegans.</a> Human Molecular Genetics. 26 (24), 4916-4928 (2017).</li><li>Gidalevitz, T., Krupinski, T., Garcia, S., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Destabilizing+protein+polymorphisms+in+the+genetic+background+direct+phenotypic+expression+of+mutant+SOD1+toxicity.">Destabilizing protein polymorphisms in the genetic background direct phenotypic expression of mutant SOD1 toxicity.</a> PLoS Genetics. 5 (3), 1000399 (2009).</li><li>Nollen, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNA+interference+screen+identifies+previously+undescribed+regulators+of+polyglutamine+aggregation.">Genome-wide RNA interference screen identifies previously undescribed regulators of polyglutamine aggregation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 101 (17), 6403-6408 (2004).</li><li>Satyal, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyglutamine+aggregates+alter+protein+folding+homeostasis+in+Caenorhabditis+elegans.">Polyglutamine aggregates alter protein folding homeostasis in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (11), 5750-5755 (2000).</li><li>Boccitto, M., Lamitina, T., Kalb, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Daf-2+signaling+modifies+mutant+SOD1+toxicity+in+C.+elegans.">Daf-2 signaling modifies mutant SOD1 toxicity in C. elegans.</a> PLoS One. 7 (3), 33494 (2012).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C9orf72+BAC+Mouse+Model+with+Motor+Deficits+and+Neurodegenerative+Features+of+ALS/FTD.">C9orf72 BAC Mouse Model with Motor Deficits and Neurodegenerative Features of ALS/FTD.</a> Neuron. 90 (3), 521-534 (2016).</li><li>Peters, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+C9ORF72+Hexanucleotide+Expansion+Reproduces+RNA+Foci+and+Dipeptide+Repeat+Proteins+but+Not+Neurodegeneration+in+BAC+Transgenic+Mice.">Human C9ORF72 Hexanucleotide Expansion Reproduces RNA Foci and Dipeptide Repeat Proteins but Not Neurodegeneration in BAC Transgenic Mice.</a> Neuron. 88 (5), 902-909 (2015).</li><li>O'Rourke, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C9orf72+BAC+Transgenic+Mice+Display+Typical+Pathologic+Features+of+ALS/FTD.">C9orf72 BAC Transgenic Mice Display Typical Pathologic Features of ALS/FTD.</a> Neuron. 88 (5), 892-901 (2015).</li><li>Mizielinska, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C9orf72+repeat+expansions+cause+neurodegeneration+in+Drosophila+through+arginine-rich+proteins.">C9orf72 repeat expansions cause neurodegeneration in Drosophila through arginine-rich proteins.</a> Science. 345 (6201), 1192-1194 (2014).</li><li>Krajacic, P., Shen, X., Purohit, P. K., Arratia, P., Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanical+profiling+of+Caenorhabditis+elegans+motility.">Biomechanical profiling of Caenorhabditis elegans motility.</a> Genetics. 191 (3), 1015-1021 (2012).</li><li>Zhang, L., Ward, J. D., Cheng, Z., Dernburg, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+auxin-inducible+degradation+(AID)+system+enables+versatile+conditional+protein+depletion+in+C.+elegans.">The auxin-inducible degradation (AID) system enables versatile conditional protein depletion in C. elegans.</a> Development. 142 (24), 4374-4384 (2015).</li></ol>

Ici, nous rapportons des méthodes qui peuvent être utilisées pour assayer la toxicité du peptide RAN modélisé dans le muscle ou dans les neurones de C. elegans. Tandis que les protéines neurodégénératives ont un phénotype d’âge de début dans les patients humains, elles peuvent également montrer la toxicité développementnelle une fois surexprimées dans des systèmes modèles. La surexpression a des limitations d’interprétation importantes, mais elle fournit également un point de départ pui...

L’expansion inappropriée des séquences répétées d’ADN est la base génétique de plusieurs maladies neurodégénératives telles que la sclérose latérale amyotrophique (SLA), la démence frontotemporale (FTD) et la maladie de Huntington (HD)1. Bien qu’il existe des modèles cellulaires et animaux établis pour ces maladies, les mécanismes sous-jacents à ces conditions ne sont pas bien définis. Par exemple, la MH est causée par l’expansion d’une séquence de répétition CAG dans la séquence de codage pour la protéine Huntingtin Htt2. Puisque CAG code la glutamine d’acide aminé, l’expansion de répétition de CAG a comme conséquence l’insertion d’une séquence de polyglutamine, ou polyQ, dans Htt. Les protéines polyQ élargies forment des agrégats de protéine de longueur et d’âge-dépendants qui sont associés à la toxicité3,4. Étonnamment, deux études récentes suggèrent que la longueur de la séquence de polyQ n’est pas le principal moteur de l’apparition de la maladie MH, suggérant que des facteurs polyQ-indépendants peuvent également contribuer à la maladie5,6.
Un mécanisme possible polyQ-indépendant implique un type nouvellement découvert de traduction de protéine appelée Repeat Associated Non-AUG-dependent (RAN) traduction7. Comme son nom l’indique, la traduction RAN ne se produit que lorsqu’une séquence de répétition élargie est présente et ne nécessite pas de codon de démarrage canonique. Par conséquent, la traduction RAN se produit dans les trois cadres de lecture de la répétition pour produire trois polypeptides distincts. En outre, parce que de nombreux gènes produisent également une transcription antisense qui contient le complément inverse de la séquence de répétition élargie, la traduction RAN se produit également dans les trois cadres de lecture de la transcription antisense. Ensemble, la traduction DE RAN augmente le nombre de protéines produites à partir d’une séquence d’ADN répétée élargie d’un peptide à six peptides. À ce jour, la traduction RAN a été observée dans au moins huit différents troubles d’expansion de répétition8. Peptides RAN sont observés dans les échantillons post mortem patient et seulement dans les cas où le patient porte une répétition élargie9,10. Tandis que ces peptides sont clairement présents dans les cellules patientes, leur contribution à la pathophysiologie de maladie n’est pas claire.
Pour mieux définir la toxicité potentielle associée aux peptides RAN, plusieurs groupes ont exprimé chaque peptide dans divers systèmes modèles, tels que la levure, les mouches, les souris et les cellules de culture tissulaire11,12,13,14,15,16. Plutôt que d’utiliser la séquence de répétition pour l’expression, ces modèles utilisent une approche de codon-variation dans laquelle la séquence de répétition est éliminée mais la séquence d’acide aminé est préservée. L’initiation de traduction se produit par un ATG canonique et le peptide est généralement fusionné à une protéine fluorescente au N- ou C-terminus, aucun de qui ne semble interférer avec la toxicité du peptide RAN. Par conséquent, chaque construction surexprime un seul peptide RAN. Modéliser les différents produits RAN dans un organisme multicellulaire avec des essais simples pour mesurer la toxicité du peptide RAN est d’une importance vitale pour comprendre comment les différents produits RAN de chaque expansion récidivante causant la maladie contribuent au dysfonctionnement cellulaire et à la neurodégénérescence.
Comme d’autres systèmes modèles, C. elegans fournit une plate-forme expérimentale flexible et efficace qui permet des études de nouveaux mécanismes de maladie, tels que la toxicité du peptide RAN. Les vers offrent plusieurs attributs expérimentaux uniques qui ne sont pas actuellement disponibles dans d’autres modèles de toxicité du peptide RAN. Tout d’abord, C. elegans sont optiquement transparents de la naissance jusqu’à la mort. Cela permet une visualisation simple de l’expression et de la localisation du peptide RAN, ainsi que l’analyse in vivo de la neurodégénérescence chez les animaux vivants. Deuxièmement, les méthodes transgéniques pour générer des modèles d’expression peptide RAN sont peu coûteuses et rapides. Étant donné le cycle de vie court de trois jours de C. elegans, les lignes transgéniques stables exprimant n’importe quel peptide RAN donné d’une manière spécifique de type cellulaire peuvent être produites en moins d’une semaine. Troisièmement, de simples sorties phénotypiques peuvent être combinées avec des méthodes de dépistage génétique, telles que la mutanèse chimique ou le dépistage de l’ARNi, afin d’identifier rapidement les gènes essentiels à la toxicité du peptide RAN. Enfin, la courte durée de vie de C. elegans (20 jours) permet aux chercheurs de déterminer comment le vieillissement, qui est le plus grand facteur de risque pour la plupart des maladies d’expansion répétée, influence la toxicité du peptide RAN. Ensemble, cette combinaison d’attributs expérimentaux est inégalée dans tout autre système modèle et offre une plate-forme puissante pour l’étude de la toxicité du peptide RAN.
Ici, nous décrivons plusieurs essais qui tirent parti des avantages expérimentaux de C. elegans pour mesurer la toxicité des peptides RAN et pour identifier les modificateurs génétiques de cette toxicité. Les peptides RAN codon-variés ATG-initiés sont marqués avec GFP et exprimés individuellement dans les cellules musculaires sous le promoteur de myo-3 ou dans les neurones moteurs GABAergic sous le promoteur unc-47. Pour l’expression dans les cellules musculaires, il est important que les peptides RAN toxiques soient étiquetés avec des protéines fluorescentes vertes (GFP), ou d’autres protéines fluorescentes (FP) qui peuvent être ciblées avec un vecteur d’alimentation RNAi. C’est parce que l’expression toxique de peptide de RAN bloque habituellement la croissance, rendant de telles souches non viables. L’utilisation de gfp (RNAi) inactive sous condition l’expression du peptide RAN et permet l’entretien des souches, les croix génétiques, etc. Pour les essais, ces animaux sont retirés de gfp (RNAi), ce qui permet l’expression du peptide RAN et des phénotypes qui en résultent. En plus de la stratégie moléculaire pour concevoir des constructions d’expression peptide RAN codon-variées, nous décrivons des essais pour mesurer la toxicité développementale (motilité larvaire et analyse de croissance), toxicité post-développementale associée à l’âge (analyse de paralysie), et défauts morphologiques neuronaux (essai de commissure).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>35mm x 10mm Petri Dish, Sterile</td>
			<td>CELLTREAT Scientific Products</td>
			<td>50-202-036</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AGAR GRANULATED 2KILOGRAM</td>
			<td>BD DIAGNOSTIC SYSTEMS</td>
			<td>DF0145070</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AGAROSE ULTRAPURE</td>
			<td>LIFE TECHNOLOGIES</td>
			<td>16500500</td>
			<td>Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CARBENICILLIN 5G</td>
			<td>THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS</td>
			<td>BP26485</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COVER GLASSES NO 1 22MM 1OZ/PK</td>
			<td>THERMO SCI ERIE</td>
			<td>12542B</td>
			<td>Imaging for commissure assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FEMOTIPS DISPSBL MICROINJ 20CS</td>
			<td>EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS</td>
			<td>E5242952008</td>
			<td>Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FF COV GLASS NO1 40X22MM 1OZPK</td>
			<td>THERMO SCI ERIE</td>
			<td>125485C</td>
			<td>Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>THERMO SCI ERIE</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td>Imaging for commissure assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;Bacto Peptone&#160;</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>DF0118-17-0</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HALOCARBON OIL 700</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH INC</td>
			<td>H8898-50ML</td>
			<td>Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG BIOTECH 10G</td>
			<td>THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS</td>
			<td>BP162010</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Advanced Fluorescence imaging software</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>LAS-AF</td>
			<td>Image acquisition software for video speed analysis and commissure assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Immersion type N (Oil)</td>
			<td>W NUHSBAUM INC</td>
			<td>NC9547002</td>
			<td>Imaging for commissure assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEVAMISOLE HYDROCHLORIDE 10GR</td>
			<td>THERMO SCI ACROS ORGANICS</td>
			<td>AC187870100</td>
			<td>Imaging for commissure assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROLOADER TIPS 2 X 96 PCS</td>
			<td>EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS</td>
			<td>E5242956003</td>
			<td>Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			PETRI DISH, 60X15MM,500/CS</td>
			<td>CORNING LIFE SCIENCES PLASTIC</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TISSUE CULT PLATE 24WEL 50/CS</td>
			<td>CORNING LIFE SCIENCES DL</td>
			<td>87721</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring ran peptide toxicity in c. elegans

C. elegans est couramment utilisé pour modéliser les maladies neurodégénératives liées à l’âge causées par des mutations d’expansion répétée, telles que la sclérose latérale amyotrophique (SLA) et la maladie de Huntington. Récemment, l’ARN contenant l’expansion répétée s’est avéré être le substrat d’un nouveau type de traduction de protéine appelé traduction non-dépendante de l’AUG (RAN) associée à la répétition. Contrairement à la traduction canonique, la traduction RAN ne nécessite pas de codon de démarrage et ne se produit que lorsque les répétitions dépassent une longueur de seuil. Parce qu’il n’y a pas de codon de démarrage pour déterminer le cadre de lecture, la traduction RAN se produit dans toutes les images de lecture à partir de modèles d’ARN de sens et d’antisense qui contiennent une séquence d’expansion répétée. Par conséquent, la traduction DE RAN augmente le nombre possible de peptides toxiques associés à la maladie possible de un à six. Jusqu’à présent, la traduction RAN a été documentée dans huit différentes maladies neurodégénératives et neuromusculaires basées sur l’expansion récidiviste. Dans chaque cas, le déchiffrement des produits RAN qui sont toxiques, ainsi que leurs mécanismes de toxicité, est une étape critique vers la compréhension de la façon dont ces peptides contribuent à la pathophysiologie de la maladie. Dans cet article, nous présentons des stratégies pour mesurer la toxicité des peptides RAN dans le système modèle C. elegans. Tout d’abord, nous décrivons les procédures pour mesurer la toxicité du peptide RAN sur la croissance et la motilité du développement de C. elegans. Deuxièmement, nous détaillons un essai pour mesurer les effets postdéveloppementaux et dépendants de l’âge des peptides RAN sur la motilité. Enfin, nous décrivons un essai de neurotoxicité pour évaluer les effets des peptides RAN sur la morphologie des neurones. Ces essais fournissent une évaluation large de la toxicité du peptide RAN et peuvent être utiles pour effectuer des écrans génétiques ou à petites molécules à grande échelle pour identifier les mécanismes ou les thérapies de la maladie.

Nous avons utilisé les essais décrits ici pour évaluer l’effet de différentes inhibitions de gène sur la toxicité des dipeptides RAN qui se trouvent dans les patients de SLA présentant une expansion de répétition de G4C2. En utilisant l’essai de croissance pour mesurer la toxicité développementale, nous avons analysé les effets de plusieurs mutants génétiques knock-out identifiés dans un suppresseurs d’écran RNAi à l’échelle du génome de la toxicité PR50-GFP exprimée par...

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Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Les produits translationnels non dépendants à l’ATG associés à répétition sont des caractéristiques pathogènes émergentes de plusieurs maladies à base d’expansion répétée. Le but du protocole décrit est d’évaluer la toxicité causée par ces peptides à l’aide d’essais comportementaux et cellulaires dans le système modèle C. elegans.

Mesurer RAN Peptide Toxicity à C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis ...

Les peptides RAN sont une caractéristique des troubles neurodégénératifs à expansion répétée tels que la maladie de Huntington, la sclérose latérale amyotrophique et la démence frontotemporale. Ces protocoles fournissent une approche normalisée importante pour quantifier la toxicité du peptide RAN dans le système modèle C.elegans. Les techniques décrites sont simples à apprendre et peu coûteuses, peuvent être exécutées rapidement, et tirer parti des caractéristiques reproductibles du système C.elegans telles que le mouvement et la reproduction.Lorsque vous essayez ce protocole, le principal défi est d’obtenir une toxicité et une expression cohérentes du peptide RAN. Les principaux facteurs à contrôler comprennent la température des médicaments, le moment des changements de température et la préparation des plaques d’analyse. Il est important pour les expérimentateurs de classer systématiquement les phénotypes des animaux dans cet essai de processus dépendant de l’âge.La démonstration visuelle de cette technique montre leurs critères de classification. Commencez par verser le milieu de croissance standard des nématodes avec un millimolaire IPTG et 25 microgrammes par carbenicilline millilitre dans des plaques de 24 puits. Stries RNAi clones d’alimentation dans les bactéries HT115 sur l’agar de carbenicilline LB et les cultiver à 37 degrés Celsius pendant 24 heures.Le lendemain, choisissez une seule colonie en un millilitre de liquide de carbenicilline LB et cultivez la bactérie pendant 18 heures à 37 degrés Celsius tout en secouant à 250 rpm. Repérait quatre puits individuels de la plaque ngm RNAi 24 puits avec 20 microlitres de cultures bactériennes nocturnes tel que décrit dans le manuscrit du texte et permettre aux bactéries RNAi d’induire la production d’ARN à double brin pendant la nuit. Utilisez la méthode standard d’hypochlorite pour isoler les œufs du premier jour de C.elegans adulte exprimant le transgène peptidique RAN intégré.Ensuite, ensemencer environ 30 œufs dans chaque puits de la plaque de 24 puits et incuber la plaque à 20 degrés Celsius pendant sept jours. Pour effectuer l’analyse de vitesse vidéo, acquérir deux vidéos à partir de deux puits distincts pour chaque condition RNAi à l’aide d’un microscope à disséquer stéréo équipé d’une caméra monochrome. Assurez-vous d’utiliser des paramètres d’acquisition cohérents entre les puits.Pour chaque vidéo, réglez la durée pendant 10 secondes et l’intervalle de temps à 76 millisecondes. Réglez le temps d’exposition à l’image à quatre millisecondes et utilisez le paramètre de zoom de 1,49. Sélectionnez ensuite deux par deux binning.Vérifiez que la résolution est de 800 x 600 pixels et commencez à enregistrer. Après l’acquisition, étiquetez chaque vidéo immédiatement avec la souche, l’état RNAi et le numéro de puits. Ensuite, mesurez la distance parcourue et la longueur de chaque animal pour 20 animaux différents par vidéo, en examinant un total d’environ 40 vers pour chaque condition RNAi.Dans le logiciel, sélectionnez le bouton outils d’annotation. Ensuite, l’outil de texte de tirage. Cliquez sur un point au centre du ver mesuré dans la première image de la vidéo et marquez-le avec un numéro.Avancez la vidéo jusqu’à la fin tout en suivant visuellement le ver. Cliquez ensuite dessus et marquez-le avec le numéro correspondant suivant. Utilisez l’outil de barre d’échelle de tirage pour tracer une ligne du premier numéro au deuxième numéro et enregistrer la distance parcourue dans une feuille de calcul.Répétez cette mesure pour 19 autres vers dans la vidéo tout en préservant chaque mesure individuelle dans la fenêtre d’analyse. Une fois les mesures terminées, prenez un instantané du cadre vidéo final illustrant toutes les lignes de mesure afin que les données puissent être retracées jusqu’à l’animal d’où elles proviennent. Ensuite, analyser les données à l’aide d’une feuille de calcul à quatre colonnes où la colonne 1 est l’identificateur de ver et la colonne deux est la vitesse.L’heure de chaque vidéo peut être trouvée en cliquant à droite sur la vidéo sous l’expérience et en allant aux propriétés. Pour normaliser la mesure de la vitesse, trouvez la longueur de chaque animal. Utilisez l’outil de polylin de tirage pour tracer librement le C.elegans de la pointe de la tête jusqu’à l’extrémité de la queue.Ensuite, prenez un instantané du cadre vidéo final illustrant toutes les polylines. La longueur des lignes sera consignée dans les statistiques. Ajouter deux colonnes à la feuille de calcul, une pour la longueur de l’animal et une pour une vitesse normalisée.Enfin, analyser les données de vitesse normalisées à l’aide d’un ANOVA uni-sens avec des tests post-hoc par rapport au vecteur vide RNAi. Placez quatre à six L4 C.elegans transgéniques exprimant le peptide RAN GFP sur une plaque RNAi GFP de six centimètres et cultivez-les à 20 degrés Celsius. Si l’expérience utilise rnai pour tester les effets génétiques sur la toxicité du peptide RAN, déplacer 10 adultes gravid transgéniques à chacun des deux vecteurs vides RNAi GFP RNAi ou des plaques RNAi spécifiques aux gènes.Si des mutants sont utilisés pour analyser les effets génétiques sur la toxicité du peptide RAN, placez 10 animaux sauvages gravid ou mutants exprimant le même transgène RAN sur chacune des deux plaques RNAi vectorielles vides ou GFP RNAi. Cultivez-les à 20 degrés Celsius pendant 48 heures. Choisissez 10 ensembles de 10 L4 transgéniques dans les plaques RNAi et placez chaque ensemble sur une plaque RNAi de trois centimètres.Assurez-vous que les vers sélectionnés pour l’analyse ont tous une motilité superficiellement normale. Placez les plaques dans un sac en plastique pour retenir l’humidité et les incuber à 25 degrés Celsius. Après 24 heures, analyser les animaux pour la mobilité en tapant les plaques sur le microscope disséquant et en vérifiant le mouvement.Si un ver se déplace plus d’une longueur de corps, comptez-le comme mobile et transférez-le à une nouvelle plaque RNAi de trois centimètres. Utilisez une pioche en platine pour taper le reste des vers sur la tête et la queue. Si l’animal se déplace plus d’une longueur de corps, comptez l’animal comme mobile et transférez-le à une nouvelle plaque RNAi de trois centimètres.Si une paralysie significative n’est pas observée dans la lutte antivectorielle vide au deuxième jour, terminez l’analyse et recommencez. Regroupez tous les vers non mobiles de sorte que le mouvement de plus d’une longueur corporelle puisse être facilement détecté. Comptez tous les vers paralysés, ensachés ou morts et jetez la plaque.Continuer à marquer les animaux pour la paralysie tous les jours pendant cinq à sept jours. L’essai de croissance a été employé pour mesurer l’effet des inhibitions de gène sur la toxicité des dipeptides de RAN qui sont trouvés dans les patients de SLA présentant une expansion répétée de G4C2. L’expression du PR50 GFP seul a eu comme conséquence un arrêt complet de croissance, mais le renversement de plusieurs gènes a supprimé la toxicité développementale.L’effet des renversements spécifiques de gène sur la motilité développementale des animaux exprimant pr50 a été mesuré utilisant la méthode d’analyse de vitesse vidéo. Comme prévu, l’inhibition de l’expression pr50 GFP a entraîné une forte augmentation de la motilité par rapport au vecteur vide RNAi. En outre, le RNAi contre la sous-unité protéasome RPN7 a entraîné l’augmentation significative de la motilité PR50.Quand des phénotypes adultes ont été analysés avec l’essai de paralysie âge-dépendant, PR50 GFP a exhibé jusqu’à 80% paralysie par cinq jours d’âge. Cependant, RNAi dirigé vers le gène cul-6 paralysie significativement retardée suggérant que cul-6 est nécessaire pour la toxicité de PR50 GFP. Pour déterminer si les protéines RAN causent la neuropathologie lorsqu’elles sont exprimées dans les neurones de C.elegans, la toxicité neuronale spécifique a été examinée à l’aide de l’analyse de commissaire.Dans le deuxième jour adultes, l’expression de PR50 GFP dans les neurones moteurs a mené à une augmentation significative du saignement de neurone moteur. Cette neuropathologie a été sensiblement supprimée par une mutation dans le gène de récepteur d’IGF d’insuline homolog DAF-2 qui retarde les propriétés toxiques de plusieurs protéines neurodegenerative. Pour l’analyse comportementale, il est important que les peptides RAN produisent un phénotype hautement pénétratif.Ces gènes ou médicaments pourraient fournir de nouveaux biomarqueurs ou options thérapeutiques pour les maladies peptidiques RAN. En utilisant ces analyses, nous avons effectué un écran RNAi à l’échelle du génome pour les suppresseurs de la C9ORF72 associé RAN peptide proline-arginine. Les gènes identifiés dans cet écran comprennent de nombreux gènes nouveaux et conservés qui feront l’objet de futures études mécanistes.

Research

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