Name: measuring ran peptide toxicity in c. elegans
Uploaded: 2020-04-30T15:00:00
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NIH R21NS107797

1. Generazione di costrutti di espressione peptide RAN a varia codone
<ol><li>Progettare la sequenza di codifica dei peptidi RAN utilizzando i codoni sinonimi per eliminare la struttura fondamentale DNA/RNA ripetitivo, ma preservare la sequenza di amminoacidi sovrastante.</li>
	<li>Ordinare le sequenze di codon personalizzate commercialmente alle lunghezze di ripetizione necessarie per gli studi (in genere da 5 a 100 ripetizioni). Includere un sito di restrizione HindIII alla fine 5' e un sito di restrizione BamHI all'...

<ol>
	<li>Cleary, J. D., Ranum, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeat+associated+non-ATG+(RAN)+translation:+new+starts+in+microsatellite+expansion+disorders.">Repeat associated non-ATG (RAN) translation: new starts in microsatellite expansion disorders.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 26, 6-15 (2014).</li><li>The Huntington's Disease Collaborative Research Group. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+gene+containing+a+trinucleotide+repeat+that+is+expanded+and+unstable+on+Huntington's+disease+chromosomes.">A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes.</a> Cell. 72 (6), 971-983 (1993).</li><li>Scherzinger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntingtin-encoded+polyglutamine+expansions+form+amyloid-like+protein+aggregates+in+vitro+and+in+vivo.">Huntingtin-encoded polyglutamine expansions form amyloid-like protein aggregates in vitro and in vivo.</a> Cell. 90 (3), 549-558 (1997).</li><li>Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+threshold+for+polyglutamine-expansion+protein+aggregation+and+cellular+toxicity+is+dynamic+and+influenced+by+aging+in+Caenorhabditis+elegans.">The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99 (16), 10417-10422 (2002).</li><li>Genetic Modifiers of Huntington's Disease Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electronic+address,+g.+h.+m.+h.+e.,+Genetic+Modifiers+of+Huntington's+Disease,+C.+CAG+Repeat+Not+Polyglutamine+Length+Determines+Timing+of+Huntington's+Disease+Onset.">Electronic address, g. h. m. h. e., Genetic Modifiers of Huntington's Disease, C. CAG Repeat Not Polyglutamine Length Determines Timing of Huntington's Disease Onset.</a> Cell. 178 (4), 887-900 (2019).</li><li>Wright, G. E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Length+of+Uninterrupted+CAG,+Independent+of+Polyglutamine+Size,+Results+in+Increased+Somatic+Instability,+Hastening+Onset+of+Huntington+Disease.">Length of Uninterrupted CAG, Independent of Polyglutamine Size, Results in Increased Somatic Instability, Hastening Onset of Huntington Disease.</a> American Journal of Human Genetics. 104 (6), 1116-1126 (2019).</li><li>Cleary, J. D., Ranum, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeat-associated+non-ATG+(RAN)+translation+in+neurological+disease.">Repeat-associated non-ATG (RAN) translation in neurological disease.</a> Human Molecular Genetics. 22 (1), 45-51 (2013).</li><li>Banez-Coronel, M., Ranum, L. P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeat-associated+non-AUG+(RAN)+translation:+insights+from+pathology.">Repeat-associated non-AUG (RAN) translation: insights from pathology.</a> Laboratory Investigation. 99 (7), 929-942 (2019).</li><li>Banez-Coronel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAN+Translation+in+Huntington+Disease.">RAN Translation in Huntington Disease.</a> Neuron. 88 (4), 667-677 (2015).</li><li>Ash, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unconventional+translation+of+C9ORF72+GGGGCC+expansion+generates+insoluble+polypeptides+specific+to+c9FTD/ALS.">Unconventional translation of C9ORF72 GGGGCC expansion generates insoluble polypeptides specific to c9FTD/ALS.</a> Neuron. 77 (4), 639-646 (2013).</li><li>Kramer, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+screens+in+human+cells+and+primary+neurons+identify+modifiers+of+C9ORF72+dipeptide-repeat-protein+toxicity.">CRISPR-Cas9 screens in human cells and primary neurons identify modifiers of C9ORF72 dipeptide-repeat-protein toxicity.</a> Nature Genetics. 50 (4), 603-612 (2018).</li><li>Boeynaems, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+screen+connects+nuclear+transport+genes+to+DPR+pathology+in+c9ALS/FTD.">Drosophila screen connects nuclear transport genes to DPR pathology in c9ALS/FTD.</a> Scientific Reports. 6, 20877 (2016).</li><li>Jovicic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modifiers+of+C9orf72+dipeptide+repeat+toxicity+connect+nucleocytoplasmic+transport+defects+to+FTD/ALS.">Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS.</a> Nature Neuroscience. 18 (9), 1226-1229 (2015).</li><li>Boeynaems, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+Separation+of+C9orf72+Dipeptide+Repeats+Perturbs+Stress+Granule+Dynamics.">Phase Separation of C9orf72 Dipeptide Repeats Perturbs Stress Granule Dynamics.</a> Molecular Cell. 65 (6), 1044-1055 (2017).</li><li>Lee, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C9orf72+Dipeptide+Repeats+Impair+the+Assembly,+Dynamics,+and+Function+of+Membrane-Less+Organelles.">C9orf72 Dipeptide Repeats Impair the Assembly, Dynamics, and Function of Membrane-Less Organelles.</a> Cell. 167 (3), 717-788 (2016).</li><li>Hao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+dysfunction+and+neurodegeneration+in+a+C9orf72+mouse+line+expressing+poly-PR.">Motor dysfunction and neurodegeneration in a C9orf72 mouse line expressing poly-PR.</a> Nature Communications. 10 (1), 2906 (2019).</li><li>Scior, A., Preissler, S., Koch, M., Deuerling, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+PCR-free+engineering+of+highly+repetitive+DNA+sequences.">Directed PCR-free engineering of highly repetitive DNA sequences.</a> BMC Biotechnology. 11, 87 (2011).</li><li>Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+transformation.">DNA transformation.</a> Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).</li><li>Rudich, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+localized+C9orf72-associated+arginine-containing+dipeptides+exhibit+age-dependent+toxicity+in+C.+elegans.">Nuclear localized C9orf72-associated arginine-containing dipeptides exhibit age-dependent toxicity in C. elegans.</a> Human Molecular Genetics. 26 (24), 4916-4928 (2017).</li><li>Gidalevitz, T., Krupinski, T., Garcia, S., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Destabilizing+protein+polymorphisms+in+the+genetic+background+direct+phenotypic+expression+of+mutant+SOD1+toxicity.">Destabilizing protein polymorphisms in the genetic background direct phenotypic expression of mutant SOD1 toxicity.</a> PLoS Genetics. 5 (3), 1000399 (2009).</li><li>Nollen, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNA+interference+screen+identifies+previously+undescribed+regulators+of+polyglutamine+aggregation.">Genome-wide RNA interference screen identifies previously undescribed regulators of polyglutamine aggregation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 101 (17), 6403-6408 (2004).</li><li>Satyal, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyglutamine+aggregates+alter+protein+folding+homeostasis+in+Caenorhabditis+elegans.">Polyglutamine aggregates alter protein folding homeostasis in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (11), 5750-5755 (2000).</li><li>Boccitto, M., Lamitina, T., Kalb, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Daf-2+signaling+modifies+mutant+SOD1+toxicity+in+C.+elegans.">Daf-2 signaling modifies mutant SOD1 toxicity in C. elegans.</a> PLoS One. 7 (3), 33494 (2012).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C9orf72+BAC+Mouse+Model+with+Motor+Deficits+and+Neurodegenerative+Features+of+ALS/FTD.">C9orf72 BAC Mouse Model with Motor Deficits and Neurodegenerative Features of ALS/FTD.</a> Neuron. 90 (3), 521-534 (2016).</li><li>Peters, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+C9ORF72+Hexanucleotide+Expansion+Reproduces+RNA+Foci+and+Dipeptide+Repeat+Proteins+but+Not+Neurodegeneration+in+BAC+Transgenic+Mice.">Human C9ORF72 Hexanucleotide Expansion Reproduces RNA Foci and Dipeptide Repeat Proteins but Not Neurodegeneration in BAC Transgenic Mice.</a> Neuron. 88 (5), 902-909 (2015).</li><li>O'Rourke, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C9orf72+BAC+Transgenic+Mice+Display+Typical+Pathologic+Features+of+ALS/FTD.">C9orf72 BAC Transgenic Mice Display Typical Pathologic Features of ALS/FTD.</a> Neuron. 88 (5), 892-901 (2015).</li><li>Mizielinska, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C9orf72+repeat+expansions+cause+neurodegeneration+in+Drosophila+through+arginine-rich+proteins.">C9orf72 repeat expansions cause neurodegeneration in Drosophila through arginine-rich proteins.</a> Science. 345 (6201), 1192-1194 (2014).</li><li>Krajacic, P., Shen, X., Purohit, P. K., Arratia, P., Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanical+profiling+of+Caenorhabditis+elegans+motility.">Biomechanical profiling of Caenorhabditis elegans motility.</a> Genetics. 191 (3), 1015-1021 (2012).</li><li>Zhang, L., Ward, J. D., Cheng, Z., Dernburg, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+auxin-inducible+degradation+(AID)+system+enables+versatile+conditional+protein+depletion+in+C.+elegans.">The auxin-inducible degradation (AID) system enables versatile conditional protein depletion in C. elegans.</a> Development. 142 (24), 4374-4384 (2015).</li></ol>

Qui riportiamo metodi che possono essere utilizzati per annotare la tossicità peptide RAN modellata nel muscolo o nei neuroni di C. elegans. Mentre le proteine neurodegenerative hanno un fenotipo inesoramento dell'età nei pazienti umani, possono anche mostrare tossicità dello sviluppo quando sovraespresse nei sistemi modello. La sovraespressione ha notevoli limitazioni interpretive, ma fornisce anche un potente punto di partenza per schermi genetici o farmacologici volti a identificare geni o farmaci in grado...

L'espansione inappropriata delle sequenze di ripetizione del DNA è la base genetica di diverse malattie neurodegenerative come la sclerosi laterale amiotrofica (SLA), la demenza frontotemporale (FTD) e la malattia di Huntington (HD)1. Sebbene esistano modelli cellulari e animali consolidati per queste malattie, i meccanismi alla base di queste condizioni non sono ben definiti. Ad esempio, l'HD è causato dalle espansioni di una sequenza di ripetizione CAG nella sequenza di codifica per la proteina Huntingtina Htt2. Poiché CAG codifica la glutammina degli amminoacidi, l'espansione della ripetizione CAG comporta l'inserimento di una sequenza poliglutamina, o poliQ, all'interno di Htt. Proteine polyQ espanse formano aggregati proteici di lunghezza e di età associati alla tossicità3,4. Sorprendentemente, due studi recenti suggeriscono che la lunghezza della sequenza poliQ non è il principale fattore di insorgenza della malattia MH, suggerendo che anche fattori indipendenti dal poliq possono contribuire alla malattia5,6.
Un possibile meccanismo indipendente dal poliQ prevede un tipo di traduzione di proteine appena scoperto chiamato Repeat Associated Non-AUG-dependent (RAN) traduzione7. Come suggerisce il nome, la traduzione RAN si verifica solo quando è presente una sequenza di ripetizione espansa e non richiede un codon di inizio canonico. Pertanto, la traduzione RAN avviene in tutti e tre i fotogrammi di lettura della ripetizione per produrre tre polipeptidi distinti. Inoltre, poiché molti geni producono anche una trascrizione antisenso che contiene il complemento inverso della sequenza di ripetizione espansa, la traduzione RAN si verifica anche in tutti e tre i fotogrammi di lettura della trascrizione antisenso. Insieme, la traduzione RAN espande il numero di proteine prodotte da una sequenza di DNA espansa contenente ripetizioni da un peptide a sei peptidi. Ad oggi, la traduzione ran è stata osservata in almeno otto diversi disturbi di espansione ripetuta8. I peptidi RAN sono osservati nei campioni di pazienti postmortem e solo nei casi in cui il paziente porta una ripetizione espansa9,10. Mentre questi peptidi sono chiaramente presenti nelle cellule del paziente, il loro contributo alla fisiopatologia della malattia non è chiaro.
Per definire meglio la potenziale tossicità associata ai peptidi RAN, diversi gruppi hanno espresso ogni peptide in vari sistemi modello, come lieviti, mosche, topi e cellule di coltura dei tessuti11,12,13,1414,15,16. Anziché utilizzare la sequenza di ripetizione per l'espressione, questi modelli utilizzano un approccio di variazione codon in cui la sequenza di ripetizione viene eliminata ma la sequenza di amminoacidi viene mantenuta. L'avvio della traduzione avviene attraverso un ATG canonico e il peptide è tipicamente fuso in una proteina fluorescente al Capon o Al C, nessuno dei quali sembra interferire con la tossicità del peptide RAN. Pertanto, ogni costrutto sovraesprime un singolo peptide RAN. Modellare i diversi prodotti RAN in un organismo multicellulare con semplici saggi per misurare la tossicità dei peptidi RAN è di vitale importanza per capire come i diversi prodotti RAN da ogni espansione di ripetizione che causa la malattia contribuiscono alla disfunzione cellulare e alla neurodegenerazione.
Come altri sistemi modello, C. elegans fornisce una piattaforma sperimentale flessibile ed efficiente che consente di studi su nuovi meccanismi di malattia, come la tossicità dei peptidi RAN. I vermi offrono diversi attributi sperimentali unici che non sono attualmente disponibili in altri modelli di tossicità peptide RAN. In primo luogo, C. elegans sono otticamente trasparenti dalla nascita alla morte. Ciò consente una semplice visualizzazione dell'espressione e localizzazione dei peptidi RAN, nonché l'analisi in vivo della neurodegenerazione negli animali vivi. In secondo luogo, i metodi transgenici per la generazione di modelli di espressione peptide RAN sono economici e veloci. Dato il breve ciclo di vita di tre giorni di C. elegans,linee transgeniche stabili che esprimono qualsiasi peptide RAN in modo specifico di tipo cellulare possono essere prodotte in meno di una settimana. In terzo luogo, semplici risultati fenotipici possono essere combinati con metodi di screening genetico, come la mutagenesi chimica o lo screening RNAi, per identificare rapidamente i geni essenziali per la tossicità dei peptidi RAN. Infine, la breve durata di vita di C. elegans (20 giorni) consente agli sperimentatori di determinare come l'invecchiamento, che è il più grande fattore di rischio per la maggior parte delle malattie di espansione ripetute, influenza la tossicità dei peptidi RAN. Insieme, questa combinazione di attributi sperimentali non ha eguali in qualsiasi altro sistema di modelli e offre una potente piattaforma per lo studio della tossicità dei peptidi RAN.
Qui descriviamo diversi saggi che sfruttano i vantaggi sperimentali di C. elegans per misurare la tossicità dei peptidi RAN e per identificare i modificatori genetici di questa tossicità. I peptidi RAN iniziati con codone sono etichettati con GFP ed espressi individualmente in cellule muscolari sotto il promotore di myo-3 o nei motoneuroni GABAergic sotto il promotore unc-47. Per l'espressione nelle cellule muscolari, è importante che i peptidi RAN tossici siano etichettati con proteine fluorescenti verdi (GFP) o altre proteine fluorescenti (FP) che possono essere mirate con un vettore di alimentazione RNAi. Questo perché l'espressione tossica del peptide RAN di solito blocca la crescita, rendendo tali ceppi non vitali. L'uso di gfp(RNAi) disattiva in modo condizionale l'espressione dei peptidi RAN e consente il mantenimento della deformazione, le croci genetiche, ecc. Per i saggi, questi animali vengono rimossi da gfp(RNAi), che consente l'espressione del peptide RAN e dei fenotipi risultanti. Oltre alla strategia molecolare per la progettazione di costrutti di espressione peptide RAN varia di codone, descriviamo i saggi per misurare la tossicità dello sviluppo (motilità larvale e test di crescita), la tossicità associata all'età post-sviluppo (analisi della paralisi) e i difetti morfologici del neurone (testare la commissure).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>35mm x 10mm Petri Dish, Sterile</td>
			<td>CELLTREAT Scientific Products</td>
			<td>50-202-036</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AGAR GRANULATED 2KILOGRAM</td>
			<td>BD DIAGNOSTIC SYSTEMS</td>
			<td>DF0145070</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AGAROSE ULTRAPURE</td>
			<td>LIFE TECHNOLOGIES</td>
			<td>16500500</td>
			<td>Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CARBENICILLIN 5G</td>
			<td>THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS</td>
			<td>BP26485</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COVER GLASSES NO 1 22MM 1OZ/PK</td>
			<td>THERMO SCI ERIE</td>
			<td>12542B</td>
			<td>Imaging for commissure assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FEMOTIPS DISPSBL MICROINJ 20CS</td>
			<td>EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS</td>
			<td>E5242952008</td>
			<td>Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FF COV GLASS NO1 40X22MM 1OZPK</td>
			<td>THERMO SCI ERIE</td>
			<td>125485C</td>
			<td>Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>THERMO SCI ERIE</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td>Imaging for commissure assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;Bacto Peptone&#160;</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>DF0118-17-0</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HALOCARBON OIL 700</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH INC</td>
			<td>H8898-50ML</td>
			<td>Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG BIOTECH 10G</td>
			<td>THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS</td>
			<td>BP162010</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Advanced Fluorescence imaging software</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>LAS-AF</td>
			<td>Image acquisition software for video speed analysis and commissure assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Immersion type N (Oil)</td>
			<td>W NUHSBAUM INC</td>
			<td>NC9547002</td>
			<td>Imaging for commissure assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEVAMISOLE HYDROCHLORIDE 10GR</td>
			<td>THERMO SCI ACROS ORGANICS</td>
			<td>AC187870100</td>
			<td>Imaging for commissure assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROLOADER TIPS 2 X 96 PCS</td>
			<td>EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS</td>
			<td>E5242956003</td>
			<td>Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			PETRI DISH, 60X15MM,500/CS</td>
			<td>CORNING LIFE SCIENCES PLASTIC</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TISSUE CULT PLATE 24WEL 50/CS</td>
			<td>CORNING LIFE SCIENCES DL</td>
			<td>87721</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring ran peptide toxicity in c. elegans

C. elegans è comunemente usato per modellare malattie neurodegenerative legate all'età causate da mutazioni di espansione ripetute, come la sclerosi laterale amiotrofica (SLA) e la malattia di Huntington. Recentemente, l'RNA che lo contiene espansione ripetuta è il substrato per un nuovo tipo di traduzione di proteine chiamato traduzione non dipendente da AUG (RAN) associata alla ripetizione. A differenza della traduzione canonica, la conversione RAN non richiede un codone iniziale e si verifica solo quando le ripetizioni superano una lunghezza di soglia. Poiché non esiste un codone iniziale per determinare il fotogramma di lettura, la traduzione RAN si verifica in tutti i fotogrammi di lettura da modelli di RNA di senso e antisenso che contengono una sequenza di espansione di ripetizione. Pertanto, la traduzione RAN espande il numero di possibili peptidi tossici associati alla malattia da uno a sei. Finora, la traduzione RAN è stata documentata in otto diverse malattie neurodegenerative e neuromuscolari basate sull'espansione delle ripetizioni. In ogni caso, decifrare quali prodotti RAN sono tossici, così come i loro meccanismi di tossicità, è un passo fondamentale per capire come questi peptidi contribuiscono alla fisiopatologia della malattia. In questo articolo, presentiamo strategie per misurare la tossicità dei peptidi RAN nel sistema modello C. elegans. In primo luogo, descriviamo le procedure per misurare la tossicità dei peptidi RAN sulla crescita e la motilità dello sviluppo di C. elegans. In secondo luogo, abbiamo dettagliato un saggio per misurare gli effetti post-sviluppo dipendenti dall'età dei peptidi RAN sulla motilità. Infine, descriviamo un saggio di neurotossicità per valutare gli effetti dei peptidi RAN sulla morfologia dei neuroni. Questi saggi forniscono un'ampia valutazione della tossicità dei peptidi RAN e possono essere utili per l'esecuzione di schermi genetici o di piccole molecole su larga scala per identificare meccanismi o terapie della malattia.

Abbiamo usato i saggi descritti qui per valutare l'effetto di diverse inibizioni geniche sulla tossicità dei dipeptidi RAN che si trovano nei pazienti con SLA con un'espansione di ripetizione G4C2. Utilizzando il saggio di crescita per misurare la tossicità dello sviluppo, abbiamo analizzato gli effetti di diversi mutanti con knockout genetico identificati in uno screen soppressori RNAi a livello genomico della tossicità PR50-GFP muscolosamente espressa. Mentre l'espressione di PR50-GFP da sola h...

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Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

I prodotti traslazionali non dipendenti dall'ATG sono caratteristiche patogene emergenti di diverse malattie basate sull'espansione delle ripetizioni. L'obiettivo del protocollo descritto è quello di valutare la tossicità causata da questi peptidi utilizzando saggi comportamentali e cellulari nel sistema modello C. elegans.

Misurazione della tossicità del Peptide RAN in C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis ...

I peptidi RAN sono una caratteristica dei disturbi neurodegenerativi di espansione ripetuta come la malattia di Huntington, la sclerosi laterale amiotrofica e la demenza frontotemporale. Questi protocolli forniscono un importante approccio standardizzato per quantificare la tossicità dei peptidi RAN nel sistema di modelli C.elegans. Le tecniche descritte sono semplici da imparare ed economiche, possono essere eseguite rapidamente e sfruttano le caratteristiche riproducibili del sistema C.elegans come il movimento e la riproduzione.Quando si tenta questo protocollo, la sfida principale è ottenere tossicità ed espressione costante del peptide RAN. I principali fattori da controllare includono la temperatura del farmaco, la tempistica dei turni di temperatura e la preparazione delle piastre di dosaggio. È importante che gli sperimentatori classifichino costantemente i fenotipi degli animali in questo saggio di processo dipendente dall'età.La dimostrazione visiva di questa tecnica mostra i loro criteri di classificazione. Inizia versando il mezzo standard di crescita del nematode con un IPTG millimolare e 25 microgrammi per carbenicillina millilitro in piastre a 24 pozzetti. Striare RNAi nutrendo cloni in batteri HT115 su agar di carbenicillina LB e coltivali a 37 gradi Celsius per 24 ore.Il giorno successivo, scegli una singola colonia in un millilitro di liquido di carbenicillina LB e fai crescere i batteri per 18 ore a 37 gradi Celsius mentre tremi a 250 giri/min. Individua quattro singoli pozzi della piastra ngm RNAi 24-well con 20 microlitri di colture batteriche durante la notte come descritto nel manoscritto testuale e consenti ai batteri RNAi di indurre la produzione di RNA a doppio filamento durante la notte. Utilizzare il metodo standard dell'ipoclorito per isolare le uova dal primo giorno di C.elegans adulti che esprimono il transgene peptidico RAN integrato.Quindi seminare circa 30 uova in ogni pozzo del piatto di 24 pozzi e incubare il piatto a 20 gradi Celsius per sette giorni. Per eseguire l'analisi della velocità video, acquisire due video da due pozzi separati per ogni condizione RNAi utilizzando un microscopio stereo sezionato dotato di una fotocamera monocromatica. Assicurarsi di utilizzare impostazioni di acquisizione coerenti tra i pozzi.Per ogni video, impostare la durata per 10 secondi e l'intervallo di tempo su 76 millisecondi. Impostare il tempo di esposizione dell'immagine su quattro millisecondi e usare l'impostazione di zoom 1,49. Quindi selezionare due per due binning.Verificare che la risoluzione sia di 800 per 600 pixel e iniziare la registrazione. Dopo l'acquisizione, etichettare immediatamente ogni video con la deformazione, la condizione RNAi e il numero del pozzo. Quindi misurare la distanza percorsa e la lunghezza di ogni animale per 20 animali diversi per video, esaminando un totale di circa 40 vermi per ogni condizione RNAi.Nel software selezionare il pulsante degli strumenti di annotazione. Quindi lo strumento di testo di disegno. Fare clic su un punto al centro del worm misurato nel primo fotogramma del video e contrassegnarlo con un numero.Avanzare il video fino alla fine mentre si traccia visivamente il worm. Quindi fai clic su di esso e contrassegnalo con il numero corrispondente successivo. Utilizzare lo strumento barra di scala di disegno per disegnare una linea dal primo al secondo numero e registrare la distanza percorsa in un foglio di calcolo.Ripetere questa misurazione per altri 19 worm nel video mantenendo ogni singola misurazione nella finestra di analisi. Una volta completate le misurazioni, scatta un'istantanea del fotogramma video finale che illustra tutte le linee di misurazione in modo che i dati possano essere ricondotti all'animale da cui provengono. Analizzare quindi i dati utilizzando un foglio di calcolo a quattro colonne in cui la colonna uno è l'identificatore del worm e la colonna due è la velocità.Il tempo di ogni video può essere trovato facendo clic con il pulsante destro del mouse sul video sotto l'esperimento e andando alle proprietà. Per normalizzare la misurazione della velocità, trova la lunghezza di ogni animale. Utilizzare lo strumento di disegno polilinea per tracciare liberamente i C.elegans dalla punta della testa alla punta della coda.Quindi scatta un'istantanea del fotogramma video finale che illustra tutte le polilinee. La lunghezza delle linee sarà registrata sotto le statistiche. Aggiungere due colonne al foglio di calcolo, una per la lunghezza degli animali e una per la velocità normalizzata.Infine, analizzare i dati di velocità normalizzati utilizzando un ANOVA unidirevio con test post-hoc rispetto al vettore vuoto RNAi. Posizionare da quattro a sei C.elegans transgenici L4 che esprimono GFP peptidico RAN su una piastra GFP RNAi di sei centimetri e coltivarli a 20 gradi Celsius. Se l'esperimento utilizza RNAi per testare gli effetti genetici sulla tossicità dei peptidi RAN, spostare 10 adulti gravidi transgenici in ciascuna delle due piastre RNAi GFP RNAi o RNAi specifiche del gene.Se i mutanti vengono utilizzati per analizzare gli effetti genetici sulla tossicità dei peptidi RAN, posizionare 10 animali gravidi di tipo selvatico o mutanti che esprimono lo stesso transgene RAN su ciascuna delle due placche RNAi o GFP RNAi vettoriali vuote. Coltivali a 20 gradi Celsius per 48 ore. Scegli 10 set di 10 L4 transgenici dalle piastre RNAi e posiziona ogni set su una piastra RNAi di tre centimetri.Assicurarsi che i vermi selezionati per il saggio abbiano tutti una motilità superficialmente normale. Mettere i piatti in un sacchetto di plastica per trattenere l'umidità e incubarli a 25 gradi Celsius. Dopo 24 ore, analizzare gli animali per la mobilità toccando le piastre sul microscopio sezionante e controllando il movimento.Se un verme si muove per più di una lunghezza del corpo, contalo come mobile e trasferiscilo su una nuova piastra RNAi di tre centimetri. Usa un piccone di platino per toccare i vermi rimanenti sulla testa e sulla coda. Se l'animale si muove per più di una lunghezza del corpo, conta l'animale come mobile e trasferiscilo su una nuova piastra RNAi di tre centimetri.Se la paralisi significativa non si osserva nel controllo vettoriale vuoto entro il secondo giorno, terminare il saggio e ricominciare da capo. Raggruppa tutti i vermi nonmovibili in modo che il movimento di più di una lunghezza del corpo possa essere facilmente rilevato. Contare tutti i vermi paralizzati, insaccati o morti e scartare il piatto.Continua a segnare gli animali per la paralisi ogni giorno per cinque o sette giorni. Il test di crescita è stato utilizzato per misurare l'effetto delle inibizioni geniche sulla tossicità dei dipeptidi RAN che si trovano nei pazienti affetti da SRIA con un'espansione ripetuta del G4C2. L'espressione di PR50 GFP da sola ha portato a un arresto completo della crescita, ma l'abbattimento di diversi geni ha soppresso la tossicità dello sviluppo.L'effetto di specifiche eliminazioni geniche sulla motilità dello sviluppo degli animali che esprimono PR50 è stato misurato utilizzando il metodo di analisi della velocità video. Come previsto, l'inibizione dell'espressione di PR50 GFP ha portato a un grande aumento della motilità rispetto al vettore vuoto RNAi. Inoltre, l'RNAi contro la proteasome subunit RPN7 ha portato al significativo aumento della motilità pr50.Quando i fenotipi adulti sono stati analizzati con il test di paralisi dipendente dall'età, PR50 GFP ha mostrato fino all'80% di paralisi entro cinque giorni di età. Tuttavia, RNAi ha diretto al gene cul-6 una paralisi significativamente ritardata suggerendo che il cul-6 è necessario per la tossicità pr50 GFP. Per determinare se le proteine RAN causano neuropatologia quando espresse nei neuroni C.elegans, la tossicità specifica dei neuroni è stata esaminata usando il saggio di commissure.Nel secondo giorno gli adulti, l'espressione di PR50 GFP nei motoneuroni ha portato a un aumento significativo del sanguinamento dei motoneuroni. Questa neuropatologia è stata significativamente soppressa da una mutazione nel gene del recettore IGF dell'insulina DAF-2 che ritarda le proprietà tossiche di diverse proteine neurodegenerative. Per il saggio comportamentale, è importante che i peptidi RAN producano un fenotipo altamente penetrativo.Tali geni o farmaci potrebbero fornire nuovi biomarcatori o opzioni terapeutiche per le malattie peptidiche RAN. Usando questi test, abbiamo eseguito uno schermo RNAi a livello genomico per soppressori della prolina-arginina peptidica RAN associata al C9ORF72. I geni identificati in questo schermo includono molti geni nuovi e conservati che saranno oggetto di futuri studi meccanicistici.

Research

JoVE Journal

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