Name: measuring ran peptide toxicity in c. elegans
Uploaded: 2020-04-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans at JoVE.com

NIH R21NS107797

1. 코돈 다양한 RAN 펩타이드 발현 구문 생성
<ol><li>기본 반복 DNA / RNA 구조를 제거하지만 오버 레이딩 아미노산 서열을 보존하기 위해 동의어 코돈활용 개별 RAN 펩타이드 코딩 서열을 설계합니다.</li>
	<li>스터디에 필요한 반복 길이(일반적으로 5-100회 반복)에서 사용자 지정 코돈 서열을 상업적으로 주문합니다. pPD95.79와 같은 C. elegans 발현 벡터로 의 클로닝을 용이하게 하기 위해 5' 말단에 H...

<ol>
	<li>Cleary, J. D., Ranum, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeat+associated+non-ATG+(RAN)+translation:+new+starts+in+microsatellite+expansion+disorders.">Repeat associated non-ATG (RAN) translation: new starts in microsatellite expansion disorders.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 26, 6-15 (2014).</li><li>The Huntington's Disease Collaborative Research Group. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+gene+containing+a+trinucleotide+repeat+that+is+expanded+and+unstable+on+Huntington's+disease+chromosomes.">A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes.</a> Cell. 72 (6), 971-983 (1993).</li><li>Scherzinger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntingtin-encoded+polyglutamine+expansions+form+amyloid-like+protein+aggregates+in+vitro+and+in+vivo.">Huntingtin-encoded polyglutamine expansions form amyloid-like protein aggregates in vitro and in vivo.</a> Cell. 90 (3), 549-558 (1997).</li><li>Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+threshold+for+polyglutamine-expansion+protein+aggregation+and+cellular+toxicity+is+dynamic+and+influenced+by+aging+in+Caenorhabditis+elegans.">The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99 (16), 10417-10422 (2002).</li><li>Genetic Modifiers of Huntington's Disease Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electronic+address,+g.+h.+m.+h.+e.,+Genetic+Modifiers+of+Huntington's+Disease,+C.+CAG+Repeat+Not+Polyglutamine+Length+Determines+Timing+of+Huntington's+Disease+Onset.">Electronic address, g. h. m. h. e., Genetic Modifiers of Huntington's Disease, C. CAG Repeat Not Polyglutamine Length Determines Timing of Huntington's Disease Onset.</a> Cell. 178 (4), 887-900 (2019).</li><li>Wright, G. E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Length+of+Uninterrupted+CAG,+Independent+of+Polyglutamine+Size,+Results+in+Increased+Somatic+Instability,+Hastening+Onset+of+Huntington+Disease.">Length of Uninterrupted CAG, Independent of Polyglutamine Size, Results in Increased Somatic Instability, Hastening Onset of Huntington Disease.</a> American Journal of Human Genetics. 104 (6), 1116-1126 (2019).</li><li>Cleary, J. D., Ranum, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeat-associated+non-ATG+(RAN)+translation+in+neurological+disease.">Repeat-associated non-ATG (RAN) translation in neurological disease.</a> Human Molecular Genetics. 22 (1), 45-51 (2013).</li><li>Banez-Coronel, M., Ranum, L. P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeat-associated+non-AUG+(RAN)+translation:+insights+from+pathology.">Repeat-associated non-AUG (RAN) translation: insights from pathology.</a> Laboratory Investigation. 99 (7), 929-942 (2019).</li><li>Banez-Coronel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAN+Translation+in+Huntington+Disease.">RAN Translation in Huntington Disease.</a> Neuron. 88 (4), 667-677 (2015).</li><li>Ash, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unconventional+translation+of+C9ORF72+GGGGCC+expansion+generates+insoluble+polypeptides+specific+to+c9FTD/ALS.">Unconventional translation of C9ORF72 GGGGCC expansion generates insoluble polypeptides specific to c9FTD/ALS.</a> Neuron. 77 (4), 639-646 (2013).</li><li>Kramer, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+screens+in+human+cells+and+primary+neurons+identify+modifiers+of+C9ORF72+dipeptide-repeat-protein+toxicity.">CRISPR-Cas9 screens in human cells and primary neurons identify modifiers of C9ORF72 dipeptide-repeat-protein toxicity.</a> Nature Genetics. 50 (4), 603-612 (2018).</li><li>Boeynaems, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+screen+connects+nuclear+transport+genes+to+DPR+pathology+in+c9ALS/FTD.">Drosophila screen connects nuclear transport genes to DPR pathology in c9ALS/FTD.</a> Scientific Reports. 6, 20877 (2016).</li><li>Jovicic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modifiers+of+C9orf72+dipeptide+repeat+toxicity+connect+nucleocytoplasmic+transport+defects+to+FTD/ALS.">Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS.</a> Nature Neuroscience. 18 (9), 1226-1229 (2015).</li><li>Boeynaems, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+Separation+of+C9orf72+Dipeptide+Repeats+Perturbs+Stress+Granule+Dynamics.">Phase Separation of C9orf72 Dipeptide Repeats Perturbs Stress Granule Dynamics.</a> Molecular Cell. 65 (6), 1044-1055 (2017).</li><li>Lee, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C9orf72+Dipeptide+Repeats+Impair+the+Assembly,+Dynamics,+and+Function+of+Membrane-Less+Organelles.">C9orf72 Dipeptide Repeats Impair the Assembly, Dynamics, and Function of Membrane-Less Organelles.</a> Cell. 167 (3), 717-788 (2016).</li><li>Hao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+dysfunction+and+neurodegeneration+in+a+C9orf72+mouse+line+expressing+poly-PR.">Motor dysfunction and neurodegeneration in a C9orf72 mouse line expressing poly-PR.</a> Nature Communications. 10 (1), 2906 (2019).</li><li>Scior, A., Preissler, S., Koch, M., Deuerling, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+PCR-free+engineering+of+highly+repetitive+DNA+sequences.">Directed PCR-free engineering of highly repetitive DNA sequences.</a> BMC Biotechnology. 11, 87 (2011).</li><li>Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+transformation.">DNA transformation.</a> Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).</li><li>Rudich, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+localized+C9orf72-associated+arginine-containing+dipeptides+exhibit+age-dependent+toxicity+in+C.+elegans.">Nuclear localized C9orf72-associated arginine-containing dipeptides exhibit age-dependent toxicity in C. elegans.</a> Human Molecular Genetics. 26 (24), 4916-4928 (2017).</li><li>Gidalevitz, T., Krupinski, T., Garcia, S., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Destabilizing+protein+polymorphisms+in+the+genetic+background+direct+phenotypic+expression+of+mutant+SOD1+toxicity.">Destabilizing protein polymorphisms in the genetic background direct phenotypic expression of mutant SOD1 toxicity.</a> PLoS Genetics. 5 (3), 1000399 (2009).</li><li>Nollen, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNA+interference+screen+identifies+previously+undescribed+regulators+of+polyglutamine+aggregation.">Genome-wide RNA interference screen identifies previously undescribed regulators of polyglutamine aggregation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 101 (17), 6403-6408 (2004).</li><li>Satyal, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyglutamine+aggregates+alter+protein+folding+homeostasis+in+Caenorhabditis+elegans.">Polyglutamine aggregates alter protein folding homeostasis in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (11), 5750-5755 (2000).</li><li>Boccitto, M., Lamitina, T., Kalb, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Daf-2+signaling+modifies+mutant+SOD1+toxicity+in+C.+elegans.">Daf-2 signaling modifies mutant SOD1 toxicity in C. elegans.</a> PLoS One. 7 (3), 33494 (2012).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C9orf72+BAC+Mouse+Model+with+Motor+Deficits+and+Neurodegenerative+Features+of+ALS/FTD.">C9orf72 BAC Mouse Model with Motor Deficits and Neurodegenerative Features of ALS/FTD.</a> Neuron. 90 (3), 521-534 (2016).</li><li>Peters, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+C9ORF72+Hexanucleotide+Expansion+Reproduces+RNA+Foci+and+Dipeptide+Repeat+Proteins+but+Not+Neurodegeneration+in+BAC+Transgenic+Mice.">Human C9ORF72 Hexanucleotide Expansion Reproduces RNA Foci and Dipeptide Repeat Proteins but Not Neurodegeneration in BAC Transgenic Mice.</a> Neuron. 88 (5), 902-909 (2015).</li><li>O'Rourke, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C9orf72+BAC+Transgenic+Mice+Display+Typical+Pathologic+Features+of+ALS/FTD.">C9orf72 BAC Transgenic Mice Display Typical Pathologic Features of ALS/FTD.</a> Neuron. 88 (5), 892-901 (2015).</li><li>Mizielinska, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C9orf72+repeat+expansions+cause+neurodegeneration+in+Drosophila+through+arginine-rich+proteins.">C9orf72 repeat expansions cause neurodegeneration in Drosophila through arginine-rich proteins.</a> Science. 345 (6201), 1192-1194 (2014).</li><li>Krajacic, P., Shen, X., Purohit, P. K., Arratia, P., Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanical+profiling+of+Caenorhabditis+elegans+motility.">Biomechanical profiling of Caenorhabditis elegans motility.</a> Genetics. 191 (3), 1015-1021 (2012).</li><li>Zhang, L., Ward, J. D., Cheng, Z., Dernburg, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+auxin-inducible+degradation+(AID)+system+enables+versatile+conditional+protein+depletion+in+C.+elegans.">The auxin-inducible degradation (AID) system enables versatile conditional protein depletion in C. elegans.</a> Development. 142 (24), 4374-4384 (2015).</li></ol>

여기에서 우리는 근육또는 C. elegans의신경에서 모델링된 RAN 펩티드 독성을 분석하기 위하여 이용될 수 있는 방법을 보고합니다. 신경 퇴행성 단백질은 인간 환자에서 나이 개시 표현형을 가지고 있는 동안, 그(것)들은 또한 모형 시스템에서 과발현될 때 발달 독성을 전시할 수 있습니다. 과발현은 유의한 해석적 한계를 가지고 있지만, 독성 표현형을 역전시킬 수 있는 유전자 또는 약물을 식...

DNA 반복 서열의 부적절한 확장은 근위축성 측삭 경화증(ALS), 전두측두엽 치매(FTD), 헌팅턴병(HD)1과같은 여러 신경 퇴행성 질환에 대한 유전적 기초이다. 이 질병을 위한 설치한 세포와 동물 모형이 있는 동안, 이 조건의 밑에 기계장치는 잘 정의되지 않습니다. 예를 들어, 헌팅틴 단백질Htt2에대한 코딩 서열에서 CAG 반복 서열의 확장에 의해 헌팅턴파가 발생한다. CAG는 아미노산 글루타민을 인코딩하기 때문에, CAG 반복 팽창은 Htt. 확장폴리Q 단백질 형성 길이 및 연령에 따른 단백질 응집체를 형성하여 폴리글루타민 또는 폴리Q의 삽입을 초래한다3,,4. 놀랍게도, 2개의 최근 연구는 polyQ 서열의 길이가 헌팅턴병 발병의 주요 동인이 아니라는 것을 시사하며, 폴리Q 독립적 인 요인이 또한 질병5,,6에기여할 수 있음을 시사한다.
한 가지 가능한 polyQ 독립적 인 메커니즘은 Repeat A연관 된 N온 - AUG 의존적 (RAN) 번역7이라고불리는 새로 발견된 유형의 단백질 번역을 포함한다. 이름에서 알 수 있듯이 RAN 번역은 확장된 반복 시퀀스가 있고 표준 시작 코돈이 필요하지 않은 경우에만 발생합니다. 따라서 RAN 번역은 3개의 뚜렷한 폴리펩티드를 생성하기 위해 반복의 세 개의 판독 프레임 에서 모두 발생한다. 또한, 많은 유전자가 또한 확장된 반복 서열의 역보체를 포함하는 안티센스 전사체를 생성하기 때문에, RAN 번역은 또한 안티센스 전사체의 세 개의 판독 프레임 에서 발생한다. 함께, RAN 번역은 1개의 펩티드에서 6개의 펩티드에 확장된 반복 함유 DNA 서열에서 생성된 단백질의 수를 확장합니다. 현재까지, RAN 번역은 적어도 8개의 상이한 반복 확장장애8에서관찰되었다. RAN 펩티드는 사후 환자 샘플에서 관찰되며 환자가 확장 된 반복을운반하는 경우에만9,10. 이 펩티드는 참을성 있는 세포에서 명확하게 나타나있는 동안, 질병 병리생리학에 그들의 기여는 불분명합니다.
RAN 펩티드와 관련된 잠재적 독성을 더 잘 정의하기 위해, 여러 그룹은 효모, 파리, 마우스 및 조직 배양 세포11,,12,,13,,14,,15,,16과같은 다양한 모델 시스템에서 각 펩티드를 발현하였다. 발현을 위한 반복 서열을 이용하는 대신, 이 모형은 반복 순서가 제거되고 아미노산 순서가 보존되는 코돈 변이 접근을 채택합니다. 번역 개시는 정식 ATG를 통해 발생하고 펩티드는 전형적으로 N- 또는 C-말단에서 형광 단백질에 융합되며, 둘 중 어느 것도 RAN 펩티드 독성을 방해하는 것으로 나타나지 않습니다. 따라서 각 구문은 단일 RAN 펩티드를 과발현합니다. RAN 펩타이드 독성을 측정하는 간단한 분석을 통해 다세포 유기체에서 상이한 RAN 제품을 모델링하는 것은 각 질병을 유발하는 반복 확장으로부터의 상이한 RAN 생성물이 세포 기능 장애 및 신경 변성에 어떻게 기여하는지 이해하는 데 매우 중요합니다.
다른 모델 시스템과 마찬가지로 C. elegans는 RAN 펩타이드 독성과 같은 새로운 질병 메커니즘에 대한 연구를 가능하게 하는 유연하고 효율적인 실험 플랫폼을 제공합니다. 웜은 RAN 펩티드 독성의 다른 모델에서 현재 사용할 수없는 몇 가지 독특한 실험 특성을 제공합니다. 첫째, C. 예쁜꼬마선충은 태어날 때부터 죽음까지 광학적으로 투명합니다. 이것은 살아있는 동물에 있는 신경 변성의 생체 내 분석 뿐만 아니라 RAN 펩티드 발현 및 현지화의 간단한 시각화를 허용합니다. 둘째, RAN 펩티드 발현 모델을 생성하기 위한 형질전환 방법은 저렴하고 빠릅니다. C. elegans의짧은 3 일 수명 주기를 감안할 때, 세포 형 특정 방식으로 임의의 주어진 RAN 펩티드를 발현하는 안정적인 형질전환 라인은 1 주일 이내에 생성 될 수있다. 셋째, 간단한 자형질 출력은 화학적 돌연변이 발생 또는 RNAi 스크리닝과 같은 유전자 스크리닝 방법과 결합되어 RAN 펩타이드 독성에 필수적인 유전자를 신속하게 식별할 수 있습니다. 마지막으로, C. elegans의 짧은 수명 (~20 일)은 대부분의 반복 확장 질병에 대한 가장 큰 위험 인자인 노화가 RAN 펩티드 독성에 미치는 영향을 결정하는 방법을 조사합니다. 함께, 실험 속성의이 조합은 다른 모델 시스템에서 타의 추종을 불허하 고 RAN 펩 티 드 독성의 연구를 위한 강력한 플랫폼을 제공 합니다.
여기에서 우리는 RAN 펩티드의 독성을 측정하고 이 독성의 유전 수정자를 확인하기 위하여 C. elegans의 실험적인 이점을 활용하는 몇몇 측정을 기술합니다. 코돈-다양한 ATG-개시 RAN 펩타이드는 GFP로 태그가 지정되고 myo-3 프로모터 아래의 근육 세포 또는 unc-47 프로모터 하에서 GABAergic 운동 뉴런에서 개별적으로 발현됩니다. 근육 세포에서의 발현을 위해, 독성 RAN 펩타이드는 녹색 형광 단백질(GFP) 또는 RNAi 공급 벡터로 표적화될 수 있는 다른 형광 단백질(FP) 태그로 태그가 지정되는 것이 중요합니다. 이는 독성 RAN 펩타이드 발현이 일반적으로 성장을 차단하기 때문에 이러한 균주를 불가능시로 렌더링합니다. gfp (RNAi)의 사용은 조건부 RAN 펩타이드 발현을 비활성화하고 긴장 유지, 유전 십자가 등을 허용합니다. 검안의 경우, 이들 동물은 gfp(RNAi)에서제거되어 RAN 펩타이드및 생성된 표현형의 발현을 허용한다. 코돈-다양한 RAN 펩타이드 발현 구조를 설계하기 위한 분자 전략 외에도, 우리는 발달 독성(애벌레 운동성 및 성장 분석), 개발 후 연령 관련 독성(마비 분석) 및 신경 형태학적 결함(commissure assay)을 측정하기 위한 분석서를 설명합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>35mm x 10mm Petri Dish, Sterile</td>
			<td>CELLTREAT Scientific Products</td>
			<td>50-202-036</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AGAR GRANULATED 2KILOGRAM</td>
			<td>BD DIAGNOSTIC SYSTEMS</td>
			<td>DF0145070</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AGAROSE ULTRAPURE</td>
			<td>LIFE TECHNOLOGIES</td>
			<td>16500500</td>
			<td>Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CARBENICILLIN 5G</td>
			<td>THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS</td>
			<td>BP26485</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COVER GLASSES NO 1 22MM 1OZ/PK</td>
			<td>THERMO SCI ERIE</td>
			<td>12542B</td>
			<td>Imaging for commissure assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FEMOTIPS DISPSBL MICROINJ 20CS</td>
			<td>EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS</td>
			<td>E5242952008</td>
			<td>Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FF COV GLASS NO1 40X22MM 1OZPK</td>
			<td>THERMO SCI ERIE</td>
			<td>125485C</td>
			<td>Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>THERMO SCI ERIE</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td>Imaging for commissure assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;Bacto Peptone&#160;</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>DF0118-17-0</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HALOCARBON OIL 700</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH INC</td>
			<td>H8898-50ML</td>
			<td>Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG BIOTECH 10G</td>
			<td>THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS</td>
			<td>BP162010</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Advanced Fluorescence imaging software</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>LAS-AF</td>
			<td>Image acquisition software for video speed analysis and commissure assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Immersion type N (Oil)</td>
			<td>W NUHSBAUM INC</td>
			<td>NC9547002</td>
			<td>Imaging for commissure assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEVAMISOLE HYDROCHLORIDE 10GR</td>
			<td>THERMO SCI ACROS ORGANICS</td>
			<td>AC187870100</td>
			<td>Imaging for commissure assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROLOADER TIPS 2 X 96 PCS</td>
			<td>EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS</td>
			<td>E5242956003</td>
			<td>Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			PETRI DISH, 60X15MM,500/CS</td>
			<td>CORNING LIFE SCIENCES PLASTIC</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TISSUE CULT PLATE 24WEL 50/CS</td>
			<td>CORNING LIFE SCIENCES DL</td>
			<td>87721</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring ran peptide toxicity in c. elegans

C. 예쁜꼬마선충은 근위축성 측삭경화증(ALS) 및 헌팅턴병과 같은 반복적인 팽창 돌연변이로 인한 노화 관련 신경퇴행성 질환을 모델링하는 데 일반적으로 사용됩니다. 최근, 반복 팽창-함유 RNA는 반복-관련 비-8월 의존적(RAN) 번역이라고 불리는 단백질 번역의 새로운 유형에 대한 기질로 나타났다. 표준 번역과 달리 RAN 번역은 시작 코돈이 필요하지 않으며 반복이 임계값 길이를 초과하는 경우에만 발생합니다. 판독 프레임을 결정하는 시작 코돈이 없기 때문에, RAN 번역은 반복 확장 서열을 포함하는 센스 및 안티센스 RNA 템플릿 모두에서 모든 판독 프레임에서 발생한다. 따라서 RAN 번역은 가능한 질병 관련 독성 펩티드의 수를 1개에서 6개로 확장합니다. 지금까지, RAN 번역은 8개의 상이한 확장 기반 신경퇴행성 및 신경근육 질환에서 문서화되었다. 각각의 경우에, RAN 제품이 유독한, 뿐만 아니라 독성의 그들의 기계장치, 이 펩티드가 질병 병리생리학에 어떻게 기여하는지 이해하는 쪽으로 중요한 단계입니다. 이 백서에서는 모델 시스템 C. elegans에서RAN 펩타이드의 독성을 측정하는 전략을 제시합니다. 첫째, 우리는 C. elegans개발의 성장 그리고 운동성에 RAN 펩티드 독성을 측정하기위한 절차를 설명합니다. 둘째, 우리는 운동성에 RAN 펩티드의 후 개발, 연령 의존적 효과를 측정하기위한 분석을 자세히 설명합니다. 마지막으로, 우리는 신경 형태에 RAN 펩티드의 효력을 평가하기 위한 신경 독성 분석학을 기술합니다. 이 시험은 RAN 펩티드 독성의 광범위한 평가를 제공하고 질병 기계장치 또는 치료를 확인하기 위하여 대규모 유전 또는 작은 분자 스크린을 능력을 발휘하기 위하여 유용할 지도 모릅니다.

우리는G4C2 반복 확장을 가진 ALS 환자에서 발견되는 RAN 디펩티드의 독성에 대한 상이한 유전자 억제의 효과를 평가하기 위하여 여기에서 기술된 분석을 이용했습니다. 성장 분석기를 사용하여 발달 독성을 측정하고, 근육 발현 PR50-GFP 독성의 게놈 전체 RNAi 스크린 억제기에서 확인된 몇몇 유전 녹아웃 돌연변이체의 효과를 분석했습니다. PR50-GFP의 발현만으로도 완전히 침투성 성장?...

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Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

반복-관련 비-ATG 의존적 번역 제품은 여러 반복 확장 기반 질병의 새로운 병원성 특징이다. 기재된 프로토콜의 목적은 모델 시스템 C. elegans에서행동 및 세포 분석술을 사용하여 이들 펩티드에 의한 독성을 평가하는 것이다.

C. 예쁜꼬마선충에서 RAN 펩타이드 독성 측정

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis ...

RAN 펩티드는 헌팅턴병, 근위축성 측삭 경화증 및 전두엽 치매와 같은 반복팽창 신경퇴행성 질환의 특징입니다. 이러한 프로토콜은 C.elegans 모델 시스템에서 RAN 펩타이드 독성을 정량화하기 위한 중요한 표준화된 접근법을 제공합니다. 설명된 기술은 배우기 쉽고 저렴하며 신속하게 수행 할 수 있으며 움직임 및 재생과 같은 C.elegans 시스템의 재현 가능한 기능을 활용합니다.이 프로토콜을 시도할 때, 중요한 도전은 일관된 RAN 펩티드 독성 및 발현을 얻는 것입니다. 제어할 주요 요인은 약물 온도, 온도 변화 타이밍 및 분석 플레이트의 준비를 포함합니다. 실험자가 이 연령의존적 과정에서 동물의 표현형을 일관되게 분류하는 것이 중요합니다.이 기술의 시각적 데모는 분류 기준을 보여줍니다. 먼저 1밀리몰러 IPTG와 밀리리터 카베니실린 당 25 마이크로그램으로 표준 선충 성장 배지를 24웰 플레이트에 붓는 것으로 시작합니다. HT115 박테리아에서 RNAi 먹이 클론을 LB 카베니실린 한천에 줄이면 24 시간 동안 섭씨 37도에서 자랍니다.다음 날, 하나의 식민지를 LB 카베니실린 액체 매체의 1 밀리리터로 선택하고 250 rpm에서 흔들리는 동안 섭씨 37도에서 18 시간 동안 박테리아를 성장시다. 텍스트 원고에 설명된 바와 같이 하룻밤 세균 배양 20 마이크로리터를 함유한 NGM RNAi 24웰 플레이트의 4개의 개별 우물을 발견하고 RNAi 박테리아가 하룻밤 사이에 이중 좌초 RNA 생산을 유도하도록 허용한다. 표준 hypochlorite 방법을 사용하여 통합 된 RAN 펩티드 트랜스진을 표현하는 성인 C.elegans가 첫날부터 계란을 분리합니다.그런 다음 약 30 개의 계란을 24 웰 플레이트의 각 우물에 넣고 7 일 동안 섭씨 20도에서 접시를 배양합니다. 비디오 속도 분석을 수행하려면 흑백 카메라가 장착된 스테레오 해부 현미경을 사용하여 각 RNAi 상태에 대해 두 개의 개별 우물에서 두 개의 비디오를 획득하십시오. 우물 간에 일관된 획득 설정을 사용해야 합니다.각 비디오에 대해 10초 동안 지속 시간을 설정하고 시간 간격을 76밀리초로 설정합니다. 이미지 노출 시간을 4밀리초로 설정하고 1.49 줌 설정을 사용합니다. 그런 다음 두 개의 비닝으로 두 가지를 선택합니다.해상도가 800x 600픽셀인지 확인하고 레코딩을 시작합니다. 획득 후 각 비디오에 스트레인, RNAi 상태 및 음수로 즉시 레이블을 지정합니다. 그런 다음 비디오 당 20 개의 다른 동물에 대한 이동 거리와 각 동물의 길이를 측정하여 각 RNAi 상태에 대해 총 40 개의 벌레를 검사합니다.소프트웨어에서 어반기 도구 단추를 선택합니다. 그런 다음 텍스트 그리기 도구입니다. 비디오의 첫 번째 프레임에서 측정되는 웜 중앙의 점을 클릭하고 숫자로 표시합니다.웜을 시각적으로 추적하면서 비디오를 끝까지 진행합니다. 그런 다음 클릭하고 다음 해당 번호로 표시합니다. 그리기 배율 막대 도구를 사용하여 첫 번째 숫자에서 두 번째 번호로 선을 그리고 스프레드시트에서 이동한 거리를 기록합니다.분석 창에서 각 개별 측정을 유지하면서 비디오에서 19개의 다른 웜에 대해 이 측정을 반복합니다. 측정이 완료되면 모든 측정 라인을 설명하는 최종 비디오 프레임의 스냅샷을 찍어 데이터를 원래의 동물로 다시 추적할 수 있습니다. 다음으로 열이 웜 식별자이고 열 2가 속도인 4열 스프레드시트를 사용하여 데이터를 분석합니다.각 비디오의 시간은 실험 에서 비디오를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 속성으로 이동하여 찾을 수 있습니다. 속도 측정을 정상화하려면 각 동물의 길이를 찾습니다. 그리기 폴리라인 도구를 사용하여 머리 끝에서 꼬리 끝까지 C.elegans를 자유롭게 추적할 수 있습니다.그런 다음 모든 폴리라인을 설명하는 최종 비디오 프레임의 스냅샷을 찍습니다. 선의 길이는 통계에 따라 기록됩니다. 스프레드시트에 두 개의 열을 추가합니다.마지막으로, 빈 벡터 RNAi 대 후 호크 테스트를 통해 단방향 ANOVA를 사용하여 정규화된 속도 데이터를 분석합니다. 6센티미터 GFP RNAi 플레이트에 RAN 펩타이드 GFP를 표현하는 4-6개의 형질형 L4 C.elegans를 배치하고 섭씨 20도에서 자랍니다. 실험이 RNAi를 활용하여 RAN 펩티드 독성에 대한 유전적 효과를 테스트하는 경우, 10명의 형질전환 그라피드 성인을 각각 2개의 빈 벡터 RNAi GFP RNAi 또는 유전자 특이적 RNAi 플레이트로 이동시한다.돌연변이가 RAN 펩티드 독성에 대한 유전적 효과를 분석하는 데 사용되는 경우, 2개의 빈 벡터 RNAi 또는 GFP RNAi 플레이트 각각에 동일한 RAN 트랜스진을 발현하는 10개의 중력 야생 형 또는 돌연변이 동물을 배치한다. 섭씨 20도에서 48시간 동안 자랍니다. RNAi 플레이트에서 10개의 트랜스제닉 L4 10세트를 선택하고 각 세트를 3센티미터 RNAi 플레이트에 놓습니다.분석에서 선택한 웜이 모두 피상적으로 정상적인 운동성을 가지고 있는지 확인합니다. 수분을 유지하고 섭씨 25도에서 배양하기 위해 접시를 비닐 봉지에 넣습니다. 24시간 후, 해부 현미경의 판을 탭하고 움직임을 확인하여 동물을 이동성을 분석합니다.웜이 몸 길이 이상으로 이동하는 경우, 이동체로 계산하고 새로운 3센티미터 RNAi 플레이트로 전송합니다. 백금 선택을 사용하여 머리와 꼬리에 남은 웜을 누릅니다. 동물이 몸 길이 보다 더 이동하는 경우, 이동으로 동물을 계산하고 새로운 3 센티미터 RNAi 플레이트로 전송합니다.2일째까지 빈 벡터 컨트롤에서 중요한 마비가 관찰되지 않으면 분석서를 종료하고 다시 시작합니다. 체길이 이상의 움직임을 쉽게 감지할 수 있도록 모든 비이동 웜을 함께 그룹화합니다. 마비, 짐, 죽은 벌레를 모두 계산하고 접시를 폐기하십시오.5~7일 동안 매일 마비동물에게 점수를 계속 주어보겠습니다. 성장 분석은 G4C2 반복 확장을 가진 ALS 환자에서 발견되는 RAN 디펩티드의 독성에 대한 유전자 억제의 효과를 측정하는 데 사용되었다. PR50 GFP의 발현은 완전한 성장 체포의 결과로, 그러나 몇몇 유전자의 녹다운은 발달 독성을 억압했습니다.특정 유전자 녹다운의 효과는 비디오 속도 분석 방법을 사용하여 측정된 PR50 표현 동물의 발달 운동성에 대한 것이다. 예상대로, PR50 GFP 발현의 억제는 빈 벡터 RNAi에 비해 운동성이 크게 증가하였다. 더욱이, 프로테솜 서브유닛 RPN7에 대한 RNAi는 PR50 운동성의 현저한 증가를 초래했다.성인 표현형이 연령 의존성 마비 분석으로 분석되었을 때 PR50 GFP는 5일까지 최대 80%의 마비를 보였습니다. 그러나, RNAi는 유전자 cul-6을 지시하여 PR50 GFP 독성에 대해 cul-6이 필요하다는 것을 시사하는 마비를 현저히 지연시켰다. RAN 단백질이 C.elegans 뉴런에서 발현될 때 신경 병리학을 일으키는지 결정하기 위해, 신경 특이적 독성은 commissure 분석기를 사용하여 검토되었다.둘째 날 성인, 모터 뉴런에서 PR50 GFP 발현은 운동 신경 출혈의 상당한 증가로 이어졌다. 이러한 신경병리학은 인슐린 IGF 수용체 유전자 homolog DAF-2의 돌연변이에 의해 현저하게 억제되어 여러 신경 퇴행성 단백질의 독성 특성을 지연시켰다. 행동 분석의 경우, RAN 펩티드가 매우 침투성 표현형을 생성하는 것이 중요하다.이러한 유전자 또는 약물 RAN 펩티드 질병에 대 한 새로운 바이오 마커 또는 치료 옵션을 제공할 수 있습니다. 이러한 분석은 이러한 분석은, 우리는 C9ORF72 관련 RAN 펩티드 프롤린-아르기닌의 억제기를 위한 게놈 전체 RNAi 스크린을 수행했습니다. 이 스크린에서 확인된 유전자는 미래 기계학 연구 결과의 주제가 될 많은 새롭고 보존된 유전자를 포함합니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Microinjection을 사용하여 안정적인 트렌스​​ 제닉 C. 엘레간스의 생성

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

연구

생물학

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

트렌스 제닉의 생성 C. 엘레간스 Biolistic 변환에 의해

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

측정 Caenorhabditis 엘레간스</em96 웰 플레이트에 Microtiter> 수명

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

에 Postembryonic Phenotypes을 식별하기 위해 RNAi 심사 C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles

대형 Unilamellar Vesicles로 펩타이드의 Translocation 측정

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1.  Many of these are referred ...

C. elegans Chemotaxis Assay

C. elegans Chemotaxis Assay

C. elegans의 주 화성 분석

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

항체 염색법에<em&gt; C. 엘레</em&gt; &quot;동결 크래킹 사용&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

에 박테리아의 효과를 측정<em&gt; C. 엘레</em계란 보존 분석을 사용하여&gt; 행동

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

허혈 / 재관류에 대한 산소 결핍 - 기아 모델<em&gt; C. 엘레</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

에 상처 응답에 대한 피부 상처에 대한 방법 및 분석 실험<em&gt; C. 엘레</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...