Name: measuring ran peptide toxicity in c. elegans
Uploaded: 2020-04-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans at JoVE.com

NIH R21NS107797

1. Generere codon-varierte RAN peptid uttrykk konstruksjoner
<ol><li>Design den enkelte RAN peptid koding sekvens ved hjelp av synonymt codons å eliminere den grunnleggende repeterende DNA / RNA struktur, men bevare overliggende aminosyre sekvens.</li>
	<li>Bestill de egendefinerte codonsekvensene kommersielt ved de gjentatte lengdene som trengs for studiene (vanligvis 5–100 repetisjoner). Inkluder et HindIII-restriksjonssted ved 5's slutten og et BamHI-restriksjonssted ved utgangen av 3-tallet for å legge til rett...

<ol>
	<li>Cleary, J. D., Ranum, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeat+associated+non-ATG+(RAN)+translation:+new+starts+in+microsatellite+expansion+disorders.">Repeat associated non-ATG (RAN) translation: new starts in microsatellite expansion disorders.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 26, 6-15 (2014).</li><li>The Huntington's Disease Collaborative Research Group. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+gene+containing+a+trinucleotide+repeat+that+is+expanded+and+unstable+on+Huntington's+disease+chromosomes.">A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes.</a> Cell. 72 (6), 971-983 (1993).</li><li>Scherzinger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntingtin-encoded+polyglutamine+expansions+form+amyloid-like+protein+aggregates+in+vitro+and+in+vivo.">Huntingtin-encoded polyglutamine expansions form amyloid-like protein aggregates in vitro and in vivo.</a> Cell. 90 (3), 549-558 (1997).</li><li>Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+threshold+for+polyglutamine-expansion+protein+aggregation+and+cellular+toxicity+is+dynamic+and+influenced+by+aging+in+Caenorhabditis+elegans.">The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99 (16), 10417-10422 (2002).</li><li>Genetic Modifiers of Huntington's Disease Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electronic+address,+g.+h.+m.+h.+e.,+Genetic+Modifiers+of+Huntington's+Disease,+C.+CAG+Repeat+Not+Polyglutamine+Length+Determines+Timing+of+Huntington's+Disease+Onset.">Electronic address, g. h. m. h. e., Genetic Modifiers of Huntington's Disease, C. CAG Repeat Not Polyglutamine Length Determines Timing of Huntington's Disease Onset.</a> Cell. 178 (4), 887-900 (2019).</li><li>Wright, G. E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Length+of+Uninterrupted+CAG,+Independent+of+Polyglutamine+Size,+Results+in+Increased+Somatic+Instability,+Hastening+Onset+of+Huntington+Disease.">Length of Uninterrupted CAG, Independent of Polyglutamine Size, Results in Increased Somatic Instability, Hastening Onset of Huntington Disease.</a> American Journal of Human Genetics. 104 (6), 1116-1126 (2019).</li><li>Cleary, J. D., Ranum, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeat-associated+non-ATG+(RAN)+translation+in+neurological+disease.">Repeat-associated non-ATG (RAN) translation in neurological disease.</a> Human Molecular Genetics. 22 (1), 45-51 (2013).</li><li>Banez-Coronel, M., Ranum, L. P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeat-associated+non-AUG+(RAN)+translation:+insights+from+pathology.">Repeat-associated non-AUG (RAN) translation: insights from pathology.</a> Laboratory Investigation. 99 (7), 929-942 (2019).</li><li>Banez-Coronel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAN+Translation+in+Huntington+Disease.">RAN Translation in Huntington Disease.</a> Neuron. 88 (4), 667-677 (2015).</li><li>Ash, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unconventional+translation+of+C9ORF72+GGGGCC+expansion+generates+insoluble+polypeptides+specific+to+c9FTD/ALS.">Unconventional translation of C9ORF72 GGGGCC expansion generates insoluble polypeptides specific to c9FTD/ALS.</a> Neuron. 77 (4), 639-646 (2013).</li><li>Kramer, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+screens+in+human+cells+and+primary+neurons+identify+modifiers+of+C9ORF72+dipeptide-repeat-protein+toxicity.">CRISPR-Cas9 screens in human cells and primary neurons identify modifiers of C9ORF72 dipeptide-repeat-protein toxicity.</a> Nature Genetics. 50 (4), 603-612 (2018).</li><li>Boeynaems, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+screen+connects+nuclear+transport+genes+to+DPR+pathology+in+c9ALS/FTD.">Drosophila screen connects nuclear transport genes to DPR pathology in c9ALS/FTD.</a> Scientific Reports. 6, 20877 (2016).</li><li>Jovicic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modifiers+of+C9orf72+dipeptide+repeat+toxicity+connect+nucleocytoplasmic+transport+defects+to+FTD/ALS.">Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS.</a> Nature Neuroscience. 18 (9), 1226-1229 (2015).</li><li>Boeynaems, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+Separation+of+C9orf72+Dipeptide+Repeats+Perturbs+Stress+Granule+Dynamics.">Phase Separation of C9orf72 Dipeptide Repeats Perturbs Stress Granule Dynamics.</a> Molecular Cell. 65 (6), 1044-1055 (2017).</li><li>Lee, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C9orf72+Dipeptide+Repeats+Impair+the+Assembly,+Dynamics,+and+Function+of+Membrane-Less+Organelles.">C9orf72 Dipeptide Repeats Impair the Assembly, Dynamics, and Function of Membrane-Less Organelles.</a> Cell. 167 (3), 717-788 (2016).</li><li>Hao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+dysfunction+and+neurodegeneration+in+a+C9orf72+mouse+line+expressing+poly-PR.">Motor dysfunction and neurodegeneration in a C9orf72 mouse line expressing poly-PR.</a> Nature Communications. 10 (1), 2906 (2019).</li><li>Scior, A., Preissler, S., Koch, M., Deuerling, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+PCR-free+engineering+of+highly+repetitive+DNA+sequences.">Directed PCR-free engineering of highly repetitive DNA sequences.</a> BMC Biotechnology. 11, 87 (2011).</li><li>Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+transformation.">DNA transformation.</a> Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).</li><li>Rudich, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+localized+C9orf72-associated+arginine-containing+dipeptides+exhibit+age-dependent+toxicity+in+C.+elegans.">Nuclear localized C9orf72-associated arginine-containing dipeptides exhibit age-dependent toxicity in C. elegans.</a> Human Molecular Genetics. 26 (24), 4916-4928 (2017).</li><li>Gidalevitz, T., Krupinski, T., Garcia, S., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Destabilizing+protein+polymorphisms+in+the+genetic+background+direct+phenotypic+expression+of+mutant+SOD1+toxicity.">Destabilizing protein polymorphisms in the genetic background direct phenotypic expression of mutant SOD1 toxicity.</a> PLoS Genetics. 5 (3), 1000399 (2009).</li><li>Nollen, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNA+interference+screen+identifies+previously+undescribed+regulators+of+polyglutamine+aggregation.">Genome-wide RNA interference screen identifies previously undescribed regulators of polyglutamine aggregation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 101 (17), 6403-6408 (2004).</li><li>Satyal, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyglutamine+aggregates+alter+protein+folding+homeostasis+in+Caenorhabditis+elegans.">Polyglutamine aggregates alter protein folding homeostasis in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (11), 5750-5755 (2000).</li><li>Boccitto, M., Lamitina, T., Kalb, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Daf-2+signaling+modifies+mutant+SOD1+toxicity+in+C.+elegans.">Daf-2 signaling modifies mutant SOD1 toxicity in C. elegans.</a> PLoS One. 7 (3), 33494 (2012).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C9orf72+BAC+Mouse+Model+with+Motor+Deficits+and+Neurodegenerative+Features+of+ALS/FTD.">C9orf72 BAC Mouse Model with Motor Deficits and Neurodegenerative Features of ALS/FTD.</a> Neuron. 90 (3), 521-534 (2016).</li><li>Peters, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+C9ORF72+Hexanucleotide+Expansion+Reproduces+RNA+Foci+and+Dipeptide+Repeat+Proteins+but+Not+Neurodegeneration+in+BAC+Transgenic+Mice.">Human C9ORF72 Hexanucleotide Expansion Reproduces RNA Foci and Dipeptide Repeat Proteins but Not Neurodegeneration in BAC Transgenic Mice.</a> Neuron. 88 (5), 902-909 (2015).</li><li>O'Rourke, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C9orf72+BAC+Transgenic+Mice+Display+Typical+Pathologic+Features+of+ALS/FTD.">C9orf72 BAC Transgenic Mice Display Typical Pathologic Features of ALS/FTD.</a> Neuron. 88 (5), 892-901 (2015).</li><li>Mizielinska, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C9orf72+repeat+expansions+cause+neurodegeneration+in+Drosophila+through+arginine-rich+proteins.">C9orf72 repeat expansions cause neurodegeneration in Drosophila through arginine-rich proteins.</a> Science. 345 (6201), 1192-1194 (2014).</li><li>Krajacic, P., Shen, X., Purohit, P. K., Arratia, P., Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanical+profiling+of+Caenorhabditis+elegans+motility.">Biomechanical profiling of Caenorhabditis elegans motility.</a> Genetics. 191 (3), 1015-1021 (2012).</li><li>Zhang, L., Ward, J. D., Cheng, Z., Dernburg, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+auxin-inducible+degradation+(AID)+system+enables+versatile+conditional+protein+depletion+in+C.+elegans.">The auxin-inducible degradation (AID) system enables versatile conditional protein depletion in C. elegans.</a> Development. 142 (24), 4374-4384 (2015).</li></ol>

Her rapporterer vi metoder som kan brukes til å analyse RAN peptid toksisitet modellert i muskelen eller i nevronene i C. elegans. Mens nevrodegenerative proteiner har en aldersinnsettende fenotype hos menneskelige pasienter, kan de også vise utviklingsmessig toksisitet når de er overuttrykt i modellsystemer. Overexpression har betydelige tolkende begrensninger, men det gir også et kraftig utgangspunkt for genetiske eller farmakologiske skjermer som tar sikte på å identifisere gener eller legemidler som ka...

Den upassende utvidelsen av DNA-gjentatte sekvenser er det genetiske grunnlaget for flere nevrodegenerative sykdommer som amyotrofisk lateral sklerose (ALS), frontotemporal demens (FTD) og Huntingtons sykdom (HD)1. Mens det er etablerte cellulære og dyremodeller for disse sykdommene, er mekanismer som ligger til grunn for disse forholdene ikke godt definert. For eksempel er HD forårsaket av utvidelser av en CAG-gjentakelsessekvens i kodesekvensen for Huntingtin-proteinet Htt2. Fordi CAG koder aminosyreglutamin, resulterer CAG-repetisjonsutvidelsen i innsetting av en polyglutamin, eller polyQ, sekvens i Htt. Utvidede polyQ-proteiner danner lengde- og aldersavhengige proteinaggregater som er forbundet med toksisitet3,4. Overraskende, to nyere studier tyder på at lengden på polyQ sekvensen er ikke den viktigste driveren for HS sykdom utbruddet, noe som tyder på at polyQ-uavhengige faktorer kan også bidra til sykdommen5,6.
En mulig polyQ-uavhengig mekanisme innebærer en nylig oppdaget type protein oversettelse kalt Repeat Enssociated Non-AUG-avhengig (RAN) oversettelse7. Som navnet tilsier, skjer RAN-oversettelse bare når en utvidet gjentakelsessekvens er til stede og krever ikke en kanonisk startcodon. Derfor skjer RAN-oversettelse i alle tre leserammer av repetisjonen for å produsere tre forskjellige polypeptider. I tillegg, fordi mange gener også produserer en antisense transkripsjon som inneholder omvendt komplement av den utvidede gjentakelsessekvensen, oppstår RAN-oversettelse også i alle tre leserammer av antisensetranskripsjonen. Sammen utvider RAN-oversettelse antall proteiner produsert fra en utvidet gjentatt DNA-sekvens fra ett peptid til seks peptider. Hittil har RAN oversettelse blitt observert i minst åtte forskjellige gjentatte ekspansjonsforstyrrelser8. RAN peptider observeres i postmortem pasientprøver og bare i tilfeller der pasienten bærer en utvidet gjentakelse9,10. Mens disse peptidene er tydelig tilstede i pasientceller, er deres bidrag til sykdomspatofiologi uklart.
For bedre å definere den potensielle toksisiteten forbundet med RAN peptider, har flere grupper uttrykt hvert peptid i ulike modellsystemer, for eksempel gjær, fluer, mus og vevskulturceller11,,12,13,14,15,16. I stedet for å bruke gjentakelsessekvensen for uttrykk, bruker disse modellene en codon-variasjonstilnærming der gjentakelsessekvensen elimineres, men aminosyresekvensen bevares. Oversettelsesinitiering skjer gjennom en kanonisk ATG, og peptidet er vanligvis smeltet sammen til et fluorescerende protein ved enten N- eller C-terminus, og ingen av dem ser ut til å forstyrre RAN peptidtoksisitet. Derfor overuttrykker hver konstruksjon et enkelt RAN-peptid. Modellering av de forskjellige RAN-produktene i en flercellet organisme med enkle analyser for å måle RAN peptidtoksisitet er viktig å forstå hvordan de forskjellige RAN-produktene fra hver sykdomsfremkallende gjentatt ekspansjon bidrar til cellulær dysfunksjon og nevrodegenerasjon.
Som andre modellsystemer gir C. elegans en fleksibel og effektiv eksperimentell plattform som muliggjør studier av nye sykdomsmekanismer, for eksempel RAN peptidtoksisitet. Ormer tilbyr flere unike eksperimentelle attributter som for øyeblikket ikke er tilgjengelige i andre modeller av RAN peptidtoksisitet. For det første er C. elegans optisk gjennomsiktig fra fødsel til død. Dette gjør det mulig for enkel visualisering av RAN peptid uttrykk og lokalisering, samt in vivo analyse av neurodegeneration i levende dyr. For det andre er transgene metoder for å generere RAN peptiduttrykksmodeller billig og rask. Gitt den korte tre-dagers livssyklusen til C. elegans,stabile transgene linjer som uttrykker en gitt RAN peptid på en celle-type spesifikk måte kan produseres på under en uke. For det tredje kan enkle fenotypic utganger kombineres med genetiske screeningmetoder, som kjemisk mutagenesis eller RNAi screening, for raskt å identifisere gener som er avgjørende for RAN peptidtoksisitet. Til slutt, den korte levetiden til C. elegans (~ 20 dager) tillater etterforskere å bestemme hvordan aldring, som er den største risikofaktoren for de fleste gjentatte ekspansjonssykdommer, påvirker RAN peptid toksisitet. Sammen er denne kombinasjonen av eksperimentelle attributter uovertruffen i et annet modellsystem og tilbyr en kraftig plattform for studiet av RAN peptidtoksisitet.
Her beskriver vi flere analyser som utnytter de eksperimentelle fordelene med C. elegans for å måle toksisiteten til RAN-peptider og for å identifisere genetiske modifikatorer av denne toksisiteten. De codon-varierte ATG-initierte RAN peptider er merket med GFP og uttrykkes individuelt i enten muskelceller under myo-3 arrangør eller i GABAergic motor nevroner under unc-47 arrangør. For uttrykk i muskelceller er det viktig at giftige RAN peptider er merket med grønt fluorescerende protein (GFP), eller andre fluorescerende protein (FP) tag som kan målrettes med en RNAi fôring vektor. Dette er fordi giftig RAN peptid uttrykk vanligvis blokkerer vekst, noe som gjør slike stammer ikke levedyktig. Bruken av gfp(RNAi) betinget inaktiverer RAN peptid uttrykk og tillater belastning vedlikehold, genetiske kors, etc. For analyser fjernes disse dyrene fra gfp(RNAi),som tillater uttrykk for RAN-peptidet og de resulterende fenotypene. I tillegg til den molekylære strategien for å designe codon-varierte RAN peptiduttrykkskonstruksjoner, beskriver vi analyser for måling av utviklingstoksisitet (larvemotilitet og vekstanalyse), postutviklingsalderassosiert toksisitet (lammelsesanalyse) og nevronmorfologiske defekter (commissure analyse).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>35mm x 10mm Petri Dish, Sterile</td>
			<td>CELLTREAT Scientific Products</td>
			<td>50-202-036</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AGAR GRANULATED 2KILOGRAM</td>
			<td>BD DIAGNOSTIC SYSTEMS</td>
			<td>DF0145070</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AGAROSE ULTRAPURE</td>
			<td>LIFE TECHNOLOGIES</td>
			<td>16500500</td>
			<td>Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CARBENICILLIN 5G</td>
			<td>THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS</td>
			<td>BP26485</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COVER GLASSES NO 1 22MM 1OZ/PK</td>
			<td>THERMO SCI ERIE</td>
			<td>12542B</td>
			<td>Imaging for commissure assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FEMOTIPS DISPSBL MICROINJ 20CS</td>
			<td>EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS</td>
			<td>E5242952008</td>
			<td>Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FF COV GLASS NO1 40X22MM 1OZPK</td>
			<td>THERMO SCI ERIE</td>
			<td>125485C</td>
			<td>Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>THERMO SCI ERIE</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td>Imaging for commissure assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;Bacto Peptone&#160;</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>DF0118-17-0</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HALOCARBON OIL 700</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH INC</td>
			<td>H8898-50ML</td>
			<td>Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG BIOTECH 10G</td>
			<td>THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS</td>
			<td>BP162010</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Advanced Fluorescence imaging software</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>LAS-AF</td>
			<td>Image acquisition software for video speed analysis and commissure assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Immersion type N (Oil)</td>
			<td>W NUHSBAUM INC</td>
			<td>NC9547002</td>
			<td>Imaging for commissure assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEVAMISOLE HYDROCHLORIDE 10GR</td>
			<td>THERMO SCI ACROS ORGANICS</td>
			<td>AC187870100</td>
			<td>Imaging for commissure assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROLOADER TIPS 2 X 96 PCS</td>
			<td>EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS</td>
			<td>E5242956003</td>
			<td>Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			PETRI DISH, 60X15MM,500/CS</td>
			<td>CORNING LIFE SCIENCES PLASTIC</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TISSUE CULT PLATE 24WEL 50/CS</td>
			<td>CORNING LIFE SCIENCES DL</td>
			<td>87721</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring ran peptide toxicity in c. elegans

C. elegans brukes ofte til å modellere aldersrelaterte nevrodegenerative sykdommer forårsaket av gjentatte ekspansjonsmutasjoner, som amyotrofisk lateral sklerose (ALS) og Huntingtons sykdom. Nylig ble gjentatt ekspansjonsholdig RNA vist seg å være substratet for en ny type proteinoversettelse kalt gjentatt assosiert ikke-AUG-avhengig (RAN) oversettelse. I motsetning til kanonisk oversettelse krever IKKE RAN-oversettelse en start-kodon, og oppstår bare når gjentakelser overskrider en terskellengde. Fordi det ikke er noen start codon å bestemme leserammen, OPPSTÅR RAN oversettelse i alle leserammer fra både sense og antisense RNA-maler som inneholder en gjentatt utvidelsessekvens. Ran-oversettelse utvider derfor antall mulige sykdomsrelaterte toksiske peptider fra én til seks. Så langt har RAN oversettelse blitt dokumentert i åtte forskjellige gjenta ekspansjonsbaserte nevrodegenerative og nevromuskulære sykdommer. I hvert tilfelle er dechiffrering som RAN-produkter er giftige, så vel som deres toksisitetsmekanismer, et kritisk skritt mot å forstå hvordan disse peptidene bidrar til sykdomspatiologi. I denne artikkelen presenterer vi strategier for å måle toksisiteten av RAN peptider i modellsystemet C. elegans. Først beskriver vi prosedyrer for måling av RAN peptidtoksisitet på vekst og motilitet av å utvikle C. elegans. For det andre beskriver vi en analyse for måling av postutvikling, aldersavhengige effekter av RAN-peptider på motilitet. Til slutt beskriver vi en nevrotoksisitetsanalyse for evaluering av effekten av RAN peptider på nevronmorfologi. Disse analysene gir en bred vurdering av RAN peptid toksisitet og kan være nyttig for å utføre store genetiske eller små molekylskjermer for å identifisere sykdomsmekanismer eller terapier.

Vi brukte analysene som er beskrevet her for å evaluere effekten av ulike genhemminger på toksisiteten av RAN-dipeptider som finnes hos ALS-pasienter med en G4C 2-repetisjonsutvidelse.2 Ved hjelp av vekstanalysen for å måle utviklingstoksisitet analyserte vi effekten av flere genetiske knockout-mutanter identifisert i en genomomfattende RNAi-skjermsuppressorer av muskeluttrykt PR50-GFP toksisitet. Mens uttrykk for PR50-GFP alene resulterte i en fullstendig gjennomtrengende vekststans, undertrykt...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans at JoVE.com

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Gjentatte tilknyttede ikke-ATG-avhengige translasjonelle produkter er nye patogene trekk ved flere gjentatte ekspansjonsbaserte sykdommer. Målet med den beskrevne protokollen er å evaluere toksisitet forårsaket av disse peptidene ved hjelp av atferds- og cellulære analyser i modellsystemet C. elegans.

Måling av RAN Peptid toksisitet i C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis ...

RAN peptider er et trekk ved gjentatte ekspansjon nevrodegenerative lidelser som Huntington sykdom, amyotrofisk lateral sklerose, og frontotemporal demens. Disse protokollene gir en viktig standardisert tilnærming for kvantifisering av RAN peptidtoksisitet i C.elegans modellsystem. Teknikkene som er beskrevet er enkle å lære og billig, kan utføres raskt, og utnytte reproduserbare funksjonene i C.elegans-systemet som bevegelse og reproduksjon.Når du prøver denne protokollen, er den store utfordringen å oppnå konsekvent RAN peptid toksisitet og uttrykk. De viktigste faktorene for å kontrollere inkluderer narkotikatemperatur, tidspunktet for temperaturendringer og fremstilling av analyseplater. Det er viktig for eksperimenterere å konsekvent klassifisere fenotypene til dyrene i denne aldersavhengige prosessanalysen.Visuell demonstrasjon av denne teknikken viser deres klassifiseringskriterier. Begynn med å helle standard nematodevekstmedium med en millimolar IPTG og 25 mikrogram per milliliter karbababinenicillin i 24-brønnplater. Strek ut RNAi fôring kloner i HT115 bakterier på LB carbenicillin agar og vokse dem på 37 grader Celsius i 24 timer.På neste dag, plukke en enkelt koloni i en milliliter LB carbenicillin flytende medier og vokse bakteriene i 18 timer ved 37 grader Celsius mens risting på 250 rpm. Spot fire individuelle brønner av NGM RNAi 24-brønnplaten med 20 mikroliter av bakterielle kulturer over natten som beskrevet i tekstmanuskriptet og la RNAi-bakterier indusere dobbelttrådet RNA-produksjon over natten. Bruk standard hypoklorittmetode til å isolere egg fra dag én voksen C.elegans som uttrykker den integrerte RAN peptidtransgene.Deretter frø ca 30 egg inn i hver brønn av 24-brønnsplaten og inkuber platen ved 20 grader Celsius i syv dager. For å utføre videohastighetsanalyse, hent to videoer fra to separate brønner for hver RNAi-tilstand ved hjelp av et stereodeksjonsmikroskop utstyrt med et monokromt kamera. Sørg for å bruke konsekvente anskaffelsesinnstillinger mellom brønner.For hver video angir du varigheten i 10 sekunder og tidsintervallet til 76 millisekunder. Angi bildeeksponeringstiden til fire millisekunder, og bruk zoominnstillingen 1,49. Velg deretter to med to binning.Kontroller at oppløsningen er 800 med 600 piksler og start opptaket. Etter oppkjøpet, merk hver video umiddelbart med belastningen, RNAi tilstand og godt nummer. Deretter måler du avstanden som er reist og lengden på hvert dyr for 20 forskjellige dyr per video, og undersøker totalt ca 40 ormer for hver RNAi-tilstand.Velg knappen merknadsverktøy i programvaren. Deretter tegne tekstverktøyet. Klikk på et punkt i midten av ormen som måles i den første rammen av videoen og markerer den med et tall.Før videoen til slutten mens du visuelt sporer ormen. Klikk deretter på den og merk det med neste tilsvarende nummer. Bruk verktøyet for tegneskalalinje til å tegne en linje fra det første tallet til det andre tallet og registrere tilbakestanden i et regneark.Gjenta denne målingen for 19 andre ormer i videoen samtidig som hver enkelt måling bevares i analysevinduet. Når målingene er fullført, ta et øyeblikksbilde av den endelige videorammen som illustrerer alle målelinjene, slik at dataene kan spores tilbake til dyret som det stammer fra. Deretter analyserer du dataene ved hjelp av et regneark med fire kolonner der kolonne én er ormidentifikatoren, og kolonne to er hastigheten.Tidspunktet for hver video finner du ved å høyreklikke på videoen under eksperimentet og gå til egenskapene. For å normalisere hastighetsmålingen, finn lengden på hvert dyr. Bruk tegnepolylineverktøyet til fritt å spore C.elegans fra spissen av hodet til spissen av halen.Ta deretter et øyeblikksbilde av den endelige videorammen som illustrerer alle polylinjene. Lengden på linjene registreres under statistikk. Legg til to kolonner i regnearket, én for dyrelengde og én for normalisert hastighet.Til slutt analyserer du de normaliserte hastighetsdataene ved hjelp av en enveis ANOVA med post-hoc-testing versus tom vektor RNAi. Plasser fire til seks transgene L4 C.elegans som uttrykker RAN peptid GFP på en seks centimeter GFP RNAi plate og vokse dem på 20 grader Celsius. Hvis forsøket bruker RNAi til å teste for genetiske effekter på RAN peptidtoksisitet, flytt 10 transgene gravid voksne til hver av to tomme vektor RNAi GFP RNAi eller genspesifikke RNAi plater.Hvis mutanter brukes til å analysere genetiske effekter på RAN peptidtoksisitet, plasser 10 gravid vill type eller muterte dyr som uttrykker samme RAN transgene på hver av to tomme vektor RNAi eller GFP RNAi plater. Vokse dem på 20 grader Celsius i 48 timer. Velg 10 sett med 10 transgene L4s fra RNAi-platene og plasser hvert sett på en tre centimeter RNAi-plate.Pass på at ormene som er valgt for analysen, alle har overfladisk normal motilitet. Legg platene i en plastpose for å beholde fuktighet og inkubere dem ved 25 grader Celsius. Etter 24 timer analyserer du dyrene for mobilitet ved å trykke på platene på det disseksjonsmikroskopet og se etter bevegelse.Hvis en orm beveger seg mer enn en kroppslengde, telle den som mobil og overføre den til en ny tre centimeter RNAi plate. Bruk en platinaplukke til å trykke på de gjenværende ormene på hodet og halen. Hvis dyret beveger seg mer enn en kroppslengde, telle dyret som mobil og overføre den til en ny tre centimeter RNAi plate.Hvis betydelig lammelse ikke observeres i den tomme vektorkontrollen innen dag to, avslutt analysen og start på nytt. Grupper alle ikke-bevegelige ormer sammen slik at bevegelsen av mer enn en kroppslengde lett kan oppdages. Tell alle lamme, posete eller døde ormer og kast platen.Fortsett å score dyrene for lammelse hver dag i fem til syv dager. Vekstanalysen ble brukt til å måle effekten av genhemminger på toksisiteten av RAN dipeptider som finnes hos ALS-pasienter med en G4C2-gjentatt ekspansjon. Uttrykk for PR50 GFP alene resulterte i en fullstendig vekstarrest, men knockdown av flere gener undertrykte utviklingstoksisiteten.Effekten av spesifikke genbankdowns på utviklingsmotiliteten til PR50 som uttrykker dyr ble målt ved hjelp av videohastighetsanalysemetoden. Som forventet resulterte hemming av PR50 GFP-uttrykk i en stor økning i motilitet sammenlignet med tom vektor RNAi. Videre resulterte RNAi mot proteasom subunit RPN7 i den betydelige økningen i PR50 motilitet.Når voksne fenotyper ble analysert med den aldersavhengige lammelsesanalysen, viste PR50 GFP opptil 80 % lammelse med fem dagers alder. RNAi rettet imidlertid mot gencul-6 betydelig forsinket lammelse som tyder på at blindvei 6 er nødvendig for PR50 GFP toksisitet. For å finne ut om RAN-proteiner forårsaker nevropatologi når de uttrykkes i C.elegans nevroner, ble nevronspesifikk toksisitet undersøkt ved hjelp av commissure-analysen.På dag to voksne førte PR50 GFP-uttrykket i motornevronene til en betydelig økning i motorneuronblebbing. Denne nevropatologien ble betydelig undertrykt av en mutasjon i insulin IGF reseptorgen homolog DAF-2 som forsinker de giftige egenskapene til flere nevrodegenerative proteiner. For atferdsanalysen er det viktig at RAN-peptidene produserer en svært penetrerende fenotype.Slike gener eller legemidler kan gi nye biomarkører eller terapeutiske alternativer for RAN peptid sykdommer. Ved hjelp av disse analysene har vi utført en genom-wide RNAi-skjerm for suppressors av C9ORF72-tilknyttede RAN peptidproline-arginin. Gener identifisert i denne skjermen inkluderer mange nye og konserverte gener som vil være gjenstand for fremtidige mekanistiske studier.

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening for å identifisere Postembryonic fenotyper i C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles

Måling Peptide translokasjon inn Large Unilamellar Blemmer

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1.  Many of these are referred ...

C. elegans Chemotaxis Assay

C. elegans Chemotaxis Assay

C. elegans Chemotaxis analysen

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

En metode for dyrking Embryonic<em&gt; C. elegans</em&gt; Celler

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

Antistoffarging i<em&gt; C. Elegans</em&gt; Ved hjelp av &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

Måle effekten av bakterier på<em&gt; C. Elegans</em&gt; Behavior Ved hjelp av en Egg Retention analysen

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

En Anoksi-sult Modell for iskemi / Reperfusjon i<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Metoder for Skin såre og Analyser for Wound Responses i<em&gt; C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...