Name: measuring ran peptide toxicity in c. elegans
Uploaded: 2020-04-30T15:00:00
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NIH R21NS107797

1. Gerando construções de expressão ran variadas de códon
<ol><li>Projete a seqüência individual de codificação de peptídeos RAN utilizando códons sinônimos para eliminar a estrutura fundamental de DNA/RNA repetitivo, mas preservar a seqüência de aminoácidos sobrepostas.</li>
	<li>Encomendar as seqüências de códon personalizadas comercialmente nos comprimentos de repetição necessários para os estudos (tipicamente 5-100 repetições). Inclua um local de restrição HindIII no final de 5' e um site de...

<ol>
	<li>Cleary, J. D., Ranum, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeat+associated+non-ATG+(RAN)+translation:+new+starts+in+microsatellite+expansion+disorders.">Repeat associated non-ATG (RAN) translation: new starts in microsatellite expansion disorders.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 26, 6-15 (2014).</li><li>The Huntington's Disease Collaborative Research Group. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+gene+containing+a+trinucleotide+repeat+that+is+expanded+and+unstable+on+Huntington's+disease+chromosomes.">A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes.</a> Cell. 72 (6), 971-983 (1993).</li><li>Scherzinger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntingtin-encoded+polyglutamine+expansions+form+amyloid-like+protein+aggregates+in+vitro+and+in+vivo.">Huntingtin-encoded polyglutamine expansions form amyloid-like protein aggregates in vitro and in vivo.</a> Cell. 90 (3), 549-558 (1997).</li><li>Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+threshold+for+polyglutamine-expansion+protein+aggregation+and+cellular+toxicity+is+dynamic+and+influenced+by+aging+in+Caenorhabditis+elegans.">The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99 (16), 10417-10422 (2002).</li><li>Genetic Modifiers of Huntington's Disease Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electronic+address,+g.+h.+m.+h.+e.,+Genetic+Modifiers+of+Huntington's+Disease,+C.+CAG+Repeat+Not+Polyglutamine+Length+Determines+Timing+of+Huntington's+Disease+Onset.">Electronic address, g. h. m. h. e., Genetic Modifiers of Huntington's Disease, C. CAG Repeat Not Polyglutamine Length Determines Timing of Huntington's Disease Onset.</a> Cell. 178 (4), 887-900 (2019).</li><li>Wright, G. E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Length+of+Uninterrupted+CAG,+Independent+of+Polyglutamine+Size,+Results+in+Increased+Somatic+Instability,+Hastening+Onset+of+Huntington+Disease.">Length of Uninterrupted CAG, Independent of Polyglutamine Size, Results in Increased Somatic Instability, Hastening Onset of Huntington Disease.</a> American Journal of Human Genetics. 104 (6), 1116-1126 (2019).</li><li>Cleary, J. D., Ranum, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeat-associated+non-ATG+(RAN)+translation+in+neurological+disease.">Repeat-associated non-ATG (RAN) translation in neurological disease.</a> Human Molecular Genetics. 22 (1), 45-51 (2013).</li><li>Banez-Coronel, M., Ranum, L. P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeat-associated+non-AUG+(RAN)+translation:+insights+from+pathology.">Repeat-associated non-AUG (RAN) translation: insights from pathology.</a> Laboratory Investigation. 99 (7), 929-942 (2019).</li><li>Banez-Coronel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAN+Translation+in+Huntington+Disease.">RAN Translation in Huntington Disease.</a> Neuron. 88 (4), 667-677 (2015).</li><li>Ash, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unconventional+translation+of+C9ORF72+GGGGCC+expansion+generates+insoluble+polypeptides+specific+to+c9FTD/ALS.">Unconventional translation of C9ORF72 GGGGCC expansion generates insoluble polypeptides specific to c9FTD/ALS.</a> Neuron. 77 (4), 639-646 (2013).</li><li>Kramer, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+screens+in+human+cells+and+primary+neurons+identify+modifiers+of+C9ORF72+dipeptide-repeat-protein+toxicity.">CRISPR-Cas9 screens in human cells and primary neurons identify modifiers of C9ORF72 dipeptide-repeat-protein toxicity.</a> Nature Genetics. 50 (4), 603-612 (2018).</li><li>Boeynaems, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+screen+connects+nuclear+transport+genes+to+DPR+pathology+in+c9ALS/FTD.">Drosophila screen connects nuclear transport genes to DPR pathology in c9ALS/FTD.</a> Scientific Reports. 6, 20877 (2016).</li><li>Jovicic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modifiers+of+C9orf72+dipeptide+repeat+toxicity+connect+nucleocytoplasmic+transport+defects+to+FTD/ALS.">Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS.</a> Nature Neuroscience. 18 (9), 1226-1229 (2015).</li><li>Boeynaems, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+Separation+of+C9orf72+Dipeptide+Repeats+Perturbs+Stress+Granule+Dynamics.">Phase Separation of C9orf72 Dipeptide Repeats Perturbs Stress Granule Dynamics.</a> Molecular Cell. 65 (6), 1044-1055 (2017).</li><li>Lee, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C9orf72+Dipeptide+Repeats+Impair+the+Assembly,+Dynamics,+and+Function+of+Membrane-Less+Organelles.">C9orf72 Dipeptide Repeats Impair the Assembly, Dynamics, and Function of Membrane-Less Organelles.</a> Cell. 167 (3), 717-788 (2016).</li><li>Hao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+dysfunction+and+neurodegeneration+in+a+C9orf72+mouse+line+expressing+poly-PR.">Motor dysfunction and neurodegeneration in a C9orf72 mouse line expressing poly-PR.</a> Nature Communications. 10 (1), 2906 (2019).</li><li>Scior, A., Preissler, S., Koch, M., Deuerling, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+PCR-free+engineering+of+highly+repetitive+DNA+sequences.">Directed PCR-free engineering of highly repetitive DNA sequences.</a> BMC Biotechnology. 11, 87 (2011).</li><li>Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+transformation.">DNA transformation.</a> Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).</li><li>Rudich, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+localized+C9orf72-associated+arginine-containing+dipeptides+exhibit+age-dependent+toxicity+in+C.+elegans.">Nuclear localized C9orf72-associated arginine-containing dipeptides exhibit age-dependent toxicity in C. elegans.</a> Human Molecular Genetics. 26 (24), 4916-4928 (2017).</li><li>Gidalevitz, T., Krupinski, T., Garcia, S., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Destabilizing+protein+polymorphisms+in+the+genetic+background+direct+phenotypic+expression+of+mutant+SOD1+toxicity.">Destabilizing protein polymorphisms in the genetic background direct phenotypic expression of mutant SOD1 toxicity.</a> PLoS Genetics. 5 (3), 1000399 (2009).</li><li>Nollen, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNA+interference+screen+identifies+previously+undescribed+regulators+of+polyglutamine+aggregation.">Genome-wide RNA interference screen identifies previously undescribed regulators of polyglutamine aggregation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 101 (17), 6403-6408 (2004).</li><li>Satyal, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyglutamine+aggregates+alter+protein+folding+homeostasis+in+Caenorhabditis+elegans.">Polyglutamine aggregates alter protein folding homeostasis in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (11), 5750-5755 (2000).</li><li>Boccitto, M., Lamitina, T., Kalb, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Daf-2+signaling+modifies+mutant+SOD1+toxicity+in+C.+elegans.">Daf-2 signaling modifies mutant SOD1 toxicity in C. elegans.</a> PLoS One. 7 (3), 33494 (2012).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C9orf72+BAC+Mouse+Model+with+Motor+Deficits+and+Neurodegenerative+Features+of+ALS/FTD.">C9orf72 BAC Mouse Model with Motor Deficits and Neurodegenerative Features of ALS/FTD.</a> Neuron. 90 (3), 521-534 (2016).</li><li>Peters, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+C9ORF72+Hexanucleotide+Expansion+Reproduces+RNA+Foci+and+Dipeptide+Repeat+Proteins+but+Not+Neurodegeneration+in+BAC+Transgenic+Mice.">Human C9ORF72 Hexanucleotide Expansion Reproduces RNA Foci and Dipeptide Repeat Proteins but Not Neurodegeneration in BAC Transgenic Mice.</a> Neuron. 88 (5), 902-909 (2015).</li><li>O'Rourke, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C9orf72+BAC+Transgenic+Mice+Display+Typical+Pathologic+Features+of+ALS/FTD.">C9orf72 BAC Transgenic Mice Display Typical Pathologic Features of ALS/FTD.</a> Neuron. 88 (5), 892-901 (2015).</li><li>Mizielinska, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C9orf72+repeat+expansions+cause+neurodegeneration+in+Drosophila+through+arginine-rich+proteins.">C9orf72 repeat expansions cause neurodegeneration in Drosophila through arginine-rich proteins.</a> Science. 345 (6201), 1192-1194 (2014).</li><li>Krajacic, P., Shen, X., Purohit, P. K., Arratia, P., Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanical+profiling+of+Caenorhabditis+elegans+motility.">Biomechanical profiling of Caenorhabditis elegans motility.</a> Genetics. 191 (3), 1015-1021 (2012).</li><li>Zhang, L., Ward, J. D., Cheng, Z., Dernburg, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+auxin-inducible+degradation+(AID)+system+enables+versatile+conditional+protein+depletion+in+C.+elegans.">The auxin-inducible degradation (AID) system enables versatile conditional protein depletion in C. elegans.</a> Development. 142 (24), 4374-4384 (2015).</li></ol>

Aqui relatamos métodos que podem ser usados para ensaio da toxicidade do peptídeo RAN modelado no músculo ou nos neurônios de C. elegans. Embora as proteínas neurodegenerativas tenham um fenótipo de início de idade em pacientes humanos, elas também podem exibir toxicidade de desenvolvimento quando superexpressas em sistemas modelo. A superexpressão tem limitações interpretativos significativas, mas também fornece um ponto de partida poderoso para telas genéticas ou farmacológicas destinadas a ident...

A expansão inadequada das sequências de repetição do DNA é a base genética para várias doenças neurodegenerativas, como a esclerose lateral amiotrófica (ELA), a demência frontotemporal (TFT) e a doença de Huntington (HD)1. Embora existam modelos celulares e animais estabelecidos para essas doenças, os mecanismos subjacentes a essas condições não são bem definidos. Por exemplo, o HD é causado pelas expansões de uma seqüência de repetição CAG na seqüência de codificação para a proteína Huntingtin Htt2. Como o CAG codifica a glutamina de aminoácidos, a expansão de repetição do CAG resulta na inserção de uma seqüência de poliglutamina, ou poliQ, dentro de Htt. Proteínas poliQ expandidas formam agregados proteicos dependentes de comprimento e idade que estão associados à toxicidade3,4. Surpreendentemente, dois estudos recentes sugerem que o comprimento da seqüência de poliQ não é o principal condutor do início da doença de HD, sugerindo que fatores independentes do poliQ também podem contribuir para a doença5,6.
Um possível mecanismo independente de poliQ envolve um tipo recém-descoberto de tradução proteica denominado Repeat Asociated Non-AUG-dependent (RAN) tradução7. Como o nome indica, a tradução RAN só ocorre quando uma seqüência de repetição expandida está presente e não requer um códon de partida canônico. Portanto, a tradução RAN ocorre em todos os três quadros de leitura da repetição para produzir três polipeptídeos distintos. Além disso, como muitos genes também produzem uma transcrição anti-sentido que contém o complemento reverso da seqüência de repetição expandida, a tradução RAN também ocorre em todos os três quadros de leitura da transcrição antisense. Em conjunto, a tradução ran expande o número de proteínas produzidas a partir de uma seqüência de DNA repetitiva expandida de um peptídeo para seis peptídeos. Até o momento, a tradução ran foi observada em pelo menos oito diferentes distúrbios de expansão repetitiva8. Os peptídeos RAN são observados em amostras de pacientes pós-morte e somente nos casos em que o paciente carrega uma repetição expandida9,10. Embora esses peptídeos estejam claramente presentes nas células do paciente, sua contribuição para a fisiopatologia da doença não é clara.
Para melhor definir a potencial toxicidade associada aos peptídeos RAN, vários grupos expressaram cada peptídeo em vários sistemas modelo, como leveduras, moscas, camundongos e células de cultura tecidual11,,12,,13,,14,,15,16. Em vez de utilizar a seqüência de repetição para expressão, esses modelos empregam uma abordagem de variação de códon em que a seqüência de repetição é eliminada, mas a seqüência de aminoácidos é preservada. A iniciação da tradução ocorre através de um ATG canônico e o peptídeo é tipicamente fundido a uma proteína fluorescente no N- ou C-terminus, nenhum dos quais parece interferir com a toxicidade do peptídeo RAN. Portanto, cada construção superexpressa um único peptídeo RAN. Modelar os diferentes produtos RAN em um organismo multicelular com ensaios simples para medir a toxicidade do peptídeo RAN é de vital importância para entender como os diferentes produtos RAN de cada expansão repetitiva causadora de doenças contribuem para a disfunção celular e neurodegeneração.
Como outros sistemas modelo, C. elegans fornece uma plataforma experimental flexível e eficiente que permite estudos de novos mecanismos de doença, como a toxicidade do peptídeo RAN. Os worms oferecem vários atributos experimentais únicos que não estão disponíveis atualmente em outros modelos de toxicidade do peptídeo RAN. Primeiro, c. elegans são opticamente transparentes desde o nascimento até a morte. Isso permite a visualização simples da expressão e localização do peptídeo RAN, bem como a análise in vivo da neurodegeneração em animais vivos. Em segundo lugar, os métodos transgênicos para a geração de modelos de expressão de peptídeos RAN são baratos e rápidos. Dado o curto ciclo de vida de três dias de C. elegans,linhas transgênicas estáveis expressando qualquer peptídeo RAN dado de forma específica do tipo celular podem ser produzidas em menos de uma semana. Em terceiro lugar, as saídas pheotípicas simples podem ser combinadas com métodos de triagem genética, como mutagênese química ou triagem RNAi, para identificar rapidamente genes essenciais para a toxicidade do peptídeo RAN. Finalmente, a curta vida útil de C. elegans (~20 dias) permite que os pesquisadores determinem como o envelhecimento, que é o maior fator de risco para a maioria das doenças de expansão repetida, influencia a toxicidade do peptídeo RAN. Juntos, essa combinação de atributos experimentais é incomparável em qualquer outro sistema de modelo e oferece uma plataforma poderosa para o estudo da toxicidade do peptídeo RAN.
Aqui descrevemos vários ensaios que aproveitam as vantagens experimentais de C. elegans para medir a toxicidade dos peptídeos RAN e identificar modificadores genéticos dessa toxicidade. Os peptídeos RAN iniciados pelo códon ATG são marcados com GFP e expressos individualmente em células musculares sob o promotor do mio-3 ou em neurônios motores GABAergic sob o promotor unc-47. Para a expressão em células musculares, é importante que os peptídeos RAN tóxicos sejam marcados com proteína fluorescente verde (GFP), ou outra etiqueta de proteína fluorescente (FP) que pode ser direcionada com um vetor de alimentação RNAi. Isso porque a expressão tóxica do peptídeo RAN geralmente bloqueia o crescimento, tornando tais cepas inviáveis. O uso de gfp(RNAi) inativa condicionalmente a expressão do peptídeo RAN e permite a manutenção de cepas, cruzes genéticas, etc. Para ensaios, esses animais são removidos do gfp(RNAi),que permite a expressão do peptídeo RAN e dos fenótipos resultantes. Além da estratégia molecular para projetar construções de expressão ran-variadas de códon, descrevemos ensaios para medir toxicidade do desenvolvimento (motilidade larval e ensaio de crescimento), toxicidade associada à idade pós-desenvolvimento (ensaio de paralisia) e defeitos morfológicos neuronológicos (ensaio de comissure).

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	<tbody>
		<tr>
			<td>35mm x 10mm Petri Dish, Sterile</td>
			<td>CELLTREAT Scientific Products</td>
			<td>50-202-036</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AGAR GRANULATED 2KILOGRAM</td>
			<td>BD DIAGNOSTIC SYSTEMS</td>
			<td>DF0145070</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AGAROSE ULTRAPURE</td>
			<td>LIFE TECHNOLOGIES</td>
			<td>16500500</td>
			<td>Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CARBENICILLIN 5G</td>
			<td>THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS</td>
			<td>BP26485</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COVER GLASSES NO 1 22MM 1OZ/PK</td>
			<td>THERMO SCI ERIE</td>
			<td>12542B</td>
			<td>Imaging for commissure assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FEMOTIPS DISPSBL MICROINJ 20CS</td>
			<td>EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS</td>
			<td>E5242952008</td>
			<td>Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FF COV GLASS NO1 40X22MM 1OZPK</td>
			<td>THERMO SCI ERIE</td>
			<td>125485C</td>
			<td>Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>THERMO SCI ERIE</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td>Imaging for commissure assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;Bacto Peptone&#160;</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>DF0118-17-0</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HALOCARBON OIL 700</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH INC</td>
			<td>H8898-50ML</td>
			<td>Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG BIOTECH 10G</td>
			<td>THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS</td>
			<td>BP162010</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Advanced Fluorescence imaging software</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>LAS-AF</td>
			<td>Image acquisition software for video speed analysis and commissure assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Immersion type N (Oil)</td>
			<td>W NUHSBAUM INC</td>
			<td>NC9547002</td>
			<td>Imaging for commissure assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEVAMISOLE HYDROCHLORIDE 10GR</td>
			<td>THERMO SCI ACROS ORGANICS</td>
			<td>AC187870100</td>
			<td>Imaging for commissure assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROLOADER TIPS 2 X 96 PCS</td>
			<td>EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS</td>
			<td>E5242956003</td>
			<td>Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			PETRI DISH, 60X15MM,500/CS</td>
			<td>CORNING LIFE SCIENCES PLASTIC</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TISSUE CULT PLATE 24WEL 50/CS</td>
			<td>CORNING LIFE SCIENCES DL</td>
			<td>87721</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring ran peptide toxicity in c. elegans

C. elegans é comumente usado para modelar doenças neurodegenerativas relacionadas à idade causadas por mutações de expansão repetidas, como a Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA) e a doença de Huntington. Recentemente, o RNA contendo expansão repetida mostrou-se o substrato para um novo tipo de tradução proteica chamada tradução não-dependente de AUG (RAN). Ao contrário da tradução canônica, a tradução RAN não requer um codon inicial e só ocorre quando as repetições excedem um comprimento de limiar. Como não há codon de início para determinar o quadro de leitura, a tradução RAN ocorre em todos os quadros de leitura tanto de modelos de RNA de sentido quanto de RNA antissentido que contêm uma seqüência de expansão repetida. Portanto, a tradução ran expande o número de possíveis peptídeos tóxicos associados à doença de um para seis. Até agora, a tradução ran foi documentada em oito diferentes doenças neurodegenerativas e neuromusculares baseadas em expansão. Em cada caso, decifrar quais produtos RAN são tóxicos, bem como seus mecanismos de toxicidade, é um passo crítico para entender como esses peptídeos contribuem para a fisiopatologia da doença. Neste artigo, apresentamos estratégias para medir a toxicidade dos peptídeos RAN no sistema modelo C. elegans. Em primeiro lugar, descrevemos procedimentos para medir a toxicidade do peptídeo RAN sobre o crescimento e a motilidade do desenvolvimento de C. elegans. Em segundo lugar, detalhamos um ensaio para medir efeitos pós-desenvolvimento, dependentes da idade dos peptídeos RAN sobre a motilidade. Finalmente, descrevemos um ensaio de neurotoxicidade para avaliar os efeitos dos peptídeos ran na morfologia dos neurônios. Esses ensaios fornecem uma ampla avaliação da toxicidade do peptídeo RAN e podem ser úteis para a realização de telas genéticas ou pequenas moléculas em larga escala para identificar mecanismos ou terapias de doenças.

Utilizou-se os ensaios descritos aqui para avaliar o efeito de diferentes inibições genéticas sobre a toxicidade dos dipeptídeos RAN que são encontrados em pacientes com ELA com uma expansão repetitiva G4C2. Usando o ensaio de crescimento para medir a toxicidade do desenvolvimento, analisamos os efeitos de vários mutantes de nocaute genético identificados em um genoma de supressores de tela RNAi de toxicidade PR50-GFP expressa muscular. Enquanto a expressão de PR50-GFP sozinha resultou em u...

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Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Os produtos translacionais não dependentes do ATG são características patogênicas emergentes de várias doenças baseadas em expansão repetida. O objetivo do protocolo descrito é avaliar a toxicidade causada por esses peptídeos utilizando ensaios comportamentais e celulares no sistema modelo C. elegans.

Medição da Toxicidade do Peptídeo RAN em C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis ...

Peptídeos RAN são uma característica de distúrbios neurodegenerativos de expansão repetida, como a doença de Huntington, esclerose lateral amiotrófica e demência frontotemporal. Esses protocolos fornecem uma abordagem padronizada importante para quantificar a toxicidade do peptídeo RAN no sistema modelo C.elegans. As técnicas descritas são simples de aprender e baratas, podem ser realizadas rapidamente e aproveitam as características reprodutíveis do sistema C.elegans, como movimento e reprodução.Ao tentar este protocolo, o maior desafio é obter toxicidade e expressão consistentes de peptídeos ran. Os principais fatores a serem controlados incluem temperatura da droga, tempo de mudanças de temperatura e preparação de placas de ensaio. É importante que os experimentadores classifiquem consistentemente os fenótipos dos animais neste ensaio de processo dependente da idade.A demonstração visual desta técnica mostra seus critérios de classificação. Comece por derramar meio de crescimento padrão de nematoide com um IPTG milimolar e 25 microgramas por mililitro carbenicillin em placas de 24 poços. Ramal fora RNAi alimentando clones em bactérias HT115 em ágar lb carbenicilina e cultivá-los a 37 graus Celsius por 24 horas.No dia seguinte, escolha uma única colônia em um mililitro de mídia líquida de carbenicilina LB e cresça a bactéria por 18 horas a 37 graus Celsius enquanto treme a 250 rpm. Localiza quatro poços individuais da placa NGM RNAi 24-well com 20 microliters de culturas bacterianas durante a noite, como descrito no manuscrito do texto e permita que as bactérias RNAi induzam a produção de RNA de dupla rerculação durante a noite. Use o método padrão de hipoclorito para isolar os ovos do primeiro dia de C.elegans adultos expressando o transgene de peptídeo RAN integrado.Em seguida, semente cerca de 30 ovos em cada poço da placa de 24 poços e incubar a placa a 20 graus Celsius por sete dias. Para realizar a análise da velocidade de vídeo, adquira dois vídeos de dois poços separados para cada condição RNAi usando um microscópio de dissecação estéreo equipado com uma câmera monocromática. Certifique-se de usar configurações de aquisição consistentes entre poços.Para cada vídeo, defina a duração por 10 segundos e o intervalo de tempo para 76 milissegundos. Defina o tempo de exposição da imagem para quatro milissegundos e use a configuração de zoom de 1,49. Em seguida, selecione dois por dois binning.Verifique se a resolução é de 800 por 600 pixels e comece a gravar. Após a aquisição, rotule cada vídeo imediatamente com a cepa, condição RNAi e número do poço. Em seguida, meça a distância percorrida e o comprimento de cada animal para 20 animais diferentes por vídeo, examinando um total de cerca de 40 vermes para cada condição RNAi.No software, selecione o botão de ferramentas de anotação. Em seguida, a ferramenta de texto de saque. Clique em um ponto no centro do worm sendo medido no primeiro quadro do vídeo e marque-o com um número.Avance o vídeo até o final enquanto rastreia visualmente o worm. Em seguida, clique nele e marque-o com o próximo número correspondente. Use a ferramenta da barra de escala de saque para desenhar uma linha do primeiro número para o segundo número e registrar a distância percorrida em uma planilha.Repita esta medição para outros 19 worms no vídeo, preservando cada medição individual na janela de análise. Uma vez que as medidas estejam concluídas, tire um instantâneo do quadro de vídeo final ilustrando todas as linhas de medição para que os dados possam ser rastreados até o animal de onde ele se originou. Em seguida, analise os dados usando uma planilha de quatro colunas onde a coluna um é o identificador de worm e a coluna dois é a velocidade.O tempo de cada vídeo pode ser encontrado clicando com o botão direito do mouse no vídeo sob o experimento e indo para as propriedades. Para normalizar a medição de velocidade, encontre o comprimento de cada animal. Use a ferramenta de polilina de desenho para rastrear livremente os C.elegans desde a ponta da cabeça até a ponta da cauda.Em seguida, tire uma foto do quadro de vídeo final ilustrando todas as polilinas. A duração das linhas será registrada nas estatísticas. Adicione duas colunas à planilha, uma para comprimento animal e outra para velocidade normalizada.Finalmente, analise os dados de velocidade normalizados usando um ANOVA unidirecional com testes pós-hoc versus rnai vetor vazio. Coloque quatro a seis L4 C.elegans transgênicos expressando GFP de peptídeo RAN em uma placa GFP RNAi de seis centímetros e plante-os a 20 graus Celsius. Se o experimento estiver utilizando a RNAi para testar os efeitos genéticos na toxicidade do peptídeo RAN, mova 10 adultos gravid transgênicos para cada um dos dois vetores vazios RNAi GFP RNAi ou placas RNAi específicas de genes.Se os mutantes estão sendo usados para analisar efeitos genéticos na toxicidade do peptídeo RAN, coloque 10 animais selvagens gravid ou animais mutantes expressando o mesmo transgene RAN em cada uma das duas placas de vetor vazio RNAi ou GFP RNAi. Cresça-os a 20 graus Celsius por 48 horas. Escolha 10 conjuntos de 10 L4s transgênicos das placas RNAi e coloque cada conjunto em uma placa RNAi de três centímetros.Certifique-se de que os vermes selecionados para o ensaio tenham motilidade superficialmente normal. Coloque as placas em um saco plástico para reter a umidade e incuba-las a 25 graus Celsius. Após 24 horas, analise os animais para mobilidade, tocando nas placas do microscópio dissecando e verificando se há movimento.Se um verme se mover mais do que um comprimento corporal, conte-o como móvel e transfira-o para uma nova placa RNAi de três centímetros. Use uma picareta de platina para tocar os vermes restantes na cabeça e na cauda. Se o animal se mover mais do que um comprimento corporal, conte o animal como móvel e transfira-o para uma nova placa RNAi de três centímetros.Se a paralisia significativa não for observada no controle de vetores vazios até o segundo dia, termine o ensaio e comece de novo. Agrupar todos os vermes não-movimentos para que o movimento de mais de um comprimento corporal possa ser facilmente detectado. Conte todos os vermes paralisados, ensacados ou mortos e descarte a placa.Continue marcando os animais para paralisia todos os dias por cinco a sete dias. O ensaio de crescimento foi utilizado para medir o efeito das inibições genéticas sobre a toxicidade dos dipeptídeos ran que são encontrados em pacientes com ELA com uma expansão repetitiva G4C2. A expressão do PR50 GFP sozinho resultou em uma prisão completa de crescimento, mas a derrubada de vários genes suprimiu a toxicidade do desenvolvimento.O efeito de knockdowns genéticos específicos sobre a motilidade de desenvolvimento dos animais expressos pr50 foi medido utilizando-se o método de análise de velocidade de vídeo. Como esperado, a inibição da expressão PR50 GFP resultou em um grande aumento da motilidade em comparação com o vetor vazio RNAi. Além disso, o RNAi contra a subunidade proteasome RPN7 resultou no aumento significativo da motilidade PR50.Quando os fenótipos adultos foram analisados com o ensaio de paralisia dependente da idade, PR50 GFP apresentou até 80% de paralisia por cinco dias de idade. No entanto, rnAi direcionado para o gene cul-6 paralisia significativamente retardada sugerindo que cul-6 é necessário para a toxicidade PR50 GFP. Para determinar se as proteínas RAN causam neuropatologia quando expressas em neurônios C.elegans, a toxicidade específica do neurônio foi examinada usando o ensaio de comissure.No segundo dia, a expressão PR50 GFP nos neurônios motores levou a um aumento significativo no blebbing do neurônio motor. Esta neuropatologia foi significativamente suprimida por uma mutação no gene receptor de insulina IGF homólogo DAF-2 que atrasa as propriedades tóxicas de várias proteínas neurodegenerativas. Para o ensaio comportamental, é importante que os peptídeos RAN produzam um fenótipo altamente penetrante.Tais genes ou drogas poderiam fornecer novos biomarcadores ou opções terapêuticas para doenças de peptídeos ran. Usando esses ensaios, realizamos uma tela RNAi em todo o genoma para supressores do peptídeo RAN proline-arginina associado C9ORF72. Os genes identificados nesta tela incluem muitos genes novos e conservados que serão objeto de futuros estudos mecanicistas.

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Geração de transgênicos Estável C. elegans Usando microinjeção

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Biologia

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Geração de transgênicos C. elegans Por biobalística Transformação

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Medição Caenorhabditis elegans Expectativa de Vida em 96 placas de microtitulação Bem

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi de triagem para identificar fenótipos pós-embrionário em C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles

Medição Translocação Peptide em grandes vesículas Unilamelares

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1.  Many of these are referred ...

C. elegans Chemotaxis Assay

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

Anticorpo de coloração em<em&gt; C. Elegans</em&gt; Usando o &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

Medição dos Efeitos de bactérias em<em&gt; C. Elegans</em&gt; Comportamento Usando um Retenção Ensaio Egg

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Um modelo de anóxia-inanição por isquemia / reperfusão em<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Métodos para a pele ferimento e Ensaios para Responses ferida no<em&gt; C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...