Name: measuring ran peptide toxicity in c. elegans
Uploaded: 2020-04-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans at JoVE.com

NIH R21NS107797

1. Создание кодон-разнообразных конструкций экспрессии пептида РАН
<ol><li>Дизайн индивидуальной последовательности пептидного кодирования RAN с использованием синонимных кодонов для устранения фундаментальной повторяющейся структуры ДНК/РНК, но сохранить надлежащую аминокислотную п?...

<ol>
	<li>Cleary, J. D., Ranum, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeat+associated+non-ATG+(RAN)+translation:+new+starts+in+microsatellite+expansion+disorders.">Repeat associated non-ATG (RAN) translation: new starts in microsatellite expansion disorders.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 26, 6-15 (2014).</li><li>The Huntington's Disease Collaborative Research Group. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+gene+containing+a+trinucleotide+repeat+that+is+expanded+and+unstable+on+Huntington's+disease+chromosomes.">A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes.</a> Cell. 72 (6), 971-983 (1993).</li><li>Scherzinger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntingtin-encoded+polyglutamine+expansions+form+amyloid-like+protein+aggregates+in+vitro+and+in+vivo.">Huntingtin-encoded polyglutamine expansions form amyloid-like protein aggregates in vitro and in vivo.</a> Cell. 90 (3), 549-558 (1997).</li><li>Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+threshold+for+polyglutamine-expansion+protein+aggregation+and+cellular+toxicity+is+dynamic+and+influenced+by+aging+in+Caenorhabditis+elegans.">The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99 (16), 10417-10422 (2002).</li><li>Genetic Modifiers of Huntington's Disease Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electronic+address,+g.+h.+m.+h.+e.,+Genetic+Modifiers+of+Huntington's+Disease,+C.+CAG+Repeat+Not+Polyglutamine+Length+Determines+Timing+of+Huntington's+Disease+Onset.">Electronic address, g. h. m. h. e., Genetic Modifiers of Huntington's Disease, C. CAG Repeat Not Polyglutamine Length Determines Timing of Huntington's Disease Onset.</a> Cell. 178 (4), 887-900 (2019).</li><li>Wright, G. E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Length+of+Uninterrupted+CAG,+Independent+of+Polyglutamine+Size,+Results+in+Increased+Somatic+Instability,+Hastening+Onset+of+Huntington+Disease.">Length of Uninterrupted CAG, Independent of Polyglutamine Size, Results in Increased Somatic Instability, Hastening Onset of Huntington Disease.</a> American Journal of Human Genetics. 104 (6), 1116-1126 (2019).</li><li>Cleary, J. D., Ranum, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeat-associated+non-ATG+(RAN)+translation+in+neurological+disease.">Repeat-associated non-ATG (RAN) translation in neurological disease.</a> Human Molecular Genetics. 22 (1), 45-51 (2013).</li><li>Banez-Coronel, M., Ranum, L. P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeat-associated+non-AUG+(RAN)+translation:+insights+from+pathology.">Repeat-associated non-AUG (RAN) translation: insights from pathology.</a> Laboratory Investigation. 99 (7), 929-942 (2019).</li><li>Banez-Coronel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAN+Translation+in+Huntington+Disease.">RAN Translation in Huntington Disease.</a> Neuron. 88 (4), 667-677 (2015).</li><li>Ash, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unconventional+translation+of+C9ORF72+GGGGCC+expansion+generates+insoluble+polypeptides+specific+to+c9FTD/ALS.">Unconventional translation of C9ORF72 GGGGCC expansion generates insoluble polypeptides specific to c9FTD/ALS.</a> Neuron. 77 (4), 639-646 (2013).</li><li>Kramer, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+screens+in+human+cells+and+primary+neurons+identify+modifiers+of+C9ORF72+dipeptide-repeat-protein+toxicity.">CRISPR-Cas9 screens in human cells and primary neurons identify modifiers of C9ORF72 dipeptide-repeat-protein toxicity.</a> Nature Genetics. 50 (4), 603-612 (2018).</li><li>Boeynaems, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+screen+connects+nuclear+transport+genes+to+DPR+pathology+in+c9ALS/FTD.">Drosophila screen connects nuclear transport genes to DPR pathology in c9ALS/FTD.</a> Scientific Reports. 6, 20877 (2016).</li><li>Jovicic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modifiers+of+C9orf72+dipeptide+repeat+toxicity+connect+nucleocytoplasmic+transport+defects+to+FTD/ALS.">Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS.</a> Nature Neuroscience. 18 (9), 1226-1229 (2015).</li><li>Boeynaems, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+Separation+of+C9orf72+Dipeptide+Repeats+Perturbs+Stress+Granule+Dynamics.">Phase Separation of C9orf72 Dipeptide Repeats Perturbs Stress Granule Dynamics.</a> Molecular Cell. 65 (6), 1044-1055 (2017).</li><li>Lee, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C9orf72+Dipeptide+Repeats+Impair+the+Assembly,+Dynamics,+and+Function+of+Membrane-Less+Organelles.">C9orf72 Dipeptide Repeats Impair the Assembly, Dynamics, and Function of Membrane-Less Organelles.</a> Cell. 167 (3), 717-788 (2016).</li><li>Hao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+dysfunction+and+neurodegeneration+in+a+C9orf72+mouse+line+expressing+poly-PR.">Motor dysfunction and neurodegeneration in a C9orf72 mouse line expressing poly-PR.</a> Nature Communications. 10 (1), 2906 (2019).</li><li>Scior, A., Preissler, S., Koch, M., Deuerling, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+PCR-free+engineering+of+highly+repetitive+DNA+sequences.">Directed PCR-free engineering of highly repetitive DNA sequences.</a> BMC Biotechnology. 11, 87 (2011).</li><li>Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+transformation.">DNA transformation.</a> Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).</li><li>Rudich, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+localized+C9orf72-associated+arginine-containing+dipeptides+exhibit+age-dependent+toxicity+in+C.+elegans.">Nuclear localized C9orf72-associated arginine-containing dipeptides exhibit age-dependent toxicity in C. elegans.</a> Human Molecular Genetics. 26 (24), 4916-4928 (2017).</li><li>Gidalevitz, T., Krupinski, T., Garcia, S., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Destabilizing+protein+polymorphisms+in+the+genetic+background+direct+phenotypic+expression+of+mutant+SOD1+toxicity.">Destabilizing protein polymorphisms in the genetic background direct phenotypic expression of mutant SOD1 toxicity.</a> PLoS Genetics. 5 (3), 1000399 (2009).</li><li>Nollen, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNA+interference+screen+identifies+previously+undescribed+regulators+of+polyglutamine+aggregation.">Genome-wide RNA interference screen identifies previously undescribed regulators of polyglutamine aggregation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 101 (17), 6403-6408 (2004).</li><li>Satyal, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyglutamine+aggregates+alter+protein+folding+homeostasis+in+Caenorhabditis+elegans.">Polyglutamine aggregates alter protein folding homeostasis in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (11), 5750-5755 (2000).</li><li>Boccitto, M., Lamitina, T., Kalb, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Daf-2+signaling+modifies+mutant+SOD1+toxicity+in+C.+elegans.">Daf-2 signaling modifies mutant SOD1 toxicity in C. elegans.</a> PLoS One. 7 (3), 33494 (2012).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C9orf72+BAC+Mouse+Model+with+Motor+Deficits+and+Neurodegenerative+Features+of+ALS/FTD.">C9orf72 BAC Mouse Model with Motor Deficits and Neurodegenerative Features of ALS/FTD.</a> Neuron. 90 (3), 521-534 (2016).</li><li>Peters, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+C9ORF72+Hexanucleotide+Expansion+Reproduces+RNA+Foci+and+Dipeptide+Repeat+Proteins+but+Not+Neurodegeneration+in+BAC+Transgenic+Mice.">Human C9ORF72 Hexanucleotide Expansion Reproduces RNA Foci and Dipeptide Repeat Proteins but Not Neurodegeneration in BAC Transgenic Mice.</a> Neuron. 88 (5), 902-909 (2015).</li><li>O'Rourke, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C9orf72+BAC+Transgenic+Mice+Display+Typical+Pathologic+Features+of+ALS/FTD.">C9orf72 BAC Transgenic Mice Display Typical Pathologic Features of ALS/FTD.</a> Neuron. 88 (5), 892-901 (2015).</li><li>Mizielinska, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C9orf72+repeat+expansions+cause+neurodegeneration+in+Drosophila+through+arginine-rich+proteins.">C9orf72 repeat expansions cause neurodegeneration in Drosophila through arginine-rich proteins.</a> Science. 345 (6201), 1192-1194 (2014).</li><li>Krajacic, P., Shen, X., Purohit, P. K., Arratia, P., Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanical+profiling+of+Caenorhabditis+elegans+motility.">Biomechanical profiling of Caenorhabditis elegans motility.</a> Genetics. 191 (3), 1015-1021 (2012).</li><li>Zhang, L., Ward, J. D., Cheng, Z., Dernburg, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+auxin-inducible+degradation+(AID)+system+enables+versatile+conditional+protein+depletion+in+C.+elegans.">The auxin-inducible degradation (AID) system enables versatile conditional protein depletion in C. elegans.</a> Development. 142 (24), 4374-4384 (2015).</li></ol>

Здесь мы сообщаем методы, которые могут быть использованы для ассеидного токсичности пептида RAN, смоделированных в мышцах или в нейронах C. elegans. В то время как нейродегенеративные белки имеют возрастной фенотип у пациентов с людьми, они также могут проявлять развитие токсичности, к...

Неуместное расширение последовательностей повторения ДНК является генетической основой для нескольких нейродегенеративных заболеваний, таких как боковой амиотрофический склероз (ALS), фронтотемпоральная деменция (FTD) и болезнь Гентингтона (HD)1. Хотя существуют клеточные и животные модели для этих заболеваний, механизмы, лежащие в основе этих условий, не четко определены. Например, HD вызвано расширением последовательности повтора CAG в последовательности кодирования для белка Хантингтин Htt2. Потому что CAG кодирует аминокислоты глутамин, CAG повторить расширение приводит к вставке полиглютамина, или поли, последовательность в Htt. Расширенный поли" белки образуют длину и возраст-зависимых белковых агрегатов, которые связаны с токсичностью3,4. Удивительно, но два последних исследования показывают, что длина последовательности поли" не является основным фактором начала заболевания БГ, предполагая, что поли- независимые факторы могут также способствовать болезни5,6.
Один из возможных поли- независимый механизм включает в себя недавно обнаруженный тип белка перевод называется Repeat Associated Nна-AUG-зависимых (RAN) перевод7. Как следует из названия, перевод РАН происходит только тогда, когда присутствует расширенная повторная последовательность и не требует канонического старта кодона. Таким образом, перевод РАН происходит во всех трех кадрах чтения повтора для получения трех различных полипептидов. Кроме того, поскольку многие гены также производят антисмысловую транскрипт, содержащую обратный дополнение расширенной последовательности повтора, перевод RAN также происходит во всех трех кадрах чтения антисмыслового транскрипта. В совокупности перевод РАН расширяет количество белков, вырабатываемых из расширенной повторяющихся последовательностей ДНК, от одного пептида до шести пептидов. На сегодняшний день перевод РАН наблюдается по крайней мере в восьми различных нарушениях повторного расширения8. Пептиды РАН наблюдаются в посмертных образцах пациентов и только в тех случаях, когда пациент несет расширенное повтор9,,10. Хотя эти пептиды явно присутствуют в клетках пациента, их вклад в патофизиологию болезни неясен.
Чтобы лучше определить потенциальную токсичность, связанную с пептидами RAN, несколько групп выразили каждый пептид в различных модельных системах, таких как дрожжи, мухи, мыши и клетки культуры тканей11,,12,,13,,1515,16., Вместо того, чтобы использовать повторную последовательность для выражения, эти модели используют подход кодон-вариации, в котором повторяющаяся последовательность устраняется, но аминокислотная последовательность сохраняется. Инициация перевода происходит через канонический АТГ и пептид, как правило, сливается с флуоресцентным белком либо n- или C-терминус, ни один из которых, как представляется, вмешиваться в RAN пептид токсичности. Поэтому каждая конструкция переэкспрессирует один пептид РАН. Моделирование различных продуктов РАН в многоклеточном организме с простыми анализами для измерения токсичности пептида РАН жизненно важно понять, как различные продукты РАН от каждого вызывающего заболевание повторного расширения способствуют клеточной дисфункции и нейродегенерации.
Как и другие модельные системы, C. elegans обеспечивает гибкую и эффективную экспериментальную платформу, которая позволяет проводить исследования новых механизмов заболевания, таких как токсичность пептида РАН. Черви предлагают несколько уникальных экспериментальных атрибутов, которые в настоящее время не доступны в других моделях пептидной токсичности RAN. Во-первых, C. elegans оптически прозрачны от рождения до смерти. Это позволяет просто визуализировать экспрессию и локализацию пептида РАН, а также анализ нейродегенерации у живых животных. Во-вторых, трансгенные методы генерации моделей экспрессии пептида РАН являются недорогими и быстрыми. Учитывая короткий трехдневный жизненный цикл C. elegans, стабильные трансгенные линии, выражающие любой пептид РАН в клеточном типе специфическим образом, могут быть произведены менее чем за неделю. В-третьих, простые фенотипические выходы могут сочетаться с методами генетического скрининга, такими как химический мутагенез или скрининг РНК, чтобы быстро определить гены, необходимые для токсичности пептида РАН. Наконец, короткая продолжительность жизни C. elegans (20 дней) позволяет следователям определить, как старение, которое является наибольшим фактором риска для большинства повторных заболеваний расширения, влияет на токсичность пептида РАН. В совокупности это сочетание экспериментальных атрибутов не имеет себе равных ни в одной другой модельной системе и предлагает мощную платформу для изучения токсичности пептида РАН.
Здесь мы описываем несколько анализов, которые используют экспериментальные преимущества C. elegans для измерения токсичности пептидов РАН и для выявления генетических модификаторов этой токсичности. Кодон-разнообразные ПЕПтиды ПО РАН помечены GFP и выражается индивидуально в любом мышечных клетках под промоутером мио-3 или в ГАМК-моторных нейронов под unc-47 промоутер. Для экспрессии в мышечных клетках, важно, чтобы токсичные пептиды RAN помечены зеленым флуоресцентным белком (GFP), или другим флуоресцентным белком (FP) тегом, который может быть направлен с вектором кормления РНК. Это потому, что токсичные экспрессии пептида RAN обычно блокирует рост, что делает такие штаммы нежизнеспособными. Использование gfp (RNAi) условно инактивирует экспрессию пептида RAN и позволяет проводить поддерживающие деформации, генетические кресты и т.д. Для анализов, эти животные удаляются из gfp (RNAi), что позволяет выражение пептида РАН и в результате фенотипов. В дополнение к молекулярной стратегии для проектирования кодон-разнообразных конструкций экспрессии RAN пептида, мы описываем анализы для измерения токсичности развития (личиальная подвижность и анализ роста), пост-развития возрастной токсичности (парализующий анализ), и нейронных морфологических дефектов (анализ commissure).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>35mm x 10mm Petri Dish, Sterile</td>
			<td>CELLTREAT Scientific Products</td>
			<td>50-202-036</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AGAR GRANULATED 2KILOGRAM</td>
			<td>BD DIAGNOSTIC SYSTEMS</td>
			<td>DF0145070</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AGAROSE ULTRAPURE</td>
			<td>LIFE TECHNOLOGIES</td>
			<td>16500500</td>
			<td>Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CARBENICILLIN 5G</td>
			<td>THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS</td>
			<td>BP26485</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COVER GLASSES NO 1 22MM 1OZ/PK</td>
			<td>THERMO SCI ERIE</td>
			<td>12542B</td>
			<td>Imaging for commissure assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FEMOTIPS DISPSBL MICROINJ 20CS</td>
			<td>EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS</td>
			<td>E5242952008</td>
			<td>Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FF COV GLASS NO1 40X22MM 1OZPK</td>
			<td>THERMO SCI ERIE</td>
			<td>125485C</td>
			<td>Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>THERMO SCI ERIE</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td>Imaging for commissure assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;Bacto Peptone&#160;</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>DF0118-17-0</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HALOCARBON OIL 700</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH INC</td>
			<td>H8898-50ML</td>
			<td>Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG BIOTECH 10G</td>
			<td>THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS</td>
			<td>BP162010</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Advanced Fluorescence imaging software</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>LAS-AF</td>
			<td>Image acquisition software for video speed analysis and commissure assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Immersion type N (Oil)</td>
			<td>W NUHSBAUM INC</td>
			<td>NC9547002</td>
			<td>Imaging for commissure assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEVAMISOLE HYDROCHLORIDE 10GR</td>
			<td>THERMO SCI ACROS ORGANICS</td>
			<td>AC187870100</td>
			<td>Imaging for commissure assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROLOADER TIPS 2 X 96 PCS</td>
			<td>EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS</td>
			<td>E5242956003</td>
			<td>Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			PETRI DISH, 60X15MM,500/CS</td>
			<td>CORNING LIFE SCIENCES PLASTIC</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TISSUE CULT PLATE 24WEL 50/CS</td>
			<td>CORNING LIFE SCIENCES DL</td>
			<td>87721</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring ran peptide toxicity in c. elegans

C. elegans обычно используется для моделирования возрастных нейродегенеративных заболеваний, вызванных повторными мутациями расширения, такими как амиотрофический боковой склероз (ALS) и болезнь Гентингтона. Недавно было показано, что повторное расширение, содержащее РНК, является субстратом для нового типа белкового перевода, называемого повторным независимым (РАН). В отличие от канонического перевода, перевод РАН не требует начала кодона и происходит только тогда, когда повторы превышают пороговую длину. Поскольку нет стартового кодона для определения кадра чтения, перевод RAN происходит во всех кадрах чтения как из смысла, так и из шаблонов РНК- антисмыслов, которые содержат последовательность повторения расширения. Таким образом, перевод РАН увеличивает количество возможных связанных с болезнью токсичных пептидов с одного до шести. До сих пор перевод РАН был задокументирован в восьми различных нейродегенеративных и нервно-мышечных заболеваниях, основанных на повторном расширении. В каждом случае расшифровка продуктов РАН, которые являются токсичными, а также их механизмы токсичности, является важным шагом на пути к пониманию того, как эти пептиды способствуют патологиологии болезни. В этой работе мы представляем стратегии для измерения токсичности пептидов RAN в модельной системе C. elegans. Во-первых, мы описываем процедуры измерения токсичности пептида РАН на рост и подвижность развивающихся C. elegans. Во-вторых, мы подробно ассси для измерения постразвития, возрастно-зависимых эффектов пептидов РАН на подвижность. Наконец, мы описываем нейротоксичность асссы для оценки влияния пептидов РАН на морфологию нейронов. Эти анализы обеспечивают широкую оценку токсичности пептида RAN и могут быть полезны для выполнения крупномасштабных генетических или малых молекул экранов для выявления механизмов заболевания или терапии.

Мы использовали анализы, описанные здесь, чтобы оценить влияние различных ингибиций генов на токсичность дипептиды РАН, которые находятся у больных ALS с расширением повторения G4C2. Используя анализ роста для измерения токсичности развития, мы проанализировали эффекты неско...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans at JoVE.com

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Повторные не-ATG-зависимые трансляционные продукты являются патогенными особенностями нескольких повторных заболеваний, основанных на расширении. Цель описанного протокола заключается в оценке токсичности, вызванной этими пептидами с помощью поведенческих и клеточных анализов в модельной системе C. elegans.

Измерение токсичности пептида РАН в C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis ...

Пептиды РАН являются особенностью рецидива нейродегенеративных расстройств, таких как болезнь Хантингтона, боковой амиотрофический склероз и фронтотемпоральная деменция. Эти протоколы обеспечивают важный стандартизированный подход для количественной оценки токсичности пептидов РАН в модели системы C.elegans. Описанные методы просты в обучении и недороги, могут быть выполнены быстро, и использовать воспроизводимые особенности системы C.elegans, такие как движение и воспроизводство.При попытке этого протокола основной проблемой является получение последовательной пептидной токсичности и экспрессии РАН. Основными факторами контроля являются температура препарата, сроки перепадов температуры и подготовка анализных пластин. Для экспериментаторов важно последовательно классифицировать фенотипы животных в этом возрастном процессе анализа.Визуальная демонстрация этого метода показывает их критерии классификации. Начните с заливки стандартной среды роста нематод с одной миллимолярной IPTG и 25 микрограмм на миллилитр карбенициллина в 24-хорошо пластин. Streak из РНК кормления клонов в HT115 бактерий на LB карбенициллин агар и расти их при 37 градусов по Цельсию в течение 24 часов.На следующий день, выбрать одну колонию в один миллилитр LB карбенициллин жидких средств массовой информации и расти бактерии в течение 18 часов при 37 градусов по Цельсию при встряхивании при 250 об / мин. Найте четыре отдельных колодца NGM RNAi 24-хорошо пластины с 20 микролитров ночных бактериальных культур, как описано в рукописи текста и позволяют рнк бактерий, чтобы вызвать двойной мель РНК производства в одночасье. Используйте стандартный метод гипохлорита, чтобы изолировать яйца с первого дня взрослых C.elegans выражая интегрированный пептидный трансген РАН.Затем семя около 30 яиц в каждый колодец из 24-хорошо пластины и инкубировать пластины при 20 градусов по Цельсию в течение семи дней. Для выполнения анализа скорости видео, приобрести два видео из двух отдельных скважин для каждого состояния РНК с помощью стерео рассечения микроскоп оснащен монохромной камерой. Убедитесь в том, чтобы использовать последовательные настройки приобретения между скважинами.Для каждого видео установите продолжительность в 10 секунд и интервал времени до 76 миллисекунд. Установите время экспозиции изображения до четырех миллисекунд и используйте параметр масштабирования 1.49. Затем выберите два на два binning.Убедитесь, что разрешение 800 на 600 пикселей и начать запись. После приобретения, этикетка каждое видео сразу же с напряжением, состояние RNAi и хорошо номер. Затем измерьте пройденное расстояние и длину каждого животного для 20 различных животных на видео, изучая в общей сложности около 40 червей для каждого состояния РНК.В программном обеспечении выберите кнопку аннотации инструментов. Затем инструмент рисовать текст. Нажмите на точку в центре червя измеряется в первом кадре видео и пометить его с номером.Заранее видео до конца при визуальном отслеживании червя. Затем нажмите на него и отметь его следующим соответствующим номером. Используйте инструмент бар масштаба притяжки, чтобы провести линию от первого числа до второго числа и записать расстояние, пройденное в электронной таблице.Повторите это измерение для 19 других червей в видео, сохраняя при этом каждое отдельное измерение в окне анализа. После завершения измерений сделайте снимок последнего видеорамки, иллюстрирующей все линии измерения, чтобы данные можно было проследить до животного, из которого они возникли. Затем проанализируйте данные с помощью четырехкоголовой таблицы, где столбец один является идентификатором червя, а столбец второй — скоростью.Время каждого видео можно найти, нажав правой кнопкой мыши на видео в рамках эксперимента и переходя к свойствам. Чтобы нормализовать измерение скорости, найти длину каждого животного. Используйте поликлинный инструмент для свободного отслеживания C.elegans от кончика головы до кончика хвоста.Затем сделай снимок финальной видеорамки, иллюстрирующей все полилины. Длина линий будет записана по статистике. Добавьте два столбца в электронную таблицу, один для длины животного и один для нормализованной скорости.Наконец, проанализируйте нормализованные данные о скорости с помощью одной из способов ANOVA с помощью пост-специального тестирования по сравнению с пустым вектором РНК. Поместите четыре-шесть трансгенных L4 C.elegans, выражаюющих пептид GFP РАН, на шестисемейную пластину GFP RNAi и выращивайте их при 20 градусах цельсия. Если в эксперименте используются РНК для проверки генетического воздействия на пептидную токсичность РАН, переместите 10 трансгенных гравидных взрослых к каждому из двух пустых векторных РНК РНК или генноспецифических РНК пластин.Если мутанты используются для анализа генетического воздействия на пептидную токсичность РАН, поместите 10 гравидных диких животных или животных-мутантов, выражаюющих один и тот же трансген РАН, на каждую из двух пустых векторных РНК или РНК-тарелок GFP. Выращивайте их при 20 градусах по Цельсию в течение 48 часов. Выберите 10 наборов из 10 трансгенных L4 из пластин РНК и поместите каждый набор на трехметровой пластине РНК.Убедитесь, что черви, отобранные для анализа все имеют поверхностно нормальную подвижность. Поместите пластины в полиэтиленовый пакет, чтобы сохранить влагу и инкубировать их при 25 градусах по Цельсию. Через 24 часа проанализируйте животных на подвижность, нажав на пластины на рассеченном микроскопе и проверив движение.Если червь перемещается больше длины тела, считайте его мобильным и перенесите его на новую трехметровую пластину РНК. Используйте платиновый выбор, чтобы коснуться оставшихся червей на голове и хвосте. Если животное движется больше, чем длина тела, подсчитайте животное как мобильное и перенесите его на новую трехметровую пластину РНК.Если на второй день не наблюдается значительного паралича при контроле пустого вектора, прекратите анализ и начните все сначала. Сгруппа всех неподвижных червей вместе, так что движение более чем длина тела могут быть легко обнаружены. Подсчитайте всех парализованных, упакованных или мертвых червей и отбросьте тарелку.Продолжить забил животных для паралича каждый день в течение пяти-семи дней. Анализ роста был использован для измерения влияния ингибиций генов на токсичность дипептидов РАН, которые находятся у пациентов с ALS с повторным расширением G4C2. Выражение PR50 GFP только привело к полному аресту роста, но нокдаун нескольких генов подавлял токсичность развития.Влияние специфических генных нокдаунов на подвижность развития PR50, выражаюющих животных, измерялось методом анализа скорости видео. Как и ожидалось, ингибирование экспрессии PR50 GFP привело к значительному увеличению подвижности по сравнению с пустым вектором РНК. Кроме того, РНК против протеасного подразделения RPN7 привели к значительному увеличению подвижности PR50.Когда взрослые фенотипы были проанализированы с возрастной зависимости паралича анализа, PR50 GFP выставлены до 80%паралич к пяти дням возраста. Тем не менее, РНК, направленных на ген куль-6 значительно задерживается паралич, предполагая, что куль-6 требуется для PR50 GFP токсичности. Чтобы определить, если RAN белки вызывают невропатологии, когда выражается в C.elegans нейронов, нейрон-специфической токсичности был рассмотрен с помощью анализа комиссариата.В день два взрослых, PR50 GFP выражение в моторных нейронов привело к значительному увеличению двигательных нейронов blebbing. Эта невропатология была значительно подавлена мутацией в гене рецептора инсулина IGF омолог DAF-2, который задерживает токсичные свойства нескольких нейродегенеративных белков. Для поведенческого анализа важно, чтобы пептиды РАН вынауют высокоперетративный фенотип.Такие гены или препараты могут обеспечить новые биомаркеры или терапевтические возможности для пептидных заболеваний РАН. Используя эти анализы, мы выполнили геномный рнк-экран для супрессоров C9ORF72, связанных с пептидом RAN proline-arginine. Гены, выявленные на этом экране, включают в себя множество новых и сохраненных генов, которые будут предметом будущих механистических исследований.

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Генерация Стабильный Трансгенные Элеганс C. Использование Микроинъекция

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Поколение трансгенных С. Элеганс По Biolistic преобразования

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Измерительный Caenorhabditis Элеганс Продолжительность жизни в 96-луночных микротитровальных

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi скрининга для выявления Постэмбриональное фенотипы в С. Элеганс</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles

Измерение пептида транслокации в Большой однослойные везикулы

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1.  Many of these are referred ...

C. elegans Chemotaxis Assay

C. elegans Chemotaxis Assay

C. Элеганс Анализ хемотаксиса

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

Антитела Окрашивание в<em&gt; С. Элеганс</em&gt; Использование &quot;Freeze-Крекинг&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

Измерения воздействия бактерий на<em&gt; C. Элеганс</em&gt; Поведение использованием анализа Яйцо Сохранение

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Аноксия-голодание модель ишемии / реперфузии в<em&gt; С. Элеганс</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Методы для кожи телесные повреждения и анализы для заживления ответы в<em&gt; C. Элеганс</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...