Name: measuring ran peptide toxicity in c. elegans
Uploaded: 2020-04-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans at JoVE.com

NIH R21NS107797

1. Generación de construcciones de expresión de péptidoRAN variadas con codón
<ol><li>Diseñar la secuencia de codificación de péptidos RAN individual utilizando codones sinónimos para eliminar la estructura repetitiva fundamental de ADN/ARN, pero preservar la secuencia de aminoácidos superantes.</li>
	<li>Ordene las secuencias de codón personalizadas comercialmente en las longitudes de repetición necesarias para los estudios (normalmente de 5 a 100 repeticiones). Incluya un sitio de restricción HindIII en e...

<ol>
	<li>Cleary, J. D., Ranum, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeat+associated+non-ATG+(RAN)+translation:+new+starts+in+microsatellite+expansion+disorders.">Repeat associated non-ATG (RAN) translation: new starts in microsatellite expansion disorders.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 26, 6-15 (2014).</li><li>The Huntington's Disease Collaborative Research Group. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+gene+containing+a+trinucleotide+repeat+that+is+expanded+and+unstable+on+Huntington's+disease+chromosomes.">A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes.</a> Cell. 72 (6), 971-983 (1993).</li><li>Scherzinger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntingtin-encoded+polyglutamine+expansions+form+amyloid-like+protein+aggregates+in+vitro+and+in+vivo.">Huntingtin-encoded polyglutamine expansions form amyloid-like protein aggregates in vitro and in vivo.</a> Cell. 90 (3), 549-558 (1997).</li><li>Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+threshold+for+polyglutamine-expansion+protein+aggregation+and+cellular+toxicity+is+dynamic+and+influenced+by+aging+in+Caenorhabditis+elegans.">The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99 (16), 10417-10422 (2002).</li><li>Genetic Modifiers of Huntington's Disease Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electronic+address,+g.+h.+m.+h.+e.,+Genetic+Modifiers+of+Huntington's+Disease,+C.+CAG+Repeat+Not+Polyglutamine+Length+Determines+Timing+of+Huntington's+Disease+Onset.">Electronic address, g. h. m. h. e., Genetic Modifiers of Huntington's Disease, C. CAG Repeat Not Polyglutamine Length Determines Timing of Huntington's Disease Onset.</a> Cell. 178 (4), 887-900 (2019).</li><li>Wright, G. E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Length+of+Uninterrupted+CAG,+Independent+of+Polyglutamine+Size,+Results+in+Increased+Somatic+Instability,+Hastening+Onset+of+Huntington+Disease.">Length of Uninterrupted CAG, Independent of Polyglutamine Size, Results in Increased Somatic Instability, Hastening Onset of Huntington Disease.</a> American Journal of Human Genetics. 104 (6), 1116-1126 (2019).</li><li>Cleary, J. D., Ranum, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeat-associated+non-ATG+(RAN)+translation+in+neurological+disease.">Repeat-associated non-ATG (RAN) translation in neurological disease.</a> Human Molecular Genetics. 22 (1), 45-51 (2013).</li><li>Banez-Coronel, M., Ranum, L. P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeat-associated+non-AUG+(RAN)+translation:+insights+from+pathology.">Repeat-associated non-AUG (RAN) translation: insights from pathology.</a> Laboratory Investigation. 99 (7), 929-942 (2019).</li><li>Banez-Coronel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAN+Translation+in+Huntington+Disease.">RAN Translation in Huntington Disease.</a> Neuron. 88 (4), 667-677 (2015).</li><li>Ash, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unconventional+translation+of+C9ORF72+GGGGCC+expansion+generates+insoluble+polypeptides+specific+to+c9FTD/ALS.">Unconventional translation of C9ORF72 GGGGCC expansion generates insoluble polypeptides specific to c9FTD/ALS.</a> Neuron. 77 (4), 639-646 (2013).</li><li>Kramer, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+screens+in+human+cells+and+primary+neurons+identify+modifiers+of+C9ORF72+dipeptide-repeat-protein+toxicity.">CRISPR-Cas9 screens in human cells and primary neurons identify modifiers of C9ORF72 dipeptide-repeat-protein toxicity.</a> Nature Genetics. 50 (4), 603-612 (2018).</li><li>Boeynaems, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+screen+connects+nuclear+transport+genes+to+DPR+pathology+in+c9ALS/FTD.">Drosophila screen connects nuclear transport genes to DPR pathology in c9ALS/FTD.</a> Scientific Reports. 6, 20877 (2016).</li><li>Jovicic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modifiers+of+C9orf72+dipeptide+repeat+toxicity+connect+nucleocytoplasmic+transport+defects+to+FTD/ALS.">Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS.</a> Nature Neuroscience. 18 (9), 1226-1229 (2015).</li><li>Boeynaems, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+Separation+of+C9orf72+Dipeptide+Repeats+Perturbs+Stress+Granule+Dynamics.">Phase Separation of C9orf72 Dipeptide Repeats Perturbs Stress Granule Dynamics.</a> Molecular Cell. 65 (6), 1044-1055 (2017).</li><li>Lee, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C9orf72+Dipeptide+Repeats+Impair+the+Assembly,+Dynamics,+and+Function+of+Membrane-Less+Organelles.">C9orf72 Dipeptide Repeats Impair the Assembly, Dynamics, and Function of Membrane-Less Organelles.</a> Cell. 167 (3), 717-788 (2016).</li><li>Hao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+dysfunction+and+neurodegeneration+in+a+C9orf72+mouse+line+expressing+poly-PR.">Motor dysfunction and neurodegeneration in a C9orf72 mouse line expressing poly-PR.</a> Nature Communications. 10 (1), 2906 (2019).</li><li>Scior, A., Preissler, S., Koch, M., Deuerling, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+PCR-free+engineering+of+highly+repetitive+DNA+sequences.">Directed PCR-free engineering of highly repetitive DNA sequences.</a> BMC Biotechnology. 11, 87 (2011).</li><li>Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+transformation.">DNA transformation.</a> Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).</li><li>Rudich, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+localized+C9orf72-associated+arginine-containing+dipeptides+exhibit+age-dependent+toxicity+in+C.+elegans.">Nuclear localized C9orf72-associated arginine-containing dipeptides exhibit age-dependent toxicity in C. elegans.</a> Human Molecular Genetics. 26 (24), 4916-4928 (2017).</li><li>Gidalevitz, T., Krupinski, T., Garcia, S., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Destabilizing+protein+polymorphisms+in+the+genetic+background+direct+phenotypic+expression+of+mutant+SOD1+toxicity.">Destabilizing protein polymorphisms in the genetic background direct phenotypic expression of mutant SOD1 toxicity.</a> PLoS Genetics. 5 (3), 1000399 (2009).</li><li>Nollen, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNA+interference+screen+identifies+previously+undescribed+regulators+of+polyglutamine+aggregation.">Genome-wide RNA interference screen identifies previously undescribed regulators of polyglutamine aggregation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 101 (17), 6403-6408 (2004).</li><li>Satyal, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyglutamine+aggregates+alter+protein+folding+homeostasis+in+Caenorhabditis+elegans.">Polyglutamine aggregates alter protein folding homeostasis in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (11), 5750-5755 (2000).</li><li>Boccitto, M., Lamitina, T., Kalb, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Daf-2+signaling+modifies+mutant+SOD1+toxicity+in+C.+elegans.">Daf-2 signaling modifies mutant SOD1 toxicity in C. elegans.</a> PLoS One. 7 (3), 33494 (2012).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C9orf72+BAC+Mouse+Model+with+Motor+Deficits+and+Neurodegenerative+Features+of+ALS/FTD.">C9orf72 BAC Mouse Model with Motor Deficits and Neurodegenerative Features of ALS/FTD.</a> Neuron. 90 (3), 521-534 (2016).</li><li>Peters, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+C9ORF72+Hexanucleotide+Expansion+Reproduces+RNA+Foci+and+Dipeptide+Repeat+Proteins+but+Not+Neurodegeneration+in+BAC+Transgenic+Mice.">Human C9ORF72 Hexanucleotide Expansion Reproduces RNA Foci and Dipeptide Repeat Proteins but Not Neurodegeneration in BAC Transgenic Mice.</a> Neuron. 88 (5), 902-909 (2015).</li><li>O'Rourke, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C9orf72+BAC+Transgenic+Mice+Display+Typical+Pathologic+Features+of+ALS/FTD.">C9orf72 BAC Transgenic Mice Display Typical Pathologic Features of ALS/FTD.</a> Neuron. 88 (5), 892-901 (2015).</li><li>Mizielinska, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C9orf72+repeat+expansions+cause+neurodegeneration+in+Drosophila+through+arginine-rich+proteins.">C9orf72 repeat expansions cause neurodegeneration in Drosophila through arginine-rich proteins.</a> Science. 345 (6201), 1192-1194 (2014).</li><li>Krajacic, P., Shen, X., Purohit, P. K., Arratia, P., Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanical+profiling+of+Caenorhabditis+elegans+motility.">Biomechanical profiling of Caenorhabditis elegans motility.</a> Genetics. 191 (3), 1015-1021 (2012).</li><li>Zhang, L., Ward, J. D., Cheng, Z., Dernburg, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+auxin-inducible+degradation+(AID)+system+enables+versatile+conditional+protein+depletion+in+C.+elegans.">The auxin-inducible degradation (AID) system enables versatile conditional protein depletion in C. elegans.</a> Development. 142 (24), 4374-4384 (2015).</li></ol>

Aquí informamos métodos que se pueden utilizar para analizar la toxicidad del péptido RAN modelado en el músculo o en las neuronas de C. elegans. Mientras que las proteínas neurodegenerativas tienen un fenotipo de inicio de edad en pacientes humanos, también pueden exhibir toxicidad en el desarrollo cuando se sobreexpresan en los sistemas modelo. La sobreexpresión tiene limitaciones interpretativas significativas, pero también proporciona un poderoso punto de partida para las pantallas genéticas o farma...

La expansión inapropiada de las secuencias de repetición de ADN es la base genética de varias enfermedades neurodegenerativas como la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), la demencia frontotemporal (FTD) y la enfermedad de Huntington (EH)1. Si bien existen modelos celulares y animales establecidos para estas enfermedades, los mecanismos subyacentes a estas condiciones no están bien definidos. Por ejemplo, la EH es causada por las expansiones de una secuencia de repetición CAG en la secuencia de codificación de la proteína Huntingtin Htt2. Debido a que CAG codifica el aminoácido glutamina, la expansión de repetición CAG da como resultado la inserción de una secuencia de poliglutamina, o polyQ, dentro de Htt. Las proteínas poliQ expandidas forman agregados proteicos dependientes de la longitud y la edad que están asociados con la toxicidad3,4. Sorprendentemente, dos estudios recientes sugieren que la longitud de la secuencia polyQ no es el principal impulsor de la aparición de la enfermedad de EH, lo que sugiere que los factores independientes del poliQ también pueden contribuir a la enfermedad5,,6.
Un posible mecanismo independiente de la poliQ implica un tipo recién descubierto de traducción de proteínas denominado Repeat Associado Non-AUG-dependiente (RAN) traducción7. Como su nombre indica, la traducción RAN sólo se produce cuando una secuencia de repetición expandida está presente y no requiere un codón de inicio canónico. Por lo tanto, la traducción RAN se produce en los tres marcos de lectura de la repetición para producir tres polipéptidos distintos. Además, debido a que muchos genes también producen una transcripción antisentido que contiene el complemento inverso de la secuencia de repetición expandida, la traducción RAN también se produce en los tres marcos de lectura de la transcripción antisentido. Juntos, la traducción RAN amplía el número de proteínas producidas a partir de una secuencia de ADN repetitiva ampliada de un péptido a seis péptidos. Hasta la fecha, la traducción RAN se ha observado en al menos ocho diferentes trastornos de expansión de repetición8. Los péptidos RAN se observan en muestras de pacientes postmortem y sólo en los casos en que el paciente lleva una repetición ampliada9,,10. Si bien estos péptidos están claramente presentes en las células del paciente, su contribución a la fisiopatología de la enfermedad no está clara.
Para definir mejor la toxicidad potencial asociada con los péptidos RAN, varios grupos han expresado cada péptido en varios sistemas modelo, tales como levadura, moscas, ratones, y células de cultivo de tejido11,12,13,14,15,16. En lugar de utilizar la secuencia de repetición para la expresión, estos modelos emplean un enfoque de codón-variación en el que se elimina la secuencia de repetición pero se conserva la secuencia de aminoácidos. La iniciación de la traducción se produce a través de un ATG canónico y el péptido se fusiona típicamente con una proteína fluorescente en la Terminal N o C, ninguno de los cuales parece interferir con la toxicidad del péptido RAN. Por lo tanto, cada construcción sobreexpresa un solo péptido RAN. Modelar los diferentes productos RAN en un organismo multicelular con ensayos simples para medir la toxicidad del péptido RAN es de vital importancia para entender cómo los diferentes productos RAN de cada expansión repetida causante de enfermedad contribuyen a la disfunción celular y la neurodegeneración.
Al igual que otros sistemas modelo, C. elegans proporciona una plataforma experimental flexible y eficiente que permite estudiar nuevos mecanismos de enfermedad, como la toxicidad de péptidos RAN. Los gusanos ofrecen varios atributos experimentales únicos que actualmente no están disponibles en otros modelos de toxicidad por péptidos RAN. En primer lugar, los C. elegans son ópticamente transparentes desde su nacimiento hasta la muerte. Esto permite una visualización sencilla de la expresión y localización del péptido RAN, así como el análisis in vivo de la neurodegeneración en animales vivos. En segundo lugar, los métodos transgénicos para generar modelos de expresión de péptidos RAN son baratos y rápidos. Dado el corto ciclo de vida de tres días de C. elegans,se pueden producir líneas transgénicas estables que expresan cualquier péptido RAN dado de una manera específica de tipo celular en menos de una semana. En tercer lugar, las salidas fenotípicas simples se pueden combinar con métodos de cribado genéticos, como mutagénesis química o cribado de ARNi, para identificar rápidamente genes esenciales para la toxicidad del péptido RAN. Por último, la corta vida útil de C. elegans (20 días) permite a los investigadores determinar cómo el envejecimiento, que es el mayor factor de riesgo para la mayoría de las enfermedades de expansión repetida, influye en la toxicidad del péptido RAN. Juntos, esta combinación de atributos experimentales es inigualable en cualquier otro sistema de modelos y ofrece una potente plataforma para el estudio de la toxicidad del péptido RAN.
Aquí describimos varios ensayos que aprovechan las ventajas experimentales de C. elegans para medir la toxicidad de los péptidos RAN e identificar modificadores genéticos de esta toxicidad. Los péptidos RAN iniciados por ATG con codón se etiquetan con GFP y se expresan individualmente en cualquiera de las células musculares bajo el promotor myo-3 o en las neuronas motoras GABAérgicas bajo el promotor unc-47. Para la expresión en las células musculares, es importante que los péptidos RAN tóxicos se etiqueten con proteína fluorescente verde (GFP), u otra etiqueta de proteína fluorescente (FP) que se puede atacar con un vector de alimentación de ARNi. Esto se debe a que la expresión tóxica del péptido RAN generalmente bloquea el crecimiento, haciendo que tales cepas no sean viables. El uso de gfp(RNAi) inactiva condicionalmente la expresión del péptido RAN y permite el mantenimiento de cepas, cruces genéticos, etc. Para los ensayos, estos animales se eliminan de gfp (RNAi),lo que permite la expresión del péptido RAN y los fenotipos resultantes. Además de la estrategia molecular para diseñar construcciones de expresión de péptidos RAN variadas con codón, describimos ensayos para medir la toxicidad del desarrollo (motilidad larval y ensayo de crecimiento), toxicidad asociada a la edad post-desarrollo (ensayo de parálisis) y defectos morfológicos de las neuronas (ensayo de coordinación).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>35mm x 10mm Petri Dish, Sterile</td>
			<td>CELLTREAT Scientific Products</td>
			<td>50-202-036</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AGAR GRANULATED 2KILOGRAM</td>
			<td>BD DIAGNOSTIC SYSTEMS</td>
			<td>DF0145070</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AGAROSE ULTRAPURE</td>
			<td>LIFE TECHNOLOGIES</td>
			<td>16500500</td>
			<td>Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CARBENICILLIN 5G</td>
			<td>THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS</td>
			<td>BP26485</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COVER GLASSES NO 1 22MM 1OZ/PK</td>
			<td>THERMO SCI ERIE</td>
			<td>12542B</td>
			<td>Imaging for commissure assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FEMOTIPS DISPSBL MICROINJ 20CS</td>
			<td>EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS</td>
			<td>E5242952008</td>
			<td>Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FF COV GLASS NO1 40X22MM 1OZPK</td>
			<td>THERMO SCI ERIE</td>
			<td>125485C</td>
			<td>Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>THERMO SCI ERIE</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td>Imaging for commissure assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;Bacto Peptone&#160;</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>DF0118-17-0</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HALOCARBON OIL 700</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH INC</td>
			<td>H8898-50ML</td>
			<td>Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG BIOTECH 10G</td>
			<td>THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS</td>
			<td>BP162010</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Advanced Fluorescence imaging software</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>LAS-AF</td>
			<td>Image acquisition software for video speed analysis and commissure assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Immersion type N (Oil)</td>
			<td>W NUHSBAUM INC</td>
			<td>NC9547002</td>
			<td>Imaging for commissure assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEVAMISOLE HYDROCHLORIDE 10GR</td>
			<td>THERMO SCI ACROS ORGANICS</td>
			<td>AC187870100</td>
			<td>Imaging for commissure assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROLOADER TIPS 2 X 96 PCS</td>
			<td>EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS</td>
			<td>E5242956003</td>
			<td>Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			PETRI DISH, 60X15MM,500/CS</td>
			<td>CORNING LIFE SCIENCES PLASTIC</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TISSUE CULT PLATE 24WEL 50/CS</td>
			<td>CORNING LIFE SCIENCES DL</td>
			<td>87721</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring ran peptide toxicity in c. elegans

C. elegans se utiliza comúnmente para modelar enfermedades neurodegenerativas relacionadas con la edad causadas por mutaciones de expansión repetidas, como la Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA) y la enfermedad de Huntington. Recientemente, se demostró que el ARN que contiene expansión repetida es el sustrato de un tipo novedoso de traducción proteica llamada traducción no dependiente de la AUG (RAN) asociada a la repetición. A diferencia de la traducción canónica, la traducción RAN no requiere un codón de inicio y solo se produce cuando las repeticiones superan una longitud de umbral. Debido a que no hay codón de inicio para determinar el marco de lectura, la traducción RAN se produce en todos los marcos de lectura de las plantillas de ARN de detección y antisentido que contienen una secuencia de expansión repetida. Por lo tanto, la traducción DERAN amplía el número de posibles péptidos tóxicos asociados a la enfermedad de uno a seis. Hasta ahora, la traducción RAN se ha documentado en ocho diferentes enfermedades neurodegenerativas y neuromusculares basadas en la expansión. En cada caso, descifrar qué productos RAN son tóxicos, así como sus mecanismos de toxicidad, es un paso crítico hacia la comprensión de cómo estos péptidos contribuyen a la fisiopatología de la enfermedad. En este artículo, presentamos estrategias para medir la toxicidad de los péptidos RAN en el sistema modelo C. elegans. En primer lugar, describimos los procedimientos para medir la toxicidad del péptido RAN en el crecimiento y la motilidad del desarrollo de C. elegans. En segundo lugar, detallamos un ensayo para medir los efectos post-desarrollo y dependientes de la edad de los péptidos RAN en la motilidad. Por último, describimos un ensayo de neurotoxicidad para evaluar los efectos de los péptidos RAN en la morfología de las neuronas. Estos ensayos proporcionan una evaluación amplia de la toxicidad de los péptidos RAN y pueden ser útiles para realizar pantallas genéticas o pequeñas moléculas a gran escala para identificar mecanismos o terapias de la enfermedad.

Utilizamos los ensayos descritos aquí para evaluar el efecto de diferentes inhibiciones genéticas sobre la toxicidad de los dipéptidos RAN que se encuentran en pacientes con ELA con una expansión repetida G4C2. Utilizando el ensayo de crecimiento para medir la toxicidad del desarrollo, analizamos los efectos de varios mutantes noqueadores genéticos identificados en un supresor de pantalla RNAi en todo el genoma de toxicidad PR50-GFP expresada por el músculo. Si bien la expresión de PR50-GFP p...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans at JoVE.com

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Los productos traslacionales no dependientes del ATG asociados a la repetición son características patógenas emergentes de varias enfermedades basadas en la expansión repetida. El objetivo del protocolo descrito es evaluar la toxicidad causada por estos péptidos utilizando ensayos conductuales y celulares en el sistema modelo C. elegans.

Medición de la toxicidad del péptido RAN en C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis ...

Los péptidos RAN son una característica de los trastornos neurodegenerativos de expansión repetida como la enfermedad de Huntington, la esclerosis lateral amiotrófica y la demencia frontotemporal. Estos protocolos proporcionan un enfoque estandarizado importante para cuantificar la toxicidad del péptido RAN en el sistema modelo C.elegans. Las técnicas descritas son fáciles de aprender y económicas, se pueden realizar rápidamente y aprovechan las características reproducibles del sistema C.elegans, como el movimiento y la reproducción.Al intentar este protocolo, el principal desafío es obtener toxicidad y expresión constantes de péptidos RAN. Los principales factores a controlar incluyen la temperatura de las drogas, el momento de los cambios de temperatura y la preparación de las placas de ensayo. Es importante que los experimentadores clasiquen constantemente los fenotipos de los animales en este ensayo de proceso dependiente de la edad.La demostración visual de esta técnica muestra sus criterios de clasificación. Comience por verter el medio de crecimiento de nematodos estándar con un IPTG milimotor y 25 microgramos por mililitro de carbenicillina en placas de 24 pozos. Estratete los clones de alimentación de ARNi en bacterias HT115 en el agar lb carbenicillina y creció a 37 grados centígrados durante 24 horas.Al día siguiente, escoge una sola colonia en un mililitro de medios líquidos de carbenicillina LB y haz crecer las bacterias durante 18 horas a 37 grados centígrados mientras tiemblas a 250 rpm. Detecte cuatro pozos individuales de la placa NGM RNAi de 24 pozos con 20 microlitros de cultivos bacterianos durante la noche como se describe en el manuscrito de texto y permita que las bacterias RNAi induzcan la producción de ARN de doble cadena durante la noche. Utilice el método estándar de hipoclorito para aislar los óvulos del primer día C.elegans adultos que expresan el transgén péptido RAN integrado.Luego sembra unos 30 huevos en cada pozo de la placa de 24 pozos e incubar el plato a 20 grados Celsius durante siete días. Para realizar análisis de velocidad de vídeo, adquiera dos vídeos de dos pozos separados para cada condición de ARNi utilizando un microscopio de disección estéreo equipado con una cámara monocroma. Asegúrese de utilizar la configuración de adquisición coherente entre pozos.Para cada vídeo, establezca la duración de 10 segundos y el intervalo de tiempo en 76 milisegundos. Establezca el tiempo de exposición de la imagen en cuatro milisegundos y utilice el ajuste de zoom 1.49. A continuación, seleccione dos por dos binning.Compruebe que la resolución es de 800 por 600 píxeles e inicie la grabación. Después de la adquisición, etiqueta cada video inmediatamente con la cepa, la condición de ARNi y el número de pozo. A continuación, medir la distancia recorrida y la longitud de cada animal para 20 animales diferentes por vídeo, examinando un total de unos 40 gusanos para cada condición de ARNi.En el software, seleccione el botón de herramientas de anotación. A continuación, la herramienta de dibujo de texto. Haga clic en un punto en el centro del gusano que se mide en el primer fotograma del vídeo y márquelo con un número.Avance el vídeo hasta el final mientras rastrea visualmente el gusano. A continuación, haga clic en él y márquelo con el siguiente número correspondiente. Utilice la herramienta de barra de escala de dibujo para dibujar una línea desde el primer número hasta el segundo número y registrar la distancia recorrida en una hoja de cálculo.Repita esta medición para otros 19 gusanos en el vídeo conservando cada medida individual en la ventana de análisis. Una vez completadas las mediciones, tome una instantánea del marco de vídeo final que ilustra todas las líneas de medición para que los datos puedan rastrearse hasta el animal del que se originaron. A continuación, analice los datos utilizando una hoja de cálculo de cuatro columnas donde la columna uno es el identificador de gusano y la columna dos es la velocidad.La hora de cada vídeo se puede encontrar haciendo clic con el botón derecho en el vídeo bajo el experimento yendo a las propiedades. Para normalizar la medición de velocidad, encuentre la longitud de cada animal. Utilice la herramienta de polilínea de dibujo para trazar libremente los C.elegans desde la punta de la cabeza hasta la punta de la cola.A continuación, tome una instantánea del fotograma de vídeo final que ilustra todas las polilíneas. La longitud de las líneas se registrará en las estadísticas. Agregue dos columnas a la hoja de cálculo, una para la longitud del animal y otra para la velocidad normalizada.Por último, analice los datos de velocidad normalizados utilizando un ANOVA unidireccional con pruebas post-hoc frente a RNI vectoriales vacíos. Coloque de cuatro a seis L4 C.elegans transgénicos que expresen la GFP de péptido RAN en una placa GFP RNAi de seis centímetros y los escríen a 20 grados centígrados. Si el experimento utiliza ARNi para detectar efectos genéticos sobre la toxicidad del péptido RAN, mueva 10 adultos gravídicos transgénicos a cada uno de dos vectores vacíos RNAi RNAi o placas RNAi específicas del gen.Si se utilizan mutantes para analizar los efectos genéticos sobre la toxicidad del péptido RAN, coloque 10 animales salvajes gravidos o animales mutantes que expresen el mismo transgén RAN en cada una de las dos placas vectoriales vacías RNAi o RNAi GFP. Cultivarlos a 20 grados centígrados durante 48 horas. Escoja 10 juegos de 10 L4 transgénicos de las placas RNAi y coloque cada juego en una placa de ARNi de tres centímetros.Asegúrese de que todos los gusanos seleccionados para el ensayo tengan motilidad superficialmente normal. Coloque las placas en una bolsa de plástico para retener la humedad e incubarlas a 25 grados centígrados. Después de 24 horas, analice los animales para la movilidad tocando las placas en el microscopio de disección y comprobando si hay movimiento.Si un gusano se mueve más de una longitud corporal, cuéntalo como móvil y transfiéralo a una nueva placa RNAi de tres centímetros. Utilice una selección de platino para tocar los gusanos restantes en la cabeza y la cola. Si el animal se mueve más de una longitud corporal, cuente el animal como móvil y transfiéralo a una nueva placa de ARNi de tres centímetros.Si no se observa una parálisis significativa en el control vectorial vacío para el día dos, termine el ensayo y comience de nuevo. Agrupe todos los gusanos no de movimiento para que el movimiento de más de una longitud corporal pueda detectarse fácilmente. Cuente todos los gusanos paralizantes, embolsados o muertos y deseche la placa.Continúe anotando a los animales para la parálisis todos los días durante cinco a siete días. El ensayo de crecimiento se utilizó para medir el efecto de las inhibiciones genéticas en la toxicidad de los dipéptidos RAN que se encuentran en pacientes con ELA con una expansión de repetición de G4C2. La expresión de PR50 GFP por sí sola resultó en un arresto de crecimiento completo, pero la eliminación de varios genes suprimió la toxicidad del desarrollo.El efecto de los derribos genéticos específicos en la motilidad del desarrollo de los animales que expresan PR50 se midió utilizando el método de análisis de la velocidad del vídeo. Como era de esperar, la inhibición de la expresión de PR50 GFP dio lugar a un gran aumento de la motilidad en comparación con el vector vacío RNAi. Además, el ARNi contra la subunidad proteasoma RPN7 dio lugar al aumento significativo de la motilidad PR50.Cuando se analizaron los fenotipos adultos con el ensayo de parálisis dependiente de la edad, pr50 GFP exhibió hasta un 80% de parálisis a los cinco días de edad. Sin embargo, el ARNi se dirigió al gen cul-6 de la parálisis significativamente retrasada, lo que sugiere que se requiere cul-6 para la toxicidad de la PFN PR50. Para determinar si las proteínas RAN causan neuropatología cuando se expresan en las neuronas C.elegans, se examinó la toxicidad específica de la neurona utilizando el ensayo de commissure.En el día dos adultos, PR50 GFP expresión en las neuronas motoras condujo a un aumento significativo en el sangrado de la neurona motora. Esta neuropatología fue suprimida significativamente por una mutación en el gen receptor de insulina IGF homólogo DAF-2 que retrasa las propiedades tóxicas de varias proteínas neurodegenerativas. Para el ensayo conductual, es importante que los péptidos RAN produzcan un fenotipo altamente penetrante.Estos genes o fármacos podrían proporcionar nuevos biomarcadores u opciones terapéuticas para las enfermedades de los péptidos RAN. Utilizando estos ensayos, hemos realizado una pantalla de ARNI en todo el genoma para los supresores del péptido RAN asociado C9ORF72 prolina-arginina. Los genes identificados en esta pantalla incluyen muchos genes nuevos y conservados que serán objeto de futuros estudios mecánicos.

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Generación de transgénicos estable C. elegans con microinyección

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Investigación

Biología

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generación de transgénicos C. elegans Por la transformación biolística

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Medición Caenorhabditis elegans Duración de la vida en 96 placas de microtitulación Bueno

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi de detección para identificar fenotipos postembrionarios en C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles

La translocación de péptidos en la medición de grandes vesículas unilamelares

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1.  Many of these are referred ...

C. elegans Chemotaxis Assay

C. elegans Chemotaxis Assay

C. elegans Ensayo de quimiotaxis

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

Tinción de anticuerpos en<em&gt; C. Elegans</em&gt; Uso de &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

Medición de los efectos de las bacterias en<em&gt; C. Elegans</em&gt; Comportamiento El uso de un ensayo de retención de huevo

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Un Modelo Anoxia inanición por isquemia / reperfusión en el<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Los métodos para la piel Heridas y ensayos para Respuestas de heridas en<em&gt; C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...