Name: measuring ran peptide toxicity in c. elegans
Uploaded: 2020-04-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans at JoVE.com

NIH R21NS107797

1. Generera kodon-varierade RAN peptid uttryck konstruktioner
<ol><li>Designa den individuella RAN peptidkodningssekvensen med synonyma kodon för att eliminera den grundläggande repetitiva DNA/RNA-strukturen men bevara den överliggande aminosyrasekvensen.</li>
	<li>Beställ de anpassade kodonsekvenserna kommersiellt vid de upprepningslängder som behövs för studierna (vanligtvis 5–100 repetitioner). Inkludera en hindIII begränsning plats vid 5's och en BamHI begränsning plats vid 3 för att underlätta kloning...

<ol>
	<li>Cleary, J. D., Ranum, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeat+associated+non-ATG+(RAN)+translation:+new+starts+in+microsatellite+expansion+disorders.">Repeat associated non-ATG (RAN) translation: new starts in microsatellite expansion disorders.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 26, 6-15 (2014).</li><li>The Huntington's Disease Collaborative Research Group. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+gene+containing+a+trinucleotide+repeat+that+is+expanded+and+unstable+on+Huntington's+disease+chromosomes.">A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes.</a> Cell. 72 (6), 971-983 (1993).</li><li>Scherzinger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntingtin-encoded+polyglutamine+expansions+form+amyloid-like+protein+aggregates+in+vitro+and+in+vivo.">Huntingtin-encoded polyglutamine expansions form amyloid-like protein aggregates in vitro and in vivo.</a> Cell. 90 (3), 549-558 (1997).</li><li>Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+threshold+for+polyglutamine-expansion+protein+aggregation+and+cellular+toxicity+is+dynamic+and+influenced+by+aging+in+Caenorhabditis+elegans.">The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99 (16), 10417-10422 (2002).</li><li>Genetic Modifiers of Huntington's Disease Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electronic+address,+g.+h.+m.+h.+e.,+Genetic+Modifiers+of+Huntington's+Disease,+C.+CAG+Repeat+Not+Polyglutamine+Length+Determines+Timing+of+Huntington's+Disease+Onset.">Electronic address, g. h. m. h. e., Genetic Modifiers of Huntington's Disease, C. CAG Repeat Not Polyglutamine Length Determines Timing of Huntington's Disease Onset.</a> Cell. 178 (4), 887-900 (2019).</li><li>Wright, G. E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Length+of+Uninterrupted+CAG,+Independent+of+Polyglutamine+Size,+Results+in+Increased+Somatic+Instability,+Hastening+Onset+of+Huntington+Disease.">Length of Uninterrupted CAG, Independent of Polyglutamine Size, Results in Increased Somatic Instability, Hastening Onset of Huntington Disease.</a> American Journal of Human Genetics. 104 (6), 1116-1126 (2019).</li><li>Cleary, J. D., Ranum, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeat-associated+non-ATG+(RAN)+translation+in+neurological+disease.">Repeat-associated non-ATG (RAN) translation in neurological disease.</a> Human Molecular Genetics. 22 (1), 45-51 (2013).</li><li>Banez-Coronel, M., Ranum, L. P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeat-associated+non-AUG+(RAN)+translation:+insights+from+pathology.">Repeat-associated non-AUG (RAN) translation: insights from pathology.</a> Laboratory Investigation. 99 (7), 929-942 (2019).</li><li>Banez-Coronel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAN+Translation+in+Huntington+Disease.">RAN Translation in Huntington Disease.</a> Neuron. 88 (4), 667-677 (2015).</li><li>Ash, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unconventional+translation+of+C9ORF72+GGGGCC+expansion+generates+insoluble+polypeptides+specific+to+c9FTD/ALS.">Unconventional translation of C9ORF72 GGGGCC expansion generates insoluble polypeptides specific to c9FTD/ALS.</a> Neuron. 77 (4), 639-646 (2013).</li><li>Kramer, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+screens+in+human+cells+and+primary+neurons+identify+modifiers+of+C9ORF72+dipeptide-repeat-protein+toxicity.">CRISPR-Cas9 screens in human cells and primary neurons identify modifiers of C9ORF72 dipeptide-repeat-protein toxicity.</a> Nature Genetics. 50 (4), 603-612 (2018).</li><li>Boeynaems, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+screen+connects+nuclear+transport+genes+to+DPR+pathology+in+c9ALS/FTD.">Drosophila screen connects nuclear transport genes to DPR pathology in c9ALS/FTD.</a> Scientific Reports. 6, 20877 (2016).</li><li>Jovicic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modifiers+of+C9orf72+dipeptide+repeat+toxicity+connect+nucleocytoplasmic+transport+defects+to+FTD/ALS.">Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS.</a> Nature Neuroscience. 18 (9), 1226-1229 (2015).</li><li>Boeynaems, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+Separation+of+C9orf72+Dipeptide+Repeats+Perturbs+Stress+Granule+Dynamics.">Phase Separation of C9orf72 Dipeptide Repeats Perturbs Stress Granule Dynamics.</a> Molecular Cell. 65 (6), 1044-1055 (2017).</li><li>Lee, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C9orf72+Dipeptide+Repeats+Impair+the+Assembly,+Dynamics,+and+Function+of+Membrane-Less+Organelles.">C9orf72 Dipeptide Repeats Impair the Assembly, Dynamics, and Function of Membrane-Less Organelles.</a> Cell. 167 (3), 717-788 (2016).</li><li>Hao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+dysfunction+and+neurodegeneration+in+a+C9orf72+mouse+line+expressing+poly-PR.">Motor dysfunction and neurodegeneration in a C9orf72 mouse line expressing poly-PR.</a> Nature Communications. 10 (1), 2906 (2019).</li><li>Scior, A., Preissler, S., Koch, M., Deuerling, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+PCR-free+engineering+of+highly+repetitive+DNA+sequences.">Directed PCR-free engineering of highly repetitive DNA sequences.</a> BMC Biotechnology. 11, 87 (2011).</li><li>Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+transformation.">DNA transformation.</a> Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).</li><li>Rudich, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+localized+C9orf72-associated+arginine-containing+dipeptides+exhibit+age-dependent+toxicity+in+C.+elegans.">Nuclear localized C9orf72-associated arginine-containing dipeptides exhibit age-dependent toxicity in C. elegans.</a> Human Molecular Genetics. 26 (24), 4916-4928 (2017).</li><li>Gidalevitz, T., Krupinski, T., Garcia, S., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Destabilizing+protein+polymorphisms+in+the+genetic+background+direct+phenotypic+expression+of+mutant+SOD1+toxicity.">Destabilizing protein polymorphisms in the genetic background direct phenotypic expression of mutant SOD1 toxicity.</a> PLoS Genetics. 5 (3), 1000399 (2009).</li><li>Nollen, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNA+interference+screen+identifies+previously+undescribed+regulators+of+polyglutamine+aggregation.">Genome-wide RNA interference screen identifies previously undescribed regulators of polyglutamine aggregation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 101 (17), 6403-6408 (2004).</li><li>Satyal, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyglutamine+aggregates+alter+protein+folding+homeostasis+in+Caenorhabditis+elegans.">Polyglutamine aggregates alter protein folding homeostasis in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (11), 5750-5755 (2000).</li><li>Boccitto, M., Lamitina, T., Kalb, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Daf-2+signaling+modifies+mutant+SOD1+toxicity+in+C.+elegans.">Daf-2 signaling modifies mutant SOD1 toxicity in C. elegans.</a> PLoS One. 7 (3), 33494 (2012).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C9orf72+BAC+Mouse+Model+with+Motor+Deficits+and+Neurodegenerative+Features+of+ALS/FTD.">C9orf72 BAC Mouse Model with Motor Deficits and Neurodegenerative Features of ALS/FTD.</a> Neuron. 90 (3), 521-534 (2016).</li><li>Peters, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+C9ORF72+Hexanucleotide+Expansion+Reproduces+RNA+Foci+and+Dipeptide+Repeat+Proteins+but+Not+Neurodegeneration+in+BAC+Transgenic+Mice.">Human C9ORF72 Hexanucleotide Expansion Reproduces RNA Foci and Dipeptide Repeat Proteins but Not Neurodegeneration in BAC Transgenic Mice.</a> Neuron. 88 (5), 902-909 (2015).</li><li>O'Rourke, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C9orf72+BAC+Transgenic+Mice+Display+Typical+Pathologic+Features+of+ALS/FTD.">C9orf72 BAC Transgenic Mice Display Typical Pathologic Features of ALS/FTD.</a> Neuron. 88 (5), 892-901 (2015).</li><li>Mizielinska, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C9orf72+repeat+expansions+cause+neurodegeneration+in+Drosophila+through+arginine-rich+proteins.">C9orf72 repeat expansions cause neurodegeneration in Drosophila through arginine-rich proteins.</a> Science. 345 (6201), 1192-1194 (2014).</li><li>Krajacic, P., Shen, X., Purohit, P. K., Arratia, P., Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanical+profiling+of+Caenorhabditis+elegans+motility.">Biomechanical profiling of Caenorhabditis elegans motility.</a> Genetics. 191 (3), 1015-1021 (2012).</li><li>Zhang, L., Ward, J. D., Cheng, Z., Dernburg, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+auxin-inducible+degradation+(AID)+system+enables+versatile+conditional+protein+depletion+in+C.+elegans.">The auxin-inducible degradation (AID) system enables versatile conditional protein depletion in C. elegans.</a> Development. 142 (24), 4374-4384 (2015).</li></ol>

Här rapporterar vi metoder som kan användas för att analysera RAN peptid toxicitet modelleras i muskeln eller i nervceller i C. elegans. Medan neurodegenerativa proteiner har en ålder debut fenotyp hos mänskliga patienter, de kan också uppvisa utvecklingsmässigt toxicitet när överuttrycks i modellsystem. Överuttryck har betydande tolkningsbegränsningar, men det ger också en kraftfull utgångspunkt för genetiska eller farmakologiska skärmar som syftar till att identifiera gener eller läkemedel som ...

Den olämpliga expansionen av DNA-repetitionssekvenser är den genetiska grunden för flera neurodegenerativa sjukdomar såsom amyotrofisk lateral skleros (ALS), frontotemporal demens (FTD) och Huntingtons sjukdom (HS)1. Även om det finns etablerade cellulära och djurmodeller för dessa sjukdomar, mekanismer bakom dessa villkor är inte väl definierade. Till exempel orsakas HD av expansioner av en CAG-upprepningssekvens i kodningssekvensen för Huntingtin-proteinet Htt2. Eftersom CAG kodar aminosyran glutamin, CAG upprepa expansion resulterar i införandet av en polyGlutamin, eller polyQ, sekvens inom Htt. Expanderade polyQ proteiner bildar längd- och åldersberoende proteinaggregat som är associerade med toxicitet3,4. Överraskande, två nyligen genomförda studier tyder på att längden på polyQ sekvensen inte är den viktigaste drivkraften för HS sjukdom debut, vilket tyder på att polyQ-oberoende faktorer kan också bidra till sjukdomen5,6.
En möjlig polyQ-oberoende mekanism innebär en nyupptäckt typ av proteinöversättning som kallas Repeat Associated Non-AUG-beroende (RAN) översättning7. Som namnet antyder inträffar RAN-översättningen endast när en utökad upprepad sekvens är närvarande och inte kräver en kanonisk start kodon. Därför förekommer RAN-översättning i alla tre läsramarna i upprepningen för att producera tre distinkta polypeptider. Dessutom, eftersom många gener också producerar en antisense avskrift som innehåller den omvända komplement av den utökade upprepa sekvensen, RAN översättning förekommer också i alla tre läsramar av antisense avskrift. Tillsammans utökar RAN översättning antalet proteiner som produceras från en utökad upprepad DNA-sekvens från en peptid till sex peptider. Hittills har RAN översättning observerats i minst åtta olika upprepade expansionsstörningar8. RAN peptider observeras i postmortem patientprover och endast i de fall där patienten bär en utökad upprepa9,10. Medan dessa peptider är tydligt närvarande i patientceller, deras bidrag till sjukdomen patofysiologin är oklart.
För att bättre definiera den potentiella toxicitet som förknippas med RAN peptid, flera grupper har uttryckt varje peptid i olika modellsystem, såsom jäst, flugor, möss, och vävnadsodling celler11,12,13,14,15,16. I stället för att använda upprepningssekvensen för uttryck använder dessa modeller en kodonvariationsmetod där upprepningssekvensen elimineras men aminosyrasekvensen bevaras. Översättning inledande sker genom en kanonisk ATG och peptid är vanligtvis smält till ett fluorescerande protein vid antingen N- eller C-ändstation, varav ingen verkar störa RAN peptid toxicitet. Därför överuttrycker varje konstruktion en enda RAN peptid. Modellering av de olika RAN-produkterna i en flercellig organism med enkla analyser för att mäta RAN-peptidtoxicitet är oerhört viktigt för att förstå hur de olika RAN-produkterna från varje sjukdomsframkallande upprepad expansion bidrar till cellulär dysfunktion och neurodegeneration.
Liksom andra modellsystem erbjuder C. elegans en flexibel och effektiv experimentell plattform som möjliggör studier av nya sjukdomsmekanismer, såsom RAN-peptidtoxicitet. Maskar erbjuder flera unika experimentella attribut som för närvarande inte finns i andra modeller av RAN peptid toxicitet. För det första är C. elegans optiskt transparent från födseln till döden. Detta möjliggör enkel visualisering av RAN peptid uttryck och lokalisering, samt in vivo analys av neurodegeneration hos levande djur. För det andra är transgena metoder för att generera RAN peptiduttrycksmodeller billiga och snabba. Med tanke på C. elegansskorta tredagars livscykel kan stabila transgena linjer som uttrycker en given RAN-peptid på ett specifikt celltypssätt produceras på mindre än en vecka. För det tredje kan enkla fenotypiska utgångar kombineras med genetiska screeningmetoder, såsom kemisk mutagenesis eller RNAi screening, för att snabbt identifiera gener som är väsentliga för RAN peptidtoxicitet. Slutligen, den korta livslängden på C. elegans (~ 20 dagar) tillåter utredare att avgöra hur åldrande, som är den största riskfaktorn för de flesta upprepade expansionssjukdomar, påverkar RAN peptid toxicitet. Tillsammans är denna kombination av experimentella attribut oöverträffad i alla andra modellsystem och erbjuder en kraftfull plattform för studier av RAN peptidtoxicitet.
Här beskriver vi flera analyser som utnyttjar de experimentella fördelarna med C. elegans för att mäta toxiciteten hos RAN-peptider och för att identifiera genetiska modifierare av denna toxicitet. Den kodon-varierade ATG-initierade RAN peptider är märkta med GFP och uttryckt individuellt i antingen muskelceller under myo-3 promotorn eller i GABAergic motor nervceller under unc-47 promotorn. För uttryck i muskelceller är det viktigt att giftiga RAN-peptider är märkta med grönt fluorescerande protein (GFP), eller andra fluorescerande protein (FP) tagg som kan riktas med en RNAi utfodring vektor. Detta beror på att giftiga RAN peptid uttryck blockerar vanligtvis tillväxt, vilket gör sådana stammar nonviable. Användningen av gfp (RNAi) inaktiverar villkorligt RAN peptid uttryck och tillåter stam underhåll, genetiska kors, etc. För analyser avlägsnas dessa djur från gfp(RNAi),vilket möjliggör uttryck av RAN-peptiden och de resulterande fenotyperna. Förutom den molekylära strategin för att utforma codon-varierade RAN peptid uttryck konstruktioner, beskriver vi analyser för att mäta utvecklingsmässiga toxicitet (larvmotilitet och tillväxt analys), post-developmental åldersassocierade toxicitet (förlamning analys), och neuron morfologiska defekter (commissure analys).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>35mm x 10mm Petri Dish, Sterile</td>
			<td>CELLTREAT Scientific Products</td>
			<td>50-202-036</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AGAR GRANULATED 2KILOGRAM</td>
			<td>BD DIAGNOSTIC SYSTEMS</td>
			<td>DF0145070</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AGAROSE ULTRAPURE</td>
			<td>LIFE TECHNOLOGIES</td>
			<td>16500500</td>
			<td>Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CARBENICILLIN 5G</td>
			<td>THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS</td>
			<td>BP26485</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COVER GLASSES NO 1 22MM 1OZ/PK</td>
			<td>THERMO SCI ERIE</td>
			<td>12542B</td>
			<td>Imaging for commissure assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FEMOTIPS DISPSBL MICROINJ 20CS</td>
			<td>EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS</td>
			<td>E5242952008</td>
			<td>Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FF COV GLASS NO1 40X22MM 1OZPK</td>
			<td>THERMO SCI ERIE</td>
			<td>125485C</td>
			<td>Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>THERMO SCI ERIE</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td>Imaging for commissure assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;Bacto Peptone&#160;</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>DF0118-17-0</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HALOCARBON OIL 700</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH INC</td>
			<td>H8898-50ML</td>
			<td>Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG BIOTECH 10G</td>
			<td>THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS</td>
			<td>BP162010</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Advanced Fluorescence imaging software</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>LAS-AF</td>
			<td>Image acquisition software for video speed analysis and commissure assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Immersion type N (Oil)</td>
			<td>W NUHSBAUM INC</td>
			<td>NC9547002</td>
			<td>Imaging for commissure assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEVAMISOLE HYDROCHLORIDE 10GR</td>
			<td>THERMO SCI ACROS ORGANICS</td>
			<td>AC187870100</td>
			<td>Imaging for commissure assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROLOADER TIPS 2 X 96 PCS</td>
			<td>EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS</td>
			<td>E5242956003</td>
			<td>Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			PETRI DISH, 60X15MM,500/CS</td>
			<td>CORNING LIFE SCIENCES PLASTIC</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TISSUE CULT PLATE 24WEL 50/CS</td>
			<td>CORNING LIFE SCIENCES DL</td>
			<td>87721</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring ran peptide toxicity in c. elegans

C. elegans används ofta för att modellera åldersrelaterade neurodegenerativa sjukdomar som orsakas av upprepade expansionsmutationer, såsom amyotrofisk lateral skleros (ALS) och Huntingtons sjukdom. Nyligen upprepade expansion-innehållande RNA visade sig vara substratet för en ny typ av protein översättning kallas upprepa-associerade icke-AUG-beroende (RAN) översättning. Till skillnad från kanonisk översättning kräver RAN-översättning inte en startkodon och inträffar endast när repetitionerna överskrider en tröskellängd. Eftersom det inte finns någon startkodon för att bestämma läsramen sker RAN-översättning i alla läsramar från både sense- och antisense RNA-mallar som innehåller en upprepningsexpansionssekvens. Därför utökar RAN översättning antalet möjliga sjukdomsrelaterade toxiska peptider från en till sex. Hittills har RAN översättning dokumenterats i åtta olika upprepa expansion-baserade neurodegenerativa och neuromuskulära sjukdomar. I varje enskilt fall är dechiffrera vilka RAN-produkter som är giftiga, liksom deras mekanismer för toxicitet, ett kritiskt steg mot att förstå hur dessa peptider bidrar till sjukdomens patofysiologi. I detta dokument presenterar vi strategier för att mäta toxiciteten hos RAN-peptider i modellsystemet C. elegans. Först beskriver vi förfaranden för att mäta RAN peptid toxicitet på tillväxt och motilitet att utveckla C. elegans. För det andra beskriver vi en analys för att mäta postdevelopmental, åldersberoende effekter av RAN peptider på motilitet. Slutligen beskriver vi en neurotoxicitet analys för att utvärdera effekterna av RAN peptider på neuron morfologi. Dessa analyser ger en bred bedömning av RAN peptid toxicitet och kan vara användbara för att utföra storskaliga genetiska eller små molekyler skärmar för att identifiera sjukdomsmekanismer eller terapier.

Vi använde de analyser som beskrivs här för att utvärdera effekten av olika genhämningar på toxiciteten av RAN dipeptider som finns i ALS patienter med en G4C2 upprepa expansion. Med hjälp av tillväxtanalys för att mäta utvecklingsmässiga toxicitet, analyserade vi effekterna av flera genetiska knockout mutanter identifieras i ett genom-hela RNAi skärm suppressors av muskel-uttryckt PR50-GFP toxicitet. Även uttryck för PR50-GFP ensam resulterade i en helt penetrerande tillväxt gripande...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans at JoVE.com

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Upprepade-associerade icke-ATG-beroende translationella produkter är nya patogena funktioner i flera upprepa expansion-baserade sjukdomar. Målet med det protokoll som beskrivs är att utvärdera toxicitet orsakad av dessa peptider med hjälp av beteendemässiga och cellulära analyser i modellsystemet C. elegans.

Mätning ran peptid toxicitet i C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis ...

RAN peptider är ett inslag i upprepa expansion neurodegenerativa sjukdomar såsom Huntingtons sjukdom, amyotrofisk lateral skleros, och frontotemporal demens. Dessa protokoll ger ett viktigt standardiserat tillvägagångssätt för kvantifiering av RAN-peptidtoxicitet i C.eleganss modellsystem. De tekniker som beskrivs är enkla att lära sig och billiga, kan utföras snabbt, och utnyttja reproducerbara funktioner i C.elegans systemet såsom rörelse och reproduktion.När du försöker detta protokoll, den stora utmaningen är att få konsekvent RAN peptid toxicitet och uttryck. De viktigaste faktorerna för att kontrollera inkluderar läkemedelstemperatur, tidpunkten för temperaturförändringar och beredning av analysplattor. Det är viktigt för försöksmän att konsekvent klassificera fenotyperna av djuren i denna åldersberoende process assay.Visuell demonstration av denna teknik visar deras klassificeringskriterier. Börja med att hälla standard nematod tillväxtmedium med en millimolar IPTG och 25 mikrogram per milliliter carbenicillin i 24-brunns plattor. Strimmig ut RNAi utfodring kloner i HT115 bakterier på LB carbenicillin agar och odla dem på 37 grader Celsius i 24 timmar.På nästa dag, plocka en enda koloni i en milliliter av LB carbenicillin flytande media och odla bakterierna i 18 timmar vid 37 grader Celsius medan skakar på 250 rpm. Spot fyra enskilda brunnar av NGM RNAi 24-brunnsplatta med 20 mikroliter av över natten bakteriekulturer som beskrivs i texten manuskriptet och låta RNAi bakterier att inducera dubbelsträngad RNA produktion över natten. Använd standardhypokloritmetoden för att isolera ägg från dag ett vuxen C.elegans som uttrycker den integrerade RAN-peptidtransgenen.Sedan utsäde cirka 30 ägg i varje brunn av 24-brunnsplattan och ruvar plattan vid 20 grader Celsius i sju dagar. För att utföra videohastighetsanalys, förvärva två videor från två separata brunnar för varje RNAi-tillstånd med hjälp av ett stereo dissekering mikroskop utrustat med en monokrom kamera. Se till att använda konsekventa förvärvsinställningar mellan brunnar.För varje video ställer du in varaktigheten för 10 sekunder och tidsintervallet till 76 millisekunder. Ställ in bildexponeringstiden på fyra millisekunder och använd zoominställningen 1,49. Välj sedan två av två binning.Kontrollera att upplösningen är 800 med 600 pixlar och börja spela in. Efter förvärvet, etikett varje video omedelbart med stammen, RNAi skick och väl nummer. Mät sedan den tillryggamen för sträckan och längden på varje djur för 20 olika djur per video, och undersöker totalt ca 40 maskar för varje RNAi-tillstånd.Välj knappen anteckningsverktyg i programvaran. Sedan verktyget rita text. Klicka på en punkt i mitten av masken mäts i den första bildrutan i videon och markera den med ett nummer.För videon till slutet medan du visuellt spårar masken. Klicka sedan på den och markera den med nästa motsvarande nummer. Använd verktyget rita skala bar för att dra en linje från det första numret till det andra numret och spela in den sträcka som reste i ett kalkylblad.Upprepa denna mätning för 19 andra maskar i videon samtidigt som varje enskild mätning bevaras i analysfönstret. När mätningarna är klara, ta en ögonblicksbild av den slutliga videoramen som illustrerar alla mätlinjer så att data kan spåras tillbaka till det djur som de härstammar från. Därefter analysera data med hjälp av en fyra-kolumn kalkylblad där kolumn ett är masken identifierare och kolumn två är hastigheten.Tiden för varje video kan hittas genom att högerklicka på videon under experimentet och gå till egenskaperna. För att normalisera hastighetsmätningen, hitta längden på varje djur. Använd dragpolylineverktyget för att fritt spåra C.elegansen från spetsen till svansspetsen.Ta sedan en ögonblicksbild av den slutliga videobildrutan som illustrerar alla polylinjer. Längden på linjerna kommer att registreras under statistik. Lägg till två kolumner i kalkylbladet, en för djurens längd och en för normaliserad hastighet.Slutligen analysera den normaliserade hastighetsdata med hjälp av en enkelriktad ANOVA med post-hoc-testning kontra tom vektor RNAi. Placera fyra till sex transgena L4 C.elegans som uttrycker RAN peptid GFP på en sex centimeters GFP RNAi-platta och odla dem i 20 grader Celsius. Om experimentet utnyttjar RNAi för att testa för genetiska effekter på RAN peptid toxicitet, flytta 10 transgena gravid vuxna till var och en av två tomma vektor RNAi GFP RNAi eller genspecifika RNAi plattor.Om mutanter används för att analysera genetiska effekter på RAN peptid toxicitet, placera 10 gravid vild typ eller muterade djur som uttrycker samma RAN transgen på var och en av två tomma vektor RNAi eller GFP RNAi plattor. Odla dem i 20 grader Celsius i 48 timmar. Plocka 10 uppsättningar av 10 transgena L4s från RNAi plattorna och placera varje uppsättning på en tre centimeter RNAi platta.Se till att maskarna som valts ut för analysen alla har ytligt normal motilitet. Placera plattorna i en plastpåse för att behålla fukt och inkubera dem i 25 grader Celsius. Efter 24 timmar, analysera djuren för rörlighet genom att knacka plattorna på dissekera mikroskop och kontrollera för rörelse.Om en mask rör sig mer än en kroppslängd, räkna den som mobil och överför den till en ny tre centimeter RNAi-platta. Använd en platinaplockning för att knacka på de återstående maskarna på huvud och svans. Om djuret rör sig mer än en kroppslängd, räkna djuret som mobilt och överför det till en ny tre centimeters RNAi-platta.Om betydande förlamning inte observeras i den tomma vektorn kontroll av dag två, avsluta analysen och börja om. Gruppera alla icke-uppdykande maskar tillsammans så att rörelsen av mer än en kroppslängd lätt kan upptäckas. Räkna alla förlamade, säckar, eller döda maskar och kasta plattan.Fortsätt att göra poäng för förlamning varje dag i fem till sju dagar. Tillväxtanalysen användes för att mäta effekten av genhämningar på toxiciteten hos RAN-dipeptider som finns hos ALS-patienter med en G4C2-upprepningsexpansion. Uttryck för PR50 GFP ensam resulterade i en fullständig tillväxt gripande, men knockdown av flera gener undertryckt utvecklingstoxicitet.Effekten av specifika gen knockdowns på utvecklingsmässiga motility av PR50 uttrycka djur mättes med hjälp av video hastighet analysmetod. Som väntat, hämning av PR50 GFP uttryck resulterade i en stor ökning av motility jämfört med tomma vektor RNAi. Vidare resulterade RNAi mot proteasom subunit RPN7 i den betydande ökningen av PR50 motility.När vuxna fenotyper analyserades med åldersberoende förlamning analysen uppvisade PR50 GFP upp till 80%förlamning av fem dagars ålder. RNAi riktade dock mot genen cul-6 betydligt fördröjd förlamning tyder på att cul-6 krävs för PR50 GFP toxicitet. För att avgöra om RAN-proteiner orsakar neuropatologi när de uttrycks i C.elegans nervceller, undersöktes neuron-specifik toxicitet med hjälp av commissure assay.I dag två vuxna, PR50 GFP uttryck i motor nervceller ledde till en betydande ökning av motor neuron blebbing. Denna neuropatologi var betydligt undertryckt av en mutation i insulin IGF receptorn genen homolog DAF-2 som försenar de toxiska egenskaperna hos flera neurodegenerativa proteiner. För beteendeanalysen är det viktigt att RAN-peptiderna producerar en mycket penetrerande fenotyp.Sådana gener eller läkemedel kan ge nya biomarkörer eller terapeutiska alternativ för RAN peptidsjukdomar. Med hjälp av dessa analyser har vi utfört en genom-bred RNAi skärm för suppressors av C9ORF72 associerade RAN peptid proline-arginin. Gener som identifierats i denna skärm inkluderar många nya och bevarade gener som kommer att bli föremål för framtida mekanistiska studier.

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Generering av Stabil Transgena C. elegans Använda mikroinjektion

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generering av Transgena C. elegans Genom Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Mätning Caenorhabditis elegans Livslängd på 96 Tja mikrotiterplattor

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi screening identifiera Postembryonic fenotyper i C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles

Mätning Peptide Translokation i stora Unilamellar Blåsor

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1.  Many of these are referred ...

C. elegans Chemotaxis Assay

C. elegans Chemotaxis Assay

C. elegans kemotaxianalys

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

Antikropp färgning i<em&gt; C. Elegans</em&gt; Använda &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

Mätning av effekterna av bakterier på<em&gt; C. Elegans</em&gt; Beteende användning av en analys Egg Retention

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

En Anoxia-svält modell för ischemi / reperfusion i<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Metoder för Skin såra och Analyser för Wound-svar i<em&gt; C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...