Name: measuring ran peptide toxicity in c. elegans
Uploaded: 2020-04-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans at JoVE.com

NIH R21NS107797

1. Kodon çeşitli RAN peptid ekspresyonu oluşturur oluşturma
<ol><li>Temel tekrarlayan DNA/RNA yapısını ortadan kaldırmak ancak üstteki amino asit dizisini korumak için eşanlamlı kodonları kullanan tek tek RAN peptid kodlama dizisi tasarla.</li>
	<li>Özel kodon dizilerini ticari olarak çalışmalar için gerekli tekrarlanan uzunluklarda sipariş edin (genellikle 5-100 tekrar). 5' sonunda bir HindIII kısıtlama sitesi ve pPD95.79 gibi C. elegans ifade vektörleri, klonlama kolaylaştırmak için ...

<ol>
	<li>Cleary, J. D., Ranum, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeat+associated+non-ATG+(RAN)+translation:+new+starts+in+microsatellite+expansion+disorders.">Repeat associated non-ATG (RAN) translation: new starts in microsatellite expansion disorders.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 26, 6-15 (2014).</li><li>The Huntington's Disease Collaborative Research Group. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+gene+containing+a+trinucleotide+repeat+that+is+expanded+and+unstable+on+Huntington's+disease+chromosomes.">A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes.</a> Cell. 72 (6), 971-983 (1993).</li><li>Scherzinger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntingtin-encoded+polyglutamine+expansions+form+amyloid-like+protein+aggregates+in+vitro+and+in+vivo.">Huntingtin-encoded polyglutamine expansions form amyloid-like protein aggregates in vitro and in vivo.</a> Cell. 90 (3), 549-558 (1997).</li><li>Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+threshold+for+polyglutamine-expansion+protein+aggregation+and+cellular+toxicity+is+dynamic+and+influenced+by+aging+in+Caenorhabditis+elegans.">The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99 (16), 10417-10422 (2002).</li><li>Genetic Modifiers of Huntington's Disease Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electronic+address,+g.+h.+m.+h.+e.,+Genetic+Modifiers+of+Huntington's+Disease,+C.+CAG+Repeat+Not+Polyglutamine+Length+Determines+Timing+of+Huntington's+Disease+Onset.">Electronic address, g. h. m. h. e., Genetic Modifiers of Huntington's Disease, C. CAG Repeat Not Polyglutamine Length Determines Timing of Huntington's Disease Onset.</a> Cell. 178 (4), 887-900 (2019).</li><li>Wright, G. E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Length+of+Uninterrupted+CAG,+Independent+of+Polyglutamine+Size,+Results+in+Increased+Somatic+Instability,+Hastening+Onset+of+Huntington+Disease.">Length of Uninterrupted CAG, Independent of Polyglutamine Size, Results in Increased Somatic Instability, Hastening Onset of Huntington Disease.</a> American Journal of Human Genetics. 104 (6), 1116-1126 (2019).</li><li>Cleary, J. D., Ranum, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeat-associated+non-ATG+(RAN)+translation+in+neurological+disease.">Repeat-associated non-ATG (RAN) translation in neurological disease.</a> Human Molecular Genetics. 22 (1), 45-51 (2013).</li><li>Banez-Coronel, M., Ranum, L. P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeat-associated+non-AUG+(RAN)+translation:+insights+from+pathology.">Repeat-associated non-AUG (RAN) translation: insights from pathology.</a> Laboratory Investigation. 99 (7), 929-942 (2019).</li><li>Banez-Coronel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAN+Translation+in+Huntington+Disease.">RAN Translation in Huntington Disease.</a> Neuron. 88 (4), 667-677 (2015).</li><li>Ash, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unconventional+translation+of+C9ORF72+GGGGCC+expansion+generates+insoluble+polypeptides+specific+to+c9FTD/ALS.">Unconventional translation of C9ORF72 GGGGCC expansion generates insoluble polypeptides specific to c9FTD/ALS.</a> Neuron. 77 (4), 639-646 (2013).</li><li>Kramer, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+screens+in+human+cells+and+primary+neurons+identify+modifiers+of+C9ORF72+dipeptide-repeat-protein+toxicity.">CRISPR-Cas9 screens in human cells and primary neurons identify modifiers of C9ORF72 dipeptide-repeat-protein toxicity.</a> Nature Genetics. 50 (4), 603-612 (2018).</li><li>Boeynaems, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+screen+connects+nuclear+transport+genes+to+DPR+pathology+in+c9ALS/FTD.">Drosophila screen connects nuclear transport genes to DPR pathology in c9ALS/FTD.</a> Scientific Reports. 6, 20877 (2016).</li><li>Jovicic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modifiers+of+C9orf72+dipeptide+repeat+toxicity+connect+nucleocytoplasmic+transport+defects+to+FTD/ALS.">Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS.</a> Nature Neuroscience. 18 (9), 1226-1229 (2015).</li><li>Boeynaems, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+Separation+of+C9orf72+Dipeptide+Repeats+Perturbs+Stress+Granule+Dynamics.">Phase Separation of C9orf72 Dipeptide Repeats Perturbs Stress Granule Dynamics.</a> Molecular Cell. 65 (6), 1044-1055 (2017).</li><li>Lee, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C9orf72+Dipeptide+Repeats+Impair+the+Assembly,+Dynamics,+and+Function+of+Membrane-Less+Organelles.">C9orf72 Dipeptide Repeats Impair the Assembly, Dynamics, and Function of Membrane-Less Organelles.</a> Cell. 167 (3), 717-788 (2016).</li><li>Hao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+dysfunction+and+neurodegeneration+in+a+C9orf72+mouse+line+expressing+poly-PR.">Motor dysfunction and neurodegeneration in a C9orf72 mouse line expressing poly-PR.</a> Nature Communications. 10 (1), 2906 (2019).</li><li>Scior, A., Preissler, S., Koch, M., Deuerling, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+PCR-free+engineering+of+highly+repetitive+DNA+sequences.">Directed PCR-free engineering of highly repetitive DNA sequences.</a> BMC Biotechnology. 11, 87 (2011).</li><li>Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+transformation.">DNA transformation.</a> Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).</li><li>Rudich, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+localized+C9orf72-associated+arginine-containing+dipeptides+exhibit+age-dependent+toxicity+in+C.+elegans.">Nuclear localized C9orf72-associated arginine-containing dipeptides exhibit age-dependent toxicity in C. elegans.</a> Human Molecular Genetics. 26 (24), 4916-4928 (2017).</li><li>Gidalevitz, T., Krupinski, T., Garcia, S., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Destabilizing+protein+polymorphisms+in+the+genetic+background+direct+phenotypic+expression+of+mutant+SOD1+toxicity.">Destabilizing protein polymorphisms in the genetic background direct phenotypic expression of mutant SOD1 toxicity.</a> PLoS Genetics. 5 (3), 1000399 (2009).</li><li>Nollen, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNA+interference+screen+identifies+previously+undescribed+regulators+of+polyglutamine+aggregation.">Genome-wide RNA interference screen identifies previously undescribed regulators of polyglutamine aggregation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 101 (17), 6403-6408 (2004).</li><li>Satyal, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyglutamine+aggregates+alter+protein+folding+homeostasis+in+Caenorhabditis+elegans.">Polyglutamine aggregates alter protein folding homeostasis in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (11), 5750-5755 (2000).</li><li>Boccitto, M., Lamitina, T., Kalb, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Daf-2+signaling+modifies+mutant+SOD1+toxicity+in+C.+elegans.">Daf-2 signaling modifies mutant SOD1 toxicity in C. elegans.</a> PLoS One. 7 (3), 33494 (2012).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C9orf72+BAC+Mouse+Model+with+Motor+Deficits+and+Neurodegenerative+Features+of+ALS/FTD.">C9orf72 BAC Mouse Model with Motor Deficits and Neurodegenerative Features of ALS/FTD.</a> Neuron. 90 (3), 521-534 (2016).</li><li>Peters, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+C9ORF72+Hexanucleotide+Expansion+Reproduces+RNA+Foci+and+Dipeptide+Repeat+Proteins+but+Not+Neurodegeneration+in+BAC+Transgenic+Mice.">Human C9ORF72 Hexanucleotide Expansion Reproduces RNA Foci and Dipeptide Repeat Proteins but Not Neurodegeneration in BAC Transgenic Mice.</a> Neuron. 88 (5), 902-909 (2015).</li><li>O'Rourke, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C9orf72+BAC+Transgenic+Mice+Display+Typical+Pathologic+Features+of+ALS/FTD.">C9orf72 BAC Transgenic Mice Display Typical Pathologic Features of ALS/FTD.</a> Neuron. 88 (5), 892-901 (2015).</li><li>Mizielinska, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C9orf72+repeat+expansions+cause+neurodegeneration+in+Drosophila+through+arginine-rich+proteins.">C9orf72 repeat expansions cause neurodegeneration in Drosophila through arginine-rich proteins.</a> Science. 345 (6201), 1192-1194 (2014).</li><li>Krajacic, P., Shen, X., Purohit, P. K., Arratia, P., Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanical+profiling+of+Caenorhabditis+elegans+motility.">Biomechanical profiling of Caenorhabditis elegans motility.</a> Genetics. 191 (3), 1015-1021 (2012).</li><li>Zhang, L., Ward, J. D., Cheng, Z., Dernburg, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+auxin-inducible+degradation+(AID)+system+enables+versatile+conditional+protein+depletion+in+C.+elegans.">The auxin-inducible degradation (AID) system enables versatile conditional protein depletion in C. elegans.</a> Development. 142 (24), 4374-4384 (2015).</li></ol>

Burada kas veya C. elegansnöronlarda modellenmiş RAN peptid toksisitesi titretini saymak için kullanılabilecek yöntemleri rapor ediyoruz. Nörodejeneratif proteinler insan hastalarında bir yaş başlangıçlı fenotip olsa da, onlar da model sistemlerinde aşırı ifade zaman gelişimsel toksisite sergileyebilir. Aşırı ifadenin önemli yorumlayıcı sınırlamaları vardır, ancak aynı zamanda toksik fenotipleri tersine çevirebilen genleri veya ilaçları tanımlamayı amaçlayan genetik veya farmakol...

DNA tekrar dizilerinin uygunsuz genişlemesi amiyotrofik lateral skleroz (ALS), frontotemporal demans (FTD) ve Huntington hastalığı (HD)1gibi birçok nörodejeneratif hastalığın genetik temelini oluşturur. Bu hastalıklar için hücresel ve hayvansal modeller kurulmuş olmakla birlikte, bu koşulların altında yatan mekanizmalar iyi tanımlanmamıştır. Örneğin, HD Huntingtin protein Htt2için kodlama dizisinde bir CAG tekrar dizisinin genişlemeleri neden olur. CAG amino asit glutamin kodlar çünkü, CAG tekrar genişleme sonuçları bir polyGlutamin ekleme, veya polyQ, Htt içinde dizi genişletilmiş polyQ proteinleri form uzunluğu- ve toksisite ile ilişkili yaşa bağlı protein agregaları3,4. Şaşırtıcı bir şekilde, iki yeni çalışmalar poliQ dizisinin uzunluğu HD hastalığı başlangıçlı ana sürücü olmadığını düşündürmektedir, poliQ bağımsız faktörler de hastalığa katkıda bulunabilir düşündüren5,6.
Olası bir poliQ-bağımsız mekanizma protein çeviri repeat a Associated Non-AUG bağımlı (RAN) çeviri7olarak adlandırılan yeni keşfedilen türü içerir. Adından da anlaşılacağı gibi, RAN çevirisi yalnızca genişletilmiş bir yineleme sırası olduğunda oluşur ve kanonik bir başlangıç kodonu gerektirmez. Bu nedenle, RAN çevirisi üç farklı polipeptid üretmek için yinelemenin üç okuma karesinde de gerçekleşir. Buna ek olarak, birçok gen de genişletilmiş tekrar dizisinin ters tamamlayıcı içeren bir antisense transkript üretmek çünkü, RAN çeviri de antisense transkript her üç okuma kareoluşur. Birlikte, RAN çevirisi genişletilmiş tekrar içeren DNA dizisinden üretilen protein sayısını bir peptitten altı peptide genişletir. Bugüne kadar, RAN çeviri en az sekiz farklı tekrar genişleme bozukluklarıgözlenmiştir 8. RAN peptidler postmortem hasta örneklerinde gözlenir ve sadece hastanın genişletilmiş tekrar ı taşıdığı durumlarda9,10. Bu peptidler hasta hücrelerinde açıkça mevcut olmakla birlikte, hastalık patofizyolojisine katkıları belirsizdir.
Daha iyi RAN peptidler ile ilişkili potansiyel toksisite tanımlamak için, çeşitli gruplar maya, sinek, fare ve doku kültürü hücreleri11,12,,13,14,15,16gibi çeşitli model sistemlerinde her peptid ifade var. Bu modeller, ifade için yineleme dizisini kullanmak yerine, yineleme sırasının ortadan kaldırıldığı ancak amino asit dizisinin korunduğu bir kodon varyasyonu yaklaşımı kullanır. Çeviri başlatma bir kanonik ATG yoluyla oluşur ve peptit genellikle n floresan protein erimiş- veya C-terminus, her ikisi de RAN peptid toksisitesi ile müdahale gibi görünüyor. Bu nedenle, her yapı tek bir RAN peptid aşırı ifade eder. RAN peptid toksisitesini ölçmek için basit tahliller ile çok hücreli bir organizmada farklı RAN ürünleri modelleme her hastalık neden tekrar genişleme farklı RAN ürünleri hücresel disfonksiyon ve nörodejenerasyon katkıda nasıl anlamak için hayati önem taşımaktadır.
Diğer model sistemleri gibi, C. elegans ran peptid toksisitesi gibi yeni hastalık mekanizmaları, çalışmalar sağlayan esnek ve verimli bir deneysel platform sağlar. Solucanlar şu anda RAN peptid toksisitesi diğer modellerde mevcut olmayan birkaç benzersiz deneysel özellikleri sunuyoruz. Birincisi, C. elegans doğuştan ölüme optik saydamdır. Bu RAN peptid ekspresyonu ve lokalizasyonu basit görselleştirme sağlar, hem de canlı hayvanlarda nörodejenerasyon in vivo analizi. İkinci olarak, RAN peptit ekspresyonu modelleri oluşturmak için transgenik yöntemler ucuz ve hızlıdır. C. eleganskısa üç günlük yaşam döngüsü göz önüne alındığında, bir hücre tipi özel bir şekilde herhangi bir RAN peptid ifade kararlı transgenik çizgiler bir hafta altında üretilebilir. Üçüncü olarak, basit henotipik çıkışlar, RAN peptid toksisitesi için gerekli genleri hızla tanımlamak için kimyasal mutagenez veya RNAi taraması gibi genetik tarama yöntemleri ile kombine edilebilir. Son olarak, C. elegans kısa ömrü (~ 20 gün) araştırmacılar nasıl yaşlanma belirlemek için izin verir, en tekrar genişleme hastalıkları için en büyük risk faktörü olan, RAN peptid toksisitesi etkiler. Birlikte, deneysel özellikleri bu kombinasyonu başka bir model sisteminde eşsiz ve RAN peptid toksisitesi çalışması için güçlü bir platform sunuyor.
Burada, RAN peptidlerinin toksisitesini ölçmek ve bu toksisitenin genetik değiştiricilerini belirlemek için C. elegans'ın deneysel avantajlarından yararlanan birkaç tahlilleri tanımlıyoruz. Kodon çeşitli ATG-başlatılan RAN peptidler GFP ile etiketlenir ve unc-47 organizatörü altında myo-3 organizatörü altında kas hücrelerinde ya da GABAerjik motor nöronlarda bireysel olarak ifade edilir. Kas hücrelerinde ifade için, toksik RAN peptidler yeşil floresan protein ile etiketlenir önemlidir (GFP), veya diğer floresan protein (FP) etiketi bir RNAi besleme vektörü ile hedeflenebilir. Toksik RAN peptid ekspresyonu genellikle büyüme engeller, bu tür suşları cansız hale olmasıdır. Gfp(RNAi) kullanımı koşullu OLARAK RAN peptid ekspresyonunu inaktive eder ve gerinim bakımı, genetik haçlar, vb. sağlar. Tahliller için, bu hayvanlar gfp kaldırılır (RNAi), RAN peptid ve ortaya çıkan fenotiplerin ifade sağlar. Kodon çeşitli RAN peptid ekspresyonu yapıları tasarlamak için moleküler stratejiye ek olarak, gelişimsel toksisite (larva hareketliliği ve büyüme tahlilleri), gelişim sonrası yaşla ilişkili toksisite (paralizi tahlil) ve nöron morfolojik defektleri (komissitöz tahlil) ölçmek için tahliller tanımlarız.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>35mm x 10mm Petri Dish, Sterile</td>
			<td>CELLTREAT Scientific Products</td>
			<td>50-202-036</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AGAR GRANULATED 2KILOGRAM</td>
			<td>BD DIAGNOSTIC SYSTEMS</td>
			<td>DF0145070</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AGAROSE ULTRAPURE</td>
			<td>LIFE TECHNOLOGIES</td>
			<td>16500500</td>
			<td>Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CARBENICILLIN 5G</td>
			<td>THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS</td>
			<td>BP26485</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COVER GLASSES NO 1 22MM 1OZ/PK</td>
			<td>THERMO SCI ERIE</td>
			<td>12542B</td>
			<td>Imaging for commissure assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FEMOTIPS DISPSBL MICROINJ 20CS</td>
			<td>EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS</td>
			<td>E5242952008</td>
			<td>Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FF COV GLASS NO1 40X22MM 1OZPK</td>
			<td>THERMO SCI ERIE</td>
			<td>125485C</td>
			<td>Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>THERMO SCI ERIE</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td>Imaging for commissure assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;Bacto Peptone&#160;</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>DF0118-17-0</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HALOCARBON OIL 700</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH INC</td>
			<td>H8898-50ML</td>
			<td>Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG BIOTECH 10G</td>
			<td>THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS</td>
			<td>BP162010</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Advanced Fluorescence imaging software</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>LAS-AF</td>
			<td>Image acquisition software for video speed analysis and commissure assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Immersion type N (Oil)</td>
			<td>W NUHSBAUM INC</td>
			<td>NC9547002</td>
			<td>Imaging for commissure assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEVAMISOLE HYDROCHLORIDE 10GR</td>
			<td>THERMO SCI ACROS ORGANICS</td>
			<td>AC187870100</td>
			<td>Imaging for commissure assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROLOADER TIPS 2 X 96 PCS</td>
			<td>EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS</td>
			<td>E5242956003</td>
			<td>Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			PETRI DISH, 60X15MM,500/CS</td>
			<td>CORNING LIFE SCIENCES PLASTIC</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TISSUE CULT PLATE 24WEL 50/CS</td>
			<td>CORNING LIFE SCIENCES DL</td>
			<td>87721</td>
			<td>Nematode growth plates and RNAi</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring ran peptide toxicity in c. elegans

C. elegans yaygın olarak amiyotrofik Lateral Skleroz (ALS) ve Huntington hastalığı gibi tekrarlayan genişleme mutasyonlarının neden olduğu yaşa bağlı nörodejeneratif hastalıkların modelini yapmak için kullanılır. Son zamanlarda, tekrar genleşme içeren RNA'nın, tekrarla ilişkili olmayan AUG bağımlı (RAN) çevirisi olarak adlandırılan yeni bir protein çevirisi nin substratı olduğu gösterilmiştir. Kanonik çevirinin aksine, RAN çevirisi başlangıç kodonu gerektirmez ve yalnızca yinelemeler bir eşik uzunluğunu aştığında oluşur. Okuma çerçevesini belirlemek için başlangıç kodonu olmadığından, RAN çevirisi hem duyu hem de antisense RNA şablonlarından yineleme genişletme dizisi içeren tüm okuma karelerinde oluşur. Bu nedenle, RAN çeviri bir den altı olası hastalık ile ilişkili toksik peptidlerin sayısını genişletir. Şimdiye kadar, RAN çeviri sekiz farklı tekrar genişleme tabanlı nörodejeneratif ve nöromüsküler hastalıklarda belgelenmiştir. Her durumda, hangi RAN ürünlerinin toksik olduğu ve toksisite mekanizmalarının deşifre edilmesi, bu peptidlerin hastalık patofizyolojisine nasıl katkıda bulunduğukonusunda kritik bir adımdır. Bu yazıda, model sistemi C. elegansRAN peptidlerin toksisitesini ölçmek için stratejiler sayılmiyoruz. İlk olarak, gelişmekte olan C. elegansbüyüme ve hareketlilik RAN peptid toksisitesi ölçmek için prosedürleri açıklar. İkinci olarak, RAN peptidlerinin hareketlilik üzerindeki postgelişimsel, yaşa bağlı etkilerini ölçmek için bir tetkik ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Son olarak, ran peptidlerin nöron morfolojisi üzerindeki etkilerini değerlendirmek için bir nörotoksisite tetkiktarif. Bu tahliller RAN peptid toksisitesi geniş bir değerlendirme sağlamak ve hastalık mekanizmaları veya tedavileri tanımlamak için büyük ölçekli genetik veya küçük molekül ekranları gerçekleştirmek için yararlı olabilir.

Burada açıklanan tahlilleri, G4C2 tekrar genleşmesi olan ALS hastalarında bulunan RAN dipeptidlerinin toksisitesi üzerindeki farklı gen inhibisyonunun etkisini değerlendirmek için kullandık. Gelişimsel toksisiteyi ölçmek için büyüme testini kullanarak, kas ifade li PR50-GFP toksisitesinin genom genişliğindeki RNAi ekran bastırıcılarında tanımlanan birkaç genetik nakavt mutantının etkilerini analiz ettik. Tek başına PR50-GFP ifadesi tamamen penetrant büyüme durmasıile so...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans at JoVE.com

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Tekrarla ilişkili olmayan ATG bağımlı çeviri ürünleri, tekrarlayan genişleme tabanlı hastalıkların patojenik özellikleridir. Açıklanan protokolün amacı, c. elegansmodel sisteminde davranışsal ve hücresel tahliller kullanarak bu peptidlerin neden olduğu toksisiteyi değerlendirmektir.

C. elegans RAN Peptid Toksisitesi Ölçme

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis ...

RAN peptidler Huntington hastalığı gibi tekrar genişleme nörodejeneratif bozuklukların bir özelliğidir, amiyotrofik lateral skleroz, ve frontotemporal demans. Bu protokoller, C.elegans model sistemindeRAN peptid toksisitesinin ölçülmesi için önemli bir standart yaklaşım sağlamaktadır. Açıklanan teknikleri öğrenmek için basit ve ucuz, hızlı bir şekilde yapılabilir ve hareket ve üreme gibi C.elegans sisteminin tekrarlanabilir özellikleri kaldıraç.Bu protokolü denerken, en büyük zorluk tutarlı RAN peptid toksisitesi ve ekspresyonu elde etmektir. Kontrol etmek için önemli faktörler ilaç sıcaklığı, sıcaklık kaymaları zamanlaması ve adeneyplakaları hazırlanması içerir. Deneycilerin bu yaşa bağlı süreçte hayvanların fenotiplerini sürekli olarak sınıflandırmaları önemlidir.Bu tekniğin görsel gösterimi sınıflandırma kriterlerini gösterir. 24-iyi plakalar içine bir milimoler IPTG ve mililitre carbenicillin başına 25 mikrogram ile standart nematod büyüme ortamı dökerek başlayın. LB carbenicillin agar üzerine HT115 bakteri conları besleme RNAi dışarı Çizgi ve 24 saat boyunca 37 santigrat derece onları büyümek.Ertesi gün, LB carbenicillin sıvı medya bir mililitre içine tek bir koloni almak ve 250 rpm sallayarak 37 santigrat derece 18 saat boyunca bakteri büyümek. Metin el yazmasında açıklandığı gibi 20 mikrolitre gecelik bakteri kültürüyle NGM RNAi 24 kuyunun dört ayrı kuyusu yerleştirin ve RNAi bakterilerinin bir gecede çift iplikçikli RNA üretimini teşvik etmesine izin verin. Entegre RAN peptid transgeni ifade eden yetişkin C.elegans'tan yumurtaları izole etmek için standart hipoklorit yöntemini kullanın.Daha sonra 24 kuyulu tabağın her kuyusuna yaklaşık 30 yumurta tohumlayın ve tabağı yedi gün boyunca 20 derecede kuluçkaya yatırın. Video hız analizi yapmak için, tek renkli kamera ile donatılmış stereo diseksiyon mikroskobu kullanarak her RNAi durumu için iki ayrı kuyudan iki video edinin. Kuyular arasında tutarlı edinme ayarlarını kullandığınızdan emin olun.Her video için süreyi 10 saniye ve zaman aralığını 76 milisaniye olarak ayarlayın. Görüntü pozlama süresini dört milisaniyeye ayarlayın ve 1,49 yakınlaştırma ayarını kullanın. Sonra ikiyi ikişer ikişer seçin.Çözünürlüğün 800'e 600 piksel olduğunu doğrulayın ve kaydetmeye başlayın. Satın alma sonra, zorlanma, RNAi durumu ve iyi numarası ile hemen her video etiket. Daha sonra her RNAi durumu için yaklaşık 40 solucan ın incelenmesiyle, video başına 20 farklı hayvan için kat edilen mesafeyi ve her hayvanın uzunluğunu ölçün.Yazılımda, ek açıklama araçları düğmesini seçin. Sonra metin aracı çizin. Videonun ilk karesinde ölçülen solucanın merkezindeki bir noktaya tıklayın ve bir sayıyla işaretleyin.Solucanı görsel olarak takip ederken videoyu sonuna kadar ilerletin. Sonra üzerine tıklayın ve bir sonraki karşılık gelen sayı ile işaretleyin. İlk sayıdan ikinci sayıya bir çizgi çizmek ve bir elektronik tabloda kat edilen mesafeyi kaydetmek için çizim ölçeği çubuğu aracını kullanın.Analiz penceresindeki her bir ölçümü korurken videodaki diğer 19 solucan için bu ölçümü tekrarlayın. Ölçümler tamamlandıktan sonra, verilerin kaynağı olan hayvana kadar izlenabilmesi için tüm ölçüm çizgilerini gösteren son video çerçevesinin anlık görüntüsünü alın. Ardından, birinci sütunun solucan tanımlayıcısı, ikinci sütunun ise hızın olduğu dört sütunlu bir elektronik tablo kullanarak verileri çözümle.Her videonun zamanı, denemenin altındaki videoya sağ tıklayarak ve özelliklerine giderek bulunabilir. Hız ölçümü normalleştirmek için, her hayvanın uzunluğunu bulmak. C.elegans'ı başın ucundan kuyruğun ucuna kadar serbestçe izlemek için çizim poliline aracını kullanın.Ardından, tüm poliçizgileri gösteren son video çerçevesinin anlık görüntüsünü alın. Satırların uzunluğu istatistiklere göre kaydedilir. Elektronik tabloya biri hayvan uzunluğu, diğeri normalleştirilmiş hız için olmak üzere iki sütun ekleyin.Son olarak, normalleştirilmiş hız verilerini, boş vektör RNAi'ye karşı post-hoc testi ile tek yönlü ANOVA kullanarak analiz edin. Ran peptid GFP'yi altı santimetrelik GFP RNAi plakasına ifade eden 4 ila 6 transgenik L4 C.elegan yerleştirin ve bunları 20 santigrat derecede büyütün. Deney RAN peptid toksisitesi üzerinde genetik etkileri test etmek için RNAi kullanıyorsa, iki boş vektör RNAi GFP RNAi veya gen-özel RNAi plakaları her 10 transgenik gravid yetişkin taşıyın.Mutantlar RAN peptid toksisitesi üzerindeki genetik etkileri analiz etmek için kullanılıyorsa, iki boş vektör RNAi veya GFP RNAi plakasının her birine aynı RAN transgeniifade eden 10 gravid yabani tip veya mutant hayvan yerleştirin. 48 saat boyunca 20 derecede yetiştirin. RNAi plakalarından 10 adet transgenik L4 seti seçin ve her seti üç santimetrelik Bir RNAi plakası üzerine yerleştirin.Test için seçilen solucanların yüzeysel olarak normal hareketliliğe sahip olduğundan emin olun. Nemi korumak ve 25 santigrat derecede kuluçkaya yatırmak için plakaları plastik bir torbaya yerleştirin. 24 saat sonra, diseksiyon mikroskobundaki plakaya dokunarak ve hareket olup olmadığını kontrol ederek hayvanları hareketlilik açısından analiz edin.Bir solucan bir vücut uzunluğundan daha fazla hareket ederse, onu mobil olarak sayın ve yeni bir üç santimetrelik RNAi plakasına aktarın. Kalan solucanların başını ve kuyruğunu kullanmak için platin bir kazma kullanın. Hayvan bir vücut uzunluğundan daha fazla hareket ederse, hayvanı hareketli olarak sayın ve yeni bir üç santimetrelik RNAi plakasına aktarın.İkinci güne kadar boş vektör kontrolünde önemli felç gözlenmezse, tetkiki sonlandırın ve baştan başlayın. Hareket etmeyen tüm solucanları bir araya getirin, böylece vücut uzunluğundan fazlasının hareketi kolayca tespit edilebilir. Tüm felçli, torbalı veya ölü solucanları sayın ve tabağı atın.Beş ila yedi gün boyunca her gün felç için hayvanlar puanlama devam edin. Büyüme testi, G4C2 tekrar genişlemesi olan ALS hastalarında bulunan RAN dipeptidlerinin toksisitesi üzerindeki gen inhibisyonunun etkisini ölçmek için kullanılmıştır. PR50 GFP'nin tek başına ifadesi tam bir büyüme tutuklaması ile sonuçlandı, ancak çeşitli genlerin yıkılması gelişimsel toksisiteyi bastırdı.Özel gen knockdowns pr50 ifade hayvanların gelişimsel hareketlilik üzerindeki etkisi video hız analizi yöntemi kullanılarak ölçüldü. Beklendiği gibi, PR50 GFP ekspresyonunun inhibisyonu boş vektör RNAi'ye göre hareketlilikte büyük bir artışa yol açtı. Ayrıca, proteozom alt birim RPN7 karşı RNAi PR50 hareketlilik önemli bir artış ile sonuçlandı.Erişkin fenotipler yaşa bağlı felç analizi ile analiz edildiğinde PR50 GFP beş günlük tefeksme yol açtı. Ancak, RNAi gene cul-6 önemli ölçüde gecikmiş felç bu cul-6 PR50 GFP toksisitesi için gerekli olduğunu düşündüren yönelik. RAN proteinlerinin C.elegans nöronlarında ifade edildiğinde nöropatolojiye neden olup olmadığını belirlemek için komissür talimi kullanılarak nöron spesifik toksisite incelendi.Gün iki yetişkin, motor nöronlarda PR50 GFP ekspresyonu motor nöron blebbing önemli bir artışa yol açtı. Bu nöropatoloji, insülin IGF reseptör geni homolog DAF-2'deki bir mutasyon la önemli ölçüde baskılandı ve bu mutasyon çeşitli nörodejeneratif proteinlerin toksik özelliklerini geciktirdi. Davranışsal teşbit için, RAN peptidler son derece penetratif fenotip üretmek önemlidir.Bu tür genler veya ilaçlar RAN peptid hastalıkları için yeni biyobelirteçler veya tedavi seçenekleri sağlayabilir. Bu tahlilleri kullanarak, C9ORF72 ilişkili RAN peptid proin-arginin bastırıcılar için genom çapında RNAi ekran gerçekleştirdik. Bu ekranda tanımlanan genler gelecekteki mekanistik çalışmalara konu olacak birçok yeni ve korunmuş genler içerir.

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Mikroenjeksiyon Kararlı Transgenik C. elegans Üretimi

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenik, Üretimi C. elegans Biyolistik Dönüşüm

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Ölçme Caenorhabditis elegans 96 Şey microtiter Tabaklar Ömrü

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

Içinde Postembryonic Fenotiplerin Belirleme RNAi Tarama C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles

Büyük Unilamellar Veziküller Ölçme Peptid Translokasyon

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1.  Many of these are referred ...

C. elegans Chemotaxis Assay

C. elegans Chemotaxis Assay

C. elegans Kemotaksis Deneyi

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

Antikor boyamasında<em&gt; C. Elegans</em&gt; &quot;Freeze-Cracking kullanma&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

Üzerinde Bakterilerin Etkilerinin Ölçme<em&gt; C. Elegans</emBir Yumurta Tutma Testi Kullanma&gt; Davranış

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Iskemi / reperfüzyon içinde bir anoksisi-açlık Modeli<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Içinde Yara Yanıtları Cilt yaralayarak Yöntemleri ve Testler<em&gt; ° C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...