Name: standardized methods for measuring induction of the heat shock response in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2020-07-03T14:00:00
Duration: 6 min 1 s
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这项工作得到了弗兰克·莱斯利的捐赠的支持。部分菌株由CGC提供，该委员会由NIH研究基础设施计划办公室（P40 OD010440）资助。

1. C. elegans 的维护和同步
<ol><li>保持蠕虫在20°C的线虫生长介质（NGM）板种子与OP50埃舍里切亚大肠杆菌通过转移几个成年人到新鲜板约每周2次10。应注意防止蠕虫耗尽食物，因为这会影响它们的生理。<ol>
<li>准备NGM板。<ol>
<li>混合 3 g NaCl， 2.5 g 的巴托 -佩酮， 20 g 的阿加， 和去电化 （DI） H2O 高达 1 L 在烧瓶中。</li>
			<li>将混合物灭菌。</li>
			<li>让混合物冷却至+50°C。</li>
			<li>加入 25 m L 1 M KH2PO4 （pH = 6），1 m CaCl2 的1 mL，1 m MgSO4的 1 mL，以及 1 mL 的胆固醇（100% 乙醇中的 5 mg/mL）。</li>
			<li>使用无菌技术，将混合物倒入 6 厘米板中，产生大约 100 个板。如果首先将混合物转移到 300 mL 无菌烧杯中，浇注板更容易。</li>
			<li>在用细菌播种或储存在4°C之前，在室温（RT）下留出1天凝固。</li>
		</ol>
</li>
		<li>将OP50细菌播种到NGM板上。<ol>
<li>在 30°C 或 37 °C 下在 LB 中生长饱和的隔夜 OP50 细菌培养。</li>
			<li>将大约 300 μL 的培养点放在 6 厘米 NGM 板的中心。</li>
			<li>让板在RT干燥1-3天，根据需要细菌草坪坚持在板。然后，板可以在4°C下使用或储存。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>通过分离新鲜产卵（此处描述），或者通过用漂白剂溶解蠕虫后收集卵子，同步生长蠕虫。<ol>
<li>使用铂线采摘将大约 10 只格拉维德成年蠕虫转移到新鲜盘子中。如果成年人在成年的第一天，产卵同步效果最好。</li>
		<li>大约 1 个月后，从板上取下蠕虫。这应该导致40-60鸡蛋每板，这取决于条件和应变。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. HSR记者的荧光成像
<ol><li>同步蠕虫（第 1.2 节），并保持在 20°C，直到所需的发育阶段。对于 AM446 （hsp-70p：：：gfp） 和 CL2070 （hsp-16.2p：：gfp） 荧光报告器菌株，尚未达到生殖成熟度的年轻成年蠕虫在产卵同步后 64 小时生成。 注：发育时间随各菌株和蠕虫的升高温度而变化。与 N2 相比，两个 HSR 报告器菌株都表现出轻微的发育延迟。重要的是，在生殖成熟期开始之后，HSR诱导的幅度大约下降2-4倍（见讨论）。</li>
	<li>热击蠕虫，用石蜡膜包裹板，在33°C的循环水浴中淹没1小时。薄条石蜡薄膜应包裹2倍围绕板密封的边缘。不要盖住板的底部，否则可能会干扰传热。使用试管机架和铅重倒置板。如有必要，请记住包括阴性控制样品（无热冲击）。 注：如果石蜡膜不安全，则水将进入板，不应用于数据收集。</li>
	<li>通过从水浴中取下盘子并用纸巾干燥来回收蠕虫。取出石蜡膜，在20°C下孵育蠕虫6-24小时。此恢复期允许有充足的时间进行 GFP 合成和折叠，然后再进行成像。</li>
	<li>准备用于成像的幻灯片。幻灯片应为每次使用准备新鲜。<ol>
<li>在水和热中用微波炉制作 3% 的气糖溶液，直到水加糖溶解。</li>
		<li>将显微镜幻灯片放在另外两张显微镜幻灯片之间进行成像，这些幻灯片上有一条实验室胶带，为 agarose 垫创建一个垫片。</li>
		<li>使用 1，000 μL 移液器，将加热的 3% 气糖滴到显微镜幻灯片的中心。</li>
		<li>
立即用垂直于第一张幻灯片的空白显微镜幻灯片覆盖显微镜幻灯片，使顶部幻灯片位于相邻幻灯片上的实验室胶带上。这会展开阿加罗斯的掉落，以创建一个均匀宽度的垫。</li>
		<li>小心地拆下顶部幻灯片。</li>
	</ol>
</li>
	<li>使用 200 μL 移液器将 M9 缓冲液中 1 mM levamisole 的小滴（±5 μL）添加到 agarose 垫的中心，使蠕虫固定。然后使用铂线挑将 10 个蠕虫转移到莱瓦米索滴中。盖上盖板。对于直立显微镜，不需要密封盖玻片。可选地，蠕虫在瘫痪时可以对齐，将利加米索摊开，传播到阿加罗斯垫的外端，并使蠕虫与铂丝挑对齐。或者，使用实验室湿巾可以浸泡利瓦米索。 注：尽快成像，因为长时间在利法米底孵育可能会改变荧光。</li>
	<li>使用荧光显微镜对蠕虫进行成像。图像捕获的细节因显微镜和软件而异。 注：要直接比较图像强度，请在一个成像会话中使用相同的显微镜设置。避免过度饱和图像。</li>
</ol>3. 使用RT-qPCR测量HSR基因表达
<ol><li>同步蠕虫（第 1.2 节），并保持在 20°C，直到所需的发育阶段。对于N2蠕虫，尚未达到生殖成熟度的年轻成年蠕虫在产卵同步后60小时生成。 注：发育时间随各菌株和蠕虫的升高温度而变化。重要的是，在生殖成熟期开始之后，HSR诱导的幅度大约下降2-4倍（见讨论）。</li>
	<li>如步骤 2.2 所述的热冲击蠕虫。</li>
	<li>将盘子从水浴中取出，取出石蜡膜，并立即收集蠕虫。通过用1 mL的M9轻轻清洗板，将液体收集在微离心管中，然后在400 x g的离心后去除M91分钟，可以收集蠕虫。</li>
	<li>使用有机萃取物对蠕虫进行精化和纯化RNA。<ol>
<li>加入250μL的RNA分离试剂（参见材料表）。</li>
		<li>旋涡管用手30 s。</li>
		<li>使用微离心管附件在 4 °C 下 20 分钟的涡流管（参见材料表）。</li>
		<li>加入50μL的氯仿。</li>
		<li>30 s 的漩涡。</li>
		<li>在RT中孵育样品3分钟。</li>
		<li>在 +14，000 x g 下离心15 分钟，在 4 °C 下。</li>
		<li>将水层（即顶层，±125 μL）转移到新的微离心管中。 注：避免在界面中的有机层和材料。</li>
		<li>加入50μL的氯仿。</li>
		<li>30 s 的漩涡。</li>
		<li>在RT中孵育样品3分钟。</li>
		<li>在 +14，000 x g 下离心5 分钟，在 4 °C 下。</li>
		<li>将水层（±100 μL）转移到新的微离心管中。 注：避免在界面中的有机层和材料。</li>
		<li>以等量（即100μL）的异丙醇沉淀RNA。</li>
		<li>在-20°C下孵育至少30分钟，但最好过夜。 注：实验可以在这里暂停，RNA可以储存在-20°C。</li>
		<li>在 +14，000 x g 下离心，在 4 °C下以 ±30 分钟将RNA切自。</li>
		<li>在不干扰颗粒的情况下，尽可能多地去除上一液。 注：颗粒很小，可能不可见。颗粒可能不会紧贴在管子的一侧，因此必须小心避免将颗粒开走。</li>
		<li>用 250 μL 的 70% 冰冷乙醇用无 RNase H 2 O 制备的颗粒进行清洗。</li>
		<li>在 +14，000 x g 下离心，在 4 °C 下为 ±5 分钟。</li>
		<li>在不干扰颗粒的情况下，尽可能多地去除上一除。</li>
		<li>在RT上快速旋转，去除剩余的70%乙醇。</li>
		<li>根据需要，让管子在RT处打开，使颗粒干燥;通常至少20分钟，管子可以覆盖一个无绒组织或铝箔，以防止污染。</li>
		<li>将颗粒在 20 μL 无 RNase H2O 中重新释放。</li>
		<li>使用小体积分光光度计（2 μL）确定RNA浓度。 注：实验可以在这里暂停，RNA可以暂时储存在-20°C或以下。</li>
	</ol></li>
	<li>使用DNase I孵育去除残留DNA。建议使用市售套件（参见材料表），并遵循制造商的说明。<ol>
<li>使用该试剂盒，在 37°C 水浴中，用 500 ng 的 RNA 和 1 μL 的 DNase I 制备 20 μL 反应，使用 30 分钟。</li>
		<li>将 2.5 μL 的 DNase 灭活试剂（包含在试剂盒中）添加到每个样品中，并在 RT 中孵育 5 分钟，偶尔进行轻拂/涡旋。</li>
		<li>以 14，000 x g 向下旋转 2 分钟。</li>
		<li>在不干扰白色颗粒的情况下，将15μL的上清液转移到用于cDNA合成的新鲜微管中。</li>
	</ol></li>
	<li>进行cDNA合成。建议使用市售套件（参见材料表），并遵循制造商的说明。<ol>
<li>使用该试剂盒，制备 20 μL 反应，使用上一步处理的 15 μL RNA 和 1 μL 的逆转录酶。</li>
		<li>使用以下程序进行cDNA合成：25°C 5分钟，46°C20分钟，95°C为1分钟，4°C保持。</li>
		<li>通过将 80 μL 无 RNase H2O 直接添加到样品中稀释 cDNA。</li>
		<li>短暂涡流，然后旋转并储存在-20°C，直到需要。</li>
	</ol></li>
	<li>执行 qPCR。建议使用市售套件（参见材料表），并遵循制造商的说明。<ol>
<li>使用该套件，在 96 井板的一个井中制备含有 2 μL cDNA 和 200 nM（每个）的前进和反向底转的 25 μL 反应。</li>
		<li>用于测量热冲击基因的底基因，hsp-70和hsp-16.2，以及18S rRNA（用于规范化控制）列在材料表中。可根据需要使用多个规范化控件。</li>
		<li>在测量 18S 之前稀释 cDNA 样品50 倍，以确保测定在线性范围内。适当的 qPCR 条件因使用的套件和底件而异（参见代表性结果）。</li>
		<li>对于 qPCR 使用实时 PCR 检测系统（参见材料表），qPCR 的周期为 40 个周期，5°C 为 5 s 变性，58 °C 为 30 s 退火，72 °C 用于 30 s 扩展。 注：最佳退火温度可能因底向和条件而异。</li>
		<li>使用 +Ct 或标准曲线方法12 进行量化。</li>
	</ol></li>
</ol>4. 在有机体一级测量HSR的特高覆盖测定
<ol><li>同步蠕虫（第 1.2 节），并保持在 20°C，直到所需的发育阶段。对于N2蠕虫，尚未达到生殖成熟度的年轻成年蠕虫在产卵同步后60小时生成。 注：发育时间随各菌株和蠕虫的升高温度而变化。重要的是，在生殖成熟期开始之后，HSR诱导的幅度大约下降2-4倍（见讨论）。</li>
	<li>热击蠕虫，如步骤2.2所述6小时。</li>
	<li>从水浴中取下盘子，取出石蜡膜，让蠕虫在20°C下孵育48小时。</li>
	<li>计算在机械刺激后可以立即爬走的蠕虫数量，而不会发生抖动或瘫痪。 注：6小时孵育是检查减少覆盖条件的最佳方法，但可能需要更长的暴露时间来寻找增强功能覆盖的条件。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Guisbert, E., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+and+function+of+the+heat+shock+response.">The regulation and function of the heat shock response.</a> Protein Quality Control in Neurodegenerative Diseases. , 1-18 (2013).</li><li>Li, J., Chauve, L., Phelps, G., Brielmann, R. M., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E2F+coregulates+an+essential+HSF+developmental+program+that+is+distinct+from+the+heat-shock+response.">E2F coregulates an essential HSF developmental program that is distinct from the heat-shock response.</a> Genes and Development. 30 (18), 2062-2075 (2016).</li><li>Hsu, A. L., Murphy, C. 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I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repression+of+the+Heat+Shock+Response+Is+a+Programmed+Event+at+the+Onset+of+Reproduction.">Repression of the Heat Shock Response Is a Programmed Event at the Onset of Reproduction.</a> Molecular Cell. 59 (4), 639-650 (2015).</li><li>Link, C. D., Cypser, J. R., Johnson, C. J., Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+stress+response+in+Caenorhabditis+elegans+using+a+reporter+transgene.">Direct observation of stress response in Caenorhabditis elegans using a reporter transgene.</a> Cell Stress &amp; Chaperones. 4 (4), 235 (1999).</li><li>Guisbert, E., Czyz, D. M., Richter, K., McMullen, P. D., Morimoto, R. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotypic+Signals+from+Neural+HSF-1+Separate+Thermotolerance+from+Longevity.">Heterotypic Signals from Neural HSF-1 Separate Thermotolerance from Longevity.</a> Cell Reports. 12 (7), 1196-1204 (2015).</li><li>Kourtis, N., Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+heat-shock+proteins+protect+from+heat-stroke-associated+neurodegeneration.">Small heat-shock proteins protect from heat-stroke-associated neurodegeneration.</a> Nature. 490 (7419), 213-218 (2012).</li></ol>

作者没有什么可透露的。

在文献中，各种温度、时间和设备都被用来测定HSR，这引入了不必要的警告，并导致实验室之间难以比较结果。例如，温度范围从32-37 °C和时间从15分钟到几个小时已被用来诱导HSR15。然而，据报道，致死性发生在3小时37°C的所有阶段和1.5小时第1天成人15。此外，我们表明，蠕虫暴露在 35°C 中会导致非 HSF-1 依赖的致命性，使这些条件不适合 HSR 分析。相比之下，33°C的热冲击为1小时，其强健性足以引起热休克基因的强烈诱导，但足够温和，不会影响蠕虫的生存能力。事实上，暴露在33°C中的时间只有6小时，只会导致20%的蠕虫表现出异常运动。因此，我们建议使用温度为33°C和1小时的时间作为RT-qPCR和荧光报告器测定的标准化条件。
最近的实验表明，HSR实验蠕虫的发育阶段尤为重要。最近发现，在C.elegans，当母体开始产卵5时，HSR的可采性下降（即坍塌）下降50%。正确分期蠕虫至关重要，因为携带突变的菌株的发育时间往往存在差异。如果使用温度敏感的突变体，这也会影响结果，如果他们不同步他们的生殖年龄。因此，建议仔细测量每个菌株的产卵开始，以确定何时发生崩溃。L4摩尔特之后和生殖成熟开始前的时间窗口很窄;因此，必须小心，使 HSR 崩溃不会无意中导致结果的变异。
除了发育时间，温度的异常小变化，只要1°C，可以对HSR产生实质性影响。例如，C. elegans 中的热传感器神经元对温度变化敏感，小至 ±0.05 °C16。因此，必须使用能够准确测量温度的温度计。因此，我们建议使用校准设备进行温度测量，这种测量精度足以测量 ±0.1 °C 内的温度。此外，应使用具有数据记录功能的温度计测量不同时间的温度变化。许多孵化器被指定在孵化器的不同部分和跨时间具有超过 1 °C 的热变化，这对 HSR 实验有显著的影响。作为最佳实践，我们建议使用具有足够绝缘和循环的培养箱，以尽量减少温度波动。对于进行热冲击实验，我们提出了循环水浴的最佳实践。在水浴中，阿加板达到所需温度大约需要6-7分钟，但在干式培养箱15，17中则要长得多。但是，如果没有循环水浴，我们已表明，使用我们的条件，在干式培养箱中也会出现坚固的 HSR 感应。如果使用干式孵化器，应在压力期间打开孵化器。
热冲击基因的诱导依赖于HSR，HSF-1的主调节器。在这里，我们提出证据表明，另外两个间接的测定，荧光记者和证据，也依赖于HSF-1。值得注意的是，我们发现，一种常用的替代有机体测定，热耐受性，不是使用hsf-1 RNAi的HSF-1依赖型（图4）。类似的结果以前也报告过使用hsf-1突变体或ttx-3突变体，它阻止HSR18，19，20。,19,20这些结果表明，热耐症测定不应用于HSR研究。此外，这表明最佳做法是测试用于测量 HSR 的任何检测的 HSF-1 依赖性。
总之，我们提出了一系列标准化协议和最佳实践，用于在C.elegans中对HSR感应进行可靠和可重复的测量。我们希望这些方法将减少HSR实验中的变异性，提高可重复性。促进实验室间HSR研究的直接比较将有助于加速HSR领域的研究。此外，标准化将有利于对与HSR密切相关的衰老和神经退行性疾病的研究。

热休克反应 （HSR） 是由温度升高和其他蛋白质毒性应力引起的细胞细胞因子错折叠引起的一种通用细胞应激反应。在卡诺哈布迪蒂斯埃利根斯启动HSR导致热休克基因的转录上调节，如hsp-70和hsp-16.2。许多热休克蛋白 （HSP） 充当分子伴管，通过与错误折叠或受损的蛋白质直接相互作用来恢复蛋白质折叠平衡或蛋白酶。HSR 的主稳压器是转录因子热冲击因子 1 （HSF-1），其激活通过多个机制1 优雅地控制。
HSF-1 的作用不限于压力。HSF-1是正常生长发育所需的，因为删除hsf-1会导致幼虫逮捕2。HSF-1在衰老和与年龄相关的神经退行性疾病中也很重要，其特征是蛋白质聚集和无法维持蛋白酶。hsf-1 的敲击会导致蛋白质聚合物的积累和寿命的缩短，而hsf-1 的过度表达会减少蛋白质聚合并延长寿命 3，,4。因此，在分子水平上调节HSF-1对机体生理和疾病有着广泛的影响。
C. elegans是 HSR 研究的强大模型生物体，因为 HSR 可以在分子、细胞和有机体级别4、5、6,5,进行测量。强调该模型的力量，在描述HSR路径的关键进展，如组织特定的差异，在HSR调控，已发现在C.elegans7，8,8。此外，C. elegans被广泛用于衰老研究，是一种新兴的系统，用于建模与蛋白细胞减少的疾病相关的疾病。
虽然使用C. elegans 的热休克实验可以快速且可重复，但在开始之前需要考虑几个问题。例如，应使用哪种温度来感应 HSR，以及蠕虫应暴露多长时间？用干培养箱还是水浴更好？应该使用哪个发展阶段？不幸的是，用于研究 HSR 的方法因实验室而异，在选择最佳方法时造成混乱，并难以在实地比较结果。
我们提出了使用RT-qPCR、荧光报告器和测量HSR的稳健和标准化协议。虽然这三种方法是相辅相成的，但它们各有优缺点。例如，RT-qPCR 是 HSR 最直接、最定量的测量方法，这种测定方法可以很容易地扩展，包括许多不同的热冲击基因。然而，RT-qPCR是最昂贵的，可能在技术上是困难的，并要求使用专门的设备。相比之下，荧光测量器具有测量HSR诱导中组织特异性差异的优点。然而，它们难以精确量化，只能测量感应超过一定阈值，并且需要使用荧光显微镜。此外，与标准N2菌株相比，此处描述的记者菌株在发育上延迟。虽然含有单拷贝转基因的较新的报告器菌株可用，但9日尚未在这里进行测试。第三种检测方法，即，具有在有机体水平上提供生理相关读出的优势。然而，这种分析可以说是最不敏感和最间接的。最后，我们讨论了这些分析中发现的一些常见变异，并提出了一套最佳做法，以促进该领域的研究。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>18S-forward primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TTGCGTCAACTGTGGTCGTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18S-reverse primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CCAACAAAAAGAACCGAAGT 
			CCTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AM446 rmIs223[phsp70::gfp; pRF4(rol-6(su1006))]</td>
			<td>Morimoto lab</td>
			<td><a href="http://groups.molbiosci.northwestern.edu/morimoto/" target="_blank">http://groups.molbiosci.northwestern.edu/morimoto/</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C12C8.1-forward primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GTACTACGTACTCATGTGTCG 
			GTATTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C12C8.1-reverse primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ACGGGCTTTCCTTGTTTTCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX Connect Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1855200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CL2070 dvIs70 [hsp-16.2p::GFP + rol-6(su1006)]</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td><a href="https://cgc.umn.edu/" target="_blank">https://cgc.umn.edu/</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyLog Thermistor Probe Data Logger with LCD</td>
			<td>Lascar</td>
			<td>EL-USB-TP-LCD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greenough Stereo Microscope S9i Series</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hard Shell 96 Well PCR Plates</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>HSS9601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hsp-16.2-forward primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ACTTTACCACTATTTCCGTCC 
			AGC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hsp-16.2-reverse primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CCTTGAACCGCTTCTTTCTTTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1708891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iTaq Universal Sybr Green Super Mix</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1725121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scanning Confocal Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse 90i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiGene OptiMax Thermo Cycler</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>TC9610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 (WT)</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td><a href="https://cgc.umn.edu/" target="_blank">https://cgc.umn.edu/</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop Lite Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-LITE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M Roll</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>5259-04LC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapidOut DNA Removal Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K2981</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recirculating Heated Water Bath</td>
			<td>Lauda Brinkmann</td>
			<td>RE-206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Traceable Platinum Ultra-Accurate Digital Thermometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-081-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td>RNA isolation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TurboMix Attachment</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

standardized methods for measuring induction of the heat shock response in caenorhabditis elegans

热休克反应 （HSR） 是由细胞细胞细胞蛋白错折叠引起的细胞应激反应，其功能可恢复蛋白质折叠平衡，或蛋白质。卡诺哈布迪蒂斯埃利根斯占据一个独特和强大的利基为HSR研究，因为HSR可以在分子，细胞和有机体水平评估。因此，分子水平的变化可以在细胞水平上可视化，它们对生理学的影响可以在有机体水平上量化。虽然测量 HSR 的检测非常简单，但文献中描述的时间、温度和方法的变化使得比较不同研究的结果变得具有挑战性。此外，这些问题对于任何寻求将HSR分析纳入其研究的人来说，都起到障碍的作用。在这里，通过RT-qPCR、荧光报告器和有机体测光检测，提出了一系列以稳健且可重复的方式测量HSR诱导的协议。此外，我们表明广泛使用的热耐受性测定不依赖于 HSR HSF-1 的成熟主稳压器，因此不应用于 HSR 研究。最后，讨论了文献中发现的这些分析方法的变异，并提出了最佳实践，以帮助标准化整个领域的结果，最终促进神经退行性疾病、衰老和HSR研究。

使用本手稿中描述的方案，使用荧光报告器、RT-qPCR 和封面检测测量 HSR 感应。在每种情况下，第1.2节中的程序都被用来生成尚未达到生殖成熟度的同步的年轻成年蠕虫。
为了在细胞水平上可视化HSR诱导，根据协议第2节分析了M446（hsp-70p：：：：：gfp）和CL2070（hsp-16.2p：：gfp）荧光报告器菌株。hsp-16.2p::gfp在没有热冲击的阴性对照样本中，hsp-16.2报告员只表现出正常的自动荧光，而hsp-70报告员在肛门减压肌中具有组成荧光，如先前报道的4（图1A）。在33°C下1小时热冲击后，在两名记者中观察到强荧光;但是，表达式模式因使用哪个报告器而与众不同（图 1B）。hsp-70记者在肠道和精子中最亮，而hsp-16.2记者在咽中最亮。此外，hsp-16.2记者的诱导量具有很高的蠕虫变异性，但hsp-70记者没有13。
第 2 节的常用变体是执行干式培养箱而不是循环水浴中的热冲击。因此，还测试了这两种方法的区别。结果发现，这两种协议都使用我们的条件对两个荧光报告器进行了强健的感应，尽管建议将循环水浴作为最佳做法（参见讨论）（图1B）。
为了测试记者对转录因子HSF-1的依赖性，在测量记者诱导之前，使用喂料RNAi来击倒hsf-1。研究发现，在HSF-1击倒时，两种菌株的荧光严重降低，表明这些记者是HSF-1依赖文献4（图2）所述。然而，也观察到，咽荧光在hsf-1击倒后，在两个记者中持续存在，这与先前的报道一致，即咽部肌肉通过喂养14对RNAi具有抗药性。
为了在分子水平上量化HSR的整个蠕虫诱导，使用协议第3节使用RT-qPCR测量了两个内源性HSP。以三钙为单位测量样品，为每个底向器生成标准曲线，并分析每个样品的熔体曲线进行质量控制。研究发现，33°C热冲击1小时导致两个热休克基因，hsp-70和hsp-16.2的相对表达增加2，000多倍（hsp-16.2图3）。这些结果表明，这两个内源基因都适合测量HSR诱导，33°C热冲击1小时足以产生实质性反应。但是，在解释热冲击诱导的绝对程度时应谨慎，因为没有热冲击的 mRNA 水平非常低。
为了分析对热冲击的生理反应，使用协议第4节对有机体性热吸收测定进行了测试。研究发现，蠕虫在33°C下暴露在6小时热冲击下，在48小时恢复后，蠕虫的正常运动减少了20%（图4A）。这种测定对HSF-1转录因子的依赖性测试使用喂养RNAi敲打hsf-1，然后再使蠕虫暴露在压力之下。研究发现，hsf-1的击倒导致正常运动急剧下降，>95% 的蠕虫在用铂金线挑后表现出抖动或瘫痪。
我们比较了这种替代性有机体测定法，通常称为热耐症。在热耐死度测定中，使用干培养箱将蠕虫暴露在连续 35°C 的温度下，并在不同时间点测量活虫的百分比。使用这种测定方法，发现连续暴露在35°C的蠕虫在大约8小时暴露后死亡（图4B）。然而，当使用RNAi击倒测试这种测定对HSF-1的依赖性时，发现对hsf-1的抑制不会导致热耐受性降低。以前使用 HSF-1 突变显示的类似结果（请参阅讨论）。因此，不建议使用热耐症测定来测量HSR，并且在有机体一级检查HSR是首选的方法。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61030/61030fig1.jpg"> 图1：用荧光测量器测量HSR感应。（A） hsp-70p的基底和（B）热致用表达：：gfp和hsp-16.2p：：gfp在水浴或孵化器中，在33°C下热冲击1小时后应变。蠕虫在OP50细菌上被提出64小时，热震惊，然后在20°C恢复8小时成像前。供参考，在 （A） 中无热震蠕虫在 （B） 中重新规范化，以匹配热冲击蠕虫的范围和饱和度。显示了两个实验复制的代表性图像。比例线 = 250 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61030/61030fig1large.jpg" target="_blank">μm. 请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61030/61030fig2.jpg"> 图2：用荧光测量器测量的HSR感应取决于HSF-1。含有hsp-70p 的应变：：gfp 和 hsp-16.2p：：gfp 记者在控制（L4440空矢量）或hsf-1 RNAi 板上提出 64 小时，在水浴中 33 °C 下暴露在 1 小时热冲击下，然后在 20 °C 下恢复 8 小时。显示了两个实验复制的代表性图像。比例线 = 250 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61030/61030fig2large.jpg" target="_blank">μm. 请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61030/61030fig3.jpg"> 图3：使用RT-qPCR测量的HSR感应。N2蠕虫在HT115细菌上繁殖60小时，然后在33°C水浴中加热1小时。hsp-70 （C12C8.1） 和 hsp-16.2的相对 mRNA 水平显示为无热冲击控制。绘制的值是四个生物复制的平均值，误差条表示 = SEM。 统计显著性是使用未配对的学生 t 检验计算的。**p < 0.01.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61030/61030fig3large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61030/61030fig4.jpg"> 图4：热覆盖，但不是热度，取决于HSF-1。N2 蠕虫在控制 （L4440） 或hsf-1 RNAi 板上提出 60 h，然后转移到：（A） A 33°C 水浴 6 小时，在 20°C 下恢复 48 小时，然后为正常运动（热覆盖）或（B） A 35 °C 干培养箱打分，每 2 小时取出一次，直到死亡（嗜热）。每次检测在2个独立日内与n= 30人一起完成。显示平均值。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61030/61030fig4large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>

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Standardized Methods for Measuring Induction of the Heat Shock Response in Caenorhabditis elegans

在这里，提出了标准化的协议，以评估在卡诺哈布迪蒂斯埃利根的热休克反应（HSR）的诱导使用RT-qPCR在分子水平，荧光报告器在细胞水平，并在有机体水平的光覆盖。

卡诺哈布迪蒂斯精英热休克反应的测量诱导标准化方法

The heat shock response (HSR) is a cellular stress response induced by cytosolic protein misfolding that functions to restore protein folding homeostasis, ...

热休克反应是维持细胞质蛋白酶的基本细胞应激反应途径，可表现为海藻的分子、细胞和有机体水平。我们提出了一系列标准化协议和最佳实践，可对海雷根的热冲击响应进行可靠的诱导，以帮助提高热冲击响应领域的可重复性。我们表明，热耐受性，一种常用的有机体测定并不依赖于热冲击反应。相反，我们建议使用热回收，一种依赖热休克反应的有机体测定。热休克反应随着产卵的开始而减弱。因此，发育时间是热休克响应实验中必须考虑的一个关键变量。首先创建同步的蠕虫群体。使用铂丝采摘将大约 10 个格拉维德成年蠕虫转移到新鲜盘子中。确保取出任何可能与成人一起转移的鸡蛋或幼虫。让蠕虫产卵一小时，然后将成人从盘子里取出。将同步蠕虫保持在 20 摄氏度，直到所需的发育阶段，同时考虑发育时间随每种菌株和蠕虫升高的温度而变化。当蠕虫准备好热冲击时，用石蜡膜包裹板，并使用带铅重量的试管架将其淹没在33摄氏度的循环水浴中一小时。从水浴中回收盘子，用纸巾擦干。去除石蜡膜，让蠕虫在20摄氏度下恢复6至24小时，这将是GP合成的足够时间。要准备用于成像的幻灯片，请将显微镜幻灯片放在其他两张幻灯片之间，这些幻灯片上有一条实验室胶带。在水中制作3%的加糖溶液，在微波炉中加热，直到加糖溶解。然后使用一毫升移液器将大约 150 微升的气糖放在幻灯片的中心。立即用空白幻灯片盖住幻灯片，将其垂直放置，以便将其放在实验室胶带上，然后小心地将其卸下。要固定蠕虫，请将一小滴毫摩尔 levamisole（M9 缓冲液）添加到 agarose 垫的中心，并使用铂线挑将 10 个蠕虫转移到落液中。可选地，将利加米索传播到阿加罗斯垫的外，并在蠕虫瘫痪时将蠕虫与选择对齐。用盖滑盖住蠕虫，并尽快使用荧光显微镜对蠕虫进行成像。要进行热覆盖测定，请同步蠕虫，并在20摄氏度时保持蠕虫，直到达到所需的发育阶段。然后热冲击他们六个小时。从水浴中取下盘子，让它们在 20 摄氏度下恢复 48 小时。恢复后，计算在机械刺激后可以立即抓走的蠕虫数量，而不会产生抽搐运动或瘫痪。为了在细胞水平上可视化热休克反应诱导，分析了两种荧光报告器海精灵菌株。在没有热冲击的阴性对照样本中，hsp-16.2记者表现出正常的自动荧光，但hsp-70记者在肛门压照肌中具有组成荧光。经过一个小时的热冲击后，当RNAi用于在测量记者感应之前击倒hsf-1时，两名记者都观察到了强的荧光。两种菌株的荧光严重减少，表明这些记者是hsf-1依赖型的。为了在分子水平上量化热休克反应的诱导，用rt键PCR测量了两种本地热冲击蛋白。结果发现，一小时33摄氏度的热冲击导致两个热休克基因的相对表达增加2000倍以上。一项研究结果表明，在6小时热冲击下，在48小时恢复后，蠕虫的正常运动减少了20%。hsf-1 的敲击导致正常运动急剧下降，超过 95% 的蠕虫在被催促后表现出抽搐运动或瘫痪。相比之下，hsf-1的敲击对热耐受性测定的结果没有显著影响，在热耐受性测定中，蠕虫暴露在连续35摄氏度的温度下，并在不同时间点测量蠕虫的活虫百分比。首次执行此技术时，请确保用石蜡膜包裹板两次，以防止水进入板并破坏实验。分子分析可以使用RNA-seq扩展到基因组分析中。其他受热休克反应影响的有机体测定可以包括在内，如寿命。在海精灵中将分子、细胞和有机体热休克反应分析关联的独特能力已证明对理解该途径在发育和疾病中的作用具有无价价值。

Research

JoVE Journal

Environment

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