Name: standardized methods for measuring induction of the heat shock response in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2020-07-03T14:00:00
Duration: 6 min 1 s
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इस काम को फ्रैंक लेस्ली के एक दान ने समर्थन दिया था। सीजीसी द्वारा कुछ उपभेद प्रदान किए गए थे, जिन्हें एनआईएच कार्यालय ऑफ रिसर्च इंफ्रास्ट्रक्चर प्रोग्राम्स (P40 OD010440) द्वारा वित्त पोषित किया जाता है।

<ol>
	<li>Guisbert, E., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+and+function+of+the+heat+shock+response.">The regulation and function of the heat shock response.</a> Protein Quality Control in Neurodegenerative Diseases. , 1-18 (2013).</li><li>Li, J., Chauve, L., Phelps, G., Brielmann, R. M., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E2F+coregulates+an+essential+HSF+developmental+program+that+is+distinct+from+the+heat-shock+response.">E2F coregulates an essential HSF developmental program that is distinct from the heat-shock response.</a> Genes and Development. 30 (18), 2062-2075 (2016).</li><li>Hsu, A. L., Murphy, C. T., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+aging+and+age-related+disease+by+DAF-16+and+heat-shock+factor.">Regulation of aging and age-related disease by DAF-16 and heat-shock factor.</a> Science. 300 (5622), 1142-1145 (2003).</li><li>Morley, J. F., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+longevity+in+Caenorhabditis+elegans+by+heat+shock+factor+and+molecular+chaperones.">Regulation of longevity in Caenorhabditis elegans by heat shock factor and molecular chaperones.</a> Molecular Biology of the Cell. 15 (2), 657-664 (2004).</li><li>Labbadia, J., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repression+of+the+Heat+Shock+Response+Is+a+Programmed+Event+at+the+Onset+of+Reproduction.">Repression of the Heat Shock Response Is a Programmed Event at the Onset of Reproduction.</a> Molecular Cell. 59 (4), 639-650 (2015).</li><li>Link, C. D., Cypser, J. R., Johnson, C. J., Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+stress+response+in+Caenorhabditis+elegans+using+a+reporter+transgene.">Direct observation of stress response in Caenorhabditis elegans using a reporter transgene.</a> Cell Stress &amp; Chaperones. 4 (4), 235 (1999).</li><li>Guisbert, E., Czyz, D. M., Richter, K., McMullen, P. D., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+Tissue-Selective+Heat+Shock+Response+Regulatory+Network.">Identification of a Tissue-Selective Heat Shock Response Regulatory Network.</a> PLoS Genetics. 9 (4), 1-12 (2013).</li><li>Ma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Proteomes+Drive+Tissue-Specific+Regulation+of+the+Heat+Shock+Response.">Cellular Proteomes Drive Tissue-Specific Regulation of the Heat Shock Response.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics. 7 (3), 1011-1018 (2017).</li><li>Mendenhall, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+single-copy+hsp-16.2+reporter+predicts+life+span.">Expression of a single-copy hsp-16.2 reporter predicts life span.</a> Journals of Gerontology - Series A Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (7), 726-733 (2012).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. (1999), 1-11 (2006).</li><li>Avery, L., You, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+feeding.">C. elegans feeding.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-23 (2012).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2-&#916;&#916;CT+method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-&#916;&#916;CT method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Rea, S. L., Wu, D., Cypser, J. R., Vaupel, J. W., Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stress-sensitive+reporter+predicts+longevity+in+isogenic+populations+of+Caenorhabditis+elegans.">A stress-sensitive reporter predicts longevity in isogenic populations of Caenorhabditis elegans.</a> Nature Genetics. 37 (8), 894-898 (2005).</li><li>Shiu, P. K., Hunter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Developmental+Exposure+to+dsRNA+Is+Critical+for+Initiating+Efficient+Nuclear+RNAi+in+C.+elegans.">Early Developmental Exposure to dsRNA Is Critical for Initiating Efficient Nuclear RNAi in C. elegans.</a> Cell Reports. 18 (12), 2969-2978 (2017).</li><li>Zevian, S. C., Yanowitz, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+considerations+for+heat+shock+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Methodological considerations for heat shock of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Methods. 68 (3), 450-457 (2014).</li><li>Clark, D. A., Biron, D., Sengupta, P., Samuel, A. D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AFD+sensory+neurons+encode+multiple+functions+underlying+thermotactic+behavior+in+Caenorhabditis+elegans.">The AFD sensory neurons encode multiple functions underlying thermotactic behavior in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Neuroscience. 26 (28), 7444-7451 (2006).</li><li>Prahlad, V., Cornelius, T., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+cellular+heat+shock+response+in+Caenorhabditis+elegans+by+thermosensory+neurons.">Regulation of the cellular heat shock response in Caenorhabditis elegans by thermosensory neurons.</a> Science. 320 (5877), 811-814 (2008).</li><li>McColl, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-like+signaling+determines+survival+during+stress+via+posttranscriptional+mechanisms+in+C.+elegans.">Insulin-like signaling determines survival during stress via posttranscriptional mechanisms in C. elegans.</a> Cell Metabolism. 12 (3), 260-272 (2010).</li><li>Douglas, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotypic+Signals+from+Neural+HSF-1+Separate+Thermotolerance+from+Longevity.">Heterotypic Signals from Neural HSF-1 Separate Thermotolerance from Longevity.</a> Cell Reports. 12 (7), 1196-1204 (2015).</li><li>Kourtis, N., Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+heat-shock+proteins+protect+from+heat-stroke-associated+neurodegeneration.">Small heat-shock proteins protect from heat-stroke-associated neurodegeneration.</a> Nature. 490 (7419), 213-218 (2012).</li></ol>

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

साहित्य में एचएसआर को परखने के लिए विभिन्न प्रकार के तापमान, समय और उपकरणों का उपयोग किया गया है, जिसने अनावश्यक चेतावनी शुरू की है और प्रयोगशालाओं के बीच परिणामों की तुलना करने में कठिनाई हुई है। उदाहरण के लिए, 32-37 डिग्री सेल्सियस से कहीं भी तापमान और 15 मिनट से कई घंटे तक के तापमान का उपयोग एचएसआर15को प्रेरित करने के लिए किया गया है। हालांकि, यह बताया गया है कि घातकता सभी चरणों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे और दिन 1 वयस्कों के लिए 1.5 घंटे के रूप में जल्दी होती है15वयस्कों। इसके अलावा, हम बताते हैं कि 35 डिग्री सेल्सियस तक कीड़े के जोखिम से घातकता होती है जो एचएसएफ-1 निर्भर नहीं है, जिससे ये स्थितियां एचएसआर के विश्लेषण के लिए खराब अनुकूल हो जाती हैं। इसके विपरीत, 1 घंटे के लिए 33 डिग्री सेल्सियस का गर्मी का झटका गर्मी सदमे जीन के मजबूत प्रेरण को प्रकाश में लाने के लिए पर्याप्त मजबूत है, फिर भी कृमि व्यवहार्यता को प्रभावित नहीं करने के लिए पर्याप्त हल्के है। दरअसल, 33 डिग्री सेल्सियस के संपर्क में आने के लिए जब तक 6 एच केवल 20% कीड़े असामान्य आंदोलन प्रदर्शित करने का कारण बनता है। इसलिए, हम आरटी-क्यूपीसीआर और फ्लोरोसेंट रिपोर्टर परख के लिए मानकीकृत स्थिति के रूप में 33 डिग्री सेल्सियस के तापमान और 1 घंटे के समय का उपयोग करने का प्रस्ताव करते हैं।
हाल के प्रयोगों से पता चला है कि एचएसआर प्रयोगों के लिए कीड़े का विकासात्मक मंचन विशेष रूप से महत्वपूर्ण है । यह हाल ही में दिखाया गया था कि सी एलिगेंस में एचएसआर की अक्रूती में गिरावट आती है (यानी, गिर) द्वारा >50% जब hermaphrodites5अंडे बिछाने शुरू करते हैं । कीड़े सही ढंग से मंचन महत्वपूर्ण है क्योंकि वहां अक्सर उत्परिवर्तन ले जाने उपभेदों में विकास के समय में मतभेद हैं । यदि तापमान-संवेदनशील म्यूटेंट का उपयोग किया जाता है, तो यह परिणामों को भी प्रभावित करेगा यदि वे अपनी प्रजनन आयु से सिंक्रोनाइज्ड नहीं हैं। इसलिए, यह निर्धारित करने के लिए हर तनाव के लिए अंडे बिछाने की शुरुआत को ध्यान से मापने की सिफारिश की जाती है जब पतन होता है। एल 4 मोल्ट के बाद और प्रजनन परिपक्वता की शुरुआत से पहले समय की खिड़की संकीर्ण है; इसलिए, देखभाल की जानी चाहिए ताकि एचएसआर पतन अनजाने में परिणामों में परिवर्तनशीलता का कारण न बन सके।
विकास के समय के अलावा, तापमान में आश्चर्यजनक रूप से छोटे परिवर्तन, 1 डिग्री सेल्सियस के रूप में छोटे, एचएसआर पर पर्याप्त प्रभाव डाल सकते हैं। उदाहरण के लिए, सी एलिगेंस में थर्मोसेंसरी न्यूरॉन्स तापमान परिवर्तन के प्रति संवेदनशील होते हैं जो ± 0.05 डिग्री सेल्सियस16के रूप में छोटे होते हैं। इस प्रकार, थर्मामीटर का उपयोग करना अनिवार्य है जो तापमान को सटीक रूप से माप सकता है। इसलिए, हम तापमान माप के लिए एक अंशांकित डिवाइस के उपयोग का सबसे अच्छा अभ्यास करने का प्रस्ताव करते हैं जो ± 0.1 डिग्री सेल्सियस के भीतर तापमान को मापने के लिए पर्याप्त सटीक है। इसके अलावा, समय भर में तापमान में बदलाव को मापने के लिए डेटा-लॉगिंग कार्यक्षमता के साथ एक थर्मामीटर का उपयोग किया जाना चाहिए। कई इनक्यूबेटर को इनक्यूबेटर के विभिन्न हिस्सों में और समय के साथ 1 डिग्री सेल्सियस से अधिक की थर्मल विविधताओं के लिए निर्दिष्ट किया जाता है, जिसका एचएसआर प्रयोगों पर महत्वपूर्ण प्रभाव हो सकता है। एक सर्वोत्तम अभ्यास के रूप में, हम उन इनक्यूबेटर का उपयोग करने का सुझाव देते हैं जिनमें तापमान में उतार-चढ़ाव को कम करने के लिए पर्याप्त इन्सुलेशन और परिसंचरण होता है। गर्मी सदमे प्रयोगों के संचालन के लिए, हम एक परिसंचारी पानी स्नान का एक सबसे अच्छा अभ्यास का प्रस्ताव है । आगर की थाली में वांछित तापमान तक पहुंचने में लगने वाला समय पानी के स्नान में लगभग 6-7 मिनट होता है लेकिन सूखे इनक्यूबेटर15,17में बहुत अधिक समय होता है । हालांकि, यदि परिसंचारी जल स्नान उपलब्ध नहीं है, तो हमने दिखाया है कि हमारी स्थितियों का उपयोग करके सूखे इनक्यूबेटर में मजबूत एचएसआर प्रेरण भी होता है। यदि एक सूखे इनक्यूबेटर का उपयोग किया जाता है, तो तनाव की अवधि के लिए इनक्यूबेटर खोलने को कम किया जाना चाहिए।
यह सर्वविदित है कि हीट शॉक जीन को शामिल करना एचएसआर, एचएसएफ-1 के मास्टर रेगुलेटर पर निर्भर करता है । यहां, हम सबूत पेश करते हैं कि दो और अप्रत्यक्ष परख, फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स और थर्मो रिकवरी भी एचएसएफ-1 पर निर्भर हैं । गौरतलब है कि हमने पाया कि आमतौर पर इस्तेमाल किया जाने वाला वैकल्पिक ऑर्गेनमल परख थर्मोटॉलेंस, एचएसएफ-1 आरएनएआई(चित्रा 4)का उपयोग करके एचएसएफ-1 निर्भर नहीं है। इसी तरह के परिणाम पहले एक hsf-1 उत्परिवर्ती या एक ttx-3 ,उत्परिवर्ती, जो एचएसआर18, 19,,1920ब्लॉक का उपयोग कर सूचित किया गया है । साथ में, इन परिणामों से संकेत मिलता है कि थर्मोटोलेंस परख एचएसआर अनुसंधान के लिए इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए। इसके अलावा, यह पता चलता है कि एक सबसे अच्छा अभ्यास एचएसआर को मापने के लिए इस्तेमाल किसी भी परख के लिए HSF-1 निर्भरता का परीक्षण करने के लिए है ।
एक साथ लिया, हम सी एलिगेंस में एचएसआर प्रेरण के मजबूत और प्रजनन योग्य माप के लिए मानकीकृत प्रोटोकॉल और सर्वोत्तम प्रथाओं की एक श्रृंखला प्रस्तुत करते हैं। हमें उम्मीद है कि इन पद्धतियों से एचएसआर प्रयोगों में परिवर्तनशीलता में कमी आएगी और प्रजनन क्षमता बढ़ेगी । प्रयोगशालाओं के बीच एचएसआर अनुसंधान की सीधी तुलना को सुविधाजनक बनाना एचएसआर क्षेत्र में अनुसंधान में तेजी लाने का काम करेगा । इसके अलावा, मानकीकरण से अनुसंधान को उम्र बढ़ने और न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों में लाभ होगा जिनके साथ एचएसआर घनिष्ठ रूप से जुड़ा हुआ है।

हीट शॉक रिस्पांस (एचएसआर) एक सार्वभौमिक सेलुलर तनाव प्रतिक्रिया है जो तापमान वृद्धि और अन्य प्रोटोटॉक्सिक तनावों के कारण साइटोसोलिक प्रोटीन द्वारा प्रेरित होती है। कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस में एचएसआर की सक्रियता से एचपीएसपी-70 और एचएसपी-16.2 जैसे हीट शॉक जीन के ट्रांसक्रिप्शनल अप्रेगुलेशन हो जाते हैं। कई हीट शॉक प्रोटीन (एचएसपी) आणविक चैपरोन के रूप में कार्य करते हैं जो सीधे गलत मोड़ या क्षतिग्रस्त प्रोटीन के साथ बातचीत करके प्रोटीन फोल्डिंग होरोस्टेसिस, या प्रोटेओस्टेसिस को बहाल करते हैं। एचएसआर का मास्टर रेगुलेटर ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर हीट शॉक फैक्टर 1 (एचएसएफ-1) है, जिसकी सक्रियण सुंदर ढंग से कई तंत्र 1 के माध्यम सेनियंत्रितहै ।
एचएसएफ-1 की भूमिका तनाव तक ही सीमित नहीं है। सामान्य विकास और विकास के लिए एचएसएफ-1 की आवश्यकता होती है, क्योंकि एचएसएफ-1 को हटाने से लार्वा गिरफ्तारी2हो जाती है । उम्र बढ़ने और उम्र से संबंधित न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों के दौरान एचएसएफ-1 भी महत्वपूर्ण है जो प्रोटीन समुच्चय के संचय और प्रोटेओस्टेसिस को बनाए रखने में असमर्थता की विशेषता है। एचएसएफ-1 के नॉकआउट से प्रोटीन समुच्चय और एक छोटी उम्र के संचय का कारण बनता है, जबकि एचएसएफ-1 की अधिकव्यक्तता प्रोटीन एकत्रीकरण को कम करती है और उम्र3, 4,4का विस्तार करती है। इसलिए, आणविक स्तर पर एचएसएफ-1 के विनियमन के संगठित शरीर विज्ञान और रोग के लिए व्यापक निहितार्थ हैं ।
C. Elegans एचएसआर अनुसंधान के लिए एक शक्तिशाली मॉडल जीव है क्योंकि एचएसआर आणविक,,सेलुलर, और संगठित स्तर4,,5,6पर मापा जा सकता है । इस मॉडल की शक्ति पर प्रकाश डालते हुए, एचएसआर मार्ग को चित्रित करने में महत्वपूर्ण प्रगति, जैसे एचएसआर विनियमन में ऊतक-विशिष्ट अंतर, सी एलिगेंस7,,8 मेंखोजागया है। इसके अलावा, सी एलिगेंस व्यापक रूप से उम्र बढ़ने अनुसंधान के लिए प्रयोग किया जाता है और प्रोटेओस्टेसिस व्यवधान से जुड़े रोगों मॉडलिंग के लिए एक उभरती हुई प्रणाली है।
हालांकि सी एलिगेंस के साथ हीट शॉक प्रयोग जल्दी और प्रजनन योग्य हो सकते हैं, लेकिन शुरुआत से पहले विचार करने के लिए कई सवाल हैं। उदाहरण के लिए, एचएसआर को शामिल करने के लिए किस तापमान का उपयोग किया जाना चाहिए और कीड़े कब तक उजागर होने चाहिए? क्या ड्राई इनक्यूबेटर या वॉटर बाथ का इस्तेमाल करना बेहतर है? किस विकास स्तर का उपयोग किया जाना चाहिए? दुर्भाग्य से, एचएसआर की जांच करने के लिए उपयोग की जाने वाली पद्धतियां प्रयोगशाला से प्रयोगशाला तक व्यापक रूप से भिन्न होती हैं, जिससे सर्वोत्तम पद्धतियों का चयन करते समय भ्रम पैदा होता है और पूरे क्षेत्र में परिणामों की तुलना करना मुश्किल हो जाता है।
हम एचएसआर को मापने के लिए आरटी-क्यूपीसीआर, फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स और थर्मो रिकवरी का उपयोग करने के लिए मजबूत और मानकीकृत प्रोटोकॉल पेश करते हैं। जबकि ये तीन दृष्टिकोण पूरक हैं, उनमें से प्रत्येक के अद्वितीय फायदे और नुकसान हैं। उदाहरण के लिए, आरटी-क्यूपीसीआर एचएसआर का सबसे प्रत्यक्ष और मात्रात्मक माप है, और इस परख को आसानी से कई अलग-अलग गर्मी सदमे-अकांक्षित जीन को शामिल करने के लिए बढ़ाया जा सकता है। हालांकि, आरटी-क्यूपीसीआर सबसे महंगा है, तकनीकी रूप से मुश्किल हो सकता है, और विशेष उपकरणों के उपयोग की आवश्यकता होती है। इसके विपरीत, फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स को एचएसआर इंडक्शन में ऊतक-विशिष्ट मतभेदों को मापने का लाभ होता है। हालांकि, उन्हें सही मात्रा में बताना मुश्किल है, केवल एक निश्चित सीमा से ऊपर प्रेरण को माप सकते हैं, और फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के उपयोग की आवश्यकता होती है। इसके अतिरिक्त, यहां वर्णित रिपोर्टर उपभेदों को मानक N2 तनाव की तुलना में विकास में देरी हो रही है । हालांकि नए रिपोर्टर एकल कॉपी ट्रांसजीन युक्त उपभेदों उपलब्ध हैं, वे यहां परीक्षण नहीं किया गया है9। तीसरी परख थर्मोरी, ऑर्गनाइज्ड लेवल पर फिजिकली प्रासंगिक रीडआउट देने का फायदा है। हालांकि, यह परख यकीनन सबसे कम संवेदनशील और सबसे अप्रत्यक्ष है । अंत में, हम इन परख में पाए जाने वाले कुछ सामान्य विविधताओं पर चर्चा करते हैं और इस क्षेत्र में अनुसंधान को सुगम बनाने के लिए सर्वोत्तम प्रथाओं का एक सेट प्रस्तावित करते हैं।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>18S-forward primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TTGCGTCAACTGTGGTCGTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18S-reverse primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CCAACAAAAAGAACCGAAGT 
			CCTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AM446 rmIs223[phsp70::gfp; pRF4(rol-6(su1006))]</td>
			<td>Morimoto lab</td>
			<td><a href="http://groups.molbiosci.northwestern.edu/morimoto/" target="_blank">http://groups.molbiosci.northwestern.edu/morimoto/</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C12C8.1-forward primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GTACTACGTACTCATGTGTCG 
			GTATTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C12C8.1-reverse primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ACGGGCTTTCCTTGTTTTCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX Connect Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1855200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CL2070 dvIs70 [hsp-16.2p::GFP + rol-6(su1006)]</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td><a href="https://cgc.umn.edu/" target="_blank">https://cgc.umn.edu/</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyLog Thermistor Probe Data Logger with LCD</td>
			<td>Lascar</td>
			<td>EL-USB-TP-LCD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greenough Stereo Microscope S9i Series</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hard Shell 96 Well PCR Plates</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>HSS9601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hsp-16.2-forward primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ACTTTACCACTATTTCCGTCC 
			AGC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hsp-16.2-reverse primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CCTTGAACCGCTTCTTTCTTTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1708891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iTaq Universal Sybr Green Super Mix</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1725121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scanning Confocal Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse 90i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiGene OptiMax Thermo Cycler</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>TC9610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 (WT)</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td><a href="https://cgc.umn.edu/" target="_blank">https://cgc.umn.edu/</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop Lite Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-LITE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M Roll</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>5259-04LC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapidOut DNA Removal Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K2981</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recirculating Heated Water Bath</td>
			<td>Lauda Brinkmann</td>
			<td>RE-206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Traceable Platinum Ultra-Accurate Digital Thermometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-081-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td>RNA isolation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TurboMix Attachment</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

standardized methods for measuring induction of the heat shock response in caenorhabditis elegans

हीट शॉक रिस्पांस (एचएसआर) साइटोसोलिक प्रोटीन द्वारा प्रेरित एक सेलुलर तनाव प्रतिक्रिया है जो प्रोटीन फोल्डिंग होगोस्टेसिस, या प्रोटेओस्टेसिस को बहाल करने के लिए कार्य करता है। कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस एचएसआर अनुसंधान के लिए एक अद्वितीय और शक्तिशाली जगह है क्योंकि एचएसआर का मूल्यांकन आणविक, सेलुलर और संगठित स्तर पर किया जा सकता है। इसलिए, आणविक स्तर पर परिवर्तनों को सेलुलर स्तर पर कल्पना की जा सकती है और शरीर विज्ञान पर उनके प्रभावों को संगठय स्तर पर मात्रा में बताया जा सकता है। जबकि एचएसआर को मापने के लिए परख सरल हैं, साहित्य में वर्णित समय, तापमान और पद्धति में भिन्नता अध्ययनों में परिणामों की तुलना करना चुनौतीपूर्ण बनाती है। इसके अलावा, इन मुद्दों को अपने अनुसंधान में एचएसआर विश्लेषण को शामिल करने की मांग किसी के लिए एक बाधा के रूप में कार्य करते हैं । यहां, आरटी-क्यूपीसीआर, फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स और एक ऑर्गनाइज्ड थर्मो रिकवरी परख के साथ मजबूत और प्रजनन योग्य तरीके से एचएसआर के प्रडक्शन को मापने के लिए प्रोटोकॉल की एक श्रृंखला प्रस्तुत की जाती है। इसके अतिरिक्त, हम बताते हैं कि एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया थर्मोटोलेंस परख एचएसआर, एचएसएफ-1 के अच्छी तरह से स्थापित मास्टर नियामक पर निर्भर नहीं है, और इसलिए एचएसआर अनुसंधान के लिए इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए। अंत में, साहित्य में पाए जाने वाले इन परखों में भिन्नता पर चर्चा की जाती है और क्षेत्र में परिणामों को मानकीकृत करने में मदद करने के लिए सर्वोत्तम प्रथाओं का प्रस्ताव किया जाता है, अंततः न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग, उम्र बढ़ने और एचएसआर अनुसंधान को सुविधाजनक बनाने के लिए।

इस पांडुलिपि में वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, एचएसआर प्रेरण फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स, आरटी-क्यूपीसीआर, और थर्मो रिकवरी परख का उपयोग करके मापा गया था। प्रत्येक मामले में, धारा 1.2 में प्रक्रिया का उपयोग सिंक्रोनाइज्ड, युवा वयस्क कीड़े उत्पन्न करने के लिए किया गया था जो प्रजनन परिपक्वता तक नहीं पहुंचे थे।
सेलुलर स्तर पर एचएसआर प्रेरण की कल्पना करने के लिए, AM446(एचएसपी-70p::gfp)और CL2070(एचएसपी-16.2 पी:जीएफपी)फ्लोरोसेंट रिपोर्टर उपभेदों का प्रोटोकॉल की धारा 2 के बाद विश्लेषण किया गया। गर्मी के झटके के बिना नकारात्मक नियंत्रण नमूनों में, एचएसपी-१६.२ रिपोर्टर केवल सामांय autofluorescence दिखाया, लेकिन एचएसपी-७० रिपोर्टर गुदा अवसाद की मांसपेशी में संविलियन फ्लोरेसेंस था के रूप में पहले4 (चित्रा 1एक)की सूचना दी । 33 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी के झटके के 1 घंटे के बाद, दोनों संवाददाताओं में मजबूत फ्लोरेसेंस देखा गया; हालांकि, अभिव्यक्ति का पैटर्न अलग था जिसके आधार पर रिपोर्टर का इस्तेमाल किया गया था(चित्रा 1बी)। एचएसपी-70 रिपोर्टर आंत और शुक्राणुओं में मेधावी था, जबकि एचएसपी-16.2 रिपोर्टर फरीनेक्स में सबसे प्रतिभाशाली था। इसके अतिरिक्त, एचएसपी-16.2 रिपोर्टर के पास पहले वर्णित प्रेरण की मात्रा में कृमि-से-कृमि परिवर्तनशीलता की उच्च डिग्री थी, लेकिन एचएसपी-70 रिपोर्टर ने13नहीं किया।
धारा 2 का एक आमतौर पर उपयोग किया जाने वाला भिन्नता परिसंचारी पानी स्नान के बजाय सूखे इनक्यूबेटर में गर्मी के झटके को अंजाम देना है। इसलिए दोनों पद्धतियों के अंतर को भी परखा गया। यह पाया गया कि दोनों प्रोटोकॉल के परिणामस्वरूप हमारी स्थितियों का उपयोग करके दो फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स को मजबूत रूप से शामिल किया गया, हालांकि एक परिसंचारी जल स्नान को सर्वोत्तम अभ्यास (चर्चा देखें)(चित्रा 1बी)के रूप में अनुशंसित किया जाता है।
ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर एचएसएफ-1 पर संवाददाताओं की निर्भरता का परीक्षण करने के लिए, रिपोर्टर इंडक्शन मापा गया था इससे पहले कि फीडिंग RNI को एचएसएफ-1 को नॉकआउट करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । यह पाया गया कि दोनों उपभेदों की फ्लोरेसेंस को एचएसएफ-1 नॉकडाउन पर गंभीर रूप से कम कर दिया गया था, यह दर्शाता है कि ये रिपोर्टर्स एचएसएफ-1-निर्भर हैं जैसा कि साहित्य4 (चित्रा 2)में वर्णित है । हालांकि, यह भी देखा गया कि फरेंगल फ्लोरेसेंस एचएसएफ-1 नॉकडाउन पर दोनों संवाददाताओं में कायम रहा, जो पिछली रिपोर्टों के अनुरूप है कि फरेंगल मांसपेशी14को खिलाकर आरएनएआई के लिए प्रतिरोधी है।
आणविक स्तर पर एचएसआर के पूरे कृमि प्रेरण की मात्रा निर्धारित करने के लिए, प्रोटोकॉल की धारा 3 का उपयोग करके दो अंतर्जात एचएसपी को आरटी-क्यूपीसीआर के साथ मापा गया था। नमूनों को ट्रिपलीकेट में मापा गया था, प्रत्येक प्राइमर के लिए एक मानक वक्र उत्पन्न किया गया था, और गुणवत्ता नियंत्रण के लिए प्रत्येक नमूने के लिए एक पिघल वक्र का विश्लेषण किया गया था। यह पाया गया कि 1 घंटे के लिए 33 डिग्री सेल्सियस हीट शॉक के परिणामस्वरूप दो हीट शॉक जीन, एचएसपी-70 और एचएसपी-16.2 (चित्रा 3)के लिए सापेक्ष अभिव्यक्ति में 2,000x से अधिक की वृद्धि हुई। hsp-70 इन परिणामों से पता चलता है कि दोनों अंतर्जात जीन एचएसआर प्रेरण को मापने के लिए उपयुक्त हैं और 1 घंटे के लिए 33 डिग्री सेल्सियस गर्मी का झटका पर्याप्त प्रतिक्रिया उत्पन्न करने के लिए पर्याप्त है। हालांकि, गर्मी शॉक इंडक्शन की पूर्ण डिग्री की व्याख्या करने में सावधानी का उपयोग किया जाना चाहिए, क्योंकि गर्मी के झटके के अभाव में एमआरएनए का स्तर बहुत कम है।
हीट शॉक के लिए एक शारीरिक प्रतिक्रिया का विश्लेषण करने के लिए, प्रोटोकॉल की धारा 4 का उपयोग करके एक ऑर्गनाइज्ड थर्मोरी परख का परीक्षण किया गया था। यह पाया गया कि 33 डिग्री सेल्सियस पर 6 घंटे के हीट शॉक के लिए कीड़े के संपर्क में आने से 48 घंटे की रिकवरी(चित्रा 4ए)के बाद सामान्य आंदोलन के साथ कीड़े में 20% की कमी आई। एचएसएफ-1 ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर पर इस परख की निर्भरता का परीक्षण तनाव के लिए कीड़े को उजागर करने से पहले एचएसएफ-1 को नॉकआउट करने के लिए आरएनएआई को खिलाने का उपयोग करके किया गया था। यह पाया गया कि एचएसएफ-1 के नॉकआउट के कारण सामान्य आंदोलन में नाटकीय कमी आई, जिसमें 95% कीड़े प्लेटिनम तार लेने के साथ उकसाने के बाद झटकेदार आंदोलन या पक्षाघात दिखाते हैं।
हमने इस थर्मोरिक्त वसूली परख की तुलना व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले वैकल्पिक ऑर्गेनाइज्ड परख से की है जिसे आमतौर पर थर्मोटॉलेंस के रूप में जाना जाता है। थर्मोटॉलेंस परख में, कीड़े एक सूखे इनक्यूबेटर का उपयोग करके निरंतर 35 डिग्री सेल्सियस तापमान के संपर्क में आते हैं, और जीवित कीड़े का प्रतिशत विभिन्न समय बिंदुओं पर मापा जाता है। इस परख का उपयोग करते हुए, यह पाया गया कि नियंत्रण कीड़े लगातार 35 डिग्री सेल्सियस के संपर्क में आने के बाद लगभग 8 घंटे के एक्सपोजर(चित्रा 4बी)के बाद मर गए। हालांकि, जब RNAi नॉकडाउन का उपयोग करके एचएसएफ-1 पर इस परख की निर्भरता का परीक्षण किया गया था, तो यह पाया गया कि एचएसएफ-1 के अवरोध के कारण थर्मोटुलेंस में कमी नहीं आई। इसी तरह के परिणाम पहले HSF-1 म्यूटेशन (चर्चा देखें) का उपयोग करके दिखाए गए हैं । इसलिए, एचएसआर को मापने के लिए थर्मोटोलेंस परख के उपयोग की सिफारिश नहीं की जाती है, और संगठित स्तर पर एचएसआर की जांच के लिए थर्मो रिकवरी पसंदीदा तरीका है।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61030/61030fig1.jpg"> चित्रा 1: एचएसआर प्रेरण फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स के साथ मापा । (A)बेसल और(बी) एचएसपी-70पी की हीट-अकांक्षित अभिव्यक्ति::जीएफपी और एचएसपी-16.2 पी:: जीएफपी रिपोर्टर 1 घंटे के बाद हीट शॉक के 1 घंटे के बाद 33 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान या इनक्यूबेटर में । 64 घंटे के लिए OP50 बैक्टीरिया पर कीड़े उठाए गए थे, गर्मी हैरान, और फिर इमेजिंग से पहले 8 घंटे के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर बरामद किया। संदर्भ के लिए,गर्मीसे सदमे वाले कीड़े की सीमा और संतृप्ति से मेल खाने के लिए(ए)में कोई गर्मी-शॉक कीड़े को फिर से सामान्य नहीं किया गया था। दो प्रयोगात्मक प्रतिकृति के प्रतिनिधि चित्र दिखाए जाते हैं। स्केल बार = 250 माइक्रोन. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61030/61030fig1large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61030/61030fig2.jpg"> चित्रा 2: फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स के साथ मापा गया एचएसआर इंडक्शन एचएसएफ-1 पर निर्भर है। एचएसपी-70पी युक्त उपभेद:: जीएफपी और एचएसपी-16.2 पी:: जीएफपी रिपोर्टर्स को नियंत्रण (L4440 खाली वेक्टर) या 64 घंटे के लिए एचएसएफ-1 आरएनएआई प्लेटों पर उठाया गया था, जो पानी के स्नान में 33 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे गर्मी के झटके से अवगत कराया गया था, और फिर 8 एच इमेजिंग के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर बरामद किया गया था। दो प्रयोगात्मक प्रतिकृति के प्रतिनिधि चित्र दिखाए जाते हैं। स्केल बार = 250 माइक्रोन. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61030/61030fig2large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61030/61030fig3.jpg"> चित्रा 3: एचएसआर प्रेरण आरटी-क्यूपीसीआर के साथ मापा गया। N2 कीड़े HT115 बैक्टीरिया पर ६० घंटे के लिए उठाया गया था और फिर गर्मी एक ३३ डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में 1 घंटे के लिए सदमे में । एचएसपी-70 (C12C8.1) और एचएसपी-16.2 के सापेक्ष एमआरएनए स्तर को कोई गर्मी-सदमे नियंत्रण के लिए सामान्यीकृत दिखाया गया है। प्लॉट किए गए मूल्य चार जैविक प्रतिकृति का मतलब हैं और त्रुटि सलाखों ± SEM का प्रतिनिधित्व करते हैं। सांख्यिकीय महत्व की गणना एक अकर्ण छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग करके की गई थी। **p< 0.01। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61030/61030fig3large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61030/61030fig4.jpg"> चित्रा 4: थर्मो रिकवरी, लेकिन थर्मोटॉलेंस नहीं, एचएसएफ-1 पर निर्भर है। N2 कीड़े नियंत्रण पर उठाया गया (L4440) या 60 घंटे के लिए एचएसएफ-1 RNAi प्लेटें और फिर या तो करने के लिए स्थानांतरित कर दिया: (ए) 6 घंटे के लिए एक 33 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान और सामान्य आंदोलन (थर्मो वसूली), या (बी) एक 35 डिग्री सेल्सियस सूखी इनक्यूबेटर के लिए स्कोरिंग से पहले 48 घंटे के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर बरामद किया और मृत (थर्मोटोलर) के लिए स्कोरिंग से पहले हर 2 घंटे हटा दिया (थर्मोटोलर) । प्रत्येक परख 2 स्वतंत्र दिनों पर एन 30 व्यक्तियों के साथ किया गया था। औसत दिखाया गया है। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61030/61030fig4large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>

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Standardized Methods for Measuring Induction of the Heat Shock Response in Caenorhabditis elegans

यहां, आणविक स्तर पर आरटी-क्यूपीसीआर का उपयोग करके कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस में हीट शॉक रिस्पांस (एचएसआर) के शामिल होने का आकलन करने के लिए मानकीकृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत किए जाते हैं, सेलुलर स्तर पर फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स और ऑर्गेनमल स्तर पर थर्मो रिकवरी।

कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस में हीट शॉक रिस्पांस के प्रेरण को मापने के लिए मानकीकृत तरीके

The heat shock response (HSR) is a cellular stress response induced by cytosolic protein misfolding that functions to restore protein folding homeostasis, ...

हीट शॉक रिस्पांस एक आवश्यक सेलुलर तनाव प्रतिक्रिया मार्ग है जो साइटोप्लाज्मिक प्रोटेओस्टेसिस को बनाए रखता है और समुद्र एलिगेंस में आणविक, सेलुलर और ऑर्गेनमल स्तर पर विशेषता हो सकती है। हम मानकीकृत प्रोटोकॉल और सर्वोत्तम प्रथाओं की एक श्रृंखला प्रस्तुत करते हैं जो गर्मी शॉक रिस्पांस क्षेत्र में प्रजनन क्षमता को बढ़ाने में मदद करने के लिए समुद्र एलिगेंस में हीट शॉक रिस्पांस का मजबूत प्रेरण उत्पन्न करते हैं। हम बताते हैं कि थर्मो टॉलरेंस, एक आमतौर पर इस्तेमाल किया संगठन परख गर्मी सदमे प्रतिक्रिया पर निर्भर नहीं है।इसके बजाय, हम थर्मल रिकवरी का उपयोग करने की सलाहते हैं, एक ऑर्गेनिमल परख जो हीट शॉक रिस्पांस निर्भर है। गर्मी सदमे प्रतिक्रिया अंडे बिछाने की शुरुआत के साथ तनु हो जाते हैं । इसलिए, विकासात्मक समय एक महत्वपूर्ण चर है जिसका हिसाब हीट शॉक रिस्पांस प्रयोगों में होना चाहिए।एक सिंक्रोनाइज्ड कृमि आबादी बनाकर शुरू करें। एक प्लेटिनम तार लेने का प्रयोग करें एक ताजा थाली में लगभग 10 ग्रेविड वयस्क कीड़े हस्तांतरण । वयस्कों के साथ स्थानांतरित किए गए किसी भी अंडे या लार्वा को हटाना सुनिश्चित करें।कीड़े को एक घंटे के लिए अंडे डालने की अनुमति दें, फिर वयस्कों को प्लेट से हटा दें। वांछित विकास चरण तक सिंक्रोनाइज्ड कीड़े को 20 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें, यह ध्यान में रखते हुए कि विकासात्मक समय प्रत्येक तनाव और तापमान के साथ भिन्न होता है जिस पर कीड़े उठाए जाते हैं। जब कीड़े गर्मी सदमे के लिए तैयार हैं, पैराफिन फिल्म के साथ प्लेटों लपेटें और एक घंटे के लिए ३३ डिग्री सेल्सियस पर एक परिसंचारी पानी स्नान में उन्हें जलमग्न करने के लिए एक सीसा वजन के साथ एक परीक्षण ट्यूब रैक का उपयोग करें ।प्लेटों को पानी के स्नान से ठीक करें और उन्हें एक कागज तौलिया के साथ सुखा लें। पैराफिन फिल्म को हटा दें और कीड़े को छह से 24 घंटे के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर ठीक होने दें, जो जीएफपी संश्लेषण के लिए पर्याप्त समय होगा। इमेजिंग के लिए स्लाइड तैयार करने के लिए, दो अन्य स्लाइडों के बीच एक माइक्रोस्कोप स्लाइड की स्थिति है जिसमें प्रयोगशाला टेप की एक पट्टी है।पानी में 3% एगरेग्मेंट सॉल्यूशन बनाएं और इसे माइक्रोवेव में तब तक गर्म करें जब तक कि एगरेग्मेंट घुल न जाए। फिर स्लाइड के केंद्र में एगर उठे के बारे में 150 माइक्रोलीटर रखने के लिए एक मिलीलीटर पिपेट का उपयोग करें। तुरंत एक खाली स्लाइड के साथ स्लाइड को कवर करें, इसे लंबवत रखें ताकि यह प्रयोगशाला टेप पर टिकी हो, फिर ध्यान से इसे हटा दें।कीड़े को स्थिर करने के लिए, एग्राजिंग पैड के केंद्र में एक मिलीमोलर लेविमिसोल, एक M9 बफर की एक छोटी सी बूंद जोड़ें और प्लेटिनम तार लेने का उपयोग करके ड्रॉप में 10 कीड़े स्थानांतरित करें। वैकल्पिक रूप से, लेवेमिसोल को एगर उठे पैड के बाहर तक फैलाएं और जब वे लकवाग्रस्त हो जाते हैं तो कीड़े को पिक के साथ संरेखित करें। कीड़े को कवर स्लिप से कवर करें और फ्लोरोसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके जितनी जल्दी हो सके उन्हें इमेज करें।थर्मोग्रीग्री परख करने के लिए, कीड़े को सिंक्रोनाइज़ करें और वांछित विकास चरण तक उन्हें 20 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें। फिर उन्हें छह घंटे तक हीट शॉक करें। पानी के स्नान से प्लेटों को हटा दें और उन्हें 48 घंटे के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर ठीक होने दें।वसूली के बाद, कीड़े की संख्या की गणना करें जो झटकेदार आंदोलन या पक्षाघात के बिना यांत्रिक उत्तेजना के बाद तुरंत दूर हो सकते हैं। सेलुलर स्तर पर हीट शॉक रिस्पांस इंडक्शन की कल्पना करने के लिए, दो फ्लोरोसेंट रिपोर्टर समुद्री एलिगेंस उपभेदों का विश्लेषण किया गया । बिना हीट शॉक के निगेटिव कंट्रोल सैंपल में एचएसपी-16.2 रिपोर्टर ने नॉर्मल ऑटो फ्लोरेसेंस दिखाया, लेकिन एचएसपी-70 रिपोर्टर ने गुदा डिप्रेसर की मांसपेशी में फ्लोरेसेंस का संविलियन किया था।एक घंटे के हीट शॉक के बाद, दोनों संवाददाताओं में मजबूत फ्लोरेसेंस देखा गया जब आरएनएआई को रिपोर्टर इंडक्शन को मापने से पहले एचएसएफ-1 को नीचे गिराने के लिए इस्तेमाल किया गया था । दोनों उपभेदों का फ्लोरेसेंस गंभीर रूप से कम हो गया था, यह दर्शाता है कि ये रिपोर्टर एचएसएफ-1 निर्भर हैं । आणविक स्तर पर हीट शॉक रिस्पांस के प्रेरण की मात्रा निर्धारित करने के लिए, आरटी कुंजी पीसीआर के साथ दो स्वदेशी हीट शॉक प्रोटीन मापा गया ।यह पाया गया कि एक घंटे ३३ डिग्री सेल्सियस हीट शॉक के परिणामस्वरूप दो हीट शॉक जीन की सापेक्ष अभिव्यक्ति में 2, 000 गुना से अधिक वृद्धि होती है । एक थर्मो वसूली परख का प्रदर्शन किया है कि एक छह घंटे गर्मी सदमे के लिए जोखिम एक ४८ घंटे की वसूली के बाद सामांय आंदोलन के साथ कीड़े में 20% की कमी के लिए नेतृत्व किया । एचएसएफ-1 के नॉकआउट के कारण सामान्य आंदोलन में नाटकीय कमी आई, जिसमें 95% से अधिक कीड़े के बाद झटकेदार आंदोलन या पक्षाघात दिखाई देते हैं।इसके विपरीत, एचएसएफ-1 के नॉकआउट का थर्मो टॉलरेंस परख के परिणामों पर महत्वपूर्ण प्रभाव नहीं पड़ा, जिसमें कीड़े लगातार 35 डिग्री सेल्सियस तापमान के संपर्क में आते हैं और जीवित कीड़े का प्रतिशत विभिन्न समय बिंदुओं पर मापा जाता है। पहली बार इस तकनीक का प्रदर्शन करते समय, प्लेटों में प्रवेश करने और प्रयोग को बर्बाद करने से पानी को रोकने के लिए दो बार पैराफिन फिल्म के साथ प्लेटों को लपेटना सुनिश्चित करें। आणविक परख आरएनए-seq का उपयोग कर जीनोमिक विश्लेषण में बढ़ाया जा सकता है।गर्मी के झटके की प्रतिक्रिया से प्रभावित अन्य संगठित परख को शामिल किया जा सकता है, जैसे जीवन काल। समुद्र elegans में आणविक, सेलुलर, और संगठित गर्मी सदमे प्रतिक्रिया परख सहसंबंधित करने के लिए अद्वितीय क्षमता विकास और रोग में इस मार्ग की भूमिका की समझ के लिए अमूल्य साबित कर दिया है ।

Research

JoVE Journal

Environment

Standardized Methods for Measuring Induction of the Heat Shock Response in Caenorhabditis elegans

Methods for Performing Crosses in Setaria viridis, a New Model System for the Grasses

Methods for Performing Crosses in Setaria viridis, a New Model System for the Grasses

पार प्रदर्शन के लिए तरीके<em&gt; Setaria viridis</emघास के लिए&gt;, एक नया मॉडल प्रणाली

Setaria viridis is an emerging model system for C4 grasses. It is closely related to the bioenergy feed stock switchgrass and the grain crop foxtail ...

A New Application of the Electrical Penetration Graph (EPG) for Acquiring and Measuring Electrical Signals in Phloem Sieve Elements

A New Application of the Electrical Penetration Graph EPG for Acquiring and Measuring Electrical Signals in Phloem Sieve Elements

फ्लोएम चलनी तत्वों में विद्युत संकेतों को प्राप्त करने और मापने के लिए बिजली पहुंच ग्राफ (EPG) का एक नया आवेदन

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3 डी भूकंपीय इमेजिंग उपसतह ज्वालामुखियों के लिए डेटा प्रसंस्करण विधियों: तारिम बाढ़ बेसाल्ट के लिए आवेदन

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Methods for Image-based Surveys of Benthic Macroinvertebrates and Their Habitat Exemplified by the Drop Camera Survey for the Atlantic Sea Scallop

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A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

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केनोरहब्डिटिस एलीगेंस की स्वचालित phenotypic रूपरेखा द्वारा रासायनिक विषाक्तता की भविष्यवाणी के लिए एक उच्च थ्रूपुट परख

Applying toxicity testing of chemicals in higher order organisms, such as mice or rats, is time-consuming and expensive, due to their long lifespan and ...

Using Caenorhabditis elegans for Studying Trans- and Multi-Generational Effects of Toxicants

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विषाक्त पदार्थों के ट्रांस और बहु-पीढ़ी के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए Caenorhabditis elegans का उपयोग करना

Information about toxicities of chemicals are essential in their application and waste management. For chemicals at low concentrations, the long-term ...