Name: standardized methods for measuring induction of the heat shock response in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2020-07-03T14:00:00
Duration: 6 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Standardized Methods for Measuring Induction of the Heat Shock Response in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Эта работа была поддержана пожертвованием от Фрэнка Лесли. Некоторые штаммы были предоставлены CGC, который финансируется NIH Управление научно-исследовательских инфраструктурных программ (P40 OD010440).

<ol>
	<li>Guisbert, E., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+and+function+of+the+heat+shock+response.">The regulation and function of the heat shock response.</a> Protein Quality Control in Neurodegenerative Diseases. , 1-18 (2013).</li><li>Li, J., Chauve, L., Phelps, G., Brielmann, R. M., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E2F+coregulates+an+essential+HSF+developmental+program+that+is+distinct+from+the+heat-shock+response.">E2F coregulates an essential HSF developmental program that is distinct from the heat-shock response.</a> Genes and Development. 30 (18), 2062-2075 (2016).</li><li>Hsu, A. L., Murphy, C. T., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+aging+and+age-related+disease+by+DAF-16+and+heat-shock+factor.">Regulation of aging and age-related disease by DAF-16 and heat-shock factor.</a> Science. 300 (5622), 1142-1145 (2003).</li><li>Morley, J. F., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+longevity+in+Caenorhabditis+elegans+by+heat+shock+factor+and+molecular+chaperones.">Regulation of longevity in Caenorhabditis elegans by heat shock factor and molecular chaperones.</a> Molecular Biology of the Cell. 15 (2), 657-664 (2004).</li><li>Labbadia, J., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repression+of+the+Heat+Shock+Response+Is+a+Programmed+Event+at+the+Onset+of+Reproduction.">Repression of the Heat Shock Response Is a Programmed Event at the Onset of Reproduction.</a> Molecular Cell. 59 (4), 639-650 (2015).</li><li>Link, C. D., Cypser, J. R., Johnson, C. J., Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+stress+response+in+Caenorhabditis+elegans+using+a+reporter+transgene.">Direct observation of stress response in Caenorhabditis elegans using a reporter transgene.</a> Cell Stress &amp; Chaperones. 4 (4), 235 (1999).</li><li>Guisbert, E., Czyz, D. M., Richter, K., McMullen, P. D., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+Tissue-Selective+Heat+Shock+Response+Regulatory+Network.">Identification of a Tissue-Selective Heat Shock Response Regulatory Network.</a> PLoS Genetics. 9 (4), 1-12 (2013).</li><li>Ma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Proteomes+Drive+Tissue-Specific+Regulation+of+the+Heat+Shock+Response.">Cellular Proteomes Drive Tissue-Specific Regulation of the Heat Shock Response.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics. 7 (3), 1011-1018 (2017).</li><li>Mendenhall, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+single-copy+hsp-16.2+reporter+predicts+life+span.">Expression of a single-copy hsp-16.2 reporter predicts life span.</a> Journals of Gerontology - Series A Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (7), 726-733 (2012).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. (1999), 1-11 (2006).</li><li>Avery, L., You, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+feeding.">C. elegans feeding.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-23 (2012).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2-&#916;&#916;CT+method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-&#916;&#916;CT method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Rea, S. L., Wu, D., Cypser, J. R., Vaupel, J. W., Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stress-sensitive+reporter+predicts+longevity+in+isogenic+populations+of+Caenorhabditis+elegans.">A stress-sensitive reporter predicts longevity in isogenic populations of Caenorhabditis elegans.</a> Nature Genetics. 37 (8), 894-898 (2005).</li><li>Shiu, P. K., Hunter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Developmental+Exposure+to+dsRNA+Is+Critical+for+Initiating+Efficient+Nuclear+RNAi+in+C.+elegans.">Early Developmental Exposure to dsRNA Is Critical for Initiating Efficient Nuclear RNAi in C. elegans.</a> Cell Reports. 18 (12), 2969-2978 (2017).</li><li>Zevian, S. C., Yanowitz, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+considerations+for+heat+shock+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Methodological considerations for heat shock of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Methods. 68 (3), 450-457 (2014).</li><li>Clark, D. A., Biron, D., Sengupta, P., Samuel, A. D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AFD+sensory+neurons+encode+multiple+functions+underlying+thermotactic+behavior+in+Caenorhabditis+elegans.">The AFD sensory neurons encode multiple functions underlying thermotactic behavior in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Neuroscience. 26 (28), 7444-7451 (2006).</li><li>Prahlad, V., Cornelius, T., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+cellular+heat+shock+response+in+Caenorhabditis+elegans+by+thermosensory+neurons.">Regulation of the cellular heat shock response in Caenorhabditis elegans by thermosensory neurons.</a> Science. 320 (5877), 811-814 (2008).</li><li>McColl, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-like+signaling+determines+survival+during+stress+via+posttranscriptional+mechanisms+in+C.+elegans.">Insulin-like signaling determines survival during stress via posttranscriptional mechanisms in C. elegans.</a> Cell Metabolism. 12 (3), 260-272 (2010).</li><li>Douglas, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotypic+Signals+from+Neural+HSF-1+Separate+Thermotolerance+from+Longevity.">Heterotypic Signals from Neural HSF-1 Separate Thermotolerance from Longevity.</a> Cell Reports. 12 (7), 1196-1204 (2015).</li><li>Kourtis, N., Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+heat-shock+proteins+protect+from+heat-stroke-associated+neurodegeneration.">Small heat-shock proteins protect from heat-stroke-associated neurodegeneration.</a> Nature. 490 (7419), 213-218 (2012).</li></ol>

Авторам нечего раскрывать.

В литературе для анализа HSR использовались самые разнообразные температуры, время и оборудование, что привело к ненужным предостережениям и затруднилось сравнение результатов между лабораториями. Например, для индуцирования HSR 15 были использованы температуры в диапазоне от32-37градусов по Цельсию и время от 15 мин до нескольких часов. Тем не менее, сообщается, что летальность происходит уже в 3 ч при 37 градусов по Цельсию для всех этапов и 1,5 ч в день 1 взрослых15. Кроме того, мы показываем, что воздействие червей до 35 градусов по Цельсию вызывает летальность, которая не зависит от HSF-1, что делает эти условия плохо пригодными для анализа HSR. В отличие от этого, тепловой шок 33 градусов по Цельсию на 1 ч является достаточно надежным, чтобы вызвать сильную индукцию генов теплового шока, но достаточно мягкий, чтобы не влиять на жизнеспособность червя. Действительно, воздействие 33 градусов по Цельсию до тех пор, как 6 ч только вызывает 20% червей для отображения ненормального движения. Поэтому мы предлагаем использовать температуру 33 градусов по Цельсию и время 1 ч в качестве стандартизированного состояния для RT-qPCR и флуоресцентных анализов репортера.
Недавние эксперименты показали, что развитие постановки червей для экспериментов HSR особенно важно. Недавно было показано, что в C. elegans inducibility of HSR снижается (т.е. рушится) на йgt;50%, когда гермафродиты начинают откладывание яиц5. Постановка червей правильно имеет решающее значение, поскольку Есть часто различия в времени развития в штаммов, несущих мутации. Если использовать чувствительные к температуре мутанты, это также повлияет на результаты, если они не синхронизированы по репродуктивному возрасту. Поэтому рекомендуется тщательно измерять начало откладывания яиц для каждого штамма, чтобы определить, когда происходит коллапс. Окно времени после линьки L4 и до начала репродуктивной зрелости является узким; поэтому необходимо проявлять осторожность, с тем чтобы крах HSR не случайно привел к изменчивости результатов.
В дополнение к срокам развития, удивительно небольшие изменения температуры, всего лишь 1 градус по Цельсию, могут оказать существенное влияние на HSR. Например, термосенсорные нейроны в C. elegans чувствительны к изменениям температуры, такой же незначительной, как 0,05 градуса по Цельсию16. Таким образом, крайне важно использовать термометр, который может точно измерить температуру. Поэтому мы предлагаем в качестве наилучшей практики использование откалиброванного устройства для измерения температуры, которое является достаточно точным для измерения температуры в пределах 0,1 градуса по Цельсию. Кроме того, для измерения колебаний температуры во времени следует использовать термометр с функцией регистрации данных. Многие инкубаторы, как указано, имеют тепловые вариации более 1 градуса по Цельсию в различных частях инкубатора и во времени, что может оказать значительное влияние на эксперименты HSR. В качестве наилучшей практики мы предлагаем использовать инкубаторы, которые имеют достаточную изоляцию и циркуляцию, чтобы свести к минимуму колебания температуры. Для проведения экспериментов теплового шока мы предлагаем передовую практику циркулирующей водяной ванны. Время, необходимое для агар пластины для достижения желаемой температуры составляет примерно 6-7 мин в водяной бане, но гораздо дольше в сухом инкубаторе15,17. Однако, если циркулирующая водяная ванна не доступна, мы показали, что надежная индукция HSR также происходит в сухом инкубаторе, используя наши условия. При использовании сухого инкубатора необходимо свести к минимуму открытие инкубатора на время стресса.
Хорошо известно, что индукция генов теплового шока зависит от главного регулятора HSR, HSF-1. Здесь мы представляем доказательства того, что еще два косвенных анализа, флуоресцентные репортеры и thermorecovery, также зависят от HSF-1. Примечательно, что мы обнаружили, что широко используемый альтернативный анализ организма, термотолеренс, не зависит от HSF-1 с помощью hsf-1 RNAi(рисунок 4). Аналогичные результаты были ранее сообщалось с помощью hf-1 мутант или ttx-3 мутант, который блокирует HSR18,19,20. Вместе эти результаты показывают, что анализ термотолерации не должен использоваться для исследования HSR. Кроме того, это говорит о том, что наилучшей практикой является тестирование зависимости HSF-1 для любого анализа, используемого для измерения HSR.
В совокупности мы представляем ряд стандартизированных протоколов и передовой практики для надежного и воспроизводимого измерения индукции HSR в C. elegans. Мы надеемся, что эти методологии уменьшат изменчивость в экспериментах HSR и повысят воспроизводимость. Содействие прямому сопоставлению исследований HSR между лабораториями послужит ускорению исследований в области HSR. Кроме того, стандартизация принесет пользу исследованиям в области старения и нейродегенеративных заболеваний, с которыми HSR тесно связан.

Реакция теплового шока (HSR) является универсальной клеточной реакцией на стресс, вызванную неправильное сворачивание цитозольного белка, вызванного повышением температуры и другими протеотоксическими стрессами. Активация HSR в Caenorhabditis elegans приводит к транскрипционной upregulation генов теплового шока, таких как hsp-70 и hsp-16.2. Многие белки теплового шока (HSPs) функционируют как молекулярные сопровождающие, которые восстанавливают белок складной гомеостаз, или протеостаз, непосредственно взаимодействуя с неправильно сложенными или поврежденными белками. Главным регулятором HSR является транскрипционный фактор Heat Shock Factor 1 (HSF-1), активация которого элегантно контролируется с помощью нескольких механизмов1.
Роль HSF-1 не ограничивается стрессом. HSF-1 необходим для нормального роста и развития, так как удаление hsf-1 приводит к личинок арест2. HSF-1 также имеет важное значение во время старения и связанных с возрастом нейродегенеративных заболеваний, характеризующихся накоплением белковых агрегатов и неспособностью поддерживать протеостаз. Нокдаун hsf-1 вызывает накопление белковых агрегатов и укороченную продолжительность жизни, в то время как переэкспрессия hsf-1 уменьшает агрегацию белка и продлевает срок службы3,,4. Таким образом, регулирование HSF-1 на молекулярном уровне имеет широкие последствия для физиологии организма и болезней.
C. elegans является мощным модельным организмом для исследования HSR, потому что HSR может быть измерена на молекулярном, клеточном и организмном уровнях4,,5,,6. Подчеркивая силу этой модели, ключевые достижения в разграничении пути HSR, такие как ткани конкретных различий в регулировании HSR, были обнаружены в C. elegans7,8. Кроме того, C. elegans широко используется для исследования старения и является новой системой моделирования заболеваний, связанных с нарушением протеостаза.
Хотя эксперименты теплового шока с C. elegans могут быть быстрыми и воспроизводимыми, есть несколько вопросов, которые необходимо рассмотреть перед началом. Например, какая температура должна использоваться для индукции HSR и как долго черви должны подвергаться воздействию? Лучше ли использовать сухой инкубатор или водяную ванну? Какой этап развития следует использовать? К сожалению, методологии, используемые для исследования HSR, сильно различаются от лабораторного к лабораторному, вызывая путаницу при выборе наилучших методологий и затрудняя сравнение результатов на местах.
Мы представляем надежные и стандартизированные протоколы для использования RT-qPCR, флуоресцентных репортеров, и thermorecovery для измерения HSR. Хотя эти три подхода дополняют друг друга, каждый из них имеет уникальные преимущества и недостатки. Например, RT-qPCR является наиболее прямым и количественным измерением HSR, и этот анализ может быть легко расширен, чтобы включить много различных генов, индуцируемых тепловым шоком. Тем не менее, РТ-qPCR является самым дорогим, может быть технически трудно, и требует использования специализированного оборудования. В отличие от этого, флуоресцентные репортеры имеют преимущество измерения тканей конкретных различий в индукции HSR. Тем не менее, они трудно количественно точно, может только измерить индукции выше определенного порога, и требуют использования флуоресценции микроскопа. Кроме того, описанные здесь штаммы репортера стягиваются с задержкой в развитии по сравнению со стандартным штаммом N2. Хотя новые штаммы репортера, содержащие однокопийные трансгены доступны, они не были протестированы здесь9. Третий анализ, thermorecovery, имеет преимущество обеспечивать физиологически уместный считывание на уровне организма. Тем не менее, этот анализ, возможно, наименее чувствительный и наиболее косвенный. Наконец, мы обсуждаем некоторые общие различия, найденные в этих анализах, и предлагаем набор передовых методов для облегчения исследований в этой области.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>18S-forward primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TTGCGTCAACTGTGGTCGTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18S-reverse primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CCAACAAAAAGAACCGAAGT 
			CCTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AM446 rmIs223[phsp70::gfp; pRF4(rol-6(su1006))]</td>
			<td>Morimoto lab</td>
			<td><a href="http://groups.molbiosci.northwestern.edu/morimoto/" target="_blank">http://groups.molbiosci.northwestern.edu/morimoto/</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C12C8.1-forward primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GTACTACGTACTCATGTGTCG 
			GTATTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C12C8.1-reverse primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ACGGGCTTTCCTTGTTTTCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX Connect Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1855200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CL2070 dvIs70 [hsp-16.2p::GFP + rol-6(su1006)]</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td><a href="https://cgc.umn.edu/" target="_blank">https://cgc.umn.edu/</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyLog Thermistor Probe Data Logger with LCD</td>
			<td>Lascar</td>
			<td>EL-USB-TP-LCD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greenough Stereo Microscope S9i Series</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hard Shell 96 Well PCR Plates</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>HSS9601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hsp-16.2-forward primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ACTTTACCACTATTTCCGTCC 
			AGC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hsp-16.2-reverse primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CCTTGAACCGCTTCTTTCTTTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1708891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iTaq Universal Sybr Green Super Mix</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1725121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scanning Confocal Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse 90i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiGene OptiMax Thermo Cycler</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>TC9610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 (WT)</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td><a href="https://cgc.umn.edu/" target="_blank">https://cgc.umn.edu/</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop Lite Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-LITE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M Roll</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>5259-04LC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapidOut DNA Removal Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K2981</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recirculating Heated Water Bath</td>
			<td>Lauda Brinkmann</td>
			<td>RE-206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Traceable Platinum Ultra-Accurate Digital Thermometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-081-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td>RNA isolation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TurboMix Attachment</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

standardized methods for measuring induction of the heat shock response in caenorhabditis elegans

Реакция теплового шока (HSR) является клеточной реакции стресса, вызванного цитозоликовых белков неправильно, что функции для восстановления белка складной гомеостаз, или протеостаза. Caenorhabditis elegans занимает уникальную и мощную нишу для исследований HSR, потому что HSR может быть оценен на молекулярном, клеточном и организмном уровнях. Таким образом, изменения на молекулярном уровне могут быть визуализированы на клеточном уровне и их воздействие на физиологию может быть количественно на уровне организма. Хотя анализы для измерения HSR просты, различия в времени, температуре и методологии, описанные в литературе, затрудняют сравнение результатов в исследованиях. Кроме того, эти вопросы служат барьером для тех, кто стремится включить анализ HSR в свои исследования. Здесь, ряд протоколов представлен для измерения индукции HSR в надежной и воспроизводимой манере с RT-qPCR, флуоресцентные репортеры, и организмных thermorecovery анализа. Кроме того, мы показываем, что широко используемый анализ термотолеров не зависит от устоявшегося главного регулятора HSR, HSF-1, и поэтому не должен использоваться для исследований HSR. Наконец, изменения в этих анализах, найденных в литературе обсуждаются и лучшие практики предлагаются, чтобы помочь стандартизировать результаты по всей области, в конечном счете, содействие нейродегенеративных заболеваний, старения и исследований HSR.

Используя протоколы, описанные в этой рукописи, индукция HSR была измерена с помощью флуоресцентных репортеров, RT-qPCR и thermorecovery assays. В каждом случае процедура в разделе 1.2 использовалась для создания синхронизированных молодых взрослых червей, которые не достигли репродуктивной зрелости.
Чтобы визуализировать индукцию HSR на клеточном уровне, AM446(hsp-70p::gfp) и CL2070(hsp-16.2p::gfp) флуоресцентные штаммы репортера были проанализированы в соответствии с разделом 2 протокола. В отрицательных образцов контроля без теплового шока, hsp-16.2 репортер только показал нормальный автофлуоресценции, но hsp-70 репортер был составной флуоресценции в анальной мышцы депрессора, как сообщалось ранее4 (Рисунок 1). После 1 ч теплового удара при температуре 33 градуса Цельсия, в обоих репортерах наблюдалась устойчивая флуоресценция; однако, шаблон выражения был различным в зависимости от того, какой репортер был использован (Рисунок 1B). Репортер hsp-70 был самым ярким в кишечнике и сперматозоиде, в то время как репортер hsp-16.2 был самым ярким в глотке. Кроме того, hsp-16.2 репортер имел высокую степень червя к червю изменчивости в количестве индукции, как описано ранее, но hsp-70 репортер не13.
Широко используемый вариант раздела 2 заключается в выполнении теплового удара в сухом инкубаторе вместо циркулирующей водяной ванны. Поэтому была также проверена разница между этими двумя методологиями. Было установлено, что оба протокола привели к надежной индукции двух флуоресцентных репортеров, используя наши условия, хотя циркулирующие ванны воды рекомендуется в качестве наилучшей практики (см. Обсуждение) (Рисунок 1B).
Чтобы проверить зависимость репортеров от транскрипционного фактора HSF-1, кормление РНК было использовано для нокдауна hsf-1 до того, как была измерена индукция репортера. Было установлено, что флуоресценция обоих штаммов была серьезно снижена на HSF-1 нокдаун, указывая, что эти репортеры HSF-1-зависимы, как описано в литературе4 (Рисунок 2). Тем не менее, было также отмечено, что фарингиальной флуоресценции сохраняется в обоих репортеров на hsf-1 нокдаун, который согласуется с предыдущими сообщениями, что фаринговая мышца устойчива к RNAi путем кормления14.
Для количественной индукции всего червя HSR на молекулярном уровне, два эндогенных HSP были измерены с помощью раздела 3 протокола RT-qPCR. Образцы были измерены в трипликате, стандартная кривая была сгенерирована для каждого из грунтовок, и кривая расплава была проанализирована для каждого образца для контроля качества. Было установлено, что тепловой шок на 33 градуса по Цельсию на 1 ч привел к увеличению относительного экспрессии на 2000 раз для двух генов теплового шока, hsp-70 и hsp-16.2 (рисунок 3). Эти результаты показывают, что оба эндогенных гена подходят для измерения индукции HSR и что тепловой шок 33 градусов по Цельсию на 1 ч достаточен для получения существенной реакции. Тем не менее, осторожность должна быть использована в интерпретации абсолютной степени индукции теплового шока, потому что уровни мРНК при отсутствии теплового шока очень низки.
Для анализа физиологической реакции на тепловой шок был протестирован с помощью раздела 4 протокола, который был протестирован организмом. Было установлено, что воздействие червей на 6 ч теплового шока при температуре 33 градусов по Цельсию привело к 20% снижение червей с нормальным движением после 48 ч восстановления (Рисунок 4A). Зависимость этого анализа на HSF-1 транскрипционный фактор был протестирован с помощью кормления РНК нокдаун hsf-1 до разоблачения червей к стрессу. Было установлено, что нокдаун hsf-1 вызвало резкое снижение нормального движения, с 95% червей, показывающих отрывистые движения или паралич после того, как prodded с платиной проволоки забрать.
Мы сравнили этот анализ thermorecovery к широко используемому альтернативному ассему организму обычно refer to как термотолеранс. В анализе термоолеровства, черви подвергаются воздействию непрерывной температуры 35 градусов по Цельсию с помощью сухого инкубатора, и процент живых червей измеряется в различных точках времени. Используя этот анализ, было установлено, что контроль червей непрерывно подвергаются 35 кк, умер после примерно 8 ч воздействия (Рисунок 4B). Однако, когда зависимость этого анализа на HSF-1 была протестирована с использованием нокдауна РНК, было установлено, что ингибирование hsf-1 не вызывает снижения термолерени. Аналогичные результаты ранее были показаны с помощью мутаций HSF-1 (см. Обсуждение). Таким образом, использование анализа термотолерента для измерения HSR не рекомендуется, и thermorecovery является предпочтительным методом для изучения HSR на уровне организма.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61030/61030fig1.jpg"> Рисунок 1: индукция HSR измеряется с флуоресцентными репортерами. (A) Базальный и (B) тепло-индуцируемое выражение hsp-70p::gfp и hsp-16.2p::gfp репортер штаммов после 1 ч теплового шока при 33 кк в водяной бане или инкубаторе. Черви были подняты на OP50 бактерий на 64 ч, тепло шокированы, а затем восстановлены при 20 градусов по Цельсию в течение 8 ч до визуализации. Для справки, не тепловой шок червей в ()были renormalized в (B) в соответствии с диапазоном и насыщения тепла шокированных червей. Показаны репрезентативные изображения двух экспериментальных репликаций. Масштабная панель No 250 м. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61030/61030fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61030/61030fig2.jpg"> Рисунок 2: индукция HSR, измеренная флуоресцентными репортерами, зависит от HSF-1. Штаммы, содержащие hsp-70p::gfp и hsp-16.2p::gfp репортеры были подняты на контроль (L4440 пустой вектор) или hsf-1 RNAi пластин для 64 ч, подвергаются 1 ч теплового шока на 33 кк в водяной бане, а затем восстановлены на 20 C для 8 ч для 8 ч до изображения. Показаны репрезентативные изображения двух экспериментальных репликаций. Масштабная панель No 250 м. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61030/61030fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61030/61030fig3.jpg"> Рисунок 3: индукция HSR измеряется с помощью RT-qPCR. N2 черви были подняты на бактерии HT115 для 60 ч, а затем тепло шокированы в течение 1 ч в 33 кк водяной бане. Относительные уровни мРНК hsp-70 (C12C8.1) и hsp-16.2 показаны нормализованы без контроля теплового удара. Значения, на которых построены, являются средними из четырех биологических репликаций, а бары ошибок представляют sem. Статистическая значимость была рассчитана с помощью неоплаченного теста студента. Зп Хтт; 0,01. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61030/61030fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61030/61030fig4.jpg"> Рисунок 4: Thermorecovery, но не термотолеранс, зависит от HSF-1. N2 черви были подняты на контроль (L4440) или hsf-1 RNAi пластины для 60 ч, а затем перенесены либо: (A) 33 КК водяной бане на 6 ч и восстановлены на 20 градусов по Цельсию в течение 48 ч до забил для нормального движения (thercovermorey), или (B) 35 C сухой инкубатор и удалены каждый 2 ч до мертвых (термотероэнс). Каждый анализ был сделан с n 30 человек на 2 независимых дней. Показано среднее значение. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61030/61030fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Standardized Methods for Measuring Induction of the Heat Shock Response in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Standardized Methods for Measuring Induction of the Heat Shock Response in Caenorhabditis elegans

Здесь представлены стандартизированные протоколы для оценки индукции реакции теплового шока (HSR) в Caenorhabditis elegans с использованием RT-qPCR на молекулярном уровне, флуоресцентных репортеров на клеточном уровне и терморобеблейки на уровне организма.

Стандартизированные методы для измерения индукции теплового удара ответ в Caenorhabditis elegans

The heat shock response (HSR) is a cellular stress response induced by cytosolic protein misfolding that functions to restore protein folding homeostasis, ...

Реакция теплового шока является важным клеточным стрессом ответ путь, который поддерживает цитоплазмический протеостаз и может быть охарактеризована на молекулярном, клеточном и организме уровнях в морских элеганов. Мы представляем ряд стандартизированных протоколов и передовой практики, которые генерируют надежную индукцию реакции теплового удара в морских элеганах, чтобы помочь повысить воспроизводимость в области реагирования на тепловой удар. Мы показываем, что термотерпимость, широко используемый анализ организма не зависит от реакции теплового шока.Вместо этого мы рекомендуем использовать тепловое восстановление, анализ организма, который зависит от реакции теплового удара. Реакция теплового удара затухается с началом откладки яиц. Таким образом, сроки развития является критической переменной, которая должна быть учтена в экспериментах теплового удара ответ.Начните с создания синхронизированной популяции червей. Используйте платиновый провод выбрать для передачи примерно 10 gravid взрослых червей на свежую тарелку. Убедитесь в том, чтобы удалить любые яйца или личинки, которые, возможно, были переданы со взрослыми.Разрешить червей откладывать яйца в течение одного часа, а затем удалить взрослых из тарелки. Поддерживайте синхронизированных червей при температуре 20 градусов по Цельсию до желаемой стадии развития, принимая во внимание, что сроки развития варьируется в зависимости от каждого штамма и температуры, при которой черви подняты. Когда черви будут готовы к тепловому удару, оберните пластины парафиновой пленкой и используйте стойку пробирки с свинцовой массой, чтобы погрузить их в циркулирующую водяную ванну при температуре 33 градуса по Цельсию в течение одного часа.Восстановить пластины из водяной бани и высушить их бумажным полотенцем. Удалите парафиновую пленку и дайте червям восстановиться при 20 градусах по Цельсию в течение шести-24 часов, что будет достаточным временем для синтеза GFP. Чтобы подготовить слайды для визуализации, распоимите слайд микроскопа между двумя другими слайдами, на которых есть полоса лабораторной ленты.Сделать 3%agarose раствор в воде и нагревать его в микроволновой печи, пока агарозы растворяются. Затем используйте одноми миллилитровую пипетку, чтобы разместить около 150 микролитров агарозы в центре горки. Немедленно накройте слайд пустым слайдом, поместив его перпендикулярно так, чтобы он лежит на лабораторной ленте, затем аккуратно удалите его.Чтобы обездвижить червей, добавьте небольшую каплю одного миллимолярского левамизола, буфера M9, в центр агарозной площадки и перенесите 10 червей в каплю с помощью платинового проволоки. По желанию, распространение левамизола с внешней стороны агарозы площадку и выровнять червей с забрать, когда они становятся парализованными. Обложка червей с крышкой скольжения и изображение их как можно скорее с помощью флуоресценции микроскопа.Для выполнения анализа термовосстановлений, синхронизировать червей и поддерживать их на 20 градусов по Цельсию до желаемой стадии развития. Затем тепло ударять их в течение шести часов. Снимите пластины с водяной ванны и дайте им восстановиться при 20 градусах по Цельсию в течение 48 часов.После выздоровления подсчитайте количество червей, которые могут сразу же уходить после механической стимуляции без отрывистых движений или паралича. Для визуализации индукции реакции теплового удара на клеточном уровне были проанализированы два флуоресцентных штамма морских элеганов. В отрицательных контрольных образцах без теплового удара репортер hsp-16.2 показал нормальную автофлуоресценцию, но у репортера hsp-70 была составная флуоресценция в анальной депрессольной мышце.После одного часа теплового удара, надежная флуоресценция наблюдалась в обоих репортеров, когда РНК был использован, чтобы сбить hsf-1 до измерения индукции репортера. Флуоресценция обоих штаммов была серьезно снижена, что свидетельствует о том, что эти репортеры являются hsf-1 зависимыми. Для количественной индукции реакции теплового шока на молекулярном уровне, два местных белка теплового шока были измерены с RT ключевых ПЦР.Было установлено, что один час 33 градусов по Цельсию тепловой шок приводит к более чем 2000 раз увеличение относительной экспрессии двух генов теплового шока. Анализ термооткрытия показал, что воздействие шестичасового теплового удара привело к 20%-му снижению числа червей с нормальным движением после 48-часового восстановления. Нокдаун hsf-1 вызвало резкое снижение нормального движения, с более чем 95% червей, показывающих отрывистые движения или паралич после того, как prodded.В отличие от этого, нокдаун hsf-1 не оказал существенного влияния на результаты анализа термотерпимости, в котором черви подвергаются воздействию непрерывной температуры 35 градусов по Цельсию и процент червей жив измеряется в различных точках времени. При выполнении этой техники в первый раз, убедитесь, что обернуть пластины с парафиновой пленкой в два раза, чтобы предотвратить воду от входа в пластины и губит эксперимент. Молекулярные анализы могут быть расширены в геномных анализах с использованием РНК-сек.Другие анализы организма, пострадавших от теплового шока ответ может быть включен, таких как продолжительность жизни. Уникальная способность соотносить молекулярные, клеточные и организмальные анализы теплового шока в морских элеганах оказалась неоценимой для понимания роли этого пути в развитии и болезни.

Research

JoVE Journal

Environment

Standardized Methods for Measuring Induction of the Heat Shock Response in Caenorhabditis elegans

Methods for Performing Crosses in Setaria viridis, a New Model System for the Grasses

Methods for Performing Crosses in Setaria viridis, a New Model System for the Grasses

Методы Выполнение Кресты в<em&gt; Setaria виридис</em&gt;, Система Новая модель для трав

Setaria viridis is an emerging model system for C4 grasses. It is closely related to the bioenergy feed stock switchgrass and the grain crop foxtail ...

A New Application of the Electrical Penetration Graph (EPG) for Acquiring and Measuring Electrical Signals in Phloem Sieve Elements

A New Application of the Electrical Penetration Graph EPG for Acquiring and Measuring Electrical Signals in Phloem Sieve Elements

Новое применение электрического проникновение график (EPG) на приобретение и измерения электрических сигналов в флоэмы сито элементов

Electrophysiological properties of cells are often studied in vitro, after dissociating them from their native environments. However, the study of ...

Methods of Soil Resampling to Monitor Changes in the Chemical Concentrations of Forest Soils

Методы почвенной ресэмпинга для мониторинга изменений в концентрации химического вещества лесных почв

Recent soils research has shown that important chemical soil characteristics can change in less than a decade, often the result of broad environmental ...

Data Processing Methods for 3D Seismic Imaging of Subsurface Volcanoes: Applications to the Tarim Flood Basalt

Методы обработки данных для 3D сейсмической томографии подповерхностных вулканов: приложения для базальта Таримской наводнение

The morphology and structure of plumbing systems can provide key information on the eruption rate and style of basalt lava fields. The most powerful way ...

Development of New Methods for Quantifying Fish Density Using Underwater Stereo-video Tools

Разработка новых методов для количественной оценки плотности рыбы с помощью подводного стерео видео инструменты

The use of video camera systems in ecological studies of fish continues to gain traction as a viable, non-extractive method of measuring fish lengths and ...

Methods for Image-based Surveys of Benthic Macroinvertebrates and Their Habitat Exemplified by the Drop Camera Survey for the Atlantic Sea Scallop

Методы для проведения обследований на основе образа бентических макробеспозвоночных и среды их обитания, подтверждается падение камеры обследования для Атлантический морской гребешок

Underwater imaging has long been used in the field of marine ecology but decreasing costs of high-resolution cameras and data storage have made the ...

Experimental Protocol for Examining Behavioral Response Profiles in Larval Fish: Application to the Neuro-stimulant Caffeine

Экспериментальный протокол для изучения поведенческих реакции профили в личинок рыб: Приложение к кофеину нейро стимулятор

Fish models and behaviors are increasingly used in the biomedical sciences; however, fish have long been the subject of ecological, physiological and ...

An Induction System for Clustered Stomata by Sugar Solution Immersion Treatment in Arabidopsis thaliana Seedlings

An Induction System for Clustered Stomata by Sugar Solution Immersion Treatment in Arabidopsis thaliana Seedlings

Индукционной системы для кластерных устьиц на лечение погружения раствора сахара в проростках Arabidopsis thaliana

Stomatal movement mediates plant gas exchange, which is essential for photosynthesis and transpiration. Stomatal opening and closing are accomplished by a ...

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

Высок объём Assay для прогнозирования химической токсичности путем автоматизированного фенотипические профилирование Caenorhabditis elegans

Applying toxicity testing of chemicals in higher order organisms, such as mice or rats, is time-consuming and expensive, due to their long lifespan and ...

Using Caenorhabditis elegans for Studying Trans- and Multi-Generational Effects of Toxicants

Using Caenorhabditis elegans for Studying Trans- and Multi-Generational Effects of Toxicants

Использование Elegans Caenorhabditis для изучения транс- и мульти-поколения эффекты токсичных веществ

Information about toxicities of chemicals are essential in their application and waste management. For chemicals at low concentrations, the long-term ...