Name: simultaneous quantification of selected kynurenines analyzed by liquid chromatography-mass spectrometry in medium collected from cancer cell cultures
Uploaded: 2020-05-09T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures at JoVE.

وقد دعم هذا العمل الاتحاد الأوروبي من صندوق التنمية الإقليمية الأوروبية في إطار تطوير البرنامج التنفيذي لبولندا الشرقية 2007-2013 (POPW.01.03.00-06-003/09-00)، من قبل كلية التكنولوجيا الحيوية والعلوم البيئية التابعة لجامعة جون بول الثانية الكاثوليكية في لوبلين (منحة العلماء الشباب لمنظمة إيلونا سادوك)، المركز البولندي الوطني للعلوم، OPUS13 (2017/25/B/NZ4/01198 لماغدالينا ستانيسزسكا، المحقق الرئيسي).  يشكر المؤلفون البروفيسور Agnieszka Ścibior من مختبر الأكسدة ، ومركز البحوث متعددة التخصصات ، JPII CUL لتقاسم المعدات لاستزراع الخلايا والتكميم البروتيني.

1. إعداد معيار 3NT، كين، 3HKyn، 3HAA، XA حلول الأسهم القياسية
<ol><li>وزن الكواشف في قارورة بأعلى دقة (0.3 ملغ لكل من الزّين). للحصول على دقة أفضل، وتوسيع نطاق الكواشف، وضبط حجم المذيب وفقا للخطوة 1.2.</li>
	<li>تذوب الكواشف في 300 ميكرولتر من المذيبات للحصول على محلول مخزون من 1 g/L. 3NT في 1٪ (v/v) حمض الفشكل (FA) في ال...

<ol>
	<li>Li, F., Zhang, R., Li, S., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IDO1:+an+import+ant+immunotherapy+target+in+cancer+treatment.">IDO1: an import ant immunotherapy target in cancer treatment.</a> International Immunopharmacology. 47, 70-77 (2017).</li><li>Heng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+role+of+the+kynurenine+pathway+in+human+breast+cancer+immunobiology.">Understanding the role of the kynurenine pathway in human breast cancer immunobiology.</a> Oncotarget. 7 (6), 6506-6520 (2015).</li><li>Badawy, A. A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kynurenine+pathway+and+human+systems.">Kynurenine pathway and human systems.</a> Experimental Gerontology. 129, (2020).</li><li>Chen, Y., Guillemin, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kynurenine+pathway+metabolites+in+humans:+Disease+and+healthy+states.">Kynurenine pathway metabolites in humans: Disease and healthy states.</a> International Journal of Tryptophan Research. 2 (1), 1-19 (2009).</li><li>Sathyasaikumar, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xanthurenic+Acid+Formation+from+3-Hydroxykynurenine+in+the+Mammalian+Brain:+Neurochemical+Characterization+and+Physiological+Effects.">Xanthurenic Acid Formation from 3-Hydroxykynurenine in the Mammalian Brain: Neurochemical Characterization and Physiological Effects.</a> Neuroscience. 367, 85-97 (2017).</li><li>Malina, H., Richter, C., Frueh, B., Hess, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lens+epithelial+cell+apoptosis+and+intracellular+Ca2++increasein+the+presence+of+xanthurenic+acid.">Lens epithelial cell apoptosis and intracellular Ca2+ increasein the presence of xanthurenic acid.</a> BMC Ophthalmology. 2, 1-7 (2002).</li><li>Col&#237;n-Gonz&#225;lez, A. L., Maldonado, P. D., Santamar&#237;a, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-Hydroxykynurenine:+an+intriguing+molecule+exerting+dual+actions+in+the+central+nervous+system.">3-Hydroxykynurenine: an intriguing molecule exerting dual actions in the central nervous system.</a> Neurotoxicology. 34, 189-204 (2013).</li><li>Xue, P., Fu, J., Zhou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+aryl+hydrocarbon+receptor+and+tumor+immunity.">The aryl hydrocarbon receptor and tumor immunity.</a> Frontiers in Immunology. 9 (286), 00286 (2018).</li><li>Tan, V. X., Guillemin, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kynurenine+pathway+metabolites+as+biomarkers+for+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Kynurenine pathway metabolites as biomarkers for amyotrophic lateral sclerosis.</a> Frontiers in Microbiology. 13 (1013), 1-11 (2019).</li><li>Wilding, J. L., Bodmer, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cell+lines+for+drug+discovery+and+development.">Cancer cell lines for drug discovery and development.</a> Cancer Research. 14 (40), 2377-2384 (2015).</li><li>Takikawa, O., Kuroiwa, T., Yamazaki, F., Kido, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+interferon-gamma+action.+Characterization+of+indoleamine+2,3-dioxygenase+in+cultured+human+cells+induced+by+interferon-gamma+and+evaluation+of+the+enzyme-mediated+tryptophan+degradation+in+its+anticellular+activity.">Mechanism of interferon-gamma action. Characterization of indoleamine 2,3-dioxygenase in cultured human cells induced by interferon-gamma and evaluation of the enzyme-mediated tryptophan degradation in its anticellular activity.</a> Journal of Biological Chemistry. 263 (4), 2041-2048 (1988).</li><li>Park, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indoleamine-2,3-dioxygenase+in+thyroid+cancer+cells+suppresses+natural+killer+cell+function+by+inhibiting+NKG2D+and+NKp46+expression+via+STAT+signaling+pathways.">Indoleamine-2,3-dioxygenase in thyroid cancer cells suppresses natural killer cell function by inhibiting NKG2D and NKp46 expression via STAT signaling pathways.</a> Journal of Clinical Medicine. 8 (6), 842-859 (2019).</li><li>Sadok, I., Gamian, A., Staniszewska, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatographic+analysis+of+tryptophan+metabolites.">Chromatographic analysis of tryptophan metabolites.</a> Journal of Separation Science. 40 (15), 3020-3045 (2017).</li><li>Fuertig, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC-MS/MS-based+quantification+of+kynurenine+metabolites,+tryptophan,+monoamines+and+neopterin+in+plasma,+cerebrospinal+fluid+and+brain.">LC-MS/MS-based quantification of kynurenine metabolites, tryptophan, monoamines and neopterin in plasma, cerebrospinal fluid and brain.</a> Bioanalysis. 8 (18), 1903-1917 (2016).</li><li>Marcos, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+tryptophan+and+tyrosine+metabolism+by+liquid+chromatography+tandem+mass+spectrometry.">Targeting tryptophan and tyrosine metabolism by liquid chromatography tandem mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography A. 1434, 91-101 (2016).</li><li>M&#246;ller, M., Du Preez, J., Harvey, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+validation+of+a+single+analytical+method+for+the+determination+of+tryptophan,+and+its+kynurenine+metabolites+in+rat+plasma.">Development and validation of a single analytical method for the determination of tryptophan, and its kynurenine metabolites in rat plasma.</a> Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in Biomedical Life Science. 898, 121-129 (2012).</li><li>Lesniak, W. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+quantification+of+tryptophan+and+its+major+metabolites.">Concurrent quantification of tryptophan and its major metabolites.</a> Analytical Biochemistry. 443 (2), 222-231 (2013).</li><li>Badawy, A. A. B., Morgan, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isocratic+liquid+chromatographic+separation+and+quantification+of+tryptophan+and+six+kynurenine+metabolites+in+biological+samples+with+ultraviolet+and+fluorimetric+detection.">Rapid isocratic liquid chromatographic separation and quantification of tryptophan and six kynurenine metabolites in biological samples with ultraviolet and fluorimetric detection.</a> International Journal of Tryptophan Research. 3, 175-186 (2010).</li><li>Vignau, J., Jacquemont, M. C., Lefort, A., Imbenotte, M., Lhermitte, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+tryptophan+and+kynurenine+in+serum+by+HPLC+with+UV+and+fluorescence+detection.">Simultaneous determination of tryptophan and kynurenine in serum by HPLC with UV and fluorescence detection.</a> Biomedical Chromatography. 18 (10), 872-874 (2004).</li><li>Zhang, A., Rijal, K., Ng, S. K., Ravid, K., Chitalia, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mass+spectrometric+method+for+quantification+of+tryptophan-derived+uremic+solutes+in+human+serum.">A mass spectrometric method for quantification of tryptophan-derived uremic solutes in human serum.</a> Journal of Biological Methods. 4 (3), 75 (2017).</li><li>Arnhard, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+validated+liquid+chromatography-high+resolution-tandem+mass+spectrometry+method+for+the+simultaneous+quantitation+of+tryptophan,+kynurenine,+kynurenic+acid,+and+quinolinic+acid+in+human+plasma.">A validated liquid chromatography-high resolution-tandem mass spectrometry method for the simultaneous quantitation of tryptophan, kynurenine, kynurenic acid, and quinolinic acid in human plasma.</a> Electrophoresis. 39 (9-10), 1171-1180 (2018).</li><li>Oh, J. S., Seo, H. S., Kim, K. H., Pyo, H., Chung, B. C., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+profiling+of+tryptophan+and+its+related+metabolites+in+patients+with+metabolic+syndrome+by+liquid+chromatography-electrospray+ionization/mass+spectrometry.">Urinary profiling of tryptophan and its related metabolites in patients with metabolic syndrome by liquid chromatography-electrospray ionization/mass spectrometry.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (23), 5501-5512 (2017).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+LC-MS/MS+method+for+determination+of+kynurenine+and+tryptophan+concentrations+in+human+plasma+from+HIV-infected+patients.">A simple LC-MS/MS method for determination of kynurenine and tryptophan concentrations in human plasma from HIV-infected patients.</a> Bioanalysis. 5 (11), 1397-1407 (2013).</li><li>Yamada, K., Miyazzaki, T., Shibata, T., Hara, N., Tsuchiya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+measurement+of+tryptophan+and+related+compounds+by+liquid+chromatography/electrospray+ionization+tandem+mass+spectrometry.">Simultaneous measurement of tryptophan and related compounds by liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in Biomedical and Life Sciences. 867 (1), 57-61 (2008).</li><li>Zhu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+profiling+of+tryptophan+metabolites+in+serum,+urine,+and+cell+culture+supernatants+by+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry.">Quantitative profiling of tryptophan metabolites in serum, urine, and cell culture supernatants by liquid chromatography-tandem mass spectrometry.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 401, 3249-3261 (2011).</li><li>Hashioka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics+analysis+implies+noninvolvement+of+the+kynurenine+pathway+neurotoxins+in+the+interferon-gamma-+induced+neurotoxicity+of+adult+human+astrocytes.">Metabolomics analysis implies noninvolvement of the kynurenine pathway neurotoxins in the interferon-gamma- induced neurotoxicity of adult human astrocytes.</a> Neuropsychiatry. 7 (2), (2017).</li><li>Sadok, I., Rachwa&#322;, K., Staniszewska, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+the+optimized+and+validated+LC-MS+method+for+simultaneous+quantification+of+tryptophan+metabolites+in+culture+medium+from+cancer+cells.">Application of the optimized and validated LC-MS method for simultaneous quantification of tryptophan metabolites in culture medium from cancer cells.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 176, 112805-112815 (2019).</li><li>Annesley, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+suppression+in+mass+spectrometry.">Ion suppression in mass spectrometry.</a> Clinical Chemistry. 49 (7), 1041-1044 (2003).</li><li>Hou&#233;e-L&#233;vin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+oxidative+modifications+of+tyrosine:+An+update+on+mechanisms+of+formation,+advances+in+analysis+and+biological+consequences.">Exploring oxidative modifications of tyrosine: An update on mechanisms of formation, advances in analysis and biological consequences.</a> Free Radical Research. 49 (4), 347-373 (2015).</li><li>Wei, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+Expression+of+Indoleamine+2,+3-Dioxygenase+in+Human+Recurrent+Miscarriage.">Abnormal Expression of Indoleamine 2, 3-Dioxygenase in Human Recurrent Miscarriage.</a> Reproductive Sciences. , (2019).</li><li>Liu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+indoleamine+2,3-dioxygenase+in+nasopharyngeal+carcinoma+impairs+the+cytolytic+function+of+peripheral+blood+lymphocytes.">Expression of indoleamine 2,3-dioxygenase in nasopharyngeal carcinoma impairs the cytolytic function of peripheral blood lymphocytes.</a> BMC Cancer. 9, 416 (2009).</li><li>Mailankot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indoleamine+2,3-dioxygenase+overexpression+causes+kynurenine-modification+of+proteins,+fiber+cell+apoptosis+and+cataract+formation+in+the+mouse+lens.">Indoleamine 2,3-dioxygenase overexpression causes kynurenine-modification of proteins, fiber cell apoptosis and cataract formation in the mouse lens.</a> Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 89 (5), 498-512 (2009).</li></ol>

هذه الورقة يعرض بروتوكول مفصل LC-SQ للقياس الكمي المتزامن من أربعة الأيض Trp الرئيسية (3HKyn, Kyn, 3HAA, XA) التي تقاس في وسط من الخلايا السرطانية البشرية في المختبر. ويولى اهتمام خاص لإعداد العينات، وإجراء قياس الطيف الكروماتوغرافي/الكتلة، وتفسير البيانات، وأهم النقاط في التحليل.
<p class="jove_content...

مسار الكينيرينين (KP) هو الطريق الرئيسي للتريبتوفان (Trp) تقويض في الخلايا البشرية. إندولام-2،3-ديوكسيجيناز (IDO-1) في الخلايا خارج الكبد هو أول والحد من إنزيم KP ويحول Trp إلى N-formylkynurenine1. خطوات أخرى داخل KP توليد الأيض الثانوية الأخرى, وهي الكينيرينين التي تحمل خصائص بيولوجية مختلفة. Kynurenine (Kyn) هو أول ثابت Trp مستقرة تظهر الخصائص السامة وتنظيم الأحداث الخلوية بعد ربط لمستقبلات الهيدروكربونات آرل (AhR)2. في وقت لاحق, يتم تحويل كين إلى عدة جزيئات إما تلقائيا أو في العمليات التي تتوسطها انزيم, توليد هذه الأيضات مثل 3-هيدروكسيكينرينين (3HKyn), حمض الجمرة الخبيثة (AA), 3-حمض هيدروكسيانثانليك (3-ها)، حمض الكيونريك (كينا), وحمض xanthurenic (XA). آخر المستقلب المصب، 2-أمينو-3-الكربوكبوكيكونيك حمض-6-شبهالديهيد (ACMS)، يخضع للدراجات غير الانزيمية إلى حمض الكينولينيك (QA) أو حمض بيكولينيك (السلطة الفلسطينية)1. وأخيرا، يتم تحويل المزيد من QA إلى نيكوتيناميد أدينين دينوكليوتيد (NAD+)3، وهو المستقلب نقطة نهاية KP الذي هو عامل مساعد انزيم مهم. بعض الكيرينينات لها خصائص اعصاب مثل كينا والسلطة الفلسطينية، في حين أن الآخرين، أي 3HAA و 3HKyn، هي سامة4. حمض Xanthurenic، الذي يتكون من 3HKyn، ويعرض خصائص مضادات الأكسدة و vasorelaxation5. XA يتراكم في العدسات الشيخوخة ويؤدي إلى موت الخلايا الظهاريةللخلايا الظهارية 6. اكتسبت KP، التي تم وصفها في منتصف القرنالعشرين، المزيد من الاهتمام عندما تم إثبات مشاركتها في اضطرابات مختلفة. زيادة نشاط هذا الطريق الأيضي وتراكم بعض الكينيرينات تعدل الاستجابة المناعية وترتبط مع ظروف مرضية مختلفة مثل الاكتئاب، الفصام، اعتلال الدماغ، فيروس نقص المناعة البشرية، الخرف، التصلب الجانبي الضموري، الملاريا، الزهايمر، مرض هنتنغتون، والسرطان4،7. ويلاحظ بعض التغيرات في التمثيل الغذائي Trp في microenonments الورم والخلايا السرطانية2,8. وعلاوة على ذلك، تعتبر الكينيرينينات علامات المرضالواعدة 9. في أبحاث السرطان، نماذج ثقافة الخلايا في المختبر راسخة وتستخدم على نطاق واسع لتقييم ما قبل الكلينيكي من الردود على العقاقير مكافحة السرطان10. ويفرز الأيض Trp من قبل الخلايا في الوسط ثقافة ويمكن قياسها لتقييم حالة مسار الكينيرينين. ولذلك، هناك حاجة إلى تطوير طرق مناسبة للكشف المتزامن عن أكبر عدد ممكن من نواتج الأيض في النماذج البيولوجية في مجموعة متنوعة من العينات البيولوجية مع بروتوكول سهل ومرن وموثوق به.
في هذه الورقة، نحن وصف بروتوكول لتحديد المتزامنة من أربعة الأيض المسار الكينيرينين: كين، 3HKyn، 3HAA، وXA من قبل LC-SQ في وسط ما بعد الثقافة التي تم جمعها من الخلايا السرطانية. في نهج تحليلي حديث، الكروماتوغرافيا السائل13،14،15،16 ويفضل للكشف في وقت واحد وتكميم من المستقلين التربتوفان الأيض، على النقيض من البيوكيميائية غير محدد مقولات استخدام كاشف Ehrlich11،12. في الوقت الحاضر، هناك العديد من الطرق المتاحة لتحديد الكينيرينين في العينات البشرية، تقوم أساسا على الكروماتوغرافيا السائلة مع الأشعة فوق البنفسجية أو للكشف عن الفلوريسين13،17،18،19. يبدو اللوني السائل مقرونًا بمستشعر لقياس الطيف الكتلي (LC-MS) أكثر ملاءمة لهذا النوع من التحليل ، نظرًا لحساسية أعلى (حدود أقل للكشف) والانتقائية والتكرار.
وقد تم بالفعل تحديد الأيض Trp في مصل الدم البشري والبلازما والبول13،20،21،22،23، ومع ذلك ، فإن أساليب العينات البيولوجية الأخرى ، مثل خلية ثقافة المتوسطة هي أيضا المطلوب. سابقا، LC-MS كانت تستخدم للمركبات المشتقة من Trp في وسط جمعت بعد زراعة خلايا الورم الدبقي البشري، monocytes، الخلايا التشعبية أو الخلايا الفلكية تعامل مع انترفيرون غاما (IFN-γ)24،25،26. حاليا, هناك حاجة لبروتوكولات جديدة التحقق من صحة التي يمكن أن تسمح بإجراء تقييم للعديد من الأيضات في وسائل الإعلام المختلفة الثقافة, الخلايا, والعلاجات المستخدمة في نماذج السرطان.
والغرض من الطريقة المتقدمة هو تحديد (في غضون عملية تحليلية واحدة) أربعة الكينيرينينات الرئيسية التي يمكن أن تشير إلى تشوهات في KP. قدمت هنا هي الخطوات الحاسمة من بروتوكولنا نشرت مؤخرا لتحليل LC-SQ الكمية من kynurenines المحددة ذات مغزى باستخدام معيار داخلي واحد (3-نيتروتروروسين، 3NT) في المتوسطة التي تم جمعها من الخلايا السرطانية البشرية في المختبر مثقف27. على حد علمنا، هو أول بروتوكول LC-SQ لتحديد كمية 3HKyn في وقت واحد، 3HAA، كين وXA في وسط الثقافة التي تم الحصول عليها من الخلايا التي تزرع في المختبر. عند بعض التعديلات، قد يتم تطبيق طريقة مزيد من لدراسة التغييرات في التمثيل الغذائي Trp في مجموعة أوسع من نماذج ثقافة الخلية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1360px;" width="1359">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">3-hydroksy-DL-kynurenina</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:261px;">H1771</td>
			<td style="width:513px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3-hydroxyanthranilic acid</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:261px;">148776</td>
			<td>97%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">3-nitro-L-tyrosine</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:261px;">N7389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:175px;">Supelco</td>
			<td>1.00029</td>
			<td>hypergrade for LC-MS LiChrosolv</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Activated charcoal</td>
			<td style="width:175px;">Supelco</td>
			<td>05105</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Analytical balance</td>
			<td style="width:175px;">Ohaus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:411px;">Analytical column</td>
			<td style="width:175px;">Agilent Technologies</td>
			<td>959764-902</td>
			<td>Zorbax Eclipse Plus C18 rapid resolution HT (2.1 x 100 mm, 1.8 &#181;m)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium formate</td>
			<td style="width:175px;">Supelco</td>
			<td style="width:261px;">7022</td>
			<td>eluent additive for LC-MS, LiChropur, &#8805;99.0%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td>1001887398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Caps for chromatographic vials</td>
			<td style="width:175px;">Agilent Technologies</td>
			<td>5185-5820</td>
			<td>blue screw caps,PTFE/red sil sepa</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell culture dish</td>
			<td style="width:175px;">Nest</td>
			<td>704004</td>
			<td>polystyrene, non-pyrogenic, sterile</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell culture plate</td>
			<td style="width:175px;">Biologix</td>
			<td>07-6012</td>
			<td>12-well, non-pyrogenic, non-cytoxic, sterille</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>HERAcell 150i Cu</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:175px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:261px;"></td>
			<td>model 5415R</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:175px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:261px;"></td>
			<td>model 5428</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge tubes</td>
			<td style="width:175px;">Bionovo</td>
			<td>B-2278</td>
			<td>Eppendorf type, 1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge tubes</td>
			<td style="width:175px;">Bionovo</td>
			<td>B-3693</td>
			<td>Falcon type, 50 mL, PP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chromatographic data acqusition and analysis software</td>
			<td style="width:175px;">Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>LC/MSD ChemStation (B.04.03-S92)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chromatographic insert vials</td>
			<td style="width:175px;">Agilent Technologies</td>
			<td>9301-1387</td>
			<td>100 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chromatographic vials</td>
			<td style="width:175px;">Agilent Technologies</td>
			<td>5182-0714</td>
			<td>2 mL, clear glass</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:175px;">Supelco</td>
			<td style="width:261px;">1.02950</td>
			<td>Uvasol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Dubelcco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:175px;">PAN Biotech</td>
			<td>P04-41450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Dual meter pH/conductivity</td>
			<td style="width:175px;">Mettler Toledo</td>
			<td style="width:261px;"></td>
			<td>SevenMulti</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Evaporator</td>
			<td style="width:175px;">Genevac</td>
			<td style="width:261px;"></td>
			<td>model EZ-2.3 Elite</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Formic acid</td>
			<td style="width:175px;">Supelco</td>
			<td style="width:261px;">5.33002</td>
			<td>for LC-MS LiChropur</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Glass bottle for reagents storage</td>
			<td style="width:175px;">Bionovo</td>
			<td>S-2070</td>
			<td>50 mL, clear glass</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Guard column</td>
			<td style="width:175px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:261px;">959757-902</td>
			<td>Zorbax Eclipse Plus-C18 Narrow Bore Guard Column (2.1 x 12.5 mm, 5 &#181;m)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:175px;">Merck</td>
			<td>1.00317.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">L-kynurenine</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:261px;">K8625</td>
			<td>&#8805;98% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Magnetic stirrer</td>
			<td style="width:175px;">Wigo</td>
			<td style="width:261px;"></td>
			<td>ES 21 H</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microbalance</td>
			<td style="width:175px;">Mettler Toledo</td>
			<td></td>
			<td>model XP6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Milli-Q system</td>
			<td style="width:175px;">Millipore</td>
			<td>ZRQSVPO30</td>
			<td>Direct-Q 3 UV with Pump</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Quadrupole mass spectrometer</td>
			<td style="width:175px;">Agilent Technologies</td>
			<td>G1948B</td>
			<td>model 6120</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Adrich</td>
			<td>048M4874V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plate reader</td>
			<td style="width:175px;">Bio Tek</td>
			<td></td>
			<td>Synergy 2 operated by Gen5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:175px;">Merck</td>
			<td>1.04936.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td style="width:175px;">Merck</td>
			<td>1.05108.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protein Assay Dye Reagent Concentrate</td>
			<td style="width:175px;">BioRad</td>
			<td>500-0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">See-saw rocker</td>
			<td style="width:175px;">Stuart</td>
			<td>SSL4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Serological pipette</td>
			<td style="width:175px;">Nest</td>
			<td>326001</td>
			<td>5 mL, polystyrene, non-pyrogenic, sterile</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:261px;">7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:175px;">Merck</td>
			<td>1.06346.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Solvent inlet filter</td>
			<td style="width:175px;">Agilent Technologies</td>
			<td>5041-2168</td>
			<td>glass filter, 20 &#956;m pore size</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Solvent reservoir (for LC-MS)</td>
			<td style="width:175px;">Agilent Technologies</td>
			<td>9301-6524</td>
			<td>1 L, clear glass</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Solvent reservoir (for LC-MS)</td>
			<td style="width:175px;">Agilent Technologies</td>
			<td>9301-6526</td>
			<td>1 L, amber glass</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spreadsheet program</td>
			<td style="width:175px;">Microsoft Office</td>
			<td></td>
			<td>Microsoft Office Excel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stir bar</td>
			<td style="width:175px;">Bionovo</td>
			<td>6-2003</td>
			<td>teflon coated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Syringe filters for culture medium filtration</td>
			<td style="width:175px;">Bionovo</td>
			<td>7-8803</td>
			<td>regenerated cellulose, &#216; 30 mm, 0,45 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Syringe filters for mobile phase components filtration</td>
			<td style="width:175px;">Bionovo</td>
			<td>6-0018</td>
			<td>nylon, &#216; 30 mm, 0,22 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue culture plates</td>
			<td style="width:175px;">VWR</td>
			<td>10062-900</td>
			<td>96-wells, sterille</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA Solution</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrih</td>
			<td>T4049-100 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:411px;">Ultra-High Performance Liquid Chromatography system</td>
			<td style="width:175px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:261px;">G1367D, G1379B, G1312B, G1316C</td>
			<td style="width:513px;">1200 Infinity system consisted of autosampler (G1367D), degasser (G1379B), binary pump (G1312B), column thermostat (G1316C)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultrasound bath</td>
			<td>Polsonic</td>
			<td>104533</td>
			<td>model 6D</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vortex</td>
			<td>Biosan</td>
			<td></td>
			<td>model V-1 plus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Xanthurenic acid</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:261px;">D120804</td>
			<td>96%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous quantification of selected kynurenines analyzed by liquid chromatography-mass spectrometry in medium collected from cancer cell cultures

وقد تلقى مسار الكينيرينين والانتبولات التربتوفان دعا kynurenines زيادة الاهتمام لمشاركتها في تنظيم المناعة وبيولوجيا السرطان. وغالبا ما تستخدم في المختبر خلية الخلية المقايسة لمعرفة المزيد عن مساهمة مختلف نواتج التريبتوفان في آلية المرض ولاختبار الاستراتيجيات العلاجية. خلية ثقافة المتوسطة التي هي غنية في المستقلبات السرية وجزيئات الإشارات يعكس حالة الأيض التربتوفان وغيرها من الأحداث الخلوية. بروتوكولات جديدة لتحديد موثوق بها من الكينيرينينات متعددة في المتوسطة خلية معقدة ثقافة مطلوبة للسماح لتحليل موثوق وسريع من عينات متعددة. ويمكن تحقيق ذلك باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة مقرونة بمنظار الطيف الكتلي. وتستخدم هذه التقنية القوية في العديد من المختبرات السريرية والبحثية من أجل القياس الكمي من المستقلبات ويمكن استخدامها لقياس الكينيرينينات.
هنا هو استخدام الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب الطيف الطيفي كتلة رباعية واحدة (LC-SQ) لتحديد في وقت واحد من أربعة kynurenines، أي، الكيونرينين، 3-هيدروكسيكي نيورينرينين، 3-هيدروكسيانثرانليك، وحمض xanthurenic في المتوسطة التي تم جمعها من الخلايا السرطانية في المختبر. SQ كاشف بسيط للاستخدام وأقل تكلفة بالمقارنة مع مطياف كتلة أخرى. في تحليل SQ-MS، يتم إنشاء أيونات متعددة من العينة وفصلها وفقًا لنسبة الكتلة إلى الشحنة المحددة(m/z)، متبوعة بالكشف باستخدام وضع مراقبة الأيونات الواحدة (SIM).
وتسترعي هذه الورقة الانتباه إلى مزايا الطريقة المبلغ عنها وتشير إلى بعض نقاط الضعف. وهو يركز على العناصر الحاسمة لتحليل LC-SQ بما في ذلك إعداد العينة جنبا إلى جنب مع تحليل الكروماتوغرافيا وقياس الطيف الكتلي. كما تناقش مراقبة الجودة، وظروف معايرة الأسلوب، وقضايا تأثير المصفوفة. وصفنا تطبيق بسيط من 3-نيتروتروروسين كمعيار واحد التناظرية لجميع التحليلات المستهدفة. وكما أكدت التجارب التي أجريت على خلايا سرطان المبيض والثدي، فإن الطريقة المقترحة من LC-SQ تولد نتائج موثوقة ويمكن تطبيقها كذلك على النماذج الخلوية المختبرية الأخرى.

LC-MS يقدم مزايا لا جدال فيها في القياس الكمي للجزيئات النشطة بيولوجيا، على الرغم من أن بعض مكونات العينات المعقدة تسبب ما يسمى آثار المصفوفة وتئينات حل وسط من التحليلات. وهو يؤدي إلى قمع الأيونات أو تعزيز أيون، وتناقص دقة بقوة، وتؤثر على حد من الكشف /الكم من LC-MS، والتي تعتبر نقطة ''ضعيفة' من ا?...

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures at JoVE.

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

وصف هنا هو بروتوكول لتحديد أربعة الأيضات التربتوفان مختلفة ولدت في مسار الكينارينين (الكينارينين، 3-هيدروكسيكينورين، حمض زانثيورينيك، 3-حمض هيدروكسيانثرانياليك) في الوسط الذي تم جمعه من الثقافات الخلايا السرطانية تحليلها بواسطة الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب واحد رباعية الطيف الكتلي.

القياس الكمي المتزامن لـ Kynurenines المختارة التي تم تحليلها بواسطة الكروماتوغرافيا السائلة- القياس الطيفي الكتلي في المتوسط الذي تم جمعه من ثقافات الخلايا السرطانية

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

الخلوية لاستخراج الدهن المستهدفة التخفيف النظائر المستقرة تحليل السائل الطيف اللوني القداس

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry

التصوير من الأنسجة البيولوجية بواسطة الامتزاز Electrospray التأين الطيف الكتلي

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological ...

Shock Wave Application to Cell Cultures

صدمة الموجة التطبيق إلى الخلية الثقافات

Shock waves nowadays are well known for their regenerative effects. Basic research findings showed that shock waves do cause a biological stimulus to ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

الكمي لالعالمي الانبساطي وظيفة عن طريق تحليل يستند النمذجة-الحركية من Transmitral التدفق عبر الشكلية ملء Parametrized الانبساطي

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Sample Preparation Strategies for Mass Spectrometry Imaging of 3D Cell Culture Models

عينة استراتيجيات التحضير للتصوير الطيف الكتلي لل3D الثقافة خلية نماذج

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with ...

Generation of Scalable, Metallic High-Aspect Ratio Nanocomposites in a Biological Liquid Medium

جيل من تحجيم، لامع عالية الارتفاع Nanocomposites نسبة في البيولوجية السائل المتوسطة

The goal of this protocol is to describe the synthesis of two novel biocomposites with high-aspect ratio structures. The biocomposites consist of copper ...

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

الآلي الجمعية معالجة السائل الروبوتية أجهزة وحدات الحمض النووي

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

Synthesis of Biocompatible Liquid Crystal Elastomer Foams as Cell Scaffolds for 3D Spatial Cell Cultures

توليف حيويا الكريستال السائل المرنة كسوات كما السقالات الخليوي لزراعات الخلايا 3D المكانية

Here, we present a step-by-step preparation of a 3D, biodegradable, foam-like cell scaffold. These scaffolds were prepared by cross-linking star block ...

Production of Genetically Engineered Golden Syrian Hamsters by Pronuclear Injection of the CRISPR/Cas9 Complex

إنتاج الهامستر السوري الذهبي المهندسة وراثيا عن طريق الحقن برونوكلير من مجمع كريسبر/Cas9

The pronuclear (PN) injection technique was first established in mice to introduce foreign genetic materials into the pronuclei of one-cell stage embryos. ...

A Microcontroller Operated Device for the Generation of Liquid Extracts from Conventional Cigarette Smoke and Electronic Cigarette Aerosol

متحكم يعمل الجهاز لتوليد السائل مقتطفات من الهباء الجوي السجائر الإلكترونية ودخان السجائر التقليدية

Electronic cigarettes are the most popular tobacco product among middle and high schoolers and are the most popular alternative tobacco product among ...