Name: simultaneous quantification of selected kynurenines analyzed by liquid chromatography-mass spectrometry in medium collected from cancer cell cultures
Uploaded: 2020-05-09T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures at JoVE.

Bu çalışma, Doğu Polonya Operasyonel Programı Geliştirme 2007-2013 (POPW.01.03.00-06-003/09-09-00) kapsamında Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu'ndan Avrupa Birliği tarafından, Lublin John Paul II Katolik Üniversitesi Biyoteknoloji ve Çevre Bilimleri Fakültesi (Ilona Sadok için Genç Bilim adamları hibesi), Polonya Ulusal Bilim Merkezi tarafından desteklendi. OPUS13 (2017/25/B/NZ4/01198 Magdalena Staniszewska, İlke Araştırmacısı).  Yazarlar, hücre kültleme ve protein nicelleştirme ekipmanlarını paylaştığı için Oksidatif Stres Laboratuvarı, Disiplinlerarası Araştırma Merkezi, JPII CUL'dan Prof. Agnieszka Ścibior'a teşekkür ediyor.

1. Standart 3NT, Kyn, 3HKyn, 3HAA, XA standart stok çözümlerinin hazırlanması
<ol><li>Reaktifleri bir şişede en yüksek doğrulukta (her biri 0,3 mg) tartın. Daha iyi doğruluk için, çözücünün hacmini adım 1.2'ye göre ayarlayarak reaktifleri ölçeklendirin.</li>
	<li>1 g/L stok çözeltisi elde etmek için çözücünün 300 μL'sinde reaktifleri çözün. Dimetil sülfitte (DMSO) Kyn, 3HAA ve XA; Hidroklorik asit (HCl) ile pH 2.5'e asitlenmiş suda 3HKyn. DİkKAT: 3HAA gözleri, burnu, boğazı ve ...

<ol>
	<li>Li, F., Zhang, R., Li, S., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IDO1:+an+import+ant+immunotherapy+target+in+cancer+treatment.">IDO1: an import ant immunotherapy target in cancer treatment.</a> International Immunopharmacology. 47, 70-77 (2017).</li><li>Heng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+role+of+the+kynurenine+pathway+in+human+breast+cancer+immunobiology.">Understanding the role of the kynurenine pathway in human breast cancer immunobiology.</a> Oncotarget. 7 (6), 6506-6520 (2015).</li><li>Badawy, A. A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kynurenine+pathway+and+human+systems.">Kynurenine pathway and human systems.</a> Experimental Gerontology. 129, (2020).</li><li>Chen, Y., Guillemin, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kynurenine+pathway+metabolites+in+humans:+Disease+and+healthy+states.">Kynurenine pathway metabolites in humans: Disease and healthy states.</a> International Journal of Tryptophan Research. 2 (1), 1-19 (2009).</li><li>Sathyasaikumar, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xanthurenic+Acid+Formation+from+3-Hydroxykynurenine+in+the+Mammalian+Brain:+Neurochemical+Characterization+and+Physiological+Effects.">Xanthurenic Acid Formation from 3-Hydroxykynurenine in the Mammalian Brain: Neurochemical Characterization and Physiological Effects.</a> Neuroscience. 367, 85-97 (2017).</li><li>Malina, H., Richter, C., Frueh, B., Hess, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lens+epithelial+cell+apoptosis+and+intracellular+Ca2++increasein+the+presence+of+xanthurenic+acid.">Lens epithelial cell apoptosis and intracellular Ca2+ increasein the presence of xanthurenic acid.</a> BMC Ophthalmology. 2, 1-7 (2002).</li><li>Col&#237;n-Gonz&#225;lez, A. L., Maldonado, P. D., Santamar&#237;a, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-Hydroxykynurenine:+an+intriguing+molecule+exerting+dual+actions+in+the+central+nervous+system.">3-Hydroxykynurenine: an intriguing molecule exerting dual actions in the central nervous system.</a> Neurotoxicology. 34, 189-204 (2013).</li><li>Xue, P., Fu, J., Zhou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+aryl+hydrocarbon+receptor+and+tumor+immunity.">The aryl hydrocarbon receptor and tumor immunity.</a> Frontiers in Immunology. 9 (286), 00286 (2018).</li><li>Tan, V. X., Guillemin, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kynurenine+pathway+metabolites+as+biomarkers+for+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Kynurenine pathway metabolites as biomarkers for amyotrophic lateral sclerosis.</a> Frontiers in Microbiology. 13 (1013), 1-11 (2019).</li><li>Wilding, J. L., Bodmer, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cell+lines+for+drug+discovery+and+development.">Cancer cell lines for drug discovery and development.</a> Cancer Research. 14 (40), 2377-2384 (2015).</li><li>Takikawa, O., Kuroiwa, T., Yamazaki, F., Kido, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+interferon-gamma+action.+Characterization+of+indoleamine+2,3-dioxygenase+in+cultured+human+cells+induced+by+interferon-gamma+and+evaluation+of+the+enzyme-mediated+tryptophan+degradation+in+its+anticellular+activity.">Mechanism of interferon-gamma action. Characterization of indoleamine 2,3-dioxygenase in cultured human cells induced by interferon-gamma and evaluation of the enzyme-mediated tryptophan degradation in its anticellular activity.</a> Journal of Biological Chemistry. 263 (4), 2041-2048 (1988).</li><li>Park, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indoleamine-2,3-dioxygenase+in+thyroid+cancer+cells+suppresses+natural+killer+cell+function+by+inhibiting+NKG2D+and+NKp46+expression+via+STAT+signaling+pathways.">Indoleamine-2,3-dioxygenase in thyroid cancer cells suppresses natural killer cell function by inhibiting NKG2D and NKp46 expression via STAT signaling pathways.</a> Journal of Clinical Medicine. 8 (6), 842-859 (2019).</li><li>Sadok, I., Gamian, A., Staniszewska, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatographic+analysis+of+tryptophan+metabolites.">Chromatographic analysis of tryptophan metabolites.</a> Journal of Separation Science. 40 (15), 3020-3045 (2017).</li><li>Fuertig, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC-MS/MS-based+quantification+of+kynurenine+metabolites,+tryptophan,+monoamines+and+neopterin+in+plasma,+cerebrospinal+fluid+and+brain.">LC-MS/MS-based quantification of kynurenine metabolites, tryptophan, monoamines and neopterin in plasma, cerebrospinal fluid and brain.</a> Bioanalysis. 8 (18), 1903-1917 (2016).</li><li>Marcos, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+tryptophan+and+tyrosine+metabolism+by+liquid+chromatography+tandem+mass+spectrometry.">Targeting tryptophan and tyrosine metabolism by liquid chromatography tandem mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography A. 1434, 91-101 (2016).</li><li>M&#246;ller, M., Du Preez, J., Harvey, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+validation+of+a+single+analytical+method+for+the+determination+of+tryptophan,+and+its+kynurenine+metabolites+in+rat+plasma.">Development and validation of a single analytical method for the determination of tryptophan, and its kynurenine metabolites in rat plasma.</a> Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in Biomedical Life Science. 898, 121-129 (2012).</li><li>Lesniak, W. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+quantification+of+tryptophan+and+its+major+metabolites.">Concurrent quantification of tryptophan and its major metabolites.</a> Analytical Biochemistry. 443 (2), 222-231 (2013).</li><li>Badawy, A. A. B., Morgan, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isocratic+liquid+chromatographic+separation+and+quantification+of+tryptophan+and+six+kynurenine+metabolites+in+biological+samples+with+ultraviolet+and+fluorimetric+detection.">Rapid isocratic liquid chromatographic separation and quantification of tryptophan and six kynurenine metabolites in biological samples with ultraviolet and fluorimetric detection.</a> International Journal of Tryptophan Research. 3, 175-186 (2010).</li><li>Vignau, J., Jacquemont, M. C., Lefort, A., Imbenotte, M., Lhermitte, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+tryptophan+and+kynurenine+in+serum+by+HPLC+with+UV+and+fluorescence+detection.">Simultaneous determination of tryptophan and kynurenine in serum by HPLC with UV and fluorescence detection.</a> Biomedical Chromatography. 18 (10), 872-874 (2004).</li><li>Zhang, A., Rijal, K., Ng, S. K., Ravid, K., Chitalia, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mass+spectrometric+method+for+quantification+of+tryptophan-derived+uremic+solutes+in+human+serum.">A mass spectrometric method for quantification of tryptophan-derived uremic solutes in human serum.</a> Journal of Biological Methods. 4 (3), 75 (2017).</li><li>Arnhard, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+validated+liquid+chromatography-high+resolution-tandem+mass+spectrometry+method+for+the+simultaneous+quantitation+of+tryptophan,+kynurenine,+kynurenic+acid,+and+quinolinic+acid+in+human+plasma.">A validated liquid chromatography-high resolution-tandem mass spectrometry method for the simultaneous quantitation of tryptophan, kynurenine, kynurenic acid, and quinolinic acid in human plasma.</a> Electrophoresis. 39 (9-10), 1171-1180 (2018).</li><li>Oh, J. S., Seo, H. S., Kim, K. H., Pyo, H., Chung, B. C., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+profiling+of+tryptophan+and+its+related+metabolites+in+patients+with+metabolic+syndrome+by+liquid+chromatography-electrospray+ionization/mass+spectrometry.">Urinary profiling of tryptophan and its related metabolites in patients with metabolic syndrome by liquid chromatography-electrospray ionization/mass spectrometry.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (23), 5501-5512 (2017).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+LC-MS/MS+method+for+determination+of+kynurenine+and+tryptophan+concentrations+in+human+plasma+from+HIV-infected+patients.">A simple LC-MS/MS method for determination of kynurenine and tryptophan concentrations in human plasma from HIV-infected patients.</a> Bioanalysis. 5 (11), 1397-1407 (2013).</li><li>Yamada, K., Miyazzaki, T., Shibata, T., Hara, N., Tsuchiya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+measurement+of+tryptophan+and+related+compounds+by+liquid+chromatography/electrospray+ionization+tandem+mass+spectrometry.">Simultaneous measurement of tryptophan and related compounds by liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in Biomedical and Life Sciences. 867 (1), 57-61 (2008).</li><li>Zhu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+profiling+of+tryptophan+metabolites+in+serum,+urine,+and+cell+culture+supernatants+by+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry.">Quantitative profiling of tryptophan metabolites in serum, urine, and cell culture supernatants by liquid chromatography-tandem mass spectrometry.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 401, 3249-3261 (2011).</li><li>Hashioka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics+analysis+implies+noninvolvement+of+the+kynurenine+pathway+neurotoxins+in+the+interferon-gamma-+induced+neurotoxicity+of+adult+human+astrocytes.">Metabolomics analysis implies noninvolvement of the kynurenine pathway neurotoxins in the interferon-gamma- induced neurotoxicity of adult human astrocytes.</a> Neuropsychiatry. 7 (2), (2017).</li><li>Sadok, I., Rachwa&#322;, K., Staniszewska, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+the+optimized+and+validated+LC-MS+method+for+simultaneous+quantification+of+tryptophan+metabolites+in+culture+medium+from+cancer+cells.">Application of the optimized and validated LC-MS method for simultaneous quantification of tryptophan metabolites in culture medium from cancer cells.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 176, 112805-112815 (2019).</li><li>Annesley, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+suppression+in+mass+spectrometry.">Ion suppression in mass spectrometry.</a> Clinical Chemistry. 49 (7), 1041-1044 (2003).</li><li>Hou&#233;e-L&#233;vin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+oxidative+modifications+of+tyrosine:+An+update+on+mechanisms+of+formation,+advances+in+analysis+and+biological+consequences.">Exploring oxidative modifications of tyrosine: An update on mechanisms of formation, advances in analysis and biological consequences.</a> Free Radical Research. 49 (4), 347-373 (2015).</li><li>Wei, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+Expression+of+Indoleamine+2,+3-Dioxygenase+in+Human+Recurrent+Miscarriage.">Abnormal Expression of Indoleamine 2, 3-Dioxygenase in Human Recurrent Miscarriage.</a> Reproductive Sciences. , (2019).</li><li>Liu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+indoleamine+2,3-dioxygenase+in+nasopharyngeal+carcinoma+impairs+the+cytolytic+function+of+peripheral+blood+lymphocytes.">Expression of indoleamine 2,3-dioxygenase in nasopharyngeal carcinoma impairs the cytolytic function of peripheral blood lymphocytes.</a> BMC Cancer. 9, 416 (2009).</li><li>Mailankot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indoleamine+2,3-dioxygenase+overexpression+causes+kynurenine-modification+of+proteins,+fiber+cell+apoptosis+and+cataract+formation+in+the+mouse+lens.">Indoleamine 2,3-dioxygenase overexpression causes kynurenine-modification of proteins, fiber cell apoptosis and cataract formation in the mouse lens.</a> Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 89 (5), 498-512 (2009).</li></ol>

Bu makale, in vitro kültürlü insan kanser hücrelerinden bir ortamda ölçülen dört ana Trp metabolitinin (3HKyn, Kyn, 3HAA, XA) eşzamanlı nicelemesi için ayrıntılı bir LC-SQ protokolü sunun. Analizdeki en önemli noktalar olan numune hazırlama, kromatografik/kütle spektrometresi prosedürü ve veri yorumlamaya özel önem verilir.
Genel olarak, LC-MS analizi, yüksek hassasiyet nedeniyle, kullanılan malzemelerin protokol katılığı ve saflığının en yüksek standa...

Kynurenine pathway (KP), insan hücrelerinde triptofan (Trp) katabolizmanın ana yoludur. Ekstrahepatik hücrelerde indoleamin-2,3-dioksijenaz (IDO-1) KP'nin ilk ve sınırlayıcı enzimidir ve Trp'yi N-formilkynurenine1'edönüştürür. KP içindeki diğer adımlar, diğer ikincil metabolitleri, yani çeşitli biyolojik özellikler gösteren kynureninleri oluşturur. Kynurenine (Kyn), aryl hidrokarbon reseptörüne (AhR) bağlandıktan sonra toksik özellikleri gösteren ve hücresel olayları düzenleyen ilk kararlı Trp katabolitidir2. Daha sonra, Kyn kendiliğinden veya enzim aracılı süreçlerde çeşitli moleküllere dönüştürülür ve 3-hidroksiynurenine (3HKyn), antranilik asit (AA), 3-hidroksiranilik asit (3-HAA), kynurenic asit (Kyna) ve ksantürenik asit (XA) gibi metabolitler üretir. Başka bir downstream metabolit, 2-amino-3-karboksimonik asit-6-semialdehit (ACMS), kinolinik asit (QA) veya pikolinik asit (PA)1için enzimatik olmayan siklizyon geçirir. Son olarak, QA ayrıca nikotinamid-adenin dinükleotid (NAD+)3, önemli bir enzim kofaktörü olan KP uç nokta metabolitine dönüştürülür. Bazı kynureninler Kyna ve PA gibi nöroprotektif özelliklere sahipken, diğerleri, yani 3HAA ve 3HKyn,toksiktir 4. 3HKyn'den oluşan ksanturenik asit antioksidan ve vasorelaksasyon özellikleri sunar5. XA yaşlanma lenslerinde birikir ve epitel hücrelerinin apoptozlanmasına yol açar6. 20. yüzyılın ortalarında tanımlanan KP, çeşitli bozukluklara katılımı gösterildiğinde daha fazla ilgi gördü. Bu metabolik rotanın artan aktivitesi ve bazı kynureninlerin birikmesi immün yanıtı modüle eder ve depresyon, şizofreni, ensefalopati, HIV, demans, amyotrofik lateral skleroz, sıtma, Alzheimer, Huntington hastalığı ve kanser4,7gibi farklı patolojik durumlarla ilişkilidir. Trp metabolizmasında bazı değişiklikler tümör mikroçevronmentlerinde ve kanser hücrelerinde gözlenir2,8. Ayrıca, kynurenines umut verici hastalık belirteçleri olarak kabul edilir9. Kanser araştırmalarında, in vitro hücre kültürü modelleri iyi kurulmuş ve antikanser ilaçlara verilen yanıtların klinik öncesi değerlendirilmesi için yaygın olarak kullanılmaktadır10. Trp metabolitleri hücreler tarafından kültür ortamına salgılanır ve kynurenine yolunun durumunu değerlendirmek için ölçülebilir. Bu nedenle, kolay, esnek ve güvenilir bir protokole sahip çeşitli biyolojik örneklerde mümkün olduğunca çok sayıda KP metabolitinin aynı anda tespiti için uygun yöntemlerin geliştirilmesine ihtiyaç vardır.
Bu yazıda, kanser hücrelerinden toplanan kültür sonrası bir ortamda LC-SQ tarafından Kyn, 3HKyn, 3HAA ve XA olmak üzere dört kynurenine yolu metabolitinin aynı anda belirlenmesi için bir protokol açıklıyoruz. Modern biranalitik yaklaşımda, Ehrlich reaktifi11,12kullanan biyokimyasal spesifik olmayan testlerin aksine, bireysel triptofan katabolitlerinin eşzamanlı tespiti ve niceliği için sıvı kromatografisi 13 , 14 , 15,16tercih edilir. Şu anda, insan örneklerinde kynurenines tayini için birçok yöntem mevcuttur, esas olarak ultraviyole veya floresan dedektörleri ile sıvı kromatografisine dayanmaktadır13,17,18,19. Sıvı kromatografisi, kütle spektrometresi dedektörü (LC-MS) ile birleştiğinde, daha yüksek hassasiyetleri (daha düşük algılama sınırları), seçicilikleri ve tekrarlanabilirlikleri nedeniyle bu tür analizler için daha uygun görünmektedir.
Trp metabolitleri insan serumu, plazma ve idrar13,20,21,22,23'te zaten belirlenmiştir, ancak hücre kültürü ortamı gibi diğer biyolojik örnekler için yöntemler de istenmemektedir. Daha önce, LC-MS, interferon gama (IFN-γ) 24 ,25,26ile tedavi edilen insan glioma hücrelerinin, monositlerin, dendritik hücrelerin veya astrositlerin kültleştirilmesinden sonra toplanan bir ortamda Trp türevi bileşikler için kullanılmıştır. Şu anda, farklı kültür ortamlarında, hücrelerde ve kanser modellerinde kullanılan tedavilerde çeşitli metabolitlerin değerlendirilmesine izin verebilen yeni onaylanmış protokollere ihtiyaç vardır.
Geliştirilen yöntemin amacı, KP'deki anormallikleri gösterebilen dört ana kynurenines'i (bir analitik çalışma içinde) ölçmektir. Burada sunulan, in vitro kültürlü insan kanser hücrelerinden toplanan ortamda bir iç standart (3-nitrotirozin, 3NT) kullanılarak seçilen anlamlı kynureninlerin nicel LC-SQ analizi için yakın zamanda yayınlanan protokolümüzün kritik adımları27. En iyi bilgimize göre, in vitro yetiştirilen hücrelerden elde edilen bir kültür ortamında 3HKyn, 3HAA, Kyn ve XA'nın eşzamanlı olarak ölçülmesi için ilk LC-SQ protokolüdür. Bazı değişikliklerde, yöntem trp metabolizmasındaki değişiklikleri daha geniş bir hücre kültürü model yelpazesinde incelemek için daha fazla uygulanabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1360px;" width="1359">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">3-hydroksy-DL-kynurenina</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:261px;">H1771</td>
			<td style="width:513px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3-hydroxyanthranilic acid</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:261px;">148776</td>
			<td>97%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">3-nitro-L-tyrosine</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:261px;">N7389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:175px;">Supelco</td>
			<td>1.00029</td>
			<td>hypergrade for LC-MS LiChrosolv</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Activated charcoal</td>
			<td style="width:175px;">Supelco</td>
			<td>05105</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Analytical balance</td>
			<td style="width:175px;">Ohaus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:411px;">Analytical column</td>
			<td style="width:175px;">Agilent Technologies</td>
			<td>959764-902</td>
			<td>Zorbax Eclipse Plus C18 rapid resolution HT (2.1 x 100 mm, 1.8 &#181;m)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium formate</td>
			<td style="width:175px;">Supelco</td>
			<td style="width:261px;">7022</td>
			<td>eluent additive for LC-MS, LiChropur, &#8805;99.0%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td>1001887398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Caps for chromatographic vials</td>
			<td style="width:175px;">Agilent Technologies</td>
			<td>5185-5820</td>
			<td>blue screw caps,PTFE/red sil sepa</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell culture dish</td>
			<td style="width:175px;">Nest</td>
			<td>704004</td>
			<td>polystyrene, non-pyrogenic, sterile</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell culture plate</td>
			<td style="width:175px;">Biologix</td>
			<td>07-6012</td>
			<td>12-well, non-pyrogenic, non-cytoxic, sterille</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>HERAcell 150i Cu</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:175px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:261px;"></td>
			<td>model 5415R</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:175px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:261px;"></td>
			<td>model 5428</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge tubes</td>
			<td style="width:175px;">Bionovo</td>
			<td>B-2278</td>
			<td>Eppendorf type, 1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge tubes</td>
			<td style="width:175px;">Bionovo</td>
			<td>B-3693</td>
			<td>Falcon type, 50 mL, PP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chromatographic data acqusition and analysis software</td>
			<td style="width:175px;">Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>LC/MSD ChemStation (B.04.03-S92)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chromatographic insert vials</td>
			<td style="width:175px;">Agilent Technologies</td>
			<td>9301-1387</td>
			<td>100 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chromatographic vials</td>
			<td style="width:175px;">Agilent Technologies</td>
			<td>5182-0714</td>
			<td>2 mL, clear glass</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:175px;">Supelco</td>
			<td style="width:261px;">1.02950</td>
			<td>Uvasol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Dubelcco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:175px;">PAN Biotech</td>
			<td>P04-41450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Dual meter pH/conductivity</td>
			<td style="width:175px;">Mettler Toledo</td>
			<td style="width:261px;"></td>
			<td>SevenMulti</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Evaporator</td>
			<td style="width:175px;">Genevac</td>
			<td style="width:261px;"></td>
			<td>model EZ-2.3 Elite</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Formic acid</td>
			<td style="width:175px;">Supelco</td>
			<td style="width:261px;">5.33002</td>
			<td>for LC-MS LiChropur</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Glass bottle for reagents storage</td>
			<td style="width:175px;">Bionovo</td>
			<td>S-2070</td>
			<td>50 mL, clear glass</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Guard column</td>
			<td style="width:175px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:261px;">959757-902</td>
			<td>Zorbax Eclipse Plus-C18 Narrow Bore Guard Column (2.1 x 12.5 mm, 5 &#181;m)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:175px;">Merck</td>
			<td>1.00317.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">L-kynurenine</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:261px;">K8625</td>
			<td>&#8805;98% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Magnetic stirrer</td>
			<td style="width:175px;">Wigo</td>
			<td style="width:261px;"></td>
			<td>ES 21 H</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microbalance</td>
			<td style="width:175px;">Mettler Toledo</td>
			<td></td>
			<td>model XP6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Milli-Q system</td>
			<td style="width:175px;">Millipore</td>
			<td>ZRQSVPO30</td>
			<td>Direct-Q 3 UV with Pump</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Quadrupole mass spectrometer</td>
			<td style="width:175px;">Agilent Technologies</td>
			<td>G1948B</td>
			<td>model 6120</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Adrich</td>
			<td>048M4874V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plate reader</td>
			<td style="width:175px;">Bio Tek</td>
			<td></td>
			<td>Synergy 2 operated by Gen5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:175px;">Merck</td>
			<td>1.04936.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td style="width:175px;">Merck</td>
			<td>1.05108.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protein Assay Dye Reagent Concentrate</td>
			<td style="width:175px;">BioRad</td>
			<td>500-0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">See-saw rocker</td>
			<td style="width:175px;">Stuart</td>
			<td>SSL4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Serological pipette</td>
			<td style="width:175px;">Nest</td>
			<td>326001</td>
			<td>5 mL, polystyrene, non-pyrogenic, sterile</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:261px;">7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:175px;">Merck</td>
			<td>1.06346.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Solvent inlet filter</td>
			<td style="width:175px;">Agilent Technologies</td>
			<td>5041-2168</td>
			<td>glass filter, 20 &#956;m pore size</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Solvent reservoir (for LC-MS)</td>
			<td style="width:175px;">Agilent Technologies</td>
			<td>9301-6524</td>
			<td>1 L, clear glass</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Solvent reservoir (for LC-MS)</td>
			<td style="width:175px;">Agilent Technologies</td>
			<td>9301-6526</td>
			<td>1 L, amber glass</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spreadsheet program</td>
			<td style="width:175px;">Microsoft Office</td>
			<td></td>
			<td>Microsoft Office Excel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stir bar</td>
			<td style="width:175px;">Bionovo</td>
			<td>6-2003</td>
			<td>teflon coated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Syringe filters for culture medium filtration</td>
			<td style="width:175px;">Bionovo</td>
			<td>7-8803</td>
			<td>regenerated cellulose, &#216; 30 mm, 0,45 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Syringe filters for mobile phase components filtration</td>
			<td style="width:175px;">Bionovo</td>
			<td>6-0018</td>
			<td>nylon, &#216; 30 mm, 0,22 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue culture plates</td>
			<td style="width:175px;">VWR</td>
			<td>10062-900</td>
			<td>96-wells, sterille</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA Solution</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrih</td>
			<td>T4049-100 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:411px;">Ultra-High Performance Liquid Chromatography system</td>
			<td style="width:175px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:261px;">G1367D, G1379B, G1312B, G1316C</td>
			<td style="width:513px;">1200 Infinity system consisted of autosampler (G1367D), degasser (G1379B), binary pump (G1312B), column thermostat (G1316C)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultrasound bath</td>
			<td>Polsonic</td>
			<td>104533</td>
			<td>model 6D</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vortex</td>
			<td>Biosan</td>
			<td></td>
			<td>model V-1 plus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Xanthurenic acid</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:261px;">D120804</td>
			<td>96%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous quantification of selected kynurenines analyzed by liquid chromatography-mass spectrometry in medium collected from cancer cell cultures

Kynurenine yolu ve kynurenines adı verilen triptofan katabolitleri, bağışıklık düzenlemesi ve kanser biyolojisinde rol almaları nedeniyle daha fazla ilgi gördü. Bir in vitro hücre kültürü testi genellikle farklı triptofan katabolitlerinin bir hastalık mekanizmasına katkısı hakkında bilgi edinmek ve terapötik stratejileri test etmek için kullanılır. Salgılanan metabolitler ve sinyal molekülleri bakımından zengin olan hücre kültürü ortamı triptofan metabolizmasının ve diğer hücresel olayların durumunu yansıtır. Karmaşık hücre kültürü ortamında birden fazla kynureninin güvenilir bir şekilde ölçülmesi için yeni protokoller, birden fazla numunenin güvenilir ve hızlı bir şekilde analiz edilmesine izin vermek için arzu edilir. Bu, kütle spektrometresi ile birleştiğinde sıvı kromatografisi ile gerçekleştirilebilir. Bu güçlü teknik metabolitlerin nicelleştirilmesi için birçok klinik ve araştırma laboratuvarında kullanılır ve kynurenines ölçümü için kullanılabilir.
Burada sunulan, in vitro kültürlü kanser hücrelerinden toplanan ortamda dört kynureninin, yani kynurenine, 3-hidroksisinurenin, 3-hidroksiranilik ve ksantrinik asidin eşzamanlı belirlenmesi için tek dörtlü kütle spektrometresi (LC-SQ) ile birleştirilmiş sıvı kromatografinin kullanımıdır. SQ dedektörünün kullanımı kolaydır ve diğer kütle spektrometrelerine kıyasla daha ucuzdur. SQ-MS analizinde, numuneden birden fazla iyon oluşturulur ve belirli kütle-şarj oranlarına(m/z)göre ayrılır ve ardından Tek İyon İzleme (SIM) modu kullanılarak tespit edilir.
Bu makale, bildirilen yöntemin avantajlarına dikkat çeker ve bazı zayıf noktaları gösterir. Kromatografi ve kütle spektrometresi analizi ile birlikte numune hazırlama dahil olmak üzere LC-SQ analizinin kritik unsurlarına odaklanmıştır. Kalite kontrol, yöntem kalibrasyon koşulları ve matris etkisi konuları da tartışılmaktadır. 3-nitrotirozinin basit bir uygulamasını tüm hedef analitler için bir analog standart olarak tanımladık. İnsan yumurtalık ve meme kanseri hücreleri ile yapılan deneylerle doğrulanan LC-SQ yöntemi güvenilir sonuçlar üretir ve diğer in vitro hücresel modellere daha fazla uygulanabilir.

LC-MS, karmaşık örneklerin bazı bileşenleri matris etkilerine neden olsa ve analitlerin iyonlaşmasını tehlikeye atsa da, biyolojik olarak aktif moleküllerin ölçülmesinde tartışılmaz avantajlar sunar. İyon bastırmaya veya iyon geliştirmesine yol açar, doğruluğu güçlü bir şekilde azaltır ve yöntemin ''zayıf' bir noktası olarak kabul edilen LC-MS'in tespit / nicelifikasyon sınırını etkiler. Protokolümüzde, iyonlar, Trp metabolitleri belirleme13ile ilgili diğer çal...

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures at JoVE.

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

Burada, tek bir dörtlüktolü kütle spektrometresi ile birlikte sıvı kromatografisi ile analiz edilen kanser hücre kültürlerinden toplanan ortamda kynurenine pathway'de (kynurenine, 3-hydroxykynurenine, ksantürenik asit, 3-hidroksiranilik asit) üretilen dört farklı triptofan metabolitinin belirlenmesi için bir protokol açıklanmıştır.

Kanser Hücre Kültürlerinden Toplanan Ortamda Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi ile Analiz Edilen Seçilmiş Kynureninlerin Eşzamanlı Nicelemesi

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

Hücresel Lipid Ekstraksiyon Hedefli Kararlı İzotop Seyreltme Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi Analizi

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Desorpsiyon Elektrosprey İyonizasyon Kütle Spektrometresi ile Biyolojik Dokuların Görüntüleme

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological ...

Shock Wave Application to Cell Cultures

Kültürler Hücre Şok Dalga Uygulama

Shock waves nowadays are well known for their regenerative effects. Basic research findings showed that shock waves do cause a biological stimulus to ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Parametrized Diyastolik Dolum Biçimcilik yoluyla Transmitral Akışının Modellenmesi Kinematik tabanlı Analizi ile Küresel Diyastolik Fonksiyonu Kantitasyonu

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Sample Preparation Strategies for Mass Spectrometry Imaging of 3D Cell Culture Models

3D Hücre Kültürü Modelleri Kütle Spektrometre Görüntüleme Hazırlık Stratejileri Numune

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with ...

Generation of Scalable, Metallic High-Aspect Ratio Nanocomposites in a Biological Liquid Medium

Biyolojik Sıvı Ortamda Ölçeklenebilir, Metalik Yüksek Aspect Ratio Nanokompositlerin Üretimi

The goal of this protocol is to describe the synthesis of two novel biocomposites with high-aspect ratio structures. The biocomposites consist of copper ...

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Robot sıvı işleme derleme modüler DNA cihazların otomatik

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

Synthesis of Biocompatible Liquid Crystal Elastomer Foams as Cell Scaffolds for 3D Spatial Cell Cultures

3D Mekansal Hücre Kültürleri için hücre yapı iskeleleri olarak biyo-uyumlu sıvı kristal Elastomer Köpüklerin sentezi

Here, we present a step-by-step preparation of a 3D, biodegradable, foam-like cell scaffold. These scaffolds were prepared by cross-linking star block ...

Production of Genetically Engineered Golden Syrian Hamsters by Pronuclear Injection of the CRISPR/Cas9 Complex

Üretim CRISPR/Cas9 kompleks Pronuclear enjeksiyonla genetiği altın Suriye hamster

The pronuclear (PN) injection technique was first established in mice to introduce foreign genetic materials into the pronuclei of one-cell stage embryos. ...

A Microcontroller Operated Device for the Generation of Liquid Extracts from Conventional Cigarette Smoke and Electronic Cigarette Aerosol

Sıvı özleri geleneksel sigara duman ve elektronik sigara Aerosol gelen nesil için aygıt mikroişlemci işletilen

Electronic cigarettes are the most popular tobacco product among middle and high schoolers and are the most popular alternative tobacco product among ...