Name: fluorescent immunolocalization of arabinogalactan proteins and pectins in the cell wall of plant tissues
Uploaded: 2021-02-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescent Immunolocalization of Arabinogalactan Proteins and Pectins in the Cell Wall of Plant Tissues at JoVE.com

تلقى المؤلفون الدعم من مشروع الاتحاد الأوروبي 690946 'SexSeed' (الاستنساخ النباتي الجنسي – تكوين البذور) الممول من H2020-MSCA-RISE-2015 وSeedWheels FCT PTDC/BIA-FBT/27839/2017. تلقى مشروع AMP منحة من مشروع MSCA-IF-2016 التابع للاتحاد الأوروبي (رقم 753328). تلقت MC منحة من منحة دكتوراه FCT SFRH/BD/111781/2015.

1. إعداد العينة: التثبيت، والجفاف، وLR-الأبيض تضمين
<ol><li>التثبيت والجفاف ملاحظة: عملية التثبيت هامة للحفاظ على العينة; عن طريق الجزيئات crosslinking يتم إيقاف الأيض الخلوية، وضمان سلامة الخلوية ومنع الانتشار الجزيئي. يجب تعديل العوامل المثبت والتركيز المستخدم لهذا الغرض ، مما يترك ال...

<ol>
	<li>Keegstra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+Cell+Walls.">Plant Cell Walls.</a> Plant Physiology. 154 (2), 483-486 (2010).</li><li>Pereira, A. M., Lopes, A. L., Coimbra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabinogalactan+Proteins+as+Interactors+along+the+Crosstalk+between+the+Pollen+Tube+and+the+Female+Tissues.">Arabinogalactan Proteins as Interactors along the Crosstalk between the Pollen Tube and the Female Tissues.</a> Frontiers in Plant Science. 7 (7), (2016).</li><li>Showalter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabinogalactan-proteins:+structure,+expression+and+function.">Arabinogalactan-proteins: structure, expression and function.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 58 (10), 1399-1417 (2001).</li><li>Majewska-Sawka, A., Nothnagel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multiple+roles+of+arabinogalactan+proteins+in+plant+development.">The multiple roles of arabinogalactan proteins in plant development.</a> Plant Physiology. 122, 3-9 (2000).</li><li>Seifert, G., Roberts, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+arabinogalactan+proteins.">The biology of arabinogalactan proteins.</a> Annual Review of Plant Biology. 58, 137-161 (2007).</li><li>Ruprecht, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Synthetic+Glycan+Microarray+Enables+Epitope+Mapping+of+Plant+Cell+Wall+Glycan-Directed+Antibodies.">A Synthetic Glycan Microarray Enables Epitope Mapping of Plant Cell Wall Glycan-Directed Antibodies.</a> Plant Physiology. 175 (3), 1094-1104 (2017).</li><li>Verhertbruggen, Y., Walker, J. L., Guillon, F., Scheller, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparative+Study+of+Sample+Preparation+for+Staining+and+Immunodetection+of+Plant+Cell+Walls+by+Light+Microscopy.">A Comparative Study of Sample Preparation for Staining and Immunodetection of Plant Cell Walls by Light Microscopy.</a> Frontiers in Plant Science. 29 (8), 1505 (2017).</li><li>Osborn, M., Weber, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+and+immunocytochemical+procedures+with+affinity+purified+antibodies:+tubulin+containing+structures.">Immunofluorescence and immunocytochemical procedures with affinity purified antibodies: tubulin containing structures.</a> Methods in Cell Biology. 24, 97-132 (1982).</li><li>Coimbra, S., Almeida, J., Junqueira, V., Costa, M., Pereira, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabinogalactan+proteins+as+molecular+markers+in+Arabidopsis+thaliana+sexual+reproduction.">Arabinogalactan proteins as molecular markers in Arabidopsis thaliana sexual reproduction.</a> Journal of Experimental Botany. 58 (15), 4027-4035 (2007).</li><li>Wilson, S. M., Bacic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+plant+cells+for+transmission+electron+microscopy+to+optimize+immunogold+labeling+of+carbohydrate+and+protein+epitopes.">Preparation of plant cells for transmission electron microscopy to optimize immunogold labeling of carbohydrate and protein epitopes.</a> Nature Protocols. 7 (9), 1716-1727 (2012).</li><li>Gane, A., Clarke, A., Bacic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+and+expression+of+arabinogalactan-proteins+in+the+ovaries+of+Nicotiana+alata+Link+and+Otto.">Localization and expression of arabinogalactan-proteins in the ovaries of Nicotiana alata Link and Otto.</a> Sex Plant Reproduction. 8, 278-282 (1995).</li><li>Coimbra, S., Salema, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunolocalization+of+arabinogalactan+proteins+in+Amaranthus+hypocondriacus+L.+ovules.">Immunolocalization of arabinogalactan proteins in Amaranthus hypocondriacus L. ovules.</a> Protoplasma. 199 (1-2), 75-82 (1997).</li><li>Coimbra, S., Duarte, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabinogalactan+proteins+may+facilitate+the+movement+of+pollen+tubes+from+the+stigma+to+the+ovules+in+Actinidia+deliciosa+and+Amaranthus+hypocondriacus.">Arabinogalactan proteins may facilitate the movement of pollen tubes from the stigma to the ovules in Actinidia deliciosa and Amaranthus hypocondriacus.</a> Euphytica. 133 (2), 171-178 (2003).</li><li>El-Tantawy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabinogalactan+protein+profiles+and+distribution+patterns+during+microspore+embryogenesis+and+pollen+development+in+Brassica+napus.">Arabinogalactan protein profiles and distribution patterns during microspore embryogenesis and pollen development in Brassica napus.</a> Plant Reproduction. 26 (3), 231-243 (2013).</li><li>Costa, M., Pereira, A. M., Rudall, P. J., Coimbra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunolocalization+of+arabinogalactan+proteins+(AGPs)+in+reproductive+structures+of+an+early-divergent+angiosperm,+Trithuria+submersa+(Hydatellaceae).">Immunolocalization of arabinogalactan proteins (AGPs) in reproductive structures of an early-divergent angiosperm, Trithuria submersa (Hydatellaceae).</a> Annals of Botany. 111 (2), 183-190 (2013).</li><li>Costa, M., Sobral, R., Ribeiro Costa, M. M., Amorim, M. I., Coimbra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+presence+of+arabinogalactan+proteins+and+pectins+during+Quercus+suber+male+gametogenesis.">Evaluation of the presence of arabinogalactan proteins and pectins during Quercus suber male gametogenesis.</a> Annals of Botany. 115 (1), 81-92 (2015).</li><li>Hibbs, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Immunolabelling.">Fluorescence Immunolabelling.</a> Confocal Microscopy for Biologists. , (2004).</li><li>Johnson, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fading+of+Immunofluorescence+during+microscopy:+A+Study+of+the+Phenomenon+and+its+Remedy.">Fading of Immunofluorescence during microscopy: A Study of the Phenomenon and its Remedy.</a> Journal of Immunological Methods. 55 (2), 231-242 (1982).</li><li>Baird, T. R., Kaufman, D., Brown, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mercury+Free+Microscopy:+An+Opportunity+for+Core+Facility+Directors.">Mercury Free Microscopy: An Opportunity for Core Facility Directors.</a> Journal of Biomolecular Techniques. 25 (2), 48-53 (2014).</li><li>Weber, G. F., Menko, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Color+image+acquisition+using+a+monochrome+camera+and+standard+fluorescence+filter+cubes.">Color image acquisition using a monochrome camera and standard fluorescence filter cubes.</a> BioTechniques. 38 (1), 52-56 (2005).</li></ol>

طريقة تحديد المواقع المناعية الفلورية في النباتات الموصوفة هنا ، في حين أنها واضحة بسلاسة ، تعتمد على نجاح العديد من الخطوات الصغيرة. الأول منها هو إعداد العينة واللصلح. خلال هذه الخطوة الأولى، يتم استخدام مزيج من الفورمالديهايد والغلوتارالدهيد لتقاطع التشابك غالبية مكونات الخلية. يوفر ...

جدران الخلايا النباتية هي هياكل معقدة تتألف من السكريات وبروكرينات الجليكو. جدران الخلية هي هياكل ديناميكية للغاية التي تختلف هندستها التنظيمية ، والتنظيم والتركيب وفقا لنوع الخلية ، والتوطين ، ومرحلة التنمية ، ومحفزات خارجية وداخلية1. تعتبر بروتينات أرابينوغالات (AGPs) والبكتين مكونات مهمة من جدار الخلايا النباتية. إن البروتينات والجليكوسيلات عالية البيرة والبكتين هي السكاريدات المثلية التي تختلف تكوينها وكميتها وبنيتها اختلافاً كبيراً خلال مراحل نمو النباتات المختلفة2،3،4. وقد كشفت الدراسات AGPs والبكتين مشاركتهم في العديد من العمليات النباتية مثل موت الخلايا المبرمجة، والاستجابة للضغوط اللاأحيائية، والتكاثر النباتي الجنسي، من بين أمور أخرى كثيرة5. وقد بدأت معظم هذه الدراسات بمعلومات تم الحصول عليها من دراسات نقل المناعة.
ونظرا لتعقيدها، فإن دراسة جدران الخلايا تتطلب العديد من الأدوات المختلفة. الكشف عن الظهارات الجليكان باستخدام الأجسام المضادة أحادية النسيلة (mAbs) هو نهج قيم لحل توزيع السكرياتيدات وجليكوبروتين على طول هذا الهيكل. هناك مجموعة كبيرة من mAbs المتاحة للكشف عن epitopes الجليكان ويتم تحسين خصوصية كل ماب بشكل مستمر وكذلك6. التقنية الموصوفة هنا قابلة للتطبيق على جميع أنواع النباتات، وهي أداة مثالية لتوجيه اتجاهات البحث المستقبلية التي قد تنطوي على تقنيات أكثر تكلفة وتعقيدا.
في هذه التقنية، يتم الاقتران مع أجسام مضادة محددة كيميائيا لأصباغ الفلورسنت مثل FITC (الفلوريسين ايزوثيوسانات)، TRITC (tetramethylrhodamine-5-(و 6)-isothiocyanate) أو عدة صبغات فلور اليكسا. يوفر الفلورسينت العديد من المزايا، مما يسمح بتعريب الخلايا دون الخلوية الواضحة والسريعة للجليكانات التي يمكن ملاحظتها مباشرة تحت مجهر الفلورانس. وهو محدد وحساس للغاية ، لأن إعداد العينة يمكن أن يحمي بشكل فعال الهيكل الطبيعي للمستضد ، حتى لو كان موجودًا بكميات أقل. فإنه يسمح للكشف عن مستضدات متعددة في نفس العينة والأهم من ذلك، ويقدم جودة عالية ونتائج جميلة بصريا. على الرغم من القوة العظمى التي تقدمها دراسات تحديد المواقع المناعية المفلورة ، فإنها غالبا ما تعتبر صعبة الأداء والتنفيذ على الأرجح بسبب عدم وجود بروتوكولات مفصلة تسمح بالتصور من مختلف خطوات الإجراء. هنا، ونحن نقدم بعض المبادئ التوجيهية البسيطة حول كيفية تنفيذ هذه التقنية وكيفية الحصول على صور ذات جودة عالية.
بالنسبة للبروتوكول المقدم هنا، يجب أولاً إصلاح العينات وإضمانها باستخدام المثبت الأكثر ملاءمة. على الرغم من اعتبارها تقنية مستهلكة للوقت ومملة نسبيًا ، فإن التثبيت السليم وتضمين عينة النبات هو المفتاح لضمان إجراء فحص مناعي ناجح. لهذا الغرض، فإن الأكثر شيوعا هو تثبيت المواد الكيميائية باستخدام المثبتات عبر الربط، مثل الألدهيدات. المثبتات المتبادلة الربط إنشاء الروابط الكيميائية بين جزيئات الأنسجة، وتحقيق الاستقرار وتصلب العينة. الفورمالديهايد والغلوتارالدهيد هي عبر ربط المثبتات، وأحيانا يتم استخدام مزيج من كل من المثبتات7. الفورمالديهايد يقدم الحفاظ الهيكلية كبيرة من الأنسجة لفترات طويلة من الزمن، وإنتاج تراجع الأنسجة الصغيرة ويجري متوافقة مع المناعة. الجلثارالدهيد هو تثبيت أقوى ومستقرة تستخدم عادة في تركيبة مع الفورمالديهايد. استخدام الجلوتارالدلديهايد لديه بعض العيوب التي يجب أن تؤخذ في الاعتبار لأنه يقدم بعض المجموعات الألدهيد الحرة في الأنسجة الثابتة, التي قد تولد بعض العلامات غير محددة. أيضا الربط بين البروتينات والجزيئات الأخرى في بعض الأحيان قد تجعل بعض epitopes الهدف لا يمكن الوصول إليها للأجسام المضادة. لتجنب هذا، يجب تحديد كمية ومدة التثبيت بعناية.
بعد التثبيت، يتم تضمين عينات في الراتنج السليم لتصلب قبل الحصول على أقسام. لندن الراتنج (LR-الأبيض) الراتنج الاكريليك هو الراتنج المفضل لدراسات تخصيص المناعة. على عكس راتنجات أخرى، LR-White هو ماء، مما يسمح للأجسام المضادة للوصول إلى المستضدات الخاصة بهم، مع عدم الحاجة إلى أي علاج لتسهيل ذلك. LR-White لديها أيضا ميزة تقديم انخفاض فلورا لصناعة السيارات، مما يسمح للحد من الضوضاء الخلفية أثناء تصوير المناعة.
هناك العديد من تقنيات التلطيخ المتاحة للكشف عن مكونات مختلفة من جدار الخلية، مثل تلطيخ الأزرق ألسيان، تلطيخ الأزرق التلوويدين أو حمض الدورية شيف (PAS) تلطيخ. لا شيء من هذه تقدم قوة تحليل تخصيص المناعة8. هذا النهج يعطي قدرا أكبر من التحديد في الكشف عن الجليكان، وتقديم معلومات أوسع بشأن تكوين جدار الخلية وهيكل.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:728px;" width="728">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">25% (w/v) Gluteraldehyde</td>
			<td style="width:99px;">Agar Scientific</td>
			<td style="width:196px;">AGR1010</td>
			<td style="width:187px;">aq. Solution, methanol free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">8 wells Glass reaction slides</td>
			<td style="width:99px;">Marinfeld</td>
			<td style="width:196px;">MARI1216750</td>
			<td style="width:187px;">other brands may be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:196px;">A6283</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Anti-Rat IgG (wole molecule)-FITC antibody produce in GOAT</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:196px;">F6258</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:247px;">cover slips, 24 mm x 50 mm</td>
			<td style="width:99px;">Marinfeld</td>
			<td>MARI0100222</td>
			<td style="width:187px;">The cover slip should cover all the wells. Other brands may be used&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:247px;">ddH2O</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Ethanol absolute</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Fluorescent brightner 28</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:196px;">F-6259</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Gelatin capsules</td>
			<td style="width:99px;">Agar scientific</td>
			<td>AGG29211</td>
			<td style="width:187px;">The capsule size sould feat the size of the sample.</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:247px;">Glass vials</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;">Any simple unexpensive glass vials that can be sealed, may be used. The vials may be clean with 96% etanol after use to remove LR-White residue and reused.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="294">
			<td height="294" style="height:294px;width:247px;">LR-white medium grade, embdeding resin</td>
			<td style="width:99px;">Agar Scientific</td>
			<td>AGR1281</td>
			<td style="width:187px;">LR-White comes in several forms the medium grade provides na adequate cutting suport for most tissues for harder tissues a harder grade of LR-white may be recomendable. If possible use a resin already mixed with the polimeration activator (benzoyl peroxide), if not please folow the instructions of the suplier to prepare the resin.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Non fat dry milk</td>
			<td style="width:99px;">Nestl&#233;</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;">any non fat dry milk is adequate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Oven</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;">generic laboratory oven</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Petri dish, 10 cm x 10 cm square</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">PIPES</td>
			<td style="width:99px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:196px;">P1851</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="357">
			<td height="357" style="height:357px;width:247px;">Rat generated Monoclonal Anti-Body</td>
			<td style="width:99px;">Plant probes</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;">Several antibodies that recognize cell wall components are 
			available at both the Complex Carbohydrate research center 
			(CCRC, Georgia University USA) and Plant Probes (Paul 
			Knox Cell Wall Lab, at Leeds University UK). A short list of 
			some commonly used MABS and where they can be purchased 
			is presented in Supplemental Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Razor blades</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;">regular razor blades</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">SDS</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:196px;">L6026</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Toluidine Blue-O</td>
			<td style="width:99px;">Agar Scientific</td>
			<td>AGR1727</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Tween 20</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:196px;">P9416</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Ultramicrotome</td>
			<td style="width:99px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:196px;">UC7</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:247px;">upright epifluorescence microscope with UV and FITC fluorescence filters</td>
			<td style="width:99px;">Leica Mycrosistems</td>
			<td style="width:196px;">DMLb</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">vaccum chamber</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">vaccum pump</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="297">
			<td height="297" style="height:297px;width:247px;">Vectashield</td>
			<td style="width:99px;">vecta Labs</td>
			<td style="width:196px;">T-1000</td>
			<td style="width:187px;">Other anti-fade may be used. Please do check for compatibility with FITC and the Fluorescente brightner 28. (Note: for a non-commercial alternative, (see Jonhson et al 198218) An antifade medium can be made by mixing 25 mg/mL of 1,4-Diazobicyclo-(2,2,2)octane (DABCO) in 9:1 (v/v) glycerol to 1xPBS. Adjust pH to 8.6 with diluted HCl.)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescent immunolocalization of arabinogalactan proteins and pectins in the cell wall of plant tissues

ويشمل تطوير النبات تعديلات ثابتة على تكوين جدار الخلية وهيكلها استجابة للمحفزات الداخلية والخارجية على حد سواء. وتتألف جدران الخلايا من السليلوز وغير السليلوزية السكريات جنبا إلى جنب مع البروتينات والمركبات الفينولية والماء. يتكون 90٪ من جدار الخلية من السكريات (مثل البكتين) وبروتينات أرابينوغالكاتا (AGPs). يبقى تحديد مكان المناعة الفلورية من أسطح جليكان محددة في أقسام النسيج النباتية أداة رئيسية للكشف عن إعادة عرض الشبكات السكاريد الجدار، والهيكل والمكونات.
هنا، نحن الإبلاغ عن إجراء تحسين المناعة الفلورية للكشف عن epitopes الجليكان من AGPs والبكتين في الأنسجة النباتية. وقد استخدم تثبيت Paraformaldehyde/glutaraldehyde جنبا إلى جنب مع LR-White تضمين عينات النبات، مما يسمح للحفاظ على نحو أفضل من بنية الأنسجة وتكوينها. واستخدمت أجزاء رقيقة من العينات المضمنة التي تم الحصول عليها مع microtome فائقة لlocalization المناعة مع الأجسام المضادة محددة. هذه التقنية تقدم دقة كبيرة، وخصوصية عالية، وفرصة للكشف عن عدة ظهارات الجليكان في نفس العينة. هذه التقنية تسمح توطين دون الخلية من الجليكان ويكتشف مستوى تراكمها في جدار الخلية. كما يسمح بتحديد الأنماط الزقتية -الزمنية لتوزيع البكتين و البكتين أثناء العمليات التطويرية. استخدام هذه الأداة قد توجه في نهاية المطاف اتجاهات البحوث وربط الجليكانات لوظائف محددة في النباتات. وعلاوة على ذلك، يمكن للمعلومات التي تم الحصول عليها أن تكمل الدراسات الكيميائية الحيوية ودراسات التعبير الجيني.

في تجربة ناجحة ، فإن الأجسام المضادة الثانوية تحديد موقع محدد من epitope في اللون الأخضر مشرق ، بطريقة متسقة ، مما يسمح لتوصيف تكوين جدار الخلية في مرحلة معينة من تطوير الخلية أو الأنسجة أو الجهاز. على سبيل المثال الأجسام المضادة LM6 له صلة عالية ل1,5-arabinan, مركب مع نوع-I rhamnogalacturonan التي يمكن العثور ...

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescent Immunolocalization of Arabinogalactan Proteins and Pectins in the Cell Wall of Plant Tissues at JoVE.com

Fluorescent Immunolocalization of Arabinogalactan Proteins and Pectins in the Cell Wall of Plant Tissues

يصف هذا البروتوكول بالتفصيل كيفية إصلاح المواد النباتية لإضفاء الطابع المناعي على البروتينات والبكتين العربي ، وجزءًا من راتنج الأكريليك المائي ، المقطع والمثبت على الشرائح الزجاجية. نظهر سيتم الكشف عن epitopes جدار الخلية ذات الصلة مع الأجسام المضادة محددة.

الفلورسنت المناعية من البروتينات و البكتينات أرابينغالات في جدار الخلية من الأنسجة النباتية

Plant development involves constant adjustments of the cell wall composition and structure in response to both internal and external stimuli. Cell walls ...

كمية المعلومات من تجربة واحدة فقط هائلة. يمكننا الكشف عن وجود هذه البوليمرات جدار الخلية ونعرف بالضبط كيف يتم توزيعها في الخلايا والأنسجة، وحتى تحديد وفرة. تم تصميم هذه الطريقة في مثل هذه الطريقة التي يمكن تطبيقها على أي نوع تقريبا من الأنسجة النباتية من أي نوع قد ترغب في تحليل.مناعة في الأنسجة النباتية ينطوي على الكثير من العمل الدقيق، من الصعب شرح دون رؤية الواقع ما يحدث. قبل جمع عينة الأنسجة النباتية، تعبئة قارورة الزجاج مع ما يكفي من حل المثبت الباردة لغمر تماما جميع العينات. ثم حدد الأنسجة النباتية لتحليلها وتقليم العينات إلى حجم لا يزيد عن 16 ملليمتر مربع.غمر العينات على الفور في الحل المثبت. الجلثارالدهيد والفورمالديهايد كلاهما المثبتات ممتازة، ولكن كلاهما خطرة ويجب التعامل معها في غطاء محرك التدفق. نقل القارورة إلى غرفة فراغ وتطبيق الفراغ ببطء.عندما يصل الضغط إلى 60 كيلو باسكال سالبة، المادة العائمة في القارورة ستبدأ في الغرق إلى القاع. الحفاظ على الضغط في الغرفة في ما لا يزيد عن باسكال 80 كيلو سلبي. قد تستغرق عملية الغرق ما يصل إلى ساعتين.بعد العينات كانت في غرفة فراغ لمدة ساعتين ، ببطء الإفراج عن الفراغ. ختم قارورة الزجاج وتبريده بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية. بعد التثبيت بين عشية وضحاها، والتخلص من أي عينات التي لم تغرق في الجزء السفلي من القارورة.غسل العينات المتبقية مع PBS 25 ملليمولار لمدة 10 دقائق ثم غسلها في 25 ميليمولار أنابيب العازلة لمدة 20 دقيقة. من المهم للغاية إزالة جميع العينات العائمة لأنه من المحتمل جدا أن المثبت لم تخترق العينة. يجفف العينات في سلسلة الإيثانول، ويغمر العينات لمدة 20 دقيقة عند كل تركيز الإيثانول.لثقب العينات، إضافة تركيزات متزايدة من راتنج LR-أبيض في الإيثانول، بدءا من راتنج جزء واحد إلى ثلاثة أجزاء الإيثانول. في كل تركيز، احتضان لمدة 24 ساعة في أربع درجات مئوية. استبدال راتنج LR-أبيض مع الراتنج الطازجة واحتضان العينات لمدة 12 ساعة إضافية في أربع درجات مئوية.إعداد كبسولات الجيلاتين التضمين، واختيار كبسولات التي هي أكبر قليلا من العينات بحيث يمكن أن تكون مغلقة تماما العينات في الراتنج. علامات الورق التسمية مع قلم رصاص لأن الحبر سوف تلوث الراتنج. تطبيق قطرة واحدة من الراتنج LR-أبيض جديد إلى الجزء السفلي من كل كبسولة.ضع عينة في كل كبسولة، ثم املأ الكبسولات بأقصى سعة مع الراتنج الطازج. ضع الغطاء على الكبسولة واضغط بلطف لختمه. لتبليمرة الراتنج، علاج كبسولات في 58 درجة مئوية حتى تصلب تماما حول 24 إلى 48 ساعة.بعد تقشير كبسولة الجيلاتين من الراتنج LR-أبيض، ضع كتلة الراتنج تحت المجهر ستيريو. باستخدام شفرة حلاقة حادة، تقليم كتلة LR-أبيض في زاوية 45 درجة إلى العينة. تدوير العينة وجعل خفض الثانية في زاوية 90 درجة إلى الأولى.استمر في القطع في نفس النمط لتشكيل هرم مع قمة الهرم مباشرة فوق منطقة العينة ذات الاهتمام ، ثم البدء في إزالة الشرائح الدقيقة عموديًا على المحور الرئيسي حتى يصل سطح القطع إلى العينة. يجب أن تكون العينة الهدف بشكل مثالي محاطة في شكل شبه منحرف. ضع كتلة الراتنج المشذبة في الدقيقة الفائقة.ضبط الزاوية بين حافة السكين وكتلة الراتنج. قطع أجزاء من كتلة بسماكة تتراوح بين 200 و 700 نانومتر. استخدام حلقة سلك لرفع بعناية بعض المقاطع العينات من microtome.وضعها في قطرة من الماء المقطر ديونيد على شريحة زجاجية. يتبخر الماء عن طريق وضع الشريحة على لوحة ساخنة في 50 درجة مئوية، ثم إضافة قطرة من وصمة عار إلى الأقسام. بعد 30 ثانية، شطف قبالة وصمة عار ومراقبة الشريحة تحت المجهر للتحقق من الحالة العامة للقسم، وأن بنية النبات المطلوب مرئية.إعداد شريحة رد فعل نظيفة عن طريق وضع قطرة من الماء المقطر deionized في كل بئر من الشريحة. نقل واحد أو قسمين عينة إلى كل قطرة من الماء. ضع الشريحة في طبق بيتري 10 سنتيمتر مربع، غطيه واتركه يجف عند 50 درجة مئوية.لإعداد غرفة حضانة للشرائح رد فعل، ووضع بعض المناشف الورقية المثبطة في الجزء السفلي من مربع نصائح ماصة والتفاف مربع مع رقائق الألومنيوم. نقل الشرائح من مربع إلى غرفة الحضانة. الماصات 50 ميكرولترات من حل الحجب في كل بئر.بعد احتضان الشريحة لمدة 10 دقائق، قم بإزالة حل الحجب، ثم اغسل جميع الآبار مرتين مع برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق في كل مرة. بعد تحضير حلول الأجسام المضادة الأولية كما هو موضح في المخطوطة، قم بإجراء غسل نهائي للآبار بالماء التقطيري لمدة خمس دقائق. الماصات الحل الأجسام المضادة الأولية في آبار رد الفعل، ثم ماصة الحل حظر في آبار التحكم.أغلق غرفة الحضانة. اتركه يقف لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة ثم ابرده بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية. إعداد 1٪ حل من الأجسام المضادة الثانوية في حل حظر.وسوف تكون هناك حاجة إلى ما يقرب من 40 ميكرولترات لكل بئر. تغطية الحل مع رقائق الألومنيوم. اغسل آبار شريحة التفاعل مرتين مع PBS ومرة واحدة مع الماء المقطر المقطّر لمدة 10 دقائق في كل مرة.ضمان عدم وجود حل للحجب أو ودائع في الآبار. الماصات حل الأجسام المضادة الثانوية في جميع الآبار. احتضان الشرائح في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث إلى أربع ساعات.مرة أخرى، وغسل آبار الشريحة رد فعل مرتين مع برنامج تلفزيوني ومرة واحدة مع الماء المقطر deionized، ثم إضافة قطرة من كالكفلور الأبيض إلى كل بئر. دون غسل، إضافة قطرة من متوسطة التركيب لكل بئر وتغطي كل بئر مع غطاء. مراقبة أجزاء العينة في الشريحة رد الفعل باستخدام المجهر المفلور.لكل ملاحظة، استخدم فلتر الأشعة فوق البنفسجية للكشف عن جدران الخلايا الملطخة بالكالكوفلور ومرشح فيتف للكشف عن تحديد المواقع المناعية. للحصول على تصور أفضل للنتائج، استخدم ImageJ أو برنامج تحليل صور مشابه لدمج كل صورة مرشح الأشعة فوق البنفسجية مع صورة مرشح FITC المقابلة. من خلال تحديد توطين epitopes محددة ، والبروتوكول يتيح توصيف تكوين جدار الخلية.على سبيل المثال، 1، 5-عربيان وفيرة في جدار الخلية من النمو Quercus suber anther. عادة ما توجد المثليات المهجورة التي نادراً ما تكون في الطرف الجذري للجنين الفرعي Quercus الذي يحدد الخصائص الميكانيكية للجهاز. تم العثور على Xylogalacturonanans في الخلايا المتحللة، مثل خلية إندوسبيرم أثناء المراحل النهائية لنضوج البلوط البلوط الفرعي Quercus.تم العثور على epitopes AGP المعترف بها من قبل JIM13 أو JIM8 على الهياكل المتعلقة بالإنجاب، مثل خطوط الخلايا المتعلقة microgametogenesis في Arabidopsis thaliana وspiillae وصمة عار والميكروبات من الاجم رثوريا البازل. وعادة ما يسهل اكتشاف الأخطاء الشائعة في تنفيذ هذا البروتوكول وتحديدها. عندما يتم تخطي الغسلات أو السماح لآبار التفاعل بالجفاف ، فإن الجسم المضاد الثانوي عادة ما يظهر كلطخة.سوف تتكون مجاميع من الفلوروكرروم الأخضر إذا لم يتم غسل الجسم المضاد الأساسي غير المنضم بشكل صحيح. عادة ما يرتبط طي أو انفصال الأقسام إلى التصاق الفقراء بسبب استخدام الشرائح غير نظيفة أو غسل العدوانية. إعداد العينة هو أيضا بالغ الأهمية.يجب أن تكون كتل الراتنج خالية من الشقوق مع أصفر شاحب واضح إلى عينة بنية فاتحة. سوف تظهر العينات المدمجة بشكل غير فعال بقع بيضاء مسحوق أو مناطق. الحفاظ على حجم العينة تحت ثمانية ملليمترات ضروري لاختراق الحل المثبت.سوف تظهر عينات ثابتة بشكل سيئ بنية داكنة أو سوداء تقريبًا. درجة الحرارة المفرطة يمكن أن يسبب الراتنج للقضاء جعل القطاعات من العينة المستحيل. استخدام تقنيات تخصيص المناعة فتح العديد من الاتجاهات البحثية.يمكن للمرء أن يتبع مع تقنيات أكثر تحديدا مثل التحليل الكيميائي الحيوي للجدار الخلية أو حتى المضي قدما في نهج الجزيئية. يمكن أن تساعد النتائج التي توفرها هذه التقنية على فهم تكوين جدار الخلية ، وهو هيكل معقد للغاية يصعب تحليله عن طريق التحليل الكيميائي البسيط.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

التعبير عن البروتينات الفلورية في<em&gt; السهيم</em&gt; من جانب مرنا حقن البويضات غير المخصبة في

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the ...

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

تقنية زرع الثدي الثديية الرواية جديدة لتصور الجيل سفينة من الخلايا الجذعية البطانية الأوعية الدموية

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

تصوير لايف من ماوس الثانوي باليت فيوجن

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

تشريح وتلطيخ إيممونوفلوريسسينت للفطر الجسم وعلم الخلايا العصبية في أدمغة البالغين melanogaster المورفولوجية

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

مركز الجامعة-جبل وتلطيخ نبات زهرة الأجهزة وسيليكويس

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

وسم المناعية-فلوري Microtubules والبروتينات سينتروسومال في 3D في المختبر أورجانويدس الأمعاء والأنسجة المعوية السابقين فيفو

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone

إعداد الأنسجة وتلطيخ المناعة من أنسجة الفئران القحفية والعظام غير الصائق

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and ...

Use of Atomic Force Microscopy to Measure Mechanical Properties and Turgor Pressure of Plant Cells and Plant Tissues

استخدام مجهرية القوة الذرية لقياس الخصائص الميكانيكية وضغط التورغور للخلايا النباتية والأنسجة النباتية

We present here the use of atomic force microscopy to indent plant tissues and recover its mechanical properties. Using two different microscopes in ...

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

حية الخلية التصوير من Microtubule Cytoskeleton والتلاعب micromechanical من عربيدوبسيس تبادل لاطلاق النار Apical Meristem

Understanding cell and tissue level regulation of growth and morphogenesis has been at the forefront of biological research for many decades. Advances in ...

Isolation of Endocardial and Coronary Endothelial Cells from the Ventricular Free Wall of the Rat Heart

عزل الخلايا الإندوكاريال والشريان التاجي من الجدار الحر البطيني للقلب الجرذ

It has been shown that endocardial endothelial cells (EECs) and coronary endothelial cells (CECs) differ in origin, development, markers, and functions. ...