Name: fluorescent immunolocalization of arabinogalactan proteins and pectins in the cell wall of plant tissues
Uploaded: 2021-02-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescent Immunolocalization of Arabinogalactan Proteins and Pectins in the Cell Wall of Plant Tissues at JoVE.com

Forfatterne modtog støtte fra EU-projektet 690946 'SexSeed' (Seksuel Plantegengivelse – Frødannelse) finansieret af H2020-MSCA-RISE-2015 og SeedWheels FCT PTDC/BIA-FBT/27839/2017. AMP modtog et tilskud fra EU's MSCA-IF-2016-projekt (nr. 753328). MC modtog et tilskud fra FCT PhD tilskud SFRH/BD/111781/2015.

1. Prøveforberedelse: fiksering, dehydrering og LR-Hvid indlejring
<ol><li>Fiksering og dehydrering BEMÆRK: Fikseringsprocessen er afgørende for at bevare prøven. ved at krydslinke molekyler stoppes cellemetabolismen, hvilket sikrer cellulær integritet og forhindrer molekylær diffusion. Fikseringsmidlerne og den anvendte koncentration skal tilpasses dette formål, således at antigenet er tilstrækkeligt udsat for at interagere med antistofferne. Følgende protokol kombinerer den milde fikseri...

<ol>
	<li>Keegstra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+Cell+Walls.">Plant Cell Walls.</a> Plant Physiology. 154 (2), 483-486 (2010).</li><li>Pereira, A. M., Lopes, A. L., Coimbra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabinogalactan+Proteins+as+Interactors+along+the+Crosstalk+between+the+Pollen+Tube+and+the+Female+Tissues.">Arabinogalactan Proteins as Interactors along the Crosstalk between the Pollen Tube and the Female Tissues.</a> Frontiers in Plant Science. 7 (7), (2016).</li><li>Showalter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabinogalactan-proteins:+structure,+expression+and+function.">Arabinogalactan-proteins: structure, expression and function.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 58 (10), 1399-1417 (2001).</li><li>Majewska-Sawka, A., Nothnagel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multiple+roles+of+arabinogalactan+proteins+in+plant+development.">The multiple roles of arabinogalactan proteins in plant development.</a> Plant Physiology. 122, 3-9 (2000).</li><li>Seifert, G., Roberts, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+arabinogalactan+proteins.">The biology of arabinogalactan proteins.</a> Annual Review of Plant Biology. 58, 137-161 (2007).</li><li>Ruprecht, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Synthetic+Glycan+Microarray+Enables+Epitope+Mapping+of+Plant+Cell+Wall+Glycan-Directed+Antibodies.">A Synthetic Glycan Microarray Enables Epitope Mapping of Plant Cell Wall Glycan-Directed Antibodies.</a> Plant Physiology. 175 (3), 1094-1104 (2017).</li><li>Verhertbruggen, Y., Walker, J. L., Guillon, F., Scheller, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparative+Study+of+Sample+Preparation+for+Staining+and+Immunodetection+of+Plant+Cell+Walls+by+Light+Microscopy.">A Comparative Study of Sample Preparation for Staining and Immunodetection of Plant Cell Walls by Light Microscopy.</a> Frontiers in Plant Science. 29 (8), 1505 (2017).</li><li>Osborn, M., Weber, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+and+immunocytochemical+procedures+with+affinity+purified+antibodies:+tubulin+containing+structures.">Immunofluorescence and immunocytochemical procedures with affinity purified antibodies: tubulin containing structures.</a> Methods in Cell Biology. 24, 97-132 (1982).</li><li>Coimbra, S., Almeida, J., Junqueira, V., Costa, M., Pereira, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabinogalactan+proteins+as+molecular+markers+in+Arabidopsis+thaliana+sexual+reproduction.">Arabinogalactan proteins as molecular markers in Arabidopsis thaliana sexual reproduction.</a> Journal of Experimental Botany. 58 (15), 4027-4035 (2007).</li><li>Wilson, S. M., Bacic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+plant+cells+for+transmission+electron+microscopy+to+optimize+immunogold+labeling+of+carbohydrate+and+protein+epitopes.">Preparation of plant cells for transmission electron microscopy to optimize immunogold labeling of carbohydrate and protein epitopes.</a> Nature Protocols. 7 (9), 1716-1727 (2012).</li><li>Gane, A., Clarke, A., Bacic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+and+expression+of+arabinogalactan-proteins+in+the+ovaries+of+Nicotiana+alata+Link+and+Otto.">Localization and expression of arabinogalactan-proteins in the ovaries of Nicotiana alata Link and Otto.</a> Sex Plant Reproduction. 8, 278-282 (1995).</li><li>Coimbra, S., Salema, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunolocalization+of+arabinogalactan+proteins+in+Amaranthus+hypocondriacus+L.+ovules.">Immunolocalization of arabinogalactan proteins in Amaranthus hypocondriacus L. ovules.</a> Protoplasma. 199 (1-2), 75-82 (1997).</li><li>Coimbra, S., Duarte, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabinogalactan+proteins+may+facilitate+the+movement+of+pollen+tubes+from+the+stigma+to+the+ovules+in+Actinidia+deliciosa+and+Amaranthus+hypocondriacus.">Arabinogalactan proteins may facilitate the movement of pollen tubes from the stigma to the ovules in Actinidia deliciosa and Amaranthus hypocondriacus.</a> Euphytica. 133 (2), 171-178 (2003).</li><li>El-Tantawy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabinogalactan+protein+profiles+and+distribution+patterns+during+microspore+embryogenesis+and+pollen+development+in+Brassica+napus.">Arabinogalactan protein profiles and distribution patterns during microspore embryogenesis and pollen development in Brassica napus.</a> Plant Reproduction. 26 (3), 231-243 (2013).</li><li>Costa, M., Pereira, A. M., Rudall, P. J., Coimbra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunolocalization+of+arabinogalactan+proteins+(AGPs)+in+reproductive+structures+of+an+early-divergent+angiosperm,+Trithuria+submersa+(Hydatellaceae).">Immunolocalization of arabinogalactan proteins (AGPs) in reproductive structures of an early-divergent angiosperm, Trithuria submersa (Hydatellaceae).</a> Annals of Botany. 111 (2), 183-190 (2013).</li><li>Costa, M., Sobral, R., Ribeiro Costa, M. M., Amorim, M. I., Coimbra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+presence+of+arabinogalactan+proteins+and+pectins+during+Quercus+suber+male+gametogenesis.">Evaluation of the presence of arabinogalactan proteins and pectins during Quercus suber male gametogenesis.</a> Annals of Botany. 115 (1), 81-92 (2015).</li><li>Hibbs, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Immunolabelling.">Fluorescence Immunolabelling.</a> Confocal Microscopy for Biologists. , (2004).</li><li>Johnson, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fading+of+Immunofluorescence+during+microscopy:+A+Study+of+the+Phenomenon+and+its+Remedy.">Fading of Immunofluorescence during microscopy: A Study of the Phenomenon and its Remedy.</a> Journal of Immunological Methods. 55 (2), 231-242 (1982).</li><li>Baird, T. R., Kaufman, D., Brown, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mercury+Free+Microscopy:+An+Opportunity+for+Core+Facility+Directors.">Mercury Free Microscopy: An Opportunity for Core Facility Directors.</a> Journal of Biomolecular Techniques. 25 (2), 48-53 (2014).</li><li>Weber, G. F., Menko, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Color+image+acquisition+using+a+monochrome+camera+and+standard+fluorescence+filter+cubes.">Color image acquisition using a monochrome camera and standard fluorescence filter cubes.</a> BioTechniques. 38 (1), 52-56 (2005).</li></ol>

Den fluorescerende immunolocalization metode i planter her beskrevet, mens problemfrit ligetil, er afhængig af succesen med flere små trin. Den første er prøveforberedelse og fiksering. I løbet af dette første trin anvendes en blanding af formaldehyd og glutaraldehyd til at krydse størstedelen af cellekomponenterne. Formaldehyd i opløsningen giver en mild og reversibel fiksering, mens glutaraldehyd giver en stærk mere permanent sammenkobling; balancen mellem de to fikseringsmidler giver en passende mængde kryds...

Plantecellevægge er komplekse strukturer bestående af polysaccharider og glycoproteiner. Cellevægge er ekstremt dynamiske strukturer, hvis arkitektur, organisation og sammensætning varierer afhængigt af celletype, lokalisering, udviklingsstadium, eksterne og interne stimuli1. Arabinogalactan proteiner (AGP) og pektiner er vigtige komponenter i plantecellevæggen. AGP'er er meget glykosylerede proteiner, og pektiner er homogalacturonan polysaccharider, hvis sammensætning, mængde og struktur varierer meget i forskellige planteudviklingsstadier2,3,4. AGP'er og pektinundersøgelser har afsløret deres involvering i flere planteprocesser såsom programmeret celledød, reaktion på abiotiske belastninger, seksuel plantegengivelse, blandt mange andre5. De fleste af disse undersøgelser startede med oplysninger fra immunolocaliseringsundersøgelser.
I betragtning af dens kompleksitet kræver studiet af cellevægge mange forskellige værktøjer. Påvisning af glycan epitoper ved hjælp af monoklonale antistoffer (mAbs) er en værdifuld tilgang til at løse polysaccharid og glycoprotein distribution langs denne struktur. Der er en stor samling af mAb'er til rådighed til påvisning af glycan epitoper, og specificiteten af hver mAb forbedres løbende samt6. Teknikken her beskrevet gælder for alle plantearter, og er et perfekt værktøj til at guide fremtidige forskningsretninger, der kan involvere dyrere og komplekse teknikker.
I denne teknik er specifikke antistoffer kemisk konjugeret til fluorescerende farvestoffer som FITC (fluorescein isothiocyanat), TRITC (tetramethylrhodamin-5-(og 6)-isothiocyanat) eller flere Alexa Fluor farvestoffer. Immunofluorescens giver flere fordele, så en klar og hurtig subcellulær lokalisering af glycaner, der kan observeres direkte under et fluorescensmikroskop. Det er meget specifikt og følsomt, da forberedelsen af prøven effektivt kan beskytte antigenets naturlige struktur, selvom det er til stede i lavere mængder. Det gør det muligt at detektere flere antigener i samme prøve og vigtigst af alt, tilbyder høj kvalitet og visuelt smukke resultater. På trods af den store magt, der tilbydes af fluorescens immunolocalization undersøgelser, er de ofte betragtes som vanskelige at udføre og gennemføre sandsynligvis på grund af manglen på detaljerede protokoller gør det muligt at visualisering af de forskellige trin i proceduren. Her giver vi nogle enkle retningslinjer for, hvordan man udfører denne teknik, og hvordan man får billeder i høj kvalitet.
For den protokol, der præsenteres her, skal prøver først fastgøres og integreres ved hjælp af det mest passende fikseringsmiddel. Selvom det betragtes som en tidskrævende og relativt kedelig teknik, er korrekt fiksering og indlejring af planteprøven nøglen til at sikre en vellykket immunolocaliseringsanalyse. Til dette formål er den mest almindelige kemisk fiksering ved hjælp af crosslinking fikseringsmidler, som aldehyder. Krydssammenhængende fikseringsmidler etablerer kemiske bindinger mellem molekyler af vævet, stabiliserer og hærder prøven. Formaldehyd og glutaraldehyd er krydssammenhængende fikseringsmidler, og nogle gange anvendes en blanding af begge fikseringsmidler7. Formaldehyd giver stor strukturel bevarelse af væv og i længere tid, producerer små væv tilbagetrækninger og er forenelig med immunostaining. Glutaraldehyd er et stærkere og stabilt fikseringsmiddel, der normalt anvendes i kombination med formaldehyd. Brugen af glutaraldehyd har nogle ulemper, der skal tages i betragtning, da det introducerer nogle frie aldehydgrupper i det faste væv, hvilket kan generere en vis uspecifik mærkning. Også krydsfeltet mellem proteiner og andre molekyler lejlighedsvis kan gøre nogle mål epitoper utilgængelige for antistoffer. For at undgå dette skal fastgørelsens mængde og varighed defineres omhyggeligt.
Efter fiksering er prøver indlejret i den rigtige harpiks for at hærde, før de får sektionerne. London Harpiks (LR-White) akryl harpiks er harpiks valg for immunolocalization undersøgelser. I modsætning til andre harpikser er LR-White hydrofil, hvilket gør det muligt for antistofferne at nå deres antigener uden behov for nogen behandling for at lette det. LR-White har også den fordel, at tilbyde lav auto-fluorescens, så en reduktion i baggrundsstøj under immunfluorescens imaging.
Der er mange farvning teknikker til rådighed til at opdage forskellige komponenter i cellevæggen, såsom Alcian blå farvning, toluidin blå farvning eller Periodisk syre-Schiff (PAS) farvning. Ingen af disse giver kraften i immunolocaliseringsanalyser8. Denne tilgang giver større specificitet i påvisning af glykaner, der tilbyder langt mere information om cellevæg sammensætning og struktur.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:728px;" width="728">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">25% (w/v) Gluteraldehyde</td>
			<td style="width:99px;">Agar Scientific</td>
			<td style="width:196px;">AGR1010</td>
			<td style="width:187px;">aq. Solution, methanol free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">8 wells Glass reaction slides</td>
			<td style="width:99px;">Marinfeld</td>
			<td style="width:196px;">MARI1216750</td>
			<td style="width:187px;">other brands may be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:196px;">A6283</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Anti-Rat IgG (wole molecule)-FITC antibody produce in GOAT</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:196px;">F6258</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:247px;">cover slips, 24 mm x 50 mm</td>
			<td style="width:99px;">Marinfeld</td>
			<td>MARI0100222</td>
			<td style="width:187px;">The cover slip should cover all the wells. Other brands may be used&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:247px;">ddH2O</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Ethanol absolute</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Fluorescent brightner 28</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:196px;">F-6259</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Gelatin capsules</td>
			<td style="width:99px;">Agar scientific</td>
			<td>AGG29211</td>
			<td style="width:187px;">The capsule size sould feat the size of the sample.</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:247px;">Glass vials</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;">Any simple unexpensive glass vials that can be sealed, may be used. The vials may be clean with 96% etanol after use to remove LR-White residue and reused.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="294">
			<td height="294" style="height:294px;width:247px;">LR-white medium grade, embdeding resin</td>
			<td style="width:99px;">Agar Scientific</td>
			<td>AGR1281</td>
			<td style="width:187px;">LR-White comes in several forms the medium grade provides na adequate cutting suport for most tissues for harder tissues a harder grade of LR-white may be recomendable. If possible use a resin already mixed with the polimeration activator (benzoyl peroxide), if not please folow the instructions of the suplier to prepare the resin.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Non fat dry milk</td>
			<td style="width:99px;">Nestl&#233;</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;">any non fat dry milk is adequate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Oven</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;">generic laboratory oven</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Petri dish, 10 cm x 10 cm square</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">PIPES</td>
			<td style="width:99px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:196px;">P1851</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="357">
			<td height="357" style="height:357px;width:247px;">Rat generated Monoclonal Anti-Body</td>
			<td style="width:99px;">Plant probes</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;">Several antibodies that recognize cell wall components are 
			available at both the Complex Carbohydrate research center 
			(CCRC, Georgia University USA) and Plant Probes (Paul 
			Knox Cell Wall Lab, at Leeds University UK). A short list of 
			some commonly used MABS and where they can be purchased 
			is presented in Supplemental Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Razor blades</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;">regular razor blades</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">SDS</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:196px;">L6026</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Toluidine Blue-O</td>
			<td style="width:99px;">Agar Scientific</td>
			<td>AGR1727</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Tween 20</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:196px;">P9416</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Ultramicrotome</td>
			<td style="width:99px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:196px;">UC7</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:247px;">upright epifluorescence microscope with UV and FITC fluorescence filters</td>
			<td style="width:99px;">Leica Mycrosistems</td>
			<td style="width:196px;">DMLb</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">vaccum chamber</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">vaccum pump</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="297">
			<td height="297" style="height:297px;width:247px;">Vectashield</td>
			<td style="width:99px;">vecta Labs</td>
			<td style="width:196px;">T-1000</td>
			<td style="width:187px;">Other anti-fade may be used. Please do check for compatibility with FITC and the Fluorescente brightner 28. (Note: for a non-commercial alternative, (see Jonhson et al 198218) An antifade medium can be made by mixing 25 mg/mL of 1,4-Diazobicyclo-(2,2,2)octane (DABCO) in 9:1 (v/v) glycerol to 1xPBS. Adjust pH to 8.6 with diluted HCl.)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescent immunolocalization of arabinogalactan proteins and pectins in the cell wall of plant tissues

Planteudvikling indebærer konstante justeringer af cellevæggens sammensætning og struktur som reaktion på både interne og eksterne stimuli. Cellevægge består af cellulose og ikke-celluloseiske polysaccharider sammen med proteiner, phenolforbindelser og vand. 90% af cellevæggen består af polysaccharider (f.eks. pectiner) og arabinogalactanproteiner (AGP). Den fluorescerende immunolocalisering af specifikke glycan epitoper i plante histologiske sektioner forbliver et vigtigt redskab til at afdække remodeling af vægpolysaccharidnetværk, struktur og komponenter.
Her rapporterer vi en optimeret fluorescerende immunolocaliseringsprocedure til påvisning af glycan epitoper fra AGP'er og pektiner i plantevæv. Paraformaldehyd/glutaraldehydfiksering blev anvendt sammen med LR-White indlejring af planteprøverne, hvilket giver mulighed for en bedre bevarelse af vævsstrukturen og sammensætningen. Tynde dele af de indlejrede prøver opnået med en ultramikromit blev brugt til immunolocalisering med specifikke antistoffer. Denne teknik giver stor opløsning, høj specificitet, og chancen for at opdage flere glycan epitoper i samme prøve. Denne teknik tillader subcellulær lokalisering af glycaner og registrerer deres akkumuleringsniveau i cellevæggen. Det giver også mulighed for at bestemme spatio-tidsmæssige mønstre af AGP og pectin distribution under udviklingsprocesser. Brugen af dette værktøj kan i sidste ende guide forskningsretninger og forbinde glycaner med specifikke funktioner i planter. Desuden kan de indhentede oplysninger supplere biokemiske undersøgelser og genekspressionsundersøgelser.

I et vellykket eksperiment vil det sekundære antistof specifikt lokalisere placeringen af den specifikke epitop i lysegrøn, på en ensartet måde, hvilket giver mulighed for karakterisering af cellevægsammensætningen i et bestemt udviklingsstadium i cellen, vævet eller organet. For eksempel LM6 antistof har en høj affinitet for 1,5-arabinan, en forbindelse med type-I rhamnogalacturonan, der kan findes rigeligt mærkning cellevæggen af den udviklende Quercus suber anther (Figur 2A</str...

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescent Immunolocalization of Arabinogalactan Proteins and Pectins in the Cell Wall of Plant Tissues at JoVE.com

Fluorescent Immunolocalization of Arabinogalactan Proteins and Pectins in the Cell Wall of Plant Tissues

Denne protokol beskriver i detaljer, hvordan plantematerialet til immunolocalisering af Arabinogalactan proteiner og pektiner er fastgjort, indlejret i en hydrofil akrylharpiks, sektionsopdelt og monteret på glasrutsjebaner. Vi viser cellevæg relaterede epitoper vil blive opdaget med specifikke antistoffer.

Fluorescerende immunolocalisering af Arabinogalactan proteiner og pektiner i cellevæggen af plantevæv

Plant development involves constant adjustments of the cell wall composition and structure in response to both internal and external stimuli. Cell walls ...

Mængden af information fra kun ét eksperiment er enorm. Vi kan opdage tilstedeværelsen af disse cellevæg polymerer og vide præcis, hvordan de distribueres i celler og væv, og endda bestemme deres overflod. Denne metode er udformet på en sådan måde, at den kan anvendes på næsten enhver form for plantevæv fra enhver art, man måtte ønske at analysere.Immunolocalization i plantevæv indebærer en masse omhyggeligt arbejde, svært at forklare uden faktisk at se, hvad der sker. Før du samler plantevævsprøven, fyldes et glasglas med nok kold fiksativ opløsning til helt at nedsænke alle prøverne. Vælg derefter de plantevæv, der skal analyseres, og trim prøverne til en størrelse på højst 16 kvadratmillimeter.Prøverne nedsænkes straks i fikseringsopløsningen. Glutaraldehyd og formaldehyd er begge fremragende fikseringsmidler, men begge er farlige og skal håndteres i flowhætten. Overfør hætteglasset til et vakuumkammer og påfør langsomt vakuum.Når trykket når negative 60 kilo pascals, begynder det flydende materiale i hætteglasset at synke til bunden. Hold trykket i kammeret på højst negative 80 kilo pascals. Forliset kan tage op til to timer.Når prøverne har været i vakuumkammeret i to timer, skal vakuumet langsomt slippes. Forsegl glasglasset og nedkøl det natten over ved fire grader Celsius. Efter fikseringen fra den ene dag til den anden skal du kassere eventuelle prøver, der ikke synker til bunden af hætteglasset.Vask de resterende prøver med 25 millimolar PBS i 10 minutter og vask dem derefter i 25 millimolar PIPES buffer i 20 minutter. Det er ekstremt vigtigt at fjerne alle flydende prøver, fordi det er meget sandsynligt, at fikseringsmiddel ikke har trængt ind i prøven. Dehydrer prøverne i en ethanolserie og nedsænke prøverne i 20 minutter ved hver ethanolkoncentration.For at gennemgå prøverne tilsættes stigende koncentrationer af LR-hvid harpiks i ethanol, begyndende med en del harpiks til tre dele ethanol. Ved hver koncentration inkuberes i 24 timer ved fire grader Celsius. Udskift LR-hvid harpiks med frisk harpiks og inkuber prøverne i yderligere 12 timer ved fire grader Celsius.Forbered indlejring gelatine kapsler, vælge kapsler, der er lidt større end prøverne, så prøverne kan være helt lukket i harpiksen. Label papir tags med blyant, fordi blæk vil forurene harpiksen. Påfør en dråbe frisk LR-hvid harpiks på bunden af hver kapsel.Placer en prøve i hver kapsel, og fyld derefter kapslerne til maksimal kapacitet med frisk harpiks. Sæt hætten på kapslen og tryk forsigtigt for at forsegle den. For at polymerisere harpiksen skal du helbrede kapslerne ved 58 grader Celsius, indtil de er fuldt hærdet omkring 24 til 48 timer.Efter skrælning af gelatinekapslen fra LR-hvid harpiks, skal du placere harpiksblokken under stereomikroskopet. Ved hjælp af et skarpt barberblad skal du trimme den LR-hvide blok i en 45 graders vinkel til prøven. Roter prøven og lav et andet snit i en 90 graders vinkel til den første.Fortsæt med at skære i samme mønster for at danne en pyramide med toppen af pyramiden direkte over prøvens interesseområde, og begynd derefter at fjerne fine skiver vinkelret på hovedaksen, indtil skærefladen når prøven. Målprøven bør ideelt set være indkapslet i trapezform. Placer den trimmede harpiksblok i ultramikrtomen.Juster vinklen mellem knivkanten og harpiksblokken. Skær sektioner fra blokken med en tykkelse mellem 200 og 700 nanometer. Brug en trådsløjfe til forsigtigt at løfte nogle samplede sektioner fra mikrotomen.Placer dem i en dråbe destilleret deioniseret vand på en glasrutsjebane. Fordamp vandet ved at placere rutsjebanen på en kogeplade ved 50 grader Celsius, og tilsæt derefter en dråbe plet til sektionerne. Efter 30 sekunder skylles pletten af og observeres rutsjebanen under mikroskopet for at kontrollere sektionens generelle tilstand, og at den ønskede plantestruktur er synlig.Forbered en ren reaktion dias ved at placere en dråbe destilleret deioniseret vand i hver brønd af diaset. Overfør en eller to prøvesektioner til hver dråbe vand. Placer rutsjebanen i en 10 centimeter firkantet petriskål, dæk den og lad den tørre ved 50 grader Celsius.For at forberede et inkubationskammer til reaktionsdiasene skal du placere nogle dæmpede papirhåndklæder i bunden af en pipettespidskasse og pakke kassen med aluminiumsfolie. Overfør diasene fra kassen til inkubationskammeret. Pipette 50 mikroliter af blokeringsopløsning i hver brønd.Når du har inkuberet rutsjebanen i 10 minutter, skal du fjerne blokeringsopløsningen og derefter vaske alle brøndene to gange med PBS i 10 minutter hver gang. Efter at have forberedt de primære antistofopløsninger som beskrevet i manuskriptet, skal du udføre en endelig vask af brøndene med destilleret deioniseret vand i fem minutter. Pipetter den primære antistofopløsning ind i reaktionsbrøndene, og rør derefter blokeringsopløsningen ind i kontrolbrøndene.Luk inkubationskammeret. Lad det stå i to timer ved stuetemperatur og derefter køle det natten over ved fire grader Celsius. Forbered en 1%opløsning af det sekundære antistof i blokeringsopløsning.Der vil være behov for ca. 40 mikroliter pr. brønd. Dæk opløsningen med aluminiumsfolie. Vask reaktionsrutsjebanens brønde to gange med PBS og en gang med destilleret deioniseret vand i 10 minutter hver gang.Sørg for, at der ikke er nogen blokeringsopløsning eller aflejringer tilbage i brøndene. Pipetter den sekundære antistofopløsning ind i alle brøndene. Inkubere dias i mørke ved stuetemperatur i tre til fire timer.Igen, vask brønde af reaktionen dias to gange med PBS og en gang med destilleret deioniseret vand, derefter tilføje en dråbe Calcofluor White til hver brønd. Uden vask, tilsæt en dråbe montering medium til hver brønd og dække hver brønd med en coverlip. Overhold prøvesektionerne i reaktionsdiaset ved hjælp af et fluorescensmikroskop.For hver observation skal du bruge et UV-filter til at detektere cellevægge, der er farvet af Calcofluor og et FITC-filter til at detektere immunolocalisering. Hvis du vil have en bedre visualisering af resultaterne, kan du bruge ImageJ eller et lignende billedanalyseprogram til at flette hvert UV-filterbillede med det tilsvarende FITC-filterbillede. Ved at lokalisere lokaliseringen af specifikke epitoper muliggør protokollen karakterisering af cellevæggens sammensætning.For eksempel er 1, 5-arabinan rigelig i cellevæggen af den udviklende Quercus suber anther. Næppe esterificeret homogalacturonans findes typisk på rodspidsen af Quercus suber embryo specificere mekaniske egenskaber af organet. Xylogalacturonans findes i degenererende celler, såsom endosperm celle i de sidste faser af Quercus suber agern modning.AGP's epitoper anerkendt af JIM13 eller JIM8 findes på strukturer relateret til reproduktion, såsom cellelinjer relateret til mikrogametogenese i Arabidopsis thaliana og den stigmatiske papiller og mikrobielle af den basale angiosperm Trithuria submersa. Almindelige fejl i implementeringen af denne protokol er normalt nemme at opdage og identificere. Når vaskene springes over, eller reaktionsbrøndene får lov til at tørre, vises det sekundære antistof normalt som et smøremiddel.Aggregater af grøn fluorochrom dannes, hvis det ubundne primære antistof ikke vaskes ordentligt væk. Foldning eller løsrivelse af sektionerne er normalt relateret til dårlig vedhæftning på grund af brugen af urene dias eller aggressiv vask. Prøveforberedelse er også kritisk.Harpiksblokkene skal være fri for revner med en tydeligt synlig lysegul til lysebrun prøve. Ineffektivt indlejrede prøver vil vise pulverformige hvide pletter eller områder. Det er vigtigt at holde prøvestørrelsen under otte millimeter for at trænge ind i fikseringsopløsningen.Dårligt faste prøver vises mørkebrune eller næsten sorte. For høj temperatur kan få harpiksen til at revne, hvilket gør det umuligt at dele prøven. Brugen af immunolocaliseringsteknikker åbner flere forskningsretninger.Man kan følge op med mere specifikke teknikker såsom biokemisk analyse af cellevæggen eller endda gå videre til en molekylær tilgang. Resultaterne af denne teknik kan bidrage til at forstå sammensætningen af cellevæggen, en ekstremt kompleks struktur meget vanskelig at analysere ved simpel kemisk analyse.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

Ekspression af fluorescerende proteiner i<em&gt; Branchiostoma lanceolatum</em&gt; Af mRNA Injektion i befrugtede oocytter

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the ...

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

En ny mammedisk fedtpudstransplantationsteknik til visualisering af fartøjsgenerering af vaskulære endotelceller

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissektion og immunfluorescent farvning af champignon krop og fotoreceptor neuroner i voksen Drosophila melanogaster hjerner

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Hele-mount Clearing og farvning af Arabidopsis blomst organer og Siliques

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Immuno-fluorescerende mærkning af mikrotubuli og Centrosomal proteiner i Ex Vivo tarmens væv og 3D In Vitro tarm Organoids

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone

Vævs præparation og immun farvning af mus craniofacial væv og Undecalcificeret knogle

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and ...

Use of Atomic Force Microscopy to Measure Mechanical Properties and Turgor Pressure of Plant Cells and Plant Tissues

Anvendelse af atomkraften mikroskopi til måling af mekaniske egenskaber og turgor tryk af planteceller og plantevæv

We present here the use of atomic force microscopy to indent plant tissues and recover its mechanical properties. Using two different microscopes in ...

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Live Cell Imaging af Microtubule Cytoskeleton og mikromekanisk manipulation af Arabidopsis Skyd Apical Meristem

Understanding cell and tissue level regulation of growth and morphogenesis has been at the forefront of biological research for many decades. Advances in ...

Isolation of Endocardial and Coronary Endothelial Cells from the Ventricular Free Wall of the Rat Heart

Isolering af endokardie- og koronarenendotelceller fra den ventrikelfrie frie væg af rottehjertet

It has been shown that endocardial endothelial cells (EECs) and coronary endothelial cells (CECs) differ in origin, development, markers, and functions. ...