Name: fluorescent immunolocalization of arabinogalactan proteins and pectins in the cell wall of plant tissues
Uploaded: 2021-02-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescent Immunolocalization of Arabinogalactan Proteins and Pectins in the Cell Wall of Plant Tissues at JoVE.com

De auteurs ontvingen steun van het EU-project 690946 'SexSeed' (Sexual Plant Reproduction – Seed Formation) gefinancierd door H2020-MSCA-RISE-2015 en SeedWheels FCT PTDC/BIA-FBT/27839/2017. AMP ontving een subsidie van het MSCA-IF-2016-project van de Europese Unie (nr. 753328). MC ontving een subsidie van FCT PhD grant SFRH/BD/111781/2015.

1. Monstervoorbereiding: fixatie, uitdroging en LR-White inbedding
<ol><li>Fixatie en uitdroging OPMERKING: Het fixatieproces is van cruciaal belang om het monster te behouden; door moleculen met elkaar te verbinden wordt het cellulaire metabolisme gestopt, waardoor de cellulaire integriteit wordt gewaarborgd en moleculaire diffusie wordt voorkomen. De fixatieve middelen en de gebruikte concentratie moeten daartoe worden aangepast, zodat de antigenen voldoende worden blootgesteld om met de antilicha...

<ol>
	<li>Keegstra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+Cell+Walls.">Plant Cell Walls.</a> Plant Physiology. 154 (2), 483-486 (2010).</li><li>Pereira, A. M., Lopes, A. L., Coimbra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabinogalactan+Proteins+as+Interactors+along+the+Crosstalk+between+the+Pollen+Tube+and+the+Female+Tissues.">Arabinogalactan Proteins as Interactors along the Crosstalk between the Pollen Tube and the Female Tissues.</a> Frontiers in Plant Science. 7 (7), (2016).</li><li>Showalter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabinogalactan-proteins:+structure,+expression+and+function.">Arabinogalactan-proteins: structure, expression and function.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 58 (10), 1399-1417 (2001).</li><li>Majewska-Sawka, A., Nothnagel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multiple+roles+of+arabinogalactan+proteins+in+plant+development.">The multiple roles of arabinogalactan proteins in plant development.</a> Plant Physiology. 122, 3-9 (2000).</li><li>Seifert, G., Roberts, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+arabinogalactan+proteins.">The biology of arabinogalactan proteins.</a> Annual Review of Plant Biology. 58, 137-161 (2007).</li><li>Ruprecht, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Synthetic+Glycan+Microarray+Enables+Epitope+Mapping+of+Plant+Cell+Wall+Glycan-Directed+Antibodies.">A Synthetic Glycan Microarray Enables Epitope Mapping of Plant Cell Wall Glycan-Directed Antibodies.</a> Plant Physiology. 175 (3), 1094-1104 (2017).</li><li>Verhertbruggen, Y., Walker, J. L., Guillon, F., Scheller, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparative+Study+of+Sample+Preparation+for+Staining+and+Immunodetection+of+Plant+Cell+Walls+by+Light+Microscopy.">A Comparative Study of Sample Preparation for Staining and Immunodetection of Plant Cell Walls by Light Microscopy.</a> Frontiers in Plant Science. 29 (8), 1505 (2017).</li><li>Osborn, M., Weber, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+and+immunocytochemical+procedures+with+affinity+purified+antibodies:+tubulin+containing+structures.">Immunofluorescence and immunocytochemical procedures with affinity purified antibodies: tubulin containing structures.</a> Methods in Cell Biology. 24, 97-132 (1982).</li><li>Coimbra, S., Almeida, J., Junqueira, V., Costa, M., Pereira, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabinogalactan+proteins+as+molecular+markers+in+Arabidopsis+thaliana+sexual+reproduction.">Arabinogalactan proteins as molecular markers in Arabidopsis thaliana sexual reproduction.</a> Journal of Experimental Botany. 58 (15), 4027-4035 (2007).</li><li>Wilson, S. M., Bacic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+plant+cells+for+transmission+electron+microscopy+to+optimize+immunogold+labeling+of+carbohydrate+and+protein+epitopes.">Preparation of plant cells for transmission electron microscopy to optimize immunogold labeling of carbohydrate and protein epitopes.</a> Nature Protocols. 7 (9), 1716-1727 (2012).</li><li>Gane, A., Clarke, A., Bacic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+and+expression+of+arabinogalactan-proteins+in+the+ovaries+of+Nicotiana+alata+Link+and+Otto.">Localization and expression of arabinogalactan-proteins in the ovaries of Nicotiana alata Link and Otto.</a> Sex Plant Reproduction. 8, 278-282 (1995).</li><li>Coimbra, S., Salema, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunolocalization+of+arabinogalactan+proteins+in+Amaranthus+hypocondriacus+L.+ovules.">Immunolocalization of arabinogalactan proteins in Amaranthus hypocondriacus L. ovules.</a> Protoplasma. 199 (1-2), 75-82 (1997).</li><li>Coimbra, S., Duarte, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabinogalactan+proteins+may+facilitate+the+movement+of+pollen+tubes+from+the+stigma+to+the+ovules+in+Actinidia+deliciosa+and+Amaranthus+hypocondriacus.">Arabinogalactan proteins may facilitate the movement of pollen tubes from the stigma to the ovules in Actinidia deliciosa and Amaranthus hypocondriacus.</a> Euphytica. 133 (2), 171-178 (2003).</li><li>El-Tantawy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabinogalactan+protein+profiles+and+distribution+patterns+during+microspore+embryogenesis+and+pollen+development+in+Brassica+napus.">Arabinogalactan protein profiles and distribution patterns during microspore embryogenesis and pollen development in Brassica napus.</a> Plant Reproduction. 26 (3), 231-243 (2013).</li><li>Costa, M., Pereira, A. M., Rudall, P. J., Coimbra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunolocalization+of+arabinogalactan+proteins+(AGPs)+in+reproductive+structures+of+an+early-divergent+angiosperm,+Trithuria+submersa+(Hydatellaceae).">Immunolocalization of arabinogalactan proteins (AGPs) in reproductive structures of an early-divergent angiosperm, Trithuria submersa (Hydatellaceae).</a> Annals of Botany. 111 (2), 183-190 (2013).</li><li>Costa, M., Sobral, R., Ribeiro Costa, M. M., Amorim, M. I., Coimbra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+presence+of+arabinogalactan+proteins+and+pectins+during+Quercus+suber+male+gametogenesis.">Evaluation of the presence of arabinogalactan proteins and pectins during Quercus suber male gametogenesis.</a> Annals of Botany. 115 (1), 81-92 (2015).</li><li>Hibbs, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Immunolabelling.">Fluorescence Immunolabelling.</a> Confocal Microscopy for Biologists. , (2004).</li><li>Johnson, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fading+of+Immunofluorescence+during+microscopy:+A+Study+of+the+Phenomenon+and+its+Remedy.">Fading of Immunofluorescence during microscopy: A Study of the Phenomenon and its Remedy.</a> Journal of Immunological Methods. 55 (2), 231-242 (1982).</li><li>Baird, T. R., Kaufman, D., Brown, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mercury+Free+Microscopy:+An+Opportunity+for+Core+Facility+Directors.">Mercury Free Microscopy: An Opportunity for Core Facility Directors.</a> Journal of Biomolecular Techniques. 25 (2), 48-53 (2014).</li><li>Weber, G. F., Menko, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Color+image+acquisition+using+a+monochrome+camera+and+standard+fluorescence+filter+cubes.">Color image acquisition using a monochrome camera and standard fluorescence filter cubes.</a> BioTechniques. 38 (1), 52-56 (2005).</li></ol>

De fluorescerende immunolocalisatiemethode in planten hier beschreven, hoewel naadloos eenvoudig, is gebaseerd op het succes van verschillende kleine stappen. De eerste is monstervoorbereiding en fixatie. Tijdens deze eerste stap wordt een mengsel van formaldehyde en glutaraldehyde gebruikt om de meerderheid van de celcomponenten te kruisen. De formaldehyde in de oplossing zorgt voor een milde en omkeerbare fixatie, terwijl de glutaraldehyde een sterke, meer permanente koppeling biedt; het evenwicht tussen de twee fixati...

Plantencelwanden zijn complexe structuren die bestaan uit polysachariden en glycoproteïnen. Celwanden zijn uiterst dynamische structuren waarvan de architectuur, organisatie en samenstelling variëren afhankelijk van celtype, lokalisatie, ontwikkelingsfase, externe en interne stimuli1. Arabinogalactan-eiwitten (APP's) en pectines zijn belangrijke componenten van de plantencelwand. APP 's zijn sterk geglycosyleerde eiwitten en pectines zijn homogalacturonan polysachariden waarvan de samenstelling, hoeveelheid en structuur sterk variëren tijdens verschillende ontwikkelingsstadia2,3,4. ASP's en pectinestudies hebben hun betrokkenheid bij verschillende plantprocessen aan het licht gebracht, zoals geprogrammeerde celdood, reactie op abiotische stress, seksuele plantenreproductie, en vele anderen5. De meeste van deze studies begonnen met informatie verkregen uit immunolocalisatiestudies.
Gezien de complexiteit vereist de studie van celwanden veel verschillende hulpmiddelen. Detectie van glycan epitopen met behulp van monoklonale antilichamen (mAbs) is een waardevolle aanpak om polysaccharide en glycoproteïne distributie langs deze structuur op te lossen. Er is een grote verzameling mAbs beschikbaar om glycan epitopen te detecteren en de specificiteit van elke mAb wordt ook voortdurend verbeterd6. De hier beschreven techniek is toepasbaar op alle plantensoorten en is een perfect hulpmiddel om toekomstige onderzoeksrichtingen te sturen die duurdere en complexere technieken met zich mee kunnen brengen.
In deze techniek worden specifieke antilichamen chemisch geconjugeerd aan fluorescerende kleurstoffen zoals FITC (fluoresceïne-isothiocyanaat), TRITC (tetramethylrhodamine-5-(en 6)-isothiocyanaat) of verschillende Alexa Fluorkleurstoffen. Immunofluorescentie biedt verschillende voordelen, waardoor een duidelijke en snelle subcellulaire lokalisatie van glycanen mogelijk is die direct kan worden waargenomen onder een fluorescentiemicroscoop. Het is zeer specifiek en gevoelig, omdat de bereiding van het monster de natuurlijke structuur van het antigeen effectief kan beschermen, zelfs als het in lagere hoeveelheden aanwezig is. Het maakt de detectie van meerdere antigenen in hetzelfde monster mogelijk en het belangrijkste, biedt hoge kwaliteit en visueel mooie resultaten. Ondanks de grote kracht die wordt geboden door fluorescentie-immunolocalisatiestudies, worden ze vaak beschouwd als moeilijk uit te voeren en te implementeren, waarschijnlijk vanwege het ontbreken van gedetailleerde protocollen die de visualisatie van de verschillende stappen van de procedure mogelijk maken. Hier geven we enkele eenvoudige richtlijnen voor het uitvoeren van deze techniek en het verkrijgen van afbeeldingen van hoge kwaliteit.
Voor het protocol dat hier wordt gepresenteerd, moeten monsters eerst worden bevestigd en ingesloten met behulp van het meest geschikte fixatieve. Hoewel beschouwd als een tijdrovende en relatief vervelende techniek, is een goede fixatie en inbedding van het plantenmonster de sleutel om een succesvolle immunolocalisatietest te garanderen. Voor dit doel is chemische fixatie het meest gebruikelijk met behulp van crosslinking-fixatieven, zoals aldehyden. Cross-linking fixatieven vestigen chemische bindingen tussen moleculen van het weefsel, stabiliseren en verharden van het monster. Formaldehyde en glutaraldehyde zijn cross-linking fixatieven, en soms wordt een mix van beide fixatieven gebruikt7. Formaldehyde biedt een grote structurele conservering van weefsels en voor langere tijd, produceert kleine weefsel retracties en is compatibel met immunostaining. Glutaraldehyde is een sterker en stabiel fixatief dat meestal wordt gebruikt in combinatie met formaldehyde. Het gebruik van glutaraldehyde heeft enkele nadelen waarmee rekening moet worden gehouden, omdat het enkele vrije aldehydegroepen in het vaste weefsel introduceert, wat een aantal niet-specifieke etikettering kan genereren. Ook het kruisen tussen eiwitten en andere moleculen kan af en toe sommige doeleptopen ontoegankelijk maken voor de antilichamen. Om dit te voorkomen, moeten de hoeveelheid en duur van de fixatie zorgvuldig worden gedefinieerd.
Na fixatie worden monsters ingebed in de juiste hars om uit te harden voordat de secties worden verkregen. London Resin (LR-White) acrylhars is de hars bij uitstek voor immunolokalisatiestudies. In tegenstelling tot andere harsen is LR-White hydrofiel, waardoor de antilichamen hun antigenen kunnen bereiken, zonder dat er een behandeling nodig is om het te vergemakkelijken. LR-White heeft ook het voordeel dat het een lage autofluorescentie biedt, waardoor achtergrondgeluid tijdens immunofluorescentiebeeldvorming kan worden verkleind.
Er zijn veel kleuringstechnieken beschikbaar om verschillende componenten van de celwand te detecteren, zoals Alcaanse blauwe kleuring, toluidineblauwe kleuring of Periodieke acid-Schiff (PAS) kleuring. Geen van deze biedt de kracht van immunolocalisatieanalyses8. Deze aanpak geeft meer specificiteit in de detectie van glycanen en biedt uitgebreidere informatie over de samenstelling en structuur van de celwand.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:728px;" width="728">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">25% (w/v) Gluteraldehyde</td>
			<td style="width:99px;">Agar Scientific</td>
			<td style="width:196px;">AGR1010</td>
			<td style="width:187px;">aq. Solution, methanol free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">8 wells Glass reaction slides</td>
			<td style="width:99px;">Marinfeld</td>
			<td style="width:196px;">MARI1216750</td>
			<td style="width:187px;">other brands may be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:196px;">A6283</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Anti-Rat IgG (wole molecule)-FITC antibody produce in GOAT</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:196px;">F6258</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:247px;">cover slips, 24 mm x 50 mm</td>
			<td style="width:99px;">Marinfeld</td>
			<td>MARI0100222</td>
			<td style="width:187px;">The cover slip should cover all the wells. Other brands may be used&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:247px;">ddH2O</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Ethanol absolute</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Fluorescent brightner 28</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:196px;">F-6259</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Gelatin capsules</td>
			<td style="width:99px;">Agar scientific</td>
			<td>AGG29211</td>
			<td style="width:187px;">The capsule size sould feat the size of the sample.</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:247px;">Glass vials</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;">Any simple unexpensive glass vials that can be sealed, may be used. The vials may be clean with 96% etanol after use to remove LR-White residue and reused.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="294">
			<td height="294" style="height:294px;width:247px;">LR-white medium grade, embdeding resin</td>
			<td style="width:99px;">Agar Scientific</td>
			<td>AGR1281</td>
			<td style="width:187px;">LR-White comes in several forms the medium grade provides na adequate cutting suport for most tissues for harder tissues a harder grade of LR-white may be recomendable. If possible use a resin already mixed with the polimeration activator (benzoyl peroxide), if not please folow the instructions of the suplier to prepare the resin.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Non fat dry milk</td>
			<td style="width:99px;">Nestl&#233;</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;">any non fat dry milk is adequate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Oven</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;">generic laboratory oven</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Petri dish, 10 cm x 10 cm square</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">PIPES</td>
			<td style="width:99px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:196px;">P1851</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="357">
			<td height="357" style="height:357px;width:247px;">Rat generated Monoclonal Anti-Body</td>
			<td style="width:99px;">Plant probes</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;">Several antibodies that recognize cell wall components are 
			available at both the Complex Carbohydrate research center 
			(CCRC, Georgia University USA) and Plant Probes (Paul 
			Knox Cell Wall Lab, at Leeds University UK). A short list of 
			some commonly used MABS and where they can be purchased 
			is presented in Supplemental Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Razor blades</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;">regular razor blades</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">SDS</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:196px;">L6026</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Toluidine Blue-O</td>
			<td style="width:99px;">Agar Scientific</td>
			<td>AGR1727</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Tween 20</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:196px;">P9416</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Ultramicrotome</td>
			<td style="width:99px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:196px;">UC7</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:247px;">upright epifluorescence microscope with UV and FITC fluorescence filters</td>
			<td style="width:99px;">Leica Mycrosistems</td>
			<td style="width:196px;">DMLb</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">vaccum chamber</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">vaccum pump</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="297">
			<td height="297" style="height:297px;width:247px;">Vectashield</td>
			<td style="width:99px;">vecta Labs</td>
			<td style="width:196px;">T-1000</td>
			<td style="width:187px;">Other anti-fade may be used. Please do check for compatibility with FITC and the Fluorescente brightner 28. (Note: for a non-commercial alternative, (see Jonhson et al 198218) An antifade medium can be made by mixing 25 mg/mL of 1,4-Diazobicyclo-(2,2,2)octane (DABCO) in 9:1 (v/v) glycerol to 1xPBS. Adjust pH to 8.6 with diluted HCl.)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescent immunolocalization of arabinogalactan proteins and pectins in the cell wall of plant tissues

Plantontwikkeling omvat constante aanpassingen van de celwandsamenstelling en structuur als reactie op zowel interne als externe stimuli. Celwanden bestaan uit cellulose en niet-cellulosepolysachariden samen met eiwitten, fenolverbindingen en water. 90% van de celwand bestaat uit polysachariden (bijv. pectines) en arabinogalactan-eiwitten (APP's). De fluorescerende immunolocalisatie van specifieke glycanepotopen in histologische secties van planten blijft een belangrijk hulpmiddel om de renovatie van wandpolysaccharidenetwerken, structuur en componenten te ontdekken.
Hier rapporteren we een geoptimaliseerde fluorescerende immunolocalisatieprocedure om glycanepotopen van APP's en pectines in plantenweefsels te detecteren. Paraformaldehyde/glutaraldehyde fixatie werd gebruikt samen met LR-White inbedding van de plantenmonsters, waardoor een betere conservering van de weefselstructuur en samenstelling mogelijk was. Dunne delen van de ingebedde monsters verkregen met een ultra-microtome werden gebruikt voor immunolocalisatie met specifieke antilichamen. Deze techniek biedt een hoge resolutie, hoge specificiteit en de kans om meerdere glycan epitopen in hetzelfde monster te detecteren. Deze techniek maakt subcellulaire lokalisatie van glycanen mogelijk en detecteert hun accumulatieniveau in de celwand. Het maakt ook de bepaling van spatio-temporele patronen van AGP en pectineverdeling tijdens ontwikkelingsprocessen mogelijk. Het gebruik van deze tool kan uiteindelijk leidend zijn voor onderzoeksrichtingen en glycanen koppelen aan specifieke functies in planten. Bovendien kan de verkregen informatie een aanvulling vormen op biochemische en genexpressiestudies.

In een succesvol experiment zal het secundaire antilichaam specifiek de locatie van de specifieke epitoop in felgroen, op een consistente manier lokaliseren, waardoor de samenstelling van de celwand in een bepaald ontwikkelingsstadium van de cel, het weefsel of het orgaan kan worden gekarakteriseerd. Het LM6-antilichaam heeft bijvoorbeeld een hoge affiniteit voor 1,5-arabinan, een verbinding met type-I rhamnogalacturonan die overvloedig de celwand van de zich ontwikkelende Quercus-suber-ether <strong class="xfig...

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescent Immunolocalization of Arabinogalactan Proteins and Pectins in the Cell Wall of Plant Tissues at JoVE.com

Fluorescent Immunolocalization of Arabinogalactan Proteins and Pectins in the Cell Wall of Plant Tissues

Dit protocol beschrijft in detail hoe het plantaardige materiaal voor immunolocalisatie van Arabinogalactan-eiwitten en pectines is bevestigd, ingebed in een hydrofiele acrylhars, doorsneden en gemonteerd op glazen dia's. We laten zien dat celwandgerelateerde epitopen worden gedetecteerd met specifieke antilichamen.

Fluorescerende immunolocalisatie van Arabinogalactan-eiwitten en pectines in de celwand van plantenweefsels

Plant development involves constant adjustments of the cell wall composition and structure in response to both internal and external stimuli. Cell walls ...

De hoeveelheid informatie van slechts één experiment is enorm. We kunnen de aanwezigheid van deze celwandpolymeren detecteren en precies weten hoe ze worden verdeeld in cellen en weefsels, en zelfs hun overvloed bepalen. Deze methode is zo ontworpen dat het kan worden toegepast op bijna elke vorm van plantenweefsel van elke soort die men zou willen analyseren.Immunolocalisatie in plantenweefsels omvat veel nauwgezet werk, moeilijk uit te leggen zonder daadwerkelijk te zien wat er gebeurt. Voordat u het plantenweefselmonster verzamelt, vult u een glazen flacon met voldoende koude fixatieve oplossing om alle monsters volledig onder te dompelen. Selecteer vervolgens de te analyseren plantenweefsels en trim de monsters tot een grootte van niet meer dan 16 vierkante millimeter.Dompel de monsters onmiddellijk onder in de fixatieve oplossing. Glutaraldehyde en formaldehyde zijn beide uitstekende fixatieven, maar beide zijn gevaarlijk en moeten in de stroomkap worden behandeld. Breng de flacon over in een vacuümkamer en breng langzaam vacuüm aan.Wanneer de druk 60 kilo negatief is, begint het zwevende materiaal in de flacon naar de bodem te zinken. Houd de druk in de kamer op niet meer dan negatieve 80 kilo pascals. Het zinken kan tot twee uur duren.Nadat de monsters twee uur in de vacuümkamer hebben gezeten, laat u het vacuüm langzaam los. Sluit de glazen flacon af en koel deze 's nachts op vier graden Celsius. Gooi na de nachtelijke fixatie alle monsters weg die niet naar de bodem van de injectieflacon zijn gezonken.Was de resterende monsters gedurende 10 minuten met 25 millimolar PBS en was ze vervolgens gedurende 20 minuten in 25 millimolar PIPES buffer. Het is uiterst belangrijk om alle drijvende monsters te verwijderen, omdat het zeer waarschijnlijk is dat het fixatieve niet in het monster is doorgedrongen. Droog de monsters uit in een ethanolreeks en dompel de monsters gedurende 20 minuten onder bij elke ethanolconcentratie.Om de monsters te doordrenken, voegt u toenemende concentraties LR-witte hars toe in ethanol, te beginnen met een deelhars tot drie delen ethanol. Incub in elke concentratie gedurende 24 uur bij vier graden Celsius. Vervang de LR-witte hars door verse hars en incubeer de monsters nog eens 12 uur bij vier graden Celsius.Bereid de insluitgelatinecapsules voor en selecteer capsules die iets groter zijn dan de monsters, zodat de monsters volledig in de hars kunnen worden ingesloten. Label papieren tags met potlood omdat inkt de hars zal vervuilen. Breng één druppel verse LR-witte hars aan op de bodem van elke capsule.Plaats een monster in elke capsule en vul de capsules vervolgens tot maximale capaciteit met verse hars. Leg de dop op de capsule en druk zachtjes om deze af te dichten. Om de hars te polymeriseren, hardt u de capsules uit op 58 graden Celsius tot ze ongeveer 24 tot 48 uur volledig zijn uitgehard.Nadat u de gelatinecapsule van de LR-witte hars hebt gepeld, plaatst u het harsblok onder de stereomicroscoop. Knip met een scherp scheermesje het LR-witte blok in een hoek van 45 graden ten opzichte van het monster. Draai het monster en maak een tweede snede onder een hoek van 90 graden ten opzichte van de eerste.Ga verder met snijden in hetzelfde patroon om een piramide te vormen met de top van de piramide direct boven het interessegebied van het monster en begin vervolgens met het verwijderen van fijne plakjes loodrecht op de hoofdas totdat het snijoppervlak het monster bereikt. Het doelmonster moet idealiter in een trapeziumvorm worden ingesloten. Plaats het bijgesneden harsblok in de ultramicrotome.Pas de hoek tussen de mesrand en het harsblok aan. Snijd secties uit het blok met een dikte tussen 200 en 700 nanometer. Gebruik een draadlus om enkele bemonsterde secties voorzichtig van de microtome op te tillen.Leg ze in een druppel gedestilleerd gedeïnsioniseerd water op een glazen glijbaan. Verdampt het water door de glijbaan op een kookplaat op 50 graden Celsius te plaatsen en voeg vervolgens een druppel vlek toe aan de secties. Spoel na 30 seconden de vlek af en observeer de glijbaan onder de microscoop om de algemene toestand van de sectie te controleren en of de gewenste plantstructuur zichtbaar is.Bereid een schone reactieschuif voor door in elke put van de glijbaan een druppel gedestilleerd gedeïnsioniseerd water te plaatsen. Breng een of twee monstersecties over op elke druppel water. Plaats de glijbaan in een vierkante Petrischaal van 10 centimeter, dek hem af en laat hem drogen op 50 graden Celsius.Om een incubatiekamer voor te bereiden op de reactieglijbanen, plaatst u enkele gedempte papieren handdoeken aan de onderkant van een pipetpuntendoos en wikkelt u de doos in met aluminiumfolie. Breng de dia's van de doos over naar de incubatiekamer. Pipet 50 microliter blokkeeroplossing in elke put.Nadat u de dia gedurende 10 minuten hebt geïncubeerd, verwijdert u de blokkeringsoplossing en wast u vervolgens alle putten telkens 10 minuten met PBS. Na het bereiden van de primaire antilichaamoplossingen zoals beschreven in het manuscript, voert u een laatste wasbeurt uit van de putten met gedestilleerd gedeïnsioniseerd water gedurende vijf minuten. Pipetteer de primaire antilichaamoplossing in de reactieputten en pipetteer vervolgens de blokkerende oplossing in de controleputten.Sluit de incubatiekamer. Laat het twee uur staan op kamertemperatuur en koel het vervolgens 's nachts op vier graden Celsius. Bereid een 1%-oplossing van het secundaire antilichaam in de blokkeringsoplossing.Er zijn ongeveer 40 microliters per put nodig. Bedek de oplossing met aluminiumfolie. Was de putten van de reactieschuif twee keer met PBS en eenmaal met gedestilleerd gedeïnsioniseerd water gedurende 10 minuten.Zorg ervoor dat er geen blokkeringsoplossing of afzettingen in de putten achterblijven. Pipetteer de secundaire antilichaamoplossing in alle putten. Incubeer de dia's in het donker bij kamertemperatuur gedurende drie tot vier uur.Was nogmaals de putten van de reactieschuif twee keer met PBS en eenmaal met gedestilleerd gedeïnsioniseerd water en voeg vervolgens een druppel Calcofluor White toe aan elke put. Voeg zonder wassen een druppel montagemedium toe aan elke put en bedek elke put met een afdeklip. Observeer de monstersecties in de reactieschuif met behulp van een fluorescentiemicroscoop.Gebruik voor elke waarneming een UV-filter om celwanden te detecteren die door de Calcofluor zijn gekleurd en een FITC-filter om immunolocalisatie te detecteren. Voor een betere visualisatie van de resultaten gebruikt u ImageJ of een vergelijkbaar beeldanalyseprogramma om elke UV-filterafbeelding samen te voegen met de bijbehorende FITC-filterafbeelding. Door de lokalisatie van specifieke epitopen te lokaliseren, maakt het protocol karakterisering van de celwandsamenstelling mogelijk.Bijvoorbeeld, 1, 5-arabinan is overvloedig in de celwand van de zich ontwikkelende Quercus suber anther. Nauwelijks veresterde homogalacturonanen worden meestal gevonden aan de wortelpunt van het Quercus suber embryo dat mechanische eigenschappen van het orgaan specificeert. Xylogalacturonans worden gevonden in degenererende cellen, zoals de endospermcel tijdens de laatste stadia van de Quercus suber eikelrijping.AGP's epitopen erkend door JIM13 of JIM8 worden gevonden op structuren die verband houden met reproductie, zoals cellijnen gerelateerd aan microgametogenese in Arabidopsis thaliana en de stigmatische papillae en microbiële van de basale angiosperm Trithuria submersa. Veelgemaakte fouten bij het implementeren van dit protocol zijn meestal gemakkelijk te detecteren en te identificeren. Wanneer de wasbeurten worden overgeslagen of de reactieputten mogen drogen, zal het secundaire antilichaam meestal verschijnen als een uitstrijkje.Aggregaten van groen fluorchroom vormen zich als het niet-gebonden primaire antilichaam niet goed wordt weggespoeld. Het vouwen of losmaken van de secties is meestal gerelateerd aan slechte hechting als gevolg van het gebruik van onreine dia's of agressief wassen. Monstervoorbereiding is ook van cruciaal belang.De harsblokken moeten vrij zijn van scheuren met een duidelijk zichtbaar lichtgeel tot lichtbruin monster. Inefficiënt ingebedde monsters vertonen poederwitte vlekken of gebieden. Het onder acht millimeter houden van de monstergrootte is essentieel voor de penetratie van de fixatieve oplossing.Slecht gefixeerde monsters verschijnen donkerbruin of bijna zwart. Overmatige temperatuur kan ervoor zorgen dat de hars barst, waardoor doorsnede van het monster onmogelijk wordt. Het gebruik van immunolocalisatietechnieken opent verschillende onderzoeksrichtingen.Men kan doorgaan met meer specifieke technieken zoals biochemische analyse van de celwand of zelfs doorgaan met een moleculaire benadering. De resultaten van deze techniek kunnen helpen om de samenstelling van de celwand te begrijpen, een uiterst complexe structuur die zeer moeilijk te analyseren is door eenvoudige chemische analyse.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

Expressie van fluorescerende eiwitten in<em&gt; Branchiostoma lanceolatum</em&gt; Door mRNA Injectie in onbevruchte eicellen

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the ...

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

Een nieuwe Mammary Fat Pad Transplantation Technique om de Vessel Generation van Vasculaire Endotheliale Stamcellen te visualiseren

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissectie en immunefluorescentie kleuring van Mushroom lichaam en fotoreceptor neuronen in de hersenen van de volwassen Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Geheel-mount Clearing en kleuring van Arabidopsis bloem organen en Siliques

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Immuno-belichting fluorescerende etikettering van microtubuli en Centrosomal eiwitten in Ex Vivo intestinale weefsel en 3D In Vitro intestinale Organoids

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone

Weefsel voorbereiding en immunokleuring van muis craniofaciale weefsels en Ondecalcificeerd bot

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and ...

Use of Atomic Force Microscopy to Measure Mechanical Properties and Turgor Pressure of Plant Cells and Plant Tissues

Gebruik van atoom kracht microscopie om mechanische eigenschappen en turgor druk van plantencellen en Plantenweefsels te meten

We present here the use of atomic force microscopy to indent plant tissues and recover its mechanical properties. Using two different microscopes in ...

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Live Cell Imaging van Microtubule Cytoskeleton en Micromechanische Manipulatie van de Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Understanding cell and tissue level regulation of growth and morphogenesis has been at the forefront of biological research for many decades. Advances in ...

Isolation of Endocardial and Coronary Endothelial Cells from the Ventricular Free Wall of the Rat Heart

Isolatie van endocardiale en coronaire endotheelcellen van de Ventriculaire Vrije Muur van het Hart van de Rat

It has been shown that endocardial endothelial cells (EECs) and coronary endothelial cells (CECs) differ in origin, development, markers, and functions. ...