Name: fluorescent immunolocalization of arabinogalactan proteins and pectins in the cell wall of plant tissues
Uploaded: 2021-02-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescent Immunolocalization of Arabinogalactan Proteins and Pectins in the Cell Wall of Plant Tissues at JoVE.com

Les auteurs ont reçu le soutien du projet de l’UE 690946 « SexSeed » (Sexual Plant Reproduction – Seed Formation) financé par H2020-MSCA-RISE-2015 et SeedWheels FCT PTDC/BIA-FBT/27839/2017. Amp a reçu une subvention du projet MSCA-IF-2016 de l’Union européenne (n° 753328). MC a reçu une subvention de la FCT PhD grant SFRH/BD/111781/2015.

1. Préparation de l’échantillon : fixation, déshydratation et intégration LR-Blanc
<ol><li>Fixation et déshydratation REMARQUE : Le processus de fixation est essentiel pour préserver l’échantillon; en croisant les molécules, le métabolisme cellulaire est arrêté, assurant l’intégrité cellulaire et empêchant la diffusion moléculaire. Les agents fixatifs et la concentration utilisée doivent être ajustés à cette fin, laissant les antigènes suffisamment exposés pour interagir a...

<ol>
	<li>Keegstra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+Cell+Walls.">Plant Cell Walls.</a> Plant Physiology. 154 (2), 483-486 (2010).</li><li>Pereira, A. M., Lopes, A. L., Coimbra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabinogalactan+Proteins+as+Interactors+along+the+Crosstalk+between+the+Pollen+Tube+and+the+Female+Tissues.">Arabinogalactan Proteins as Interactors along the Crosstalk between the Pollen Tube and the Female Tissues.</a> Frontiers in Plant Science. 7 (7), (2016).</li><li>Showalter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabinogalactan-proteins:+structure,+expression+and+function.">Arabinogalactan-proteins: structure, expression and function.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 58 (10), 1399-1417 (2001).</li><li>Majewska-Sawka, A., Nothnagel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multiple+roles+of+arabinogalactan+proteins+in+plant+development.">The multiple roles of arabinogalactan proteins in plant development.</a> Plant Physiology. 122, 3-9 (2000).</li><li>Seifert, G., Roberts, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+arabinogalactan+proteins.">The biology of arabinogalactan proteins.</a> Annual Review of Plant Biology. 58, 137-161 (2007).</li><li>Ruprecht, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Synthetic+Glycan+Microarray+Enables+Epitope+Mapping+of+Plant+Cell+Wall+Glycan-Directed+Antibodies.">A Synthetic Glycan Microarray Enables Epitope Mapping of Plant Cell Wall Glycan-Directed Antibodies.</a> Plant Physiology. 175 (3), 1094-1104 (2017).</li><li>Verhertbruggen, Y., Walker, J. L., Guillon, F., Scheller, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparative+Study+of+Sample+Preparation+for+Staining+and+Immunodetection+of+Plant+Cell+Walls+by+Light+Microscopy.">A Comparative Study of Sample Preparation for Staining and Immunodetection of Plant Cell Walls by Light Microscopy.</a> Frontiers in Plant Science. 29 (8), 1505 (2017).</li><li>Osborn, M., Weber, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+and+immunocytochemical+procedures+with+affinity+purified+antibodies:+tubulin+containing+structures.">Immunofluorescence and immunocytochemical procedures with affinity purified antibodies: tubulin containing structures.</a> Methods in Cell Biology. 24, 97-132 (1982).</li><li>Coimbra, S., Almeida, J., Junqueira, V., Costa, M., Pereira, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabinogalactan+proteins+as+molecular+markers+in+Arabidopsis+thaliana+sexual+reproduction.">Arabinogalactan proteins as molecular markers in Arabidopsis thaliana sexual reproduction.</a> Journal of Experimental Botany. 58 (15), 4027-4035 (2007).</li><li>Wilson, S. M., Bacic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+plant+cells+for+transmission+electron+microscopy+to+optimize+immunogold+labeling+of+carbohydrate+and+protein+epitopes.">Preparation of plant cells for transmission electron microscopy to optimize immunogold labeling of carbohydrate and protein epitopes.</a> Nature Protocols. 7 (9), 1716-1727 (2012).</li><li>Gane, A., Clarke, A., Bacic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+and+expression+of+arabinogalactan-proteins+in+the+ovaries+of+Nicotiana+alata+Link+and+Otto.">Localization and expression of arabinogalactan-proteins in the ovaries of Nicotiana alata Link and Otto.</a> Sex Plant Reproduction. 8, 278-282 (1995).</li><li>Coimbra, S., Salema, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunolocalization+of+arabinogalactan+proteins+in+Amaranthus+hypocondriacus+L.+ovules.">Immunolocalization of arabinogalactan proteins in Amaranthus hypocondriacus L. ovules.</a> Protoplasma. 199 (1-2), 75-82 (1997).</li><li>Coimbra, S., Duarte, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabinogalactan+proteins+may+facilitate+the+movement+of+pollen+tubes+from+the+stigma+to+the+ovules+in+Actinidia+deliciosa+and+Amaranthus+hypocondriacus.">Arabinogalactan proteins may facilitate the movement of pollen tubes from the stigma to the ovules in Actinidia deliciosa and Amaranthus hypocondriacus.</a> Euphytica. 133 (2), 171-178 (2003).</li><li>El-Tantawy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabinogalactan+protein+profiles+and+distribution+patterns+during+microspore+embryogenesis+and+pollen+development+in+Brassica+napus.">Arabinogalactan protein profiles and distribution patterns during microspore embryogenesis and pollen development in Brassica napus.</a> Plant Reproduction. 26 (3), 231-243 (2013).</li><li>Costa, M., Pereira, A. M., Rudall, P. J., Coimbra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunolocalization+of+arabinogalactan+proteins+(AGPs)+in+reproductive+structures+of+an+early-divergent+angiosperm,+Trithuria+submersa+(Hydatellaceae).">Immunolocalization of arabinogalactan proteins (AGPs) in reproductive structures of an early-divergent angiosperm, Trithuria submersa (Hydatellaceae).</a> Annals of Botany. 111 (2), 183-190 (2013).</li><li>Costa, M., Sobral, R., Ribeiro Costa, M. M., Amorim, M. I., Coimbra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+presence+of+arabinogalactan+proteins+and+pectins+during+Quercus+suber+male+gametogenesis.">Evaluation of the presence of arabinogalactan proteins and pectins during Quercus suber male gametogenesis.</a> Annals of Botany. 115 (1), 81-92 (2015).</li><li>Hibbs, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Immunolabelling.">Fluorescence Immunolabelling.</a> Confocal Microscopy for Biologists. , (2004).</li><li>Johnson, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fading+of+Immunofluorescence+during+microscopy:+A+Study+of+the+Phenomenon+and+its+Remedy.">Fading of Immunofluorescence during microscopy: A Study of the Phenomenon and its Remedy.</a> Journal of Immunological Methods. 55 (2), 231-242 (1982).</li><li>Baird, T. R., Kaufman, D., Brown, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mercury+Free+Microscopy:+An+Opportunity+for+Core+Facility+Directors.">Mercury Free Microscopy: An Opportunity for Core Facility Directors.</a> Journal of Biomolecular Techniques. 25 (2), 48-53 (2014).</li><li>Weber, G. F., Menko, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Color+image+acquisition+using+a+monochrome+camera+and+standard+fluorescence+filter+cubes.">Color image acquisition using a monochrome camera and standard fluorescence filter cubes.</a> BioTechniques. 38 (1), 52-56 (2005).</li></ol>

La méthode d’immunolocalisation fluorescente chez les plantes décrite ici, bien que parfaitement simple, repose sur le succès de plusieurs petits pas. Le premier est la préparation et la fixation de l’échantillon. Au cours de cette première étape, un mélange de formaldéhyde et de glutaraldehyde est utilisé pour croiser la majorité des composants cellulaires. Le formaldéhyde dans la solution fournit une fixation douce et réversible tandis que le glutaraldehyde fournit un lien plus fort et plus permanent ;...

Les parois cellulaires végétales sont des structures complexes composées de polysaccharides et de glycoprotéines. Les parois cellulaires sont des structures extrêmement dynamiques dont l’architecture, l’organisation et la composition varient selon le type de cellule, la localisation, le stade de développement, les stimuli externeset internes 1. Les protéines arabinogalactan (AGPs) et les pectines sont des composants importants de la paroi cellulaire végétale. Les APC sont des protéines fortement glycoylées et les pectines sont des polysaccharides homogalacturonan dont la composition, la quantité et la structure varient considérablement au cours des différents stades de développementvégétal 2,3,4. Les AIG et les études sur la pectine ont révélé leur implication dans plusieurs processus végétaux tels que la mort cellulaire programmée, la réponse aux stress abiotiques, la reproduction sexuelle des plantes, parmi beaucoupd’autres 5. La plupart de ces études ont commencé avec des informations obtenues à partir d’études d’immunolocalisation.
Compte tenu de sa complexité, l’étude des parois cellulaires nécessite de nombreux outils différents. La détection des épitopes glycan à l’aide d’anticorps monoclonaux (mAbs) est une approche précieuse pour résoudre la distribution du polysaccharide et de la glycoprotéine le long de cette structure. Il existe une grande collection de mAbs disponibles pour détecter les épitopes glycan et la spécificité de chaque mAb est continuellement améliorée ainsi6. La technique décrite ici s’applique à toutes les espèces végétales, et est un outil parfait pour guider les orientations futures de recherche qui pourraient impliquer des techniques plus coûteuses et complexes.
Dans cette technique, des anticorps spécifiques sont chimiquement conjugués à des colorants fluorescents tels que fitc (fluorescéine isothiocyanate), TRITC (tétramethylrhodamine-5-(et 6)-isothiocyanate) ou plusieurs colorants Alexa Fluor. L’immunofluorescence offre plusieurs avantages, permettant une localisation subcellulaire claire et rapide des glycans qui peut être directement observée au microscope à fluorescence. Il est très spécifique et sensible, puisque la préparation de l’échantillon peut effectivement protéger la structure naturelle de l’antigène, même s’il est présent en plus faibles quantités. Il permet la détection de plusieurs antigènes dans le même échantillon et le plus important, offre des résultats de haute qualité et visuellement belle. Malgré la grande puissance offerte par les études d’immunolocalisation de fluorescence, elles sont souvent considérées comme difficiles à exécuter et à mettre en œuvre très probablement en raison de l’absence de protocoles détaillés permettant la visualisation des différentes étapes de la procédure. Ici, nous fournissons quelques lignes directrices simples sur la façon d’effectuer cette technique et comment obtenir des images de haute qualité.
Pour le protocole présenté ici, les échantillons doivent d’abord être corrigés et intégrés à l’aide du fixatif le plus approprié. Bien que considérée comme une technique longue et relativement fastidieuse, la fixation et l’intégration appropriées de l’échantillon végétal sont la clé pour assurer un essai d’immunolocalisation réussi. À cette fin, le plus habituel est la fixation chimique à l’aide de fixatifs de liaison croisée, comme les aldéhydes. Les fixatifs croisés établissent des liaisons chimiques entre les molécules du tissu, stabilisant et durcissant l’échantillon. Le formaldéhyde et le glutaraldehyde sont des fixatifs de liaison croisée, et parfois un mélange des deux fixatifs est employé7. Le formaldéhyde offre une grande préservation structurelle des tissus et pendant de longues périodes de temps, produisant de petites rétractations tissulaires et étant compatible avec l’immunostaining. Le glutaraldehyde est un fixatif plus fort et stable habituellement utilisé en combinaison avec le formaldéhyde. L’utilisation du glutaraldehyde présente certains inconvénients qui doivent être pris en compte car il introduit certains groupes d’aldéhyde libre dans le tissu fixe, ce qui peut générer une certaine étiquetage non spécifique. En outre, le croisement entre les protéines et d’autres molécules peut parfois rendre certaines épitopes cibles inaccessibles pour les anticorps. Pour éviter cela, la quantité et la durée de la fixation doivent être soigneusement définies.
Après fixation, les échantillons sont incorporés dans la résine appropriée pour durcir avant d’obtenir les sections. La résine acrylique London Resin (LR-White) est la résine de choix pour les études d’immunolocalisation. Contrairement à d’autres résines, LR-White est hydrophile, permettant aux anticorps d’atteindre leurs antigènes, sans aucun traitement pour le faciliter. LR-White a également l’avantage d’offrir une faible fluorescence automatique, permettant une réduction du bruit de fond pendant l’imagerie par immunofluorescence.
Il existe de nombreuses techniques de coloration disponibles pour détecter différents composants de la paroi cellulaire, tels que la coloration bleue alcienne, la coloration bleue toluidine ou la coloration périodique de l’acide schiff (PAS). Aucun d’entre eux n’offre le pouvoir des analyses d’immunolocalisation8. Cette approche donne une plus grande spécificité dans la détection des glycanes, offrant des informations plus vastes concernant la composition et la structure des parois cellulaires.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:728px;" width="728">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">25% (w/v) Gluteraldehyde</td>
			<td style="width:99px;">Agar Scientific</td>
			<td style="width:196px;">AGR1010</td>
			<td style="width:187px;">aq. Solution, methanol free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">8 wells Glass reaction slides</td>
			<td style="width:99px;">Marinfeld</td>
			<td style="width:196px;">MARI1216750</td>
			<td style="width:187px;">other brands may be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:196px;">A6283</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Anti-Rat IgG (wole molecule)-FITC antibody produce in GOAT</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:196px;">F6258</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:247px;">cover slips, 24 mm x 50 mm</td>
			<td style="width:99px;">Marinfeld</td>
			<td>MARI0100222</td>
			<td style="width:187px;">The cover slip should cover all the wells. Other brands may be used&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:247px;">ddH2O</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Ethanol absolute</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Fluorescent brightner 28</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:196px;">F-6259</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Gelatin capsules</td>
			<td style="width:99px;">Agar scientific</td>
			<td>AGG29211</td>
			<td style="width:187px;">The capsule size sould feat the size of the sample.</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:247px;">Glass vials</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;">Any simple unexpensive glass vials that can be sealed, may be used. The vials may be clean with 96% etanol after use to remove LR-White residue and reused.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="294">
			<td height="294" style="height:294px;width:247px;">LR-white medium grade, embdeding resin</td>
			<td style="width:99px;">Agar Scientific</td>
			<td>AGR1281</td>
			<td style="width:187px;">LR-White comes in several forms the medium grade provides na adequate cutting suport for most tissues for harder tissues a harder grade of LR-white may be recomendable. If possible use a resin already mixed with the polimeration activator (benzoyl peroxide), if not please folow the instructions of the suplier to prepare the resin.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Non fat dry milk</td>
			<td style="width:99px;">Nestl&#233;</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;">any non fat dry milk is adequate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Oven</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;">generic laboratory oven</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Petri dish, 10 cm x 10 cm square</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">PIPES</td>
			<td style="width:99px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:196px;">P1851</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="357">
			<td height="357" style="height:357px;width:247px;">Rat generated Monoclonal Anti-Body</td>
			<td style="width:99px;">Plant probes</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;">Several antibodies that recognize cell wall components are 
			available at both the Complex Carbohydrate research center 
			(CCRC, Georgia University USA) and Plant Probes (Paul 
			Knox Cell Wall Lab, at Leeds University UK). A short list of 
			some commonly used MABS and where they can be purchased 
			is presented in Supplemental Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Razor blades</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;">regular razor blades</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">SDS</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:196px;">L6026</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Toluidine Blue-O</td>
			<td style="width:99px;">Agar Scientific</td>
			<td>AGR1727</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Tween 20</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:196px;">P9416</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Ultramicrotome</td>
			<td style="width:99px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:196px;">UC7</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:247px;">upright epifluorescence microscope with UV and FITC fluorescence filters</td>
			<td style="width:99px;">Leica Mycrosistems</td>
			<td style="width:196px;">DMLb</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">vaccum chamber</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">vaccum pump</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="297">
			<td height="297" style="height:297px;width:247px;">Vectashield</td>
			<td style="width:99px;">vecta Labs</td>
			<td style="width:196px;">T-1000</td>
			<td style="width:187px;">Other anti-fade may be used. Please do check for compatibility with FITC and the Fluorescente brightner 28. (Note: for a non-commercial alternative, (see Jonhson et al 198218) An antifade medium can be made by mixing 25 mg/mL of 1,4-Diazobicyclo-(2,2,2)octane (DABCO) in 9:1 (v/v) glycerol to 1xPBS. Adjust pH to 8.6 with diluted HCl.)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescent immunolocalization of arabinogalactan proteins and pectins in the cell wall of plant tissues

Le développement des plantes implique des ajustements constants de la composition et de la structure de la paroi cellulaire en réponse à des stimuli internes et externes. Les parois cellulaires sont composées de cellulose et de polysaccharides non cellulosiques ainsi que de protéines, de composés phénoliques et d’eau. 90 % de la paroi cellulaire est composée de polysaccharides (p. ex., pectines) et de protéines arabinogalactan (APC). L’immunolocalisation fluorescente d’épitopes glycan spécifiques dans les sections histologiques végétales demeure un outil clé pour découvrir le remodelage des réseaux, de la structure et des composants de polysaccharide de mur.
Ici, nous rapportons une procédure optimisée d’immunolocalisation fluorescente pour détecter les épitopes glycan des ARG et des pectines dans les tissus végétaux. La fixation de paraformaldéhyde/glutaraldehyde a été employée avec l’intégration LR-White des échantillons de plante, permettant une meilleure conservation de la structure et de la composition de tissu. Des sections minces des échantillons incorporés obtenus avec un ultra-microtome ont été utilisées pour l’immunolocalisation avec des anticorps spécifiques. Cette technique offre une grande résolution, une grande spécificité et la possibilité de détecter plusieurs épitopes glycan dans le même échantillon. Cette technique permet la localisation subcellulaire des glycanes et détecte leur niveau d’accumulation dans la paroi cellulaire. Il permet également la détermination des modèles spatio-temporels de la distribution d’AGP et de pectine pendant des processus développementaux. L’utilisation de cet outil peut en fin de compte guider les orientations de recherche et relier les glycanes à des fonctions spécifiques chez les plantes. En outre, les informations obtenues peuvent compléter les études biochimiques et d’expression génique.

Dans une expérience réussie, l’anticorps secondaire identifiera spécifiquement l’emplacement de l’épitope spécifique en vert vif, d’une manière cohérente, permettant la caractérisation de la composition de la paroi cellulaire à un certain stade de développement de la cellule, du tissu ou de l’organe. Par exemple, l’anticorps LM6 a une forte affinité pour 1,5-arabinan, un composé avec type I rhamnogalacturonan qui peut être trouvé abondamment l’étiquetage de la paroi cellulaire de l’anth...

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Fluorescent Immunolocalization of Arabinogalactan Proteins and Pectins in the Cell Wall of Plant Tissues

Ce protocole décrit en détail comment le matériel végétal pour l’immunolocalisation des protéines arabinogalactan et des pectines est fixé, incorporé dans une résine acrylique hydrophilique, sectionné et monté sur des glissières en verre. Nous montrons que des épitopes liés à la paroi cellulaire seront détectés avec des anticorps spécifiques.

Immunolocalisation fluorescente des protéines arabinogalactan et des pectines dans la paroi cellulaire des tissus végétaux

Plant development involves constant adjustments of the cell wall composition and structure in response to both internal and external stimuli. Cell walls ...

La quantité d’informations provenant d’une seule expérience est énorme. Nous pouvons détecter la présence de ces polymères de la paroi cellulaire et savoir exactement comment ils sont répartis dans les cellules et les tissus, et même déterminer leur abondance. Cette méthode est conçue de telle sorte qu’elle puisse être appliquée à presque n’importe quel type de tissu végétaux de n’importe quelle espèce que l’on peut vouloir analyser.L’immunolocalisation dans les tissus végétaux implique beaucoup de travail méticuleux, difficile à expliquer sans réellement voir ce qui se passe. Avant de recueillir l’échantillon de tissu végétal, remplissez un flacon de verre avec suffisamment de solution fixative froide pour submerger complètement tous les échantillons. Sélectionnez ensuite les tissus végétaux à analyser et coupez les échantillons à une taille maximale de 16 millimètres carrés.Plongez immédiatement les échantillons dans la solution fixative. Le glutaraldehyde et le formaldéhyde sont tous deux d’excellents fixatifs, mais les deux sont dangereux et doivent être manipulés dans le capot d’écoulement. Transférer le flacon dans une chambre à vide et appliquer lentement le vide.Lorsque la pression atteint 60 kilos de pascals négatifs, le matériau flottant dans le flacon commence à couler vers le bas. Maintenir la pression dans la chambre à pas plus de 80 kilos de pascals négatifs. Le processus de naufrage peut prendre jusqu’à deux heures.Après que les échantillons ont été dans la chambre à vide pendant deux heures, relâchez lentement le vide. Sceller le flacon de verre et le réfrigérer toute la nuit à quatre degrés Celsius. Après la fixation de nuit, jetez tous les échantillons qui n’ont pas coulé au fond du flacon.Lavez les échantillons restants avec 25 millimolar PBS pendant 10 minutes, puis lavez-les dans un tampon PIPES de 25 millimaux pendant 20 minutes. Il est extrêmement important d’enlever tous les échantillons flottants parce qu’il est très probable que le fixatif n’a pas pénétré l’échantillon. Déshydrater les échantillons dans une série d’éthanol, en immergeant les échantillons pendant 20 minutes à chaque concentration d’éthanol.Pour parcourir les échantillons, ajoutez des concentrations croissantes de résine blanche LR dans l’éthanol, en commençant par une partie de résine à trois parties d’éthanol. À chaque concentration, incuber pendant 24 heures à quatre degrés Celsius. Remplacez la résine blanche LR par de la résine fraîche et incubez les échantillons pendant 12 heures supplémentaires à quatre degrés Celsius.Préparer les capsules de gélatine d’intégration, en sélectionnant des capsules légèrement plus grandes que les échantillons afin que les échantillons puissent être complètement enfermés dans la résine. Étiquetez les étiquettes de papier avec un crayon parce que l’encre contaminera la résine. Appliquer une goutte de résine blanche LR fraîche au fond de chaque capsule.Placer un échantillon dans chaque capsule, puis remplir les capsules à pleine capacité avec de la résine fraîche. Mettre le bouchon sur la capsule et presser doucement pour le sceller. Pour polymériser la résine, guérir les capsules à 58 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elles soient complètement durcies vers 24 à 48 heures.Après avoir épluché la capsule de gélatine de la résine blanche LR, placez le bloc de résine sous le microscope stéréo. À l’aide d’une lame de rasoir tranchante, coupez le bloc blanc LR à un angle de 45 degrés par rapport à l’échantillon. Faites pivoter l’échantillon et faites une deuxième coupe à un angle de 90 degrés par rapport à la première.Continuer à couper dans le même modèle pour former une pyramide avec l’apex de la pyramide directement au-dessus de la zone d’intérêt de l’échantillon, puis commencer à enlever les fines tranches perpendiculaires à l’axe principal jusqu’à ce que la surface de coupe atteint l’échantillon. Idéalement, l’échantillon cible doit être enfermé dans une forme trapézoïde. Placez le bloc de résine taillé dans l’ultra microtome.Ajustez l’angle entre le bord du couteau et le bloc de résine. Couper les sections du bloc avec une épaisseur comprise entre 200 et 700 nanomètres. Utilisez une boucle métallique pour soulever soigneusement certaines sections échantillonnées de la microtome.Placez-les dans une goutte d’eau déionisée distillée sur une toboggan en verre. Évaporer l’eau en plaçant la toboggan sur une plaque chaude à 50 degrés Celsius, puis ajouter une goutte de tache aux sections. Après 30 secondes, rincer la tache et observer la toboggan au microscope pour vérifier l’état général de la section et que la structure de la plante désirée est visible.Préparez une glissière de réaction propre en plaçant une goutte d’eau déionisée distillée dans chaque puits de la glissière. Transférez une ou deux sections d’échantillon à chaque goutte d’eau. Placez la glissade dans une boîte de Pétri carrée de 10 centimètres, couvrez-la et laissez-la sécher à 50 degrés Celsius.Pour préparer une chambre d’incubation pour les glissières de réaction, placez des serviettes en papier amorties au fond d’une boîte de pointes de pipette et enveloppez la boîte avec du papier d’aluminium. Transférer les diapositives de la boîte à la chambre d’incubation. Pipette 50 microlitres de solution de blocage dans chaque puits.Après avoir incubé la lame pendant 10 minutes, retirez la solution de blocage, puis lavez tous les puits deux fois avec du PBS pendant 10 minutes à chaque fois. Après avoir préparé les principales solutions d’anticorps décrites dans le manuscrit, effectuez un lavage final des puits avec de l’eau déionisée distillée pendant cinq minutes. Pipette la solution d’anticorps primaire dans les puits de réaction, puis pipette la solution de blocage dans les puits de contrôle.Fermer la chambre d’incubation. Laisser reposer pendant deux heures à température ambiante, puis réfrigérer toute la nuit à quatre degrés Celsius. Préparez une solution de 1% de l’anticorps secondaire dans la solution de blocage.Environ 40 microlitres par puits seront nécessaires. Couvrir la solution de papier d’aluminium. Lavez les puits de la glissière de réaction deux fois avec du PBS et une fois avec de l’eau déionisée distillée pendant 10 minutes à chaque fois.Assurez-vous qu’aucune solution de blocage ou dépôts ne reste dans les puits. Pipette la solution d’anticorps secondaire dans tous les puits. Incuber les glissières dans l’obscurité à température ambiante pendant trois à quatre heures.Encore une fois, lavez les puits de la glissière de réaction deux fois avec PBS et une fois avec de l’eau déionisée distillée, puis ajoutez une goutte de calcofluor blanc à chaque puits. Sans lavage, ajouter une goutte de milieu de montage à chaque puits et couvrir chaque puits d’un coverslip. Observez les sections de l’échantillon dans la diapositive de réaction à l’aide d’un microscope à fluorescence.Pour chaque observation, utilisez un filtre UV pour détecter les parois cellulaires tachées par le Calcofluor et un filtre FITC pour détecter l’immunolocalisation. Pour une meilleure visualisation des résultats, utilisez ImageJ ou un programme similaire d’analyse d’image pour fusionner chaque image de filtre UV avec l’image correspondante du filtre FITC. En identifiant la localisation d’épitopes spécifiques, le protocole permet de caractériser la composition de la paroi cellulaire.Par exemple, 1, 5-arabinan est abondant dans la paroi cellulaire de l’anthère en développement quercus suber. Les homogalacturonans à peine estérifiés se trouvent généralement à l’extrémité racine de l’embryon quercus suber spécifier les propriétés mécaniques de l’organe. Les xylogalacturonans se trouvent dans les cellules dégénératrices, comme la cellule endosperme pendant les derniers stades de la maturation du gland quercus suber.Les épitopes d’AGP reconnues par JIM13 ou JIM8 se trouvent sur des structures liées à la reproduction, telles que les lignées cellulaires liées à la microgametogenèse dans Arabidopsis thaliana et les papilles stigmatistiques et microbiennes de l’angiosperme basal Trithuria submersa. Les erreurs courantes dans la mise en œuvre de ce protocole sont généralement faciles à détecter et à identifier. Lorsque les lavages sont sautés ou que les puits de réaction sont autorisés à sécher, l’anticorps secondaire apparaît généralement sous forme de frottis.Des agrégats de fluorochrome vert se formeront si l’anticorps primaire non lié n’est pas correctement emporté. Le pliage ou le détachement des sections est habituellement lié à une mauvaise adhérence due à l’utilisation de toboggans impurs ou d’un lavage agressif. La préparation de l’échantillon est également essentielle.Les blocs de résine doivent être exempts de fissures avec un échantillon jaune pâle à brun clair clairement visible. Les échantillons incrustés de façon inefficace montreront des taches blanches poudreuse ou des zones. Garder la taille de l’échantillon sous huit millimètres est essentiel pour la pénétration de la solution fixative.Les échantillons mal fixés apparaîtront brun foncé ou presque noirs. Une température excessive peut provoquer une fissure de la résine rendant impossible la sectionnement de l’échantillon. L’utilisation de techniques d’immunolocalisation ouvre plusieurs directions de recherche.On peut suivre des techniques plus spécifiques telles que l’analyse biochimique de la paroi cellulaire ou même procéder à une approche moléculaire. Les résultats fournis par cette technique peuvent aider à comprendre la composition de la paroi cellulaire, une structure extrêmement complexe très difficile à analyser par simple analyse chimique.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

L&#39;expression de protéines fluorescentes en<em&gt; Branchiostoma lanceolatum</em&gt; Par injection dans l&#39;ARNm non fécondés ovocytes

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the ...

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