Name: fluorescent immunolocalization of arabinogalactan proteins and pectins in the cell wall of plant tissues
Uploaded: 2021-02-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescent Immunolocalization of Arabinogalactan Proteins and Pectins in the Cell Wall of Plant Tissues at JoVE.com

Unterstützung erhielten die Autoren aus dem EU-Projekt 690946 "SexSeed" (Sexuelle Pflanzenreproduktion – Saatgutbildung), das von H2020-MSCA-RISE-2015 und SeedWheels FCT PTDC/BIA-FBT/27839/2017 gefördert wird. AMP erhielt ein Stipendium aus dem Projekt MSCA-IF-2016 der Europäischen Union (Nr. 753328). MC erhielt ein Stipendium aus dem FCT PhD-Stipendium SFRH/BD/111781/2015.

1. Probenvorbereitung: Fixierung, Dehydrierung und LR-White-Einbettung
<ol><li>Fixierung und Austrocknung HINWEIS: Der Fixierungsprozess ist wichtig, um die Probe zu erhalten. durch Vernetzung von Molekülen wird der Zellstoffwechsel gestoppt, wodurch die zelluläre Integrität gewährleistet und die molekulare Diffusion verhindert wird. Fixiermittel und die verwendete Konzentration müssen auf diesen Zweck angepasst werden, so dass die Antigene ausreichend exponiert sind, um mit den Antikörpern zu...

<ol>
	<li>Keegstra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+Cell+Walls.">Plant Cell Walls.</a> Plant Physiology. 154 (2), 483-486 (2010).</li><li>Pereira, A. M., Lopes, A. L., Coimbra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabinogalactan+Proteins+as+Interactors+along+the+Crosstalk+between+the+Pollen+Tube+and+the+Female+Tissues.">Arabinogalactan Proteins as Interactors along the Crosstalk between the Pollen Tube and the Female Tissues.</a> Frontiers in Plant Science. 7 (7), (2016).</li><li>Showalter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabinogalactan-proteins:+structure,+expression+and+function.">Arabinogalactan-proteins: structure, expression and function.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 58 (10), 1399-1417 (2001).</li><li>Majewska-Sawka, A., Nothnagel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multiple+roles+of+arabinogalactan+proteins+in+plant+development.">The multiple roles of arabinogalactan proteins in plant development.</a> Plant Physiology. 122, 3-9 (2000).</li><li>Seifert, G., Roberts, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+arabinogalactan+proteins.">The biology of arabinogalactan proteins.</a> Annual Review of Plant Biology. 58, 137-161 (2007).</li><li>Ruprecht, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Synthetic+Glycan+Microarray+Enables+Epitope+Mapping+of+Plant+Cell+Wall+Glycan-Directed+Antibodies.">A Synthetic Glycan Microarray Enables Epitope Mapping of Plant Cell Wall Glycan-Directed Antibodies.</a> Plant Physiology. 175 (3), 1094-1104 (2017).</li><li>Verhertbruggen, Y., Walker, J. L., Guillon, F., Scheller, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparative+Study+of+Sample+Preparation+for+Staining+and+Immunodetection+of+Plant+Cell+Walls+by+Light+Microscopy.">A Comparative Study of Sample Preparation for Staining and Immunodetection of Plant Cell Walls by Light Microscopy.</a> Frontiers in Plant Science. 29 (8), 1505 (2017).</li><li>Osborn, M., Weber, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+and+immunocytochemical+procedures+with+affinity+purified+antibodies:+tubulin+containing+structures.">Immunofluorescence and immunocytochemical procedures with affinity purified antibodies: tubulin containing structures.</a> Methods in Cell Biology. 24, 97-132 (1982).</li><li>Coimbra, S., Almeida, J., Junqueira, V., Costa, M., Pereira, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabinogalactan+proteins+as+molecular+markers+in+Arabidopsis+thaliana+sexual+reproduction.">Arabinogalactan proteins as molecular markers in Arabidopsis thaliana sexual reproduction.</a> Journal of Experimental Botany. 58 (15), 4027-4035 (2007).</li><li>Wilson, S. M., Bacic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+plant+cells+for+transmission+electron+microscopy+to+optimize+immunogold+labeling+of+carbohydrate+and+protein+epitopes.">Preparation of plant cells for transmission electron microscopy to optimize immunogold labeling of carbohydrate and protein epitopes.</a> Nature Protocols. 7 (9), 1716-1727 (2012).</li><li>Gane, A., Clarke, A., Bacic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+and+expression+of+arabinogalactan-proteins+in+the+ovaries+of+Nicotiana+alata+Link+and+Otto.">Localization and expression of arabinogalactan-proteins in the ovaries of Nicotiana alata Link and Otto.</a> Sex Plant Reproduction. 8, 278-282 (1995).</li><li>Coimbra, S., Salema, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunolocalization+of+arabinogalactan+proteins+in+Amaranthus+hypocondriacus+L.+ovules.">Immunolocalization of arabinogalactan proteins in Amaranthus hypocondriacus L. ovules.</a> Protoplasma. 199 (1-2), 75-82 (1997).</li><li>Coimbra, S., Duarte, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabinogalactan+proteins+may+facilitate+the+movement+of+pollen+tubes+from+the+stigma+to+the+ovules+in+Actinidia+deliciosa+and+Amaranthus+hypocondriacus.">Arabinogalactan proteins may facilitate the movement of pollen tubes from the stigma to the ovules in Actinidia deliciosa and Amaranthus hypocondriacus.</a> Euphytica. 133 (2), 171-178 (2003).</li><li>El-Tantawy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabinogalactan+protein+profiles+and+distribution+patterns+during+microspore+embryogenesis+and+pollen+development+in+Brassica+napus.">Arabinogalactan protein profiles and distribution patterns during microspore embryogenesis and pollen development in Brassica napus.</a> Plant Reproduction. 26 (3), 231-243 (2013).</li><li>Costa, M., Pereira, A. M., Rudall, P. J., Coimbra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunolocalization+of+arabinogalactan+proteins+(AGPs)+in+reproductive+structures+of+an+early-divergent+angiosperm,+Trithuria+submersa+(Hydatellaceae).">Immunolocalization of arabinogalactan proteins (AGPs) in reproductive structures of an early-divergent angiosperm, Trithuria submersa (Hydatellaceae).</a> Annals of Botany. 111 (2), 183-190 (2013).</li><li>Costa, M., Sobral, R., Ribeiro Costa, M. M., Amorim, M. I., Coimbra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+presence+of+arabinogalactan+proteins+and+pectins+during+Quercus+suber+male+gametogenesis.">Evaluation of the presence of arabinogalactan proteins and pectins during Quercus suber male gametogenesis.</a> Annals of Botany. 115 (1), 81-92 (2015).</li><li>Hibbs, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Immunolabelling.">Fluorescence Immunolabelling.</a> Confocal Microscopy for Biologists. , (2004).</li><li>Johnson, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fading+of+Immunofluorescence+during+microscopy:+A+Study+of+the+Phenomenon+and+its+Remedy.">Fading of Immunofluorescence during microscopy: A Study of the Phenomenon and its Remedy.</a> Journal of Immunological Methods. 55 (2), 231-242 (1982).</li><li>Baird, T. R., Kaufman, D., Brown, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mercury+Free+Microscopy:+An+Opportunity+for+Core+Facility+Directors.">Mercury Free Microscopy: An Opportunity for Core Facility Directors.</a> Journal of Biomolecular Techniques. 25 (2), 48-53 (2014).</li><li>Weber, G. F., Menko, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Color+image+acquisition+using+a+monochrome+camera+and+standard+fluorescence+filter+cubes.">Color image acquisition using a monochrome camera and standard fluorescence filter cubes.</a> BioTechniques. 38 (1), 52-56 (2005).</li></ol>

Die hier beschriebene fluoreszierende Immunlokalisierungsmethode in Pflanzen, die zwar nahtlos unkompliziert ist, beruht jedoch auf dem Erfolg mehrerer kleiner Schritte. Die erste davon ist die Probenvorbereitung und -fixierung. In diesem ersten Schritt wird ein Gemisch aus Formaldehyd und Glutaraldehyd verwendet, um die Mehrheit der Zellkomponenten zu vernetzen. Das Formaldehyd in der Lösung sorgt für eine milde und reversible Fixierung, während das Glutaraldehyd eine starke dauerhaftere Verbindung bietet; das Gleich...

Pflanzenzellwände sind komplexe Strukturen, die aus Polysacchariden und Glykoproteinen bestehen. Zellwände sind extrem dynamische Strukturen, deren Architektur, Organisation und Zusammensetzung je nach Zelltyp, Lokalisierung, Entwicklungsstadium, äußeren und inneren Reizen variieren1. Arabinogalactan Proteine (AGPs) und Pektine sind wichtige Bestandteile der Pflanzenzellwand. AGPs sind hochglykosylierte Proteine und Pektine sind homogalacturonanpolysaccharide, deren Zusammensetzung, Menge und Struktur in verschiedenen Pflanzenentwicklungsstadien stark variieren2,3,4. AGPs und Pektinstudien haben ihre Beteiligung an mehreren Pflanzenprozessen wie programmiertem Zelltod, Reaktion auf abiotische Belastungen, sexuelle Pflanzenreproduktion, unter vielen anderen5gezeigt. Die meisten dieser Studien begannen mit Informationen aus Immunlokalisierungsstudien.
Angesichts seiner Komplexität erfordert das Studium von Zellwänden viele verschiedene Werkzeuge. Der Nachweis von Glykinepitopen mit monoklonalen Antikörpern (mAbs) ist ein wertvoller Ansatz, um die Verteilung von Polysaccharid und Glykoprotein entlang dieser Struktur aufzulösen. Es gibt eine große Sammlung von mAbs zur Verfügung, um Glyglyan-Epitope zu erkennen und die Spezifität jedes mAb wird kontinuierlich verbessert sowie6. Die hier beschriebene Technik ist auf alle Pflanzenarten anwendbar und ist ein perfektes Werkzeug, um zukünftige Forschungsrichtungen zu leiten, die teurere und komplexere Techniken beinhalten könnten.
Bei dieser Technik werden spezifische Antikörper chemisch mit fluoreszierenden Farbstoffen wie FITC (Fluorescein isothiocyanat), TRITC (Tetramethylrhodamine-5-(und 6)-isothiocyanat) oder mehreren Alexa-Fluorfarbstoffen konjugiert. Die Immunfluoreszenz bietet mehrere Vorteile, die eine klare und schnelle subzelluläre Lokalisation von Glykanen ermöglichen, die direkt unter einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet werden können. Es ist sehr spezifisch und empfindlich, da die Herstellung der Probe effektiv die natürliche Struktur des Antigens schützen kann, auch wenn es in geringeren Mengen vorhanden ist. Es ermöglicht die Detektion von mehreren Antigenen in der gleichen Probe und am wichtigsten, bietet hohe Qualität und visuell schöne Ergebnisse. Trotz der großen Macht, die Fluoreszenz-Immunlokalisierungsstudien bieten, werden sie oft als schwierig durchzuführen und umzusetzen angesehen, höchstwahrscheinlich aufgrund des Fehlens detaillierter Protokolle, die die Visualisierung der verschiedenen Schritte des Verfahrens ermöglichen. Hier bieten wir einige einfache Richtlinien, wie diese Technik durchgeführt werden und wie man qualitativ hochwertige Bilder erhält.
Für das hier vorgestellte Protokoll müssen Die Proben zunächst mit dem am besten geeigneten Fixierungsprotokoll fixiert und eingebettet werden. Obwohl als zeitaufwändige und relativ mühsame Technik betrachtet, ist die richtige Fixierung und Einbettung der Pflanzenprobe der Schlüssel, um einen erfolgreichen Immunlokalisierungstest zu gewährleisten. Zu diesem Zweck ist die üblichste chemische Fixierung mit vernetzungsfixativen, wie Aldehyden. Vernetzungsfixative stellen chemische Bindungen zwischen Gewebemolekülen her, stabilisieren und verhärten die Probe. Formaldehyd und Glutaraldehyd sind vernetzungsfixative, und manchmal wird eine Mischung aus beiden Fixativen verwendet7. Formaldehyd bietet eine große strukturelle Konservierung von Geweben und über einen längeren Zeitraum, produziert kleine Geweberückzüge und ist mit der Immunfärbung kompatibel. Glutaraldehyd ist ein stärkeres und stabiles Fixativ, das in der Regel in Kombination mit Formaldehyd verwendet wird. Die Verwendung von Glutaraldehyd hat einige Nachteile, die berücksichtigt werden müssen, da es einige freie Aldehydgruppen in das feste Gewebe einführt, was zu einer unspezifischen Kennzeichnung führen kann. Auch die Vernetzung zwischen Proteinen und anderen Molekülen kann gelegentlich dazu führen, dass einige Zielepitope für die Antikörper unzugänglich werden. Um dies zu vermeiden, müssen Menge und Dauer der Fixierung sorgfältig definiert werden.
Nach der Fixierung werden die Proben in das richtige Harz eingebettet, um vor dem Erhalt der Abschnitte zu härten. London Resin (LR-White) Acrylharz ist das Harz der Wahl für Immunlokalisierungsstudien. Im Gegensatz zu anderen Harzen ist LR-White hydrophil, so dass die Antikörper ihre Antigene erreichen können, ohne dass eine Behandlung erforderlich ist, um es zu erleichtern. LR-White hat auch den Vorteil, eine geringe Autofluoreszenz zu bieten, was eine Reduzierung von Hintergrundgeräuschen während der Immunfluoreszenz-Bildgebung ermöglicht.
Es gibt viele Färbetechniken zur Verfügung, um verschiedene Komponenten der Zellwand zu erkennen, wie Alcian blaue Färbung, Toluidin blau Färbung oder Periodische Säure-Schiff (PAS) Färbung. Keines davon bietet die Kraft der Immunlokalisierungsanalysen8. Dieser Ansatz gibt eine größere Spezifität bei der Detektion von Glykanen und bietet umfangreichere Informationen über die Zusammensetzung und Struktur der Zellwand.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:728px;" width="728">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">25% (w/v) Gluteraldehyde</td>
			<td style="width:99px;">Agar Scientific</td>
			<td style="width:196px;">AGR1010</td>
			<td style="width:187px;">aq. Solution, methanol free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">8 wells Glass reaction slides</td>
			<td style="width:99px;">Marinfeld</td>
			<td style="width:196px;">MARI1216750</td>
			<td style="width:187px;">other brands may be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:196px;">A6283</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Anti-Rat IgG (wole molecule)-FITC antibody produce in GOAT</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:196px;">F6258</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:247px;">cover slips, 24 mm x 50 mm</td>
			<td style="width:99px;">Marinfeld</td>
			<td>MARI0100222</td>
			<td style="width:187px;">The cover slip should cover all the wells. Other brands may be used&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:247px;">ddH2O</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Ethanol absolute</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Fluorescent brightner 28</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:196px;">F-6259</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Gelatin capsules</td>
			<td style="width:99px;">Agar scientific</td>
			<td>AGG29211</td>
			<td style="width:187px;">The capsule size sould feat the size of the sample.</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:247px;">Glass vials</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;">Any simple unexpensive glass vials that can be sealed, may be used. The vials may be clean with 96% etanol after use to remove LR-White residue and reused.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="294">
			<td height="294" style="height:294px;width:247px;">LR-white medium grade, embdeding resin</td>
			<td style="width:99px;">Agar Scientific</td>
			<td>AGR1281</td>
			<td style="width:187px;">LR-White comes in several forms the medium grade provides na adequate cutting suport for most tissues for harder tissues a harder grade of LR-white may be recomendable. If possible use a resin already mixed with the polimeration activator (benzoyl peroxide), if not please folow the instructions of the suplier to prepare the resin.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Non fat dry milk</td>
			<td style="width:99px;">Nestl&#233;</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;">any non fat dry milk is adequate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Oven</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;">generic laboratory oven</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Petri dish, 10 cm x 10 cm square</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">PIPES</td>
			<td style="width:99px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:196px;">P1851</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="357">
			<td height="357" style="height:357px;width:247px;">Rat generated Monoclonal Anti-Body</td>
			<td style="width:99px;">Plant probes</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;">Several antibodies that recognize cell wall components are 
			available at both the Complex Carbohydrate research center 
			(CCRC, Georgia University USA) and Plant Probes (Paul 
			Knox Cell Wall Lab, at Leeds University UK). A short list of 
			some commonly used MABS and where they can be purchased 
			is presented in Supplemental Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Razor blades</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;">regular razor blades</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">SDS</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:196px;">L6026</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Toluidine Blue-O</td>
			<td style="width:99px;">Agar Scientific</td>
			<td>AGR1727</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Tween 20</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:196px;">P9416</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Ultramicrotome</td>
			<td style="width:99px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:196px;">UC7</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:247px;">upright epifluorescence microscope with UV and FITC fluorescence filters</td>
			<td style="width:99px;">Leica Mycrosistems</td>
			<td style="width:196px;">DMLb</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">vaccum chamber</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">vaccum pump</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="297">
			<td height="297" style="height:297px;width:247px;">Vectashield</td>
			<td style="width:99px;">vecta Labs</td>
			<td style="width:196px;">T-1000</td>
			<td style="width:187px;">Other anti-fade may be used. Please do check for compatibility with FITC and the Fluorescente brightner 28. (Note: for a non-commercial alternative, (see Jonhson et al 198218) An antifade medium can be made by mixing 25 mg/mL of 1,4-Diazobicyclo-(2,2,2)octane (DABCO) in 9:1 (v/v) glycerol to 1xPBS. Adjust pH to 8.6 with diluted HCl.)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescent immunolocalization of arabinogalactan proteins and pectins in the cell wall of plant tissues

Die Pflanzenentwicklung beinhaltet ständige Anpassungen der Zellwandzusammensetzung und -struktur als Reaktion auf innere und äußere Reize. Zellwände bestehen aus Zellulose und nicht-zellulosehaltigen Polysacchariden zusammen mit Proteinen, Phenolverbindungen und Wasser. 90% der Zellwand besteht aus Polysacchariden (z.B. Pektine) und Arabinogalactan-Proteinen (AGPs). Die fluoreszierende Immunlokalisierung spezifischer Glykanepitope in pflanzenhistologischen Abschnitten bleibt ein Schlüsselwerkzeug, um die Umgestaltung von Wandpolysaccharidnetzwerken, -strukturen und -komponenten aufzudecken.
Hier berichten wir über ein optimiertes fluoreszierendes Immunlokalisierungsverfahren zum Nachweis von Glykanepitopen aus AGPs und Pektinen in Pflanzengeweben. Paraformaldehyd/Glutaraldehyd-Fixierung wurde zusammen mit DER LR-White Einbettung der Pflanzenproben verwendet, was eine bessere Erhaltung der Gewebestruktur und -zusammensetzung ermöglicht. Dünne Abschnitte der mit einem Ultramikrotom erhaltenen eingebetteten Proben wurden zur Immunlokalisierung mit spezifischen Antikörpern verwendet. Diese Technik bietet eine großartige Auflösung, hohe Spezifität und die Möglichkeit, mehrere glykanische Epitope in der gleichen Probe zu erkennen. Diese Technik ermöglicht die subzelluläre Lokalisierung von Glykanen und erkennt deren Akkumulation in der Zellwand. Es ermöglicht auch die Bestimmung von räumlich-zeitlichen Mustern der AGP- und Pektinverteilung während entwicklungsischer Prozesse. Die Verwendung dieses Werkzeugs kann letztlich Forschungsrichtungen leiten und Glykane mit bestimmten Funktionen in Pflanzen verknüpfen. Darüber hinaus können die erhaltenen Informationen biochemische und Genexpressionsstudien ergänzen.

In einem erfolgreichen Experiment wird der sekundäre Antikörper die Position des spezifischen Epitops in hellem Grün in einer konsistenten Weise genau bestimmen, was die Charakterisierung der Zellwandzusammensetzung in einem bestimmten Entwicklungsstadium der Zelle, des Gewebes oder des Organs ermöglicht. Zum Beispiel hat der LM6-Antikörper eine hohe Affinität zu 1,5-Arabinan, einer Verbindung mit Typ-I-Rhamnogalacturonan, die reichlich gefunden werden kann, um die Zellwand des sich entwickelnden Quercus suber<...

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Fluorescent Immunolocalization of Arabinogalactan Proteins and Pectins in the Cell Wall of Plant Tissues

Dieses Protokoll beschreibt detailliert, wie das Pflanzenmaterial für die Immunlokalisierung von Arabinogalactan-Proteinen und Pektinen fixiert, in ein hydrophiles Acrylharz eingebettet, geschnitten und auf Glasrutschen montiert ist. Wir zeigen, dass zellwandbezogene Epitope mit spezifischen Antikörpern nachgewiesen werden.

Fluoreszierende Immunlokalisierung von Arabinogalactan-Proteinen und Pektinen in der Zellwand von Pflanzengeweben

Plant development involves constant adjustments of the cell wall composition and structure in response to both internal and external stimuli. Cell walls ...

Die Menge an Informationen aus nur einem Experiment ist enorm. Wir können das Vorhandensein dieser Zellwandpolymere erkennen und genau wissen, wie sie in Zellen und Geweben verteilt sind, und sogar ihre Häufigkeit bestimmen. Diese Methode ist so konzipiert, dass sie auf fast jede Art von Pflanzengewebe von jeder Art angewendet werden kann, die man analysieren möchte.Die Immunlokalisierung in Pflanzengeweben erfordert viel akribische Arbeit, schwer zu erklären, ohne wirklich zu sehen, was passiert. Vor dem Sammeln der Pflanzengewebeprobe eine Glasdurchstechflasche mit genügend kaltfixativer Lösung füllen, um alle Proben vollständig unterWasser zu stellen. Wählen Sie dann die zu analysierenden Pflanzengewebe aus und stutzen Sie die Proben auf eine Größe von nicht mehr als 16 Quadratmillimetern.Tauchen Sie die Proben sofort in die Fixierlösung ein. Glutaraldehyd und Formaldehyd sind beide ausgezeichnete Fixative, aber beide sind gefährlich und müssen in der Durchflusshaube behandelt werden. Die Durchstechflasche in eine Vakuumkammer übertragen und langsam Vakuum auftragen.Wenn der Druck negative 60 Kilo Pascal erreicht, beginnt das schwimmende Material in der Durchstechflasche nach unten zu sinken. Halten Sie den Druck in der Kammer bei nicht mehr als negativen 80 Kilo Pascal. Der Sinkvorgang kann bis zu zwei Stunden dauern.Nachdem die Proben zwei Stunden in der Vakuumkammer gewesen sind, lassen Sie das Vakuum langsam los. Versiegeln Sie die Glasflasche und kühlen Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie nach der nächtlichen Fixierung alle Proben, die nicht auf den Boden der Durchstechflasche gesunken sind.Die restlichen Proben mit 25 Millimolaren PBS 10 Minuten waschen und dann 20 Minuten in 25 Millimolar PIPES Puffer waschen. Es ist äußerst wichtig, alle schwimmenden Proben zu entfernen, da es sehr wahrscheinlich ist, dass das Fixativ nicht in die Probe eingedrungen ist. Dehydrieren Sie die Proben in einer Ethanolserie, tauchen Sie die Proben für 20 Minuten bei jeder Ethanolkonzentration ein.Um die Proben zu durchdringen, fügen Sie zunehmende Konzentrationen von LR-weißem Harz in Ethanol hinzu, beginnend mit einem Teilharz zu drei Teilen Ethanol. Bei jeder Konzentration 24 Stunden bei vier Grad Celsius inkubieren. Ersetzen Sie das LR-weiße Harz durch frisches Harz und brüten Sie die Proben für weitere 12 Stunden bei vier Grad Celsius.Bereiten Sie die Einbettungsgelatinekapseln vor und wählen Sie Kapseln aus, die etwas größer als die Proben sind, damit die Proben vollständig in das Harz eingeschlossen werden können. Etiketten Papieretiketten mit Bleistift, weil Tinte das Harz verunreinigen wird. Tragen Sie einen Tropfen frisches LR-weißes Harz auf den Boden jeder Kapsel auf.Legen Sie eine Probe in jede Kapsel, dann füllen Sie die Kapseln bis zur maximalen Kapazität mit frischem Harz. Setzen Sie die Kappe auf die Kapsel und drücken Sie vorsichtig, um sie zu versiegeln. Um das Harz zu polymerisieren, härten Sie die Kapseln bei 58 Grad Celsius aus, bis sie etwa 24 bis 48 Stunden vollständig gehärtet sind.Nach dem Peeling der Gelatinekapsel aus dem LR-weißen Harz den Harzblock unter das Stereomikroskop legen. Mit einer scharfen Rasierklinge den LR-weißen Block in einem 45-Grad-Winkel zur Probe zu schneiden. Drehen Sie die Probe und machen Sie einen zweiten Schnitt in einem 90-Grad-Winkel zum ersten.Fahren Sie mit dem Schneiden im gleichen Muster fort, um eine Pyramide mit dem Scheitelpunkt der Pyramide direkt über dem Interessenbereich der Probe zu bilden, und beginnen Sie dann mit dem Entfernen feiner Scheiben senkrecht zur Hauptachse, bis die Schnittfläche die Probe erreicht. Die Zielprobe sollte idealerweise in trapezförmiger Form eingeschlossen werden. Legen Sie den getrimmten Harzblock in das Ultramikrotome.Passen Sie den Winkel zwischen der Messerkante und dem Harzblock an. Schneiden Sie Abschnitte aus dem Block mit einer Dicke zwischen 200 und 700 Nanometern. Verwenden Sie eine Drahtschleife, um einige abgetastete Abschnitte vorsichtig aus dem Mikrotome zu heben.Legen Sie sie in einen Tropfen destilliertes deionisiertes Wasser auf eine Glasrutsche. Verdunsten Sie das Wasser, indem Sie die Rutsche auf einer heißen Platte bei 50 Grad Celsius platzieren, und fügen Sie dann einen Tropfen Fleck zu den Abschnitten hinzu. Nach 30 Sekunden spülen Sie den Fleck ab und beobachten Sie das Dia unter dem Mikroskop, um den allgemeinen Zustand des Abschnitts zu überprüfen und die gewünschte Pflanzenstruktur sichtbar zu machen.Bereiten Sie eine saubere Reaktionsrutsche vor, indem Sie einen Tropfen destilliertes entionisiertes Wasser in jeden Brunnen der Rutsche legen. Übertragen Sie ein oder zwei Probenabschnitte auf jeden Tropfen Wasser. Die Rutsche in eine 10 Zentimeter große Petrischale geben, bedecken und bei 50 Grad Celsius trocknen lassen.Um eine Inkubationskammer für die Reaktionsschlitten vorzubereiten, legen Sie einige gedämpfte Papiertücher an die Unterseite einer Pipettenspitzenbox und wickeln Sie die Box mit Aluminiumfolie. Übertragen Sie die Dias von der Box in die Inkubationskammer. Pipette 50 Mikroliter Blockierlösung in jeden Brunnen.Nach dem Inkubieren der Rutsche für 10 Minuten, entfernen Sie die blockierende Lösung, dann waschen Sie alle Brunnen zweimal mit PBS für 10 Minuten jedes Mal. Nach der Vorbereitung der primären Antikörperlösungen, wie im Manuskript beschrieben, führen Sie eine abschließende Wäsche der Brunnen mit destilliertem entionisiertem Wasser für fünf Minuten durch. Pipette die primäre Antikörperlösung in die Reaktionsbrunnen, dann Pipette die Blockierlösung in die Steuerbrunnen.Schließen Sie die Inkubationskammer. Lassen Sie es für zwei Stunden bei Raumtemperatur stehen und dann kühlen Sie es über Nacht bei vier Grad Celsius. Bereiten Sie eine 1%-Lösung des sekundären Antikörpers in der Blockierungslösung vor.Etwa 40 Mikroliter pro Brunnen werden benötigt. Bedecken Sie die Lösung mit Aluminiumfolie. Waschen Sie die Brunnen der Reaktionsrutsche zweimal mit PBS und einmal mit destilliertem entionisiertem Wasser für jeweils 10 Minuten.Stellen Sie sicher, dass keine Sperrlösung oder Ablagerungen in den Brunnen verbleiben. Pipette die sekundäre Antikörperlösung in alle Brunnen. Inkubieren Sie die Dias im Dunkeln bei Raumtemperatur für drei bis vier Stunden.Erneut die Brunnen der Reaktionsrutsche zweimal mit PBS und einmal mit destilliertem entionisiertem Wasser waschen, dann einen Tropfen Calcofluor White zu jedem Brunnen hinzufügen. Ohne Waschen, fügen Sie einen Tropfen Montagemedium zu jedem Brunnen und decken Sie jeden Brunnen mit einem Deckel. Beobachten Sie die Probenabschnitte im Reaktionsschlitten mit einem Fluoreszenzmikroskop.Verwenden Sie für jede Beobachtung einen UV-Filter, um Zellwände zu erkennen, die vom Calcofluor und einem FITC-Filter gefärbt sind, um die Immunlokalisierung zu erkennen. Um die Ergebnisse besser zu können, verwenden Sie ImageJ oder ein ähnliches Bildanalyseprogramm, um jedes UV-Filterbild mit dem entsprechenden FITC-Filterbild zusammenzuführen. Durch die Lokalisierung bestimmter Epitope ermöglicht das Protokoll die Charakterisierung der Zellwandzusammensetzung.Zum Beispiel ist 1, 5-Arabinan reichlich in der Zellwand des sich entwickelnden Quercus suber Anther. Kaum veresterte Homogalacturonane finden sich typischerweise an der Wurzelspitze des Quercus suber embryo, der die mechanischen Eigenschaften des Organs angibt. Xylogalacturonane finden sich in degenerierenden Zellen, wie der Endospermzelle in den letzten Stadien der Quercus suber acorn reifation.Die von JIM13 oder JIM8 anerkannten Epitope von AGP finden sich auf Strukturen im Zusammenhang mit der Reproduktion, wie Zelllinien im Zusammenhang mit der Mikrogametogenese in Arabidopsis thaliana und der stigmatischen Papille und mikrobiell des basalen Angiospermtrien-Tauchmers. Häufige Fehler bei der Implementierung dieses Protokolls sind in der Regel leicht zu erkennen und zu identifizieren. Wenn die Wäschen übersprungen werden oder die Reaktionsbrunnen trocknen dürfen, erscheint der sekundäre Antikörper in der Regel als Abstrich.Aggregate von grünem Fluorchrom bilden sich, wenn der ungebundene Primärantikörper nicht richtig weggespült wird. Falten oder Ablösen der Abschnitte ist in der Regel mit schlechter Haftung aufgrund der Verwendung von unsauberen Rutschen oder aggressive sanieren verbunden. Auch die Probenvorbereitung ist von entscheidender Bedeutung.Die Harzblöcke sollten frei von Rissen mit einer deutlich sichtbaren hellgelben bis hellbraunen Probe sein. Ineffizient eingebettete Proben zeigen pulverförmige weiße Flecken oder Flächen. Die Beibehaltung der Probengröße unter acht Millimetern ist für das Eindringen der fixativen Lösung unerlässlich.Schlecht fixierte Proben erscheinen dunkelbraun oder fast schwarz. Übermäßige Temperatur kann dazu führen, dass das Harz risse, was eine Verteilung der Probe unmöglich macht. Der Einsatz von Immunlokalisierungstechniken eröffnet mehrere Forschungsrichtungen.Man kann mit spezifischeren Techniken wie der biochemischen Analyse der Zellwand weitermachen oder sogar zu einem molekularen Ansatz übergehen. Die Ergebnisse dieser Technik können helfen, die Zusammensetzung der Zellwand zu verstehen, eine extrem komplexe Struktur, die durch einfache chemische Analyse sehr schwer zu analysieren ist.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

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Expression von fluoreszierenden Proteinen in<em&gt; Branchiostoma lanceolatum</em&gt; Durch mRNA Injektion in ungedüngte Eizellen

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

Eine neuartige Mamma-Fat-Pad-Transplantationstechnik zur Visualisierung der Gefäßerzeugung von vaskulären endothelialen Stammzellen

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

Live Imaging der Maus Sekundärer Gaumen Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

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Dissektion, Immunofluorescent Färbung der Pilz Körper und Photorezeptor Neuronen im Gehirn Erwachsener Taufliege melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

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Vollständig-hängen Clearing und Färbung des Arabidopsis Blume Organe und Siliques

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

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Immuno-fluoreszierende Etikettierung von Mikrotubuli und Centrosomal Proteine in Ex Vivo Darmgewebe und 3D In-vitro- Darm Organellen

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone

Gewebevorbereitung und Immunostainierung von Craniofacial Tissues und unkalkulierten Knochen

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and ...

Use of Atomic Force Microscopy to Measure Mechanical Properties and Turgor Pressure of Plant Cells and Plant Tissues

Einsatz der Atomkraftmikroskopie zur Messung mechanischer Eigenschaften und Turgordruck von Pflanzenzellen und Pflanzengeweben

We present here the use of atomic force microscopy to indent plant tissues and recover its mechanical properties. Using two different microscopes in ...

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

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Live Cell Imaging von Microtubule Cytoskeleton und mikromechanische Manipulation der Arabidopsis Schießen apical Meristem

Understanding cell and tissue level regulation of growth and morphogenesis has been at the forefront of biological research for many decades. Advances in ...

Isolation of Endocardial and Coronary Endothelial Cells from the Ventricular Free Wall of the Rat Heart

Isolierung von Endokardialen und koronaren Endothelzellen aus der ventrikulären freien Wand des Rattenherzes

It has been shown that endocardial endothelial cells (EECs) and coronary endothelial cells (CECs) differ in origin, development, markers, and functions. ...