Name: fluorescent immunolocalization of arabinogalactan proteins and pectins in the cell wall of plant tissues
Uploaded: 2021-02-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescent Immunolocalization of Arabinogalactan Proteins and Pectins in the Cell Wall of Plant Tissues at JoVE.com

Gli autori hanno ricevuto il sostegno del progetto ue 690946 "SexSeed" (Sexual Plant Reproduction – Seed Formation) finanziato da H2020-MSCA-RISE-2015 e SeedWheels FCT PTDC/BIA-FBT/27839/2017. AMP ha ricevuto una sovvenzione dal progetto MSCA-IF-2016 dell'Unione Europea (n. 753328). MC ha ricevuto una sovvenzione dalla borsa di dottorato FCT SFRH/BD/111781/2015.

1. Preparazione del campione: fissazione, disidratazione e incorporamento LR-White
<ol><li>Fissazione e disidratazione NOTA: il processo di fissazione è fondamentale per preservare il campione; incrociando le molecole il metabolismo cellulare viene interrotto, garantendo l'integrità cellulare e prevenendo la diffusione molecolare. Gli agenti fissivi e la concentrazione utilizzata devono essere adeguati a tale scopo, lasciando gli antigeni sufficientemente esposti per interagire con gli anticorpi. ...

<ol>
	<li>Keegstra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+Cell+Walls.">Plant Cell Walls.</a> Plant Physiology. 154 (2), 483-486 (2010).</li><li>Pereira, A. M., Lopes, A. L., Coimbra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabinogalactan+Proteins+as+Interactors+along+the+Crosstalk+between+the+Pollen+Tube+and+the+Female+Tissues.">Arabinogalactan Proteins as Interactors along the Crosstalk between the Pollen Tube and the Female Tissues.</a> Frontiers in Plant Science. 7 (7), (2016).</li><li>Showalter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabinogalactan-proteins:+structure,+expression+and+function.">Arabinogalactan-proteins: structure, expression and function.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 58 (10), 1399-1417 (2001).</li><li>Majewska-Sawka, A., Nothnagel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multiple+roles+of+arabinogalactan+proteins+in+plant+development.">The multiple roles of arabinogalactan proteins in plant development.</a> Plant Physiology. 122, 3-9 (2000).</li><li>Seifert, G., Roberts, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+arabinogalactan+proteins.">The biology of arabinogalactan proteins.</a> Annual Review of Plant Biology. 58, 137-161 (2007).</li><li>Ruprecht, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Synthetic+Glycan+Microarray+Enables+Epitope+Mapping+of+Plant+Cell+Wall+Glycan-Directed+Antibodies.">A Synthetic Glycan Microarray Enables Epitope Mapping of Plant Cell Wall Glycan-Directed Antibodies.</a> Plant Physiology. 175 (3), 1094-1104 (2017).</li><li>Verhertbruggen, Y., Walker, J. L., Guillon, F., Scheller, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparative+Study+of+Sample+Preparation+for+Staining+and+Immunodetection+of+Plant+Cell+Walls+by+Light+Microscopy.">A Comparative Study of Sample Preparation for Staining and Immunodetection of Plant Cell Walls by Light Microscopy.</a> Frontiers in Plant Science. 29 (8), 1505 (2017).</li><li>Osborn, M., Weber, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+and+immunocytochemical+procedures+with+affinity+purified+antibodies:+tubulin+containing+structures.">Immunofluorescence and immunocytochemical procedures with affinity purified antibodies: tubulin containing structures.</a> Methods in Cell Biology. 24, 97-132 (1982).</li><li>Coimbra, S., Almeida, J., Junqueira, V., Costa, M., Pereira, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabinogalactan+proteins+as+molecular+markers+in+Arabidopsis+thaliana+sexual+reproduction.">Arabinogalactan proteins as molecular markers in Arabidopsis thaliana sexual reproduction.</a> Journal of Experimental Botany. 58 (15), 4027-4035 (2007).</li><li>Wilson, S. M., Bacic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+plant+cells+for+transmission+electron+microscopy+to+optimize+immunogold+labeling+of+carbohydrate+and+protein+epitopes.">Preparation of plant cells for transmission electron microscopy to optimize immunogold labeling of carbohydrate and protein epitopes.</a> Nature Protocols. 7 (9), 1716-1727 (2012).</li><li>Gane, A., Clarke, A., Bacic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+and+expression+of+arabinogalactan-proteins+in+the+ovaries+of+Nicotiana+alata+Link+and+Otto.">Localization and expression of arabinogalactan-proteins in the ovaries of Nicotiana alata Link and Otto.</a> Sex Plant Reproduction. 8, 278-282 (1995).</li><li>Coimbra, S., Salema, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunolocalization+of+arabinogalactan+proteins+in+Amaranthus+hypocondriacus+L.+ovules.">Immunolocalization of arabinogalactan proteins in Amaranthus hypocondriacus L. ovules.</a> Protoplasma. 199 (1-2), 75-82 (1997).</li><li>Coimbra, S., Duarte, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabinogalactan+proteins+may+facilitate+the+movement+of+pollen+tubes+from+the+stigma+to+the+ovules+in+Actinidia+deliciosa+and+Amaranthus+hypocondriacus.">Arabinogalactan proteins may facilitate the movement of pollen tubes from the stigma to the ovules in Actinidia deliciosa and Amaranthus hypocondriacus.</a> Euphytica. 133 (2), 171-178 (2003).</li><li>El-Tantawy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabinogalactan+protein+profiles+and+distribution+patterns+during+microspore+embryogenesis+and+pollen+development+in+Brassica+napus.">Arabinogalactan protein profiles and distribution patterns during microspore embryogenesis and pollen development in Brassica napus.</a> Plant Reproduction. 26 (3), 231-243 (2013).</li><li>Costa, M., Pereira, A. M., Rudall, P. J., Coimbra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunolocalization+of+arabinogalactan+proteins+(AGPs)+in+reproductive+structures+of+an+early-divergent+angiosperm,+Trithuria+submersa+(Hydatellaceae).">Immunolocalization of arabinogalactan proteins (AGPs) in reproductive structures of an early-divergent angiosperm, Trithuria submersa (Hydatellaceae).</a> Annals of Botany. 111 (2), 183-190 (2013).</li><li>Costa, M., Sobral, R., Ribeiro Costa, M. M., Amorim, M. I., Coimbra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+presence+of+arabinogalactan+proteins+and+pectins+during+Quercus+suber+male+gametogenesis.">Evaluation of the presence of arabinogalactan proteins and pectins during Quercus suber male gametogenesis.</a> Annals of Botany. 115 (1), 81-92 (2015).</li><li>Hibbs, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Immunolabelling.">Fluorescence Immunolabelling.</a> Confocal Microscopy for Biologists. , (2004).</li><li>Johnson, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fading+of+Immunofluorescence+during+microscopy:+A+Study+of+the+Phenomenon+and+its+Remedy.">Fading of Immunofluorescence during microscopy: A Study of the Phenomenon and its Remedy.</a> Journal of Immunological Methods. 55 (2), 231-242 (1982).</li><li>Baird, T. R., Kaufman, D., Brown, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mercury+Free+Microscopy:+An+Opportunity+for+Core+Facility+Directors.">Mercury Free Microscopy: An Opportunity for Core Facility Directors.</a> Journal of Biomolecular Techniques. 25 (2), 48-53 (2014).</li><li>Weber, G. F., Menko, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Color+image+acquisition+using+a+monochrome+camera+and+standard+fluorescence+filter+cubes.">Color image acquisition using a monochrome camera and standard fluorescence filter cubes.</a> BioTechniques. 38 (1), 52-56 (2005).</li></ol>

Il metodo di immunolocalizzazione fluorescente nelle piante qui descritto, sebbene perfettamente semplice, si basa sul successo di diversi piccoli passaggi. Il primo dei quali è la preparazione e la fissazione del campione. Durante questo primo passaggio, una miscela di formaldeide e glutaraldeide viene utilizzata per collegare la maggior parte dei componenti cellulari. La formaldeide nella soluzione fornisce una fissazione lieve e reversibile mentre la glutaraldeide fornisce un forte collegamento più permanente; l'equ...

Le pareti delle cellule vegetali sono strutture complesse composte da polisaccaridi e glicoproteine. Le pareti cellulari sono strutture estremamente dinamiche la cui architettura, organizzazione e composizione variano a seconda del tipo di cella, della localizzazione, dello stadio di sviluppo, degli stimoli esterni e interni1. Le proteine arabinogalactane (ARP) e le pectine sono componenti importanti della parete cellulare della pianta. Gli ARP sono proteine altamente glicosilate e le pectine sono polisaccaridi omogalattivonan la cui composizione, quantità e struttura variano notevolmente durante le diverse fasi di sviluppo dellepiante 2,3,4. ARP e studi sulla pectina hanno rivelato il loro coinvolgimento in diversi processi vegetali come la morte cellulare programmata, la risposta a stress abiotici, la riproduzione delle piante sessuali, tra moltialtri 5. La maggior parte di questi studi è iniziata con informazioni ottenute da studi di immunolocalizzazione.
Data la sua complessità, lo studio delle pareti cellulari richiede molti strumenti diversi. Il rilevamento di epitopi glicani utilizzando anticorpi monoclonali (mAbs) è un approccio prezioso per risolvere la distribuzione di polisaccaride e glicoproteina lungo questa struttura. C'è una vasta collezione di mAb disponibili per rilevare epitopi glicani e la specificità di ogni mAb viene continuamente migliorataanche 6. La tecnica qui descritta è applicabile a tutte le specie vegetali ed è uno strumento perfetto per guidare le direzioni di ricerca future che potrebbero comportare tecniche più costose e complesse.
In questa tecnica, anticorpi specifici sono coniugati chimicamente a coloranti fluorescenti come FITC (isotiocianato di fluoresceina), TRITC (tetrametillrhodamina-5-(e 6)-isotiocianato) o diversi coloranti Alexa Fluor. L'immunofluorescenza offre diversi vantaggi, consentendo una localizzazione subcellulare chiara e rapida dei glicani che possono essere osservati direttamente al microscopio a fluorescenza. È altamente specifico e sensibile, poiché la preparazione del campione può proteggere efficacemente la struttura naturale dell'antigene, anche se presente in quantità inferiori. Consente il rilevamento di più antigeni nello stesso campione e, cosa più importante, offre risultati di alta qualità e visivamente belli. Nonostante la grande potenza offerta dagli studi di immunolocalizzazione a fluorescenza, sono spesso considerati difficili da eseguire e implementare molto probabilmente a causa della mancanza di protocolli dettagliati che consentono la visualizzazione delle diverse fasi della procedura. Qui, forniamo alcune semplici linee guida su come eseguire questa tecnica e su come ottenere immagini di alta qualità.
Per il protocollo qui presentato, i campioni devono prima essere corretti e incorporati utilizzando il fissatore più appropriato. Sebbene considerata una tecnica dispendiosa in termini di tempo e relativamente noiosa, una corretta fissazione e incorporamento del campione vegetale è la chiave per garantire un test di immunolocalizzazione di successo. A questo scopo, il più comune è la fissazione chimica usando fissanti reticali, come le aldeidi. I fissatori incrociati stabiliscono legami chimici tra molecole del tessuto, stabilizzando e indurendo il campione. La formaldeide e la glutaraldeide sono fissivi di collegamento incrociato e talvolta viene utilizzata una combinazione di entrambi i fissivi7. La formaldeide offre una grande conservazione strutturale dei tessuti e per lunghi periodi di tempo, producendo piccole retrazioni tissutali ed essendo compatibile con l'immunostaining. La glutaraldeide è un fissatore più forte e stabile solitamente usato in combinazione con la formaldeide. L'uso della glutaraldeide ha alcuni svantaggi che devono essere presi in considerazione in quanto introduce alcuni gruppi di aldeide liberi nel tessuto fisso, che possono generare qualche etichettatura aspecifica. Anche il collegamento incrociato tra proteine e altre molecole occasionalmente può rendere alcuni epitopi bersaglio inaccessibili per gli anticorpi. Per evitare ciò, la quantità e la durata della fissazione devono essere accuratamente definite.
Dopo la fissazione, i campioni vengono incorporati nella resina corretta per indurirsi prima di ottenere le sezioni. La resina acrilica London Resin (LR-White) è la resina preferita per gli studi di immunolocalizzazione. A differenza di altre resine, LR-White è idrofilo, permettendo agli anticorpi di raggiungere i loro antigeni, senza bisogno di alcun trattamento per facilitarlo. LR-White ha anche il vantaggio di offrire una bassa autofluorescenza, consentendo una riduzione del rumore di fondo durante l'imaging ad immunofluorescenza.
Ci sono molte tecniche di colorazione disponibili per rilevare diversi componenti della parete cellulare, come la colorazione blu alciana, la colorazione blu toluidina o la colorazione periodica acido-schiff (PAS). Nessuno di questi offre il potere delle analisi di immunolocalizzazione8. Questo approccio fornisce una maggiore specificità nel rilevamento dei glicani, offrendo informazioni più vaste sulla composizione e la struttura della parete cellulare.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:728px;" width="728">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">25% (w/v) Gluteraldehyde</td>
			<td style="width:99px;">Agar Scientific</td>
			<td style="width:196px;">AGR1010</td>
			<td style="width:187px;">aq. Solution, methanol free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">8 wells Glass reaction slides</td>
			<td style="width:99px;">Marinfeld</td>
			<td style="width:196px;">MARI1216750</td>
			<td style="width:187px;">other brands may be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:196px;">A6283</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Anti-Rat IgG (wole molecule)-FITC antibody produce in GOAT</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:196px;">F6258</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:247px;">cover slips, 24 mm x 50 mm</td>
			<td style="width:99px;">Marinfeld</td>
			<td>MARI0100222</td>
			<td style="width:187px;">The cover slip should cover all the wells. Other brands may be used&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:247px;">ddH2O</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Ethanol absolute</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Fluorescent brightner 28</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:196px;">F-6259</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Gelatin capsules</td>
			<td style="width:99px;">Agar scientific</td>
			<td>AGG29211</td>
			<td style="width:187px;">The capsule size sould feat the size of the sample.</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:247px;">Glass vials</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;">Any simple unexpensive glass vials that can be sealed, may be used. The vials may be clean with 96% etanol after use to remove LR-White residue and reused.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="294">
			<td height="294" style="height:294px;width:247px;">LR-white medium grade, embdeding resin</td>
			<td style="width:99px;">Agar Scientific</td>
			<td>AGR1281</td>
			<td style="width:187px;">LR-White comes in several forms the medium grade provides na adequate cutting suport for most tissues for harder tissues a harder grade of LR-white may be recomendable. If possible use a resin already mixed with the polimeration activator (benzoyl peroxide), if not please folow the instructions of the suplier to prepare the resin.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Non fat dry milk</td>
			<td style="width:99px;">Nestl&#233;</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;">any non fat dry milk is adequate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Oven</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;">generic laboratory oven</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Petri dish, 10 cm x 10 cm square</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">PIPES</td>
			<td style="width:99px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:196px;">P1851</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="357">
			<td height="357" style="height:357px;width:247px;">Rat generated Monoclonal Anti-Body</td>
			<td style="width:99px;">Plant probes</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;">Several antibodies that recognize cell wall components are 
			available at both the Complex Carbohydrate research center 
			(CCRC, Georgia University USA) and Plant Probes (Paul 
			Knox Cell Wall Lab, at Leeds University UK). A short list of 
			some commonly used MABS and where they can be purchased 
			is presented in Supplemental Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Razor blades</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;">regular razor blades</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">SDS</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:196px;">L6026</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Toluidine Blue-O</td>
			<td style="width:99px;">Agar Scientific</td>
			<td>AGR1727</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Tween 20</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:196px;">P9416</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Ultramicrotome</td>
			<td style="width:99px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:196px;">UC7</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:247px;">upright epifluorescence microscope with UV and FITC fluorescence filters</td>
			<td style="width:99px;">Leica Mycrosistems</td>
			<td style="width:196px;">DMLb</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">vaccum chamber</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">vaccum pump</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="297">
			<td height="297" style="height:297px;width:247px;">Vectashield</td>
			<td style="width:99px;">vecta Labs</td>
			<td style="width:196px;">T-1000</td>
			<td style="width:187px;">Other anti-fade may be used. Please do check for compatibility with FITC and the Fluorescente brightner 28. (Note: for a non-commercial alternative, (see Jonhson et al 198218) An antifade medium can be made by mixing 25 mg/mL of 1,4-Diazobicyclo-(2,2,2)octane (DABCO) in 9:1 (v/v) glycerol to 1xPBS. Adjust pH to 8.6 with diluted HCl.)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescent immunolocalization of arabinogalactan proteins and pectins in the cell wall of plant tissues

Lo sviluppo dell'impianto comporta regolazioni costanti della composizione e della struttura della parete cellulare in risposta a stimoli sia interni che esterni. Le pareti cellulari sono composte da cellulosa e polisaccaridi non cellulosici insieme a proteine, composti fenolici e acqua. Il 90% della parete cellulare è composto da polisaccaridi (ad esempio, pectine) e proteine arabinogalactane (ARP). L'immunolocalizzazione fluorescente di specifici epitopi glicani nelle sezioni istologiche vegetali rimane uno strumento chiave per scoprire il rimodellamento delle reti, della struttura e dei componenti del polisaccaride delle pareti.
Qui, segnalamo una procedura di immunolocalizzazione fluorescente ottimizzata per rilevare epitopi glicani da ARP e pectine nei tessuti vegetali. La fissazione della paraformaldeide/glutaraldeide è stata utilizzata insieme all'incorporamento LR-White dei campioni vegetali, consentendo una migliore conservazione della struttura e della composizione dei tessuti. Sezioni sottili dei campioni incorporati ottenuti con un ultra-microtomo sono state utilizzate per l'immunolocalizzazione con anticorpi specifici. Questa tecnica offre grande risoluzione, alta specificità e la possibilità di rilevare più epitopi glicani nello stesso campione. Questa tecnica consente la localizzazione subcellulare dei glicani e rileva il loro livello di accumulo nella parete cellulare. Consente inoltre la determinazione dei modelli spazio-temporali di distribuzione dell'AGP e della pectina durante i processi di sviluppo. L'uso di questo strumento può in ultima analisi guidare le direzioni di ricerca e collegare i glicani a funzioni specifiche nelle piante. Inoltre, le informazioni ottenute possono integrare gli studi biochimici e di espressione genica.

In un esperimento riuscito, l'anticorpo secondario intaserà specificamente la posizione dell'epitopo specifico in verde brillante, in modo coerente, consentendo la caratterizzazione della composizione della parete cellulare in una certa fase di sviluppo della cellula, del tessuto o dell'organo. Ad esempio l'anticorpo LM6 ha un'alta affinità per 1,5-arabinan, un composto con rhamnogalacturonan di tipo I che può essere trovato abbondantemente etichettando la parete cellulare dell'anther Quercus suber in via di ...

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescent Immunolocalization of Arabinogalactan Proteins and Pectins in the Cell Wall of Plant Tissues at JoVE.com

Fluorescent Immunolocalization of Arabinogalactan Proteins and Pectins in the Cell Wall of Plant Tissues

Questo protocollo descrive in dettaglio come viene fissato il materiale vegetale per l'immunolocalizzazione delle proteine arabinogalactane e delle pectine, incorporato in una resina acrilica idrofila, sezionale e montato su vetrini. Mostriamo che gli epitopi correlati alla parete cellulare verranno rilevati con anticorpi specifici.

Immunolocalizzazione fluorescente delle proteine arabinogalactane e delle pectine nella parete cellulare dei tessuti vegetali

Plant development involves constant adjustments of the cell wall composition and structure in response to both internal and external stimuli. Cell walls ...

La quantità di informazioni provenienti da un solo esperimento è enorme. Possiamo rilevare la presenza di questi polimeri a parete cellulare e sapere esattamente come sono distribuiti in cellule e tessuti, e persino determinarne l'abbondanza. Questo metodo è progettato in modo tale che possa essere applicato a quasi tutti i tipi di tessuto vegetale di qualsiasi specie che si possa voler analizzare.L'immunolocalizzazione nei tessuti vegetali comporta un sacco di lavoro meticoloso, difficile da spiegare senza vedere realmente cosa succede. Prima di raccogliere il campione di tessuto vegetale, riempire una fiala di vetro con una soluzione fissante a freddo sufficiente per immergere completamente tutti i campioni. Quindi selezionare i tessuti vegetali da analizzare e tagliare i campioni a una dimensione non superiore a 16 millimetri quadrati.Immergere immediatamente i campioni nella soluzione fissante. La glutaraldeide e la formaldeide sono entrambi ottimi fissatori, ma entrambi sono pericolosi e devono essere maneggiati nella cappa di flusso. Trasferire il flaconcino in una camera a vuoto e applicare lentamente il vuoto.Quando la pressione raggiunge -60 kilo pascal, il materiale galleggiante nella fiala inizierà ad affondare sul fondo. Mantenere la pressione nella camera a non più di -80 kilo pascal. Il processo di affondamento può richiedere fino a due ore.Dopo che i campioni sono stati nella camera a vuoto per due ore, rilasciare lentamente il vuoto. Sigillare la fiala di vetro e refrigera durante la notte a quattro gradi Celsius. Dopo la fissazione notturna, scartare tutti i campioni che non sono affondati sul fondo del flaconcino.Lavare i campioni rimanenti con 25 PBS millimolare per 10 minuti e quindi lavarli in tampone PIPES da 25 millimolare per 20 minuti. È estremamente importante rimuovere tutti i campioni galleggianti perché è altamente probabile che il fissatore non sia penetrato nel campione. Disidratare i campioni in una serie di etanolo, immergendo i campioni per 20 minuti ad ogni concentrazione di etanolo.Per perfondere i campioni, aggiungere concentrazioni crescenti di resina LR-bianca in etanolo, a partire da una parte di resina a tre parti di etanolo. Ad ogni concentrazione, incubare per 24 ore a quattro gradi Celsius. Sostituire la resina lr-bianca con resina fresca e incubare i campioni per altre 12 ore a quattro gradi Celsius.Preparare le capsule di gelatina incorporanti, selezionando capsule leggermente più grandi dei campioni in modo che i campioni possano essere completamente racchiusi nella resina. Etichettare le etichette di carta con matita perché l'inchiostro contaminerà la resina. Applicare una goccia di resina fresca LR-bianca sul fondo di ogni capsula.Posizionare un campione in ogni capsula, quindi riempire le capsule alla massima capacità con resina fresca. Mettere il cappuccio sulla capsula e premere delicatamente per sigillare. Per polimerizzare la resina, polimerizzare le capsule a 58 gradi Celsius fino a quando non sono completamente indurite intorno alle 24-48 ore.Dopo aver sbucciato la capsula di gelatina dalla resina bianca LR, posizionare il blocco di resina sotto il microscopio stereo. Utilizzando una lama affilata, tagliare il blocco LR-white con un angolo di 45 gradi rispetto al campione. Ruotare il campione e fare un secondo taglio con un angolo di 90 gradi al primo.Continuare a tagliare nello stesso modello per formare una piramide con l'apice della piramide direttamente sopra l'area di interesse del campione, quindi iniziare a rimuovere le fette sottili perpendicolari all'asse maggiore fino a quando la superficie di taglio raggiunge il campione. Il campione di destinazione dovrebbe idealmente essere racchiuso in una forma trapezio. Posizionare il blocco di resina rifilato nell'ultra microtomo.Regolare l'angolo tra il bordo del coltello e il blocco di resina. Tagliare sezioni dal blocco con uno spessore compreso tra 200 e 700 nanometri. Utilizzare un anello metallico per sollevare con cura alcune sezioni campiolate dal microtomo.Mettili in una goccia di acqua deionizzata distillata su uno scivolo di vetro. Evaporare l'acqua posizionando lo scivolo su una piastra calda a 50 gradi Celsius, quindi aggiungere una goccia di macchia alle sezioni. Dopo 30 secondi, sciacquare la macchia e osservare lo scivolo al microscopio per verificare lo stato generale della sezione e che la struttura della pianta desiderata sia visibile.Preparare uno scivolo di reazione pulito posizionando una goccia di acqua deionizzata distillata in ogni pozzo dello scivolo. Trasferire una o due sezioni campione in ogni goccia d'acqua. Posizionare lo scivolo in una piastra di Petri quadrata di 10 centimetri, coprirlo e lasciarlo asciugare a 50 gradi Celsius.Per preparare una camera di incubazione per le diapositive di reazione, posizionare alcuni tovaglioli di carta inumiditi nella parte inferiore di una scatola di punte di pipetta e avvolgere la scatola con un foglio di alluminio. Trasferire le diapositive dalla scatola alla camera di incubazione. Pipettare 50 microlitri di soluzione di blocco in ogni pozzo.Dopo aver incubato lo scivolo per 10 minuti, rimuovere la soluzione di blocco, quindi lavare tutti i pozzali due volte con PBS per 10 minuti ogni volta. Dopo aver preparato le soluzioni anticorpali primarie come descritto nel manoscritto, eseguire un lavaggio finale dei pozzi con acqua distillata per cinque minuti. Pipettare la soluzione anticorpale primaria nei pozzi di reazione, quindi pipettare la soluzione di blocco nei pozzi di controllo.Chiudere la camera di incubazione. Lascialo riposare per due ore a temperatura ambiente e poi refrigera durante la notte a quattro gradi Celsius. Preparare una soluzione all'1% dell'anticorpo secondario nella soluzione di blocco.Saranno necessari circa 40 microlitri per pozzo. Coprire la soluzione con un foglio di alluminio. Lavare i pozzi dello scivolo di reazione due volte con PBS e una volta con acqua deionizzata distillata per 10 minuti ogni volta.Assicurarsi che nessuna soluzione di blocco o depositi rimanga nei pozzi. Pipettare la soluzione anticorpale secondaria in tutti i pozzi. Incubare gli scivoli al buio a temperatura ambiente per tre o quattro ore.Ancora una volta, lavare i pozzi dello scivolo di reazione due volte con PBS e una volta con acqua deionizzata distillata, quindi aggiungere una goccia di Calcofluor White ad ogni pozzo. Senza lavaggio, aggiungere una goccia di mezzo di montaggio ad ogni bene e coprire ogni bene con un copripavi. Osservare le sezioni del campione nella diapositiva di reazione utilizzando un microscopio a fluorescenza.Per ogni osservazione, utilizzare un filtro UV per rilevare le pareti cellulari macchiate dal Calcofluor e un filtro FITC per rilevare l'immunolocalizzazione. Per una migliore visualizzazione dei risultati, utilizzare ImageJ o un programma di analisi delle immagini simile per unire ogni immagine del filtro UV con l'immagine del filtro FITC corrispondente. Individuando la localizzazione di epitopi specifici, il protocollo consente la caratterizzazione della composizione della parete cellulare.Ad esempio, 1, 5-arabinan è abbondante nella parete cellulare dell'ante Quercus suber in via di sviluppo. Gli omogalattiuronan appena esterificati si trovano tipicamente sulla punta della radice dell'embrione Quercus suber specificando le proprietà meccaniche dell'organo. Gli xilogalacturoni si trovano nelle cellule degenerante, come la cellula endosperma durante le fasi finali della maturazione della ghianda Quercus suber.Gli epitopi dell'AGP riconosciuti da JIM13 o JIM8 si trovano su strutture legate alla riproduzione, come le linee cellulari legate alla microgametogenesi nella thaliana arabidopsis e le papille stigmatiche e microbiche dell'angiosperma basale Trithuria submersa. Gli errori comuni nell'implementazione di questo protocollo sono in genere facili da rilevare e identificare. Quando i lavaggi vengono saltati o i pozzi di reazione sono autorizzati ad asciugarsi, l'anticorpo secondario di solito apparirà come uno striscio.Aggregati di fluorocromo verde si formeranno se l'anticorpo primario non legato non viene lavato via correttamente. La piegatura o il distacco delle sezioni è solitamente correlato a una scarsa adesione a causa dell'uso di scivoli impuri o lavaggio aggressivo. Anche la preparazione del campione è fondamentale.I blocchi di resina dovrebbero essere liberi da crepe con un campione chiaramente visibile dal giallo pallido al marrone chiaro. Campioni incorporati in modo inefficiente mostreranno macchie o aree bianche polverose. Mantenere la dimensione del campione sotto gli otto millimetri è essenziale per la penetrazione della soluzione fissante.Campioni scarsamente fissati appariranno marrone scuro o quasi nero. Una temperatura eccessiva può causare la rottura della resina rendendo impossibile il sessamento del campione. L'uso di tecniche di immunolocalizzazione apre diverse direzioni di ricerca.Si può seguire con tecniche più specifiche come l'analisi biochimica della parete cellulare o persino procedere ad un approccio molecolare. I risultati forniti da questa tecnica possono aiutare a comprendere la composizione della parete cellulare, una struttura estremamente complessa molto difficile da analizzare con una semplice analisi chimica.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

L&#39;espressione di proteine ​​fluorescenti in<em&gt; Branchiostoma lanceolatum</em&gt; By mRNA iniezione in ovociti non fecondate

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

Una tecnica novel di trapianto di grassi del grasso mammario per visualizzare la generazione di vascelli delle cellule staminali endoteliali vascolari

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

Imaging Live di Mouse Seconda Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissezione e macchiatura immunofluorescente del corpo di fungo e del fotoricettore neuroni nel cervello adulto Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Intero-monta schiarimento e colorazione delle silique e organi del fiore di Arabidopsis

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Immuno-fluorescenza etichettatura dei microtubuli e proteine centrosomali in tessuto intestinale Ex Vivo e 3D In Vitro intestinale Organoids

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone

Preparazione dei tessuti e immunostaining dei tessuti craniofacciali del topo e dell'osso non decalcolato

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and ...

Use of Atomic Force Microscopy to Measure Mechanical Properties and Turgor Pressure of Plant Cells and Plant Tissues

Uso della microscopia a forza atomica per misurare le proprietà meccaniche e la pressione del turgor delle cellule vegetali e dei tessuti vegetali

We present here the use of atomic force microscopy to indent plant tissues and recover its mechanical properties. Using two different microscopes in ...

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Imaging a cellule vive di microtubulo citoscheletro e manipolazione micromeccanica del meristem apicale del germoglio di arabidopsis

Understanding cell and tissue level regulation of growth and morphogenesis has been at the forefront of biological research for many decades. Advances in ...

Isolation of Endocardial and Coronary Endothelial Cells from the Ventricular Free Wall of the Rat Heart

Isolamento delle cellule endocartali e coronarie dal muro libero ventricolare del cuore di ratto

It has been shown that endocardial endothelial cells (EECs) and coronary endothelial cells (CECs) differ in origin, development, markers, and functions. ...