Name: fluorescent immunolocalization of arabinogalactan proteins and pectins in the cell wall of plant tissues
Uploaded: 2021-02-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescent Immunolocalization of Arabinogalactan Proteins and Pectins in the Cell Wall of Plant Tissues at JoVE.com

著者らは、H2020-MSCA-RISE-2015およびSeedWheels FCT PTDC/BIA-FBT/27839/2017が資金を提供するEUプロジェクト690946'SexSeed'(性植物生殖–種子形成)から支援を受けた。AMPは、欧州連合(EU)のMSCA-IF-2016プロジェクト(No. 753328)から助成金を受けました。MCはFCT PhD助成金SFRH/BD/111781/2015から助成金を受けました。

1. サンプル調製:固定、脱水、LR-白埋め込み
<ol><li>固定と脱水 注: 固定プロセスは、サンプルを保存するために重要です。分子を架橋することで細胞代謝が停止し、細胞の完全性を確保し、分子拡散を防止する。固定剤および使用する濃度は、抗体と相互作用するために十分に露出した抗原を残して、その目的に合わせて調整されなければならない。以下のプロトコルは、グ?...

<ol>
	<li>Keegstra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+Cell+Walls.">Plant Cell Walls.</a> Plant Physiology. 154 (2), 483-486 (2010).</li><li>Pereira, A. M., Lopes, A. L., Coimbra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabinogalactan+Proteins+as+Interactors+along+the+Crosstalk+between+the+Pollen+Tube+and+the+Female+Tissues.">Arabinogalactan Proteins as Interactors along the Crosstalk between the Pollen Tube and the Female Tissues.</a> Frontiers in Plant Science. 7 (7), (2016).</li><li>Showalter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabinogalactan-proteins:+structure,+expression+and+function.">Arabinogalactan-proteins: structure, expression and function.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 58 (10), 1399-1417 (2001).</li><li>Majewska-Sawka, A., Nothnagel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multiple+roles+of+arabinogalactan+proteins+in+plant+development.">The multiple roles of arabinogalactan proteins in plant development.</a> Plant Physiology. 122, 3-9 (2000).</li><li>Seifert, G., Roberts, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+arabinogalactan+proteins.">The biology of arabinogalactan proteins.</a> Annual Review of Plant Biology. 58, 137-161 (2007).</li><li>Ruprecht, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Synthetic+Glycan+Microarray+Enables+Epitope+Mapping+of+Plant+Cell+Wall+Glycan-Directed+Antibodies.">A Synthetic Glycan Microarray Enables Epitope Mapping of Plant Cell Wall Glycan-Directed Antibodies.</a> Plant Physiology. 175 (3), 1094-1104 (2017).</li><li>Verhertbruggen, Y., Walker, J. L., Guillon, F., Scheller, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparative+Study+of+Sample+Preparation+for+Staining+and+Immunodetection+of+Plant+Cell+Walls+by+Light+Microscopy.">A Comparative Study of Sample Preparation for Staining and Immunodetection of Plant Cell Walls by Light Microscopy.</a> Frontiers in Plant Science. 29 (8), 1505 (2017).</li><li>Osborn, M., Weber, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+and+immunocytochemical+procedures+with+affinity+purified+antibodies:+tubulin+containing+structures.">Immunofluorescence and immunocytochemical procedures with affinity purified antibodies: tubulin containing structures.</a> Methods in Cell Biology. 24, 97-132 (1982).</li><li>Coimbra, S., Almeida, J., Junqueira, V., Costa, M., Pereira, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabinogalactan+proteins+as+molecular+markers+in+Arabidopsis+thaliana+sexual+reproduction.">Arabinogalactan proteins as molecular markers in Arabidopsis thaliana sexual reproduction.</a> Journal of Experimental Botany. 58 (15), 4027-4035 (2007).</li><li>Wilson, S. M., Bacic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+plant+cells+for+transmission+electron+microscopy+to+optimize+immunogold+labeling+of+carbohydrate+and+protein+epitopes.">Preparation of plant cells for transmission electron microscopy to optimize immunogold labeling of carbohydrate and protein epitopes.</a> Nature Protocols. 7 (9), 1716-1727 (2012).</li><li>Gane, A., Clarke, A., Bacic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+and+expression+of+arabinogalactan-proteins+in+the+ovaries+of+Nicotiana+alata+Link+and+Otto.">Localization and expression of arabinogalactan-proteins in the ovaries of Nicotiana alata Link and Otto.</a> Sex Plant Reproduction. 8, 278-282 (1995).</li><li>Coimbra, S., Salema, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunolocalization+of+arabinogalactan+proteins+in+Amaranthus+hypocondriacus+L.+ovules.">Immunolocalization of arabinogalactan proteins in Amaranthus hypocondriacus L. ovules.</a> Protoplasma. 199 (1-2), 75-82 (1997).</li><li>Coimbra, S., Duarte, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabinogalactan+proteins+may+facilitate+the+movement+of+pollen+tubes+from+the+stigma+to+the+ovules+in+Actinidia+deliciosa+and+Amaranthus+hypocondriacus.">Arabinogalactan proteins may facilitate the movement of pollen tubes from the stigma to the ovules in Actinidia deliciosa and Amaranthus hypocondriacus.</a> Euphytica. 133 (2), 171-178 (2003).</li><li>El-Tantawy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabinogalactan+protein+profiles+and+distribution+patterns+during+microspore+embryogenesis+and+pollen+development+in+Brassica+napus.">Arabinogalactan protein profiles and distribution patterns during microspore embryogenesis and pollen development in Brassica napus.</a> Plant Reproduction. 26 (3), 231-243 (2013).</li><li>Costa, M., Pereira, A. M., Rudall, P. J., Coimbra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunolocalization+of+arabinogalactan+proteins+(AGPs)+in+reproductive+structures+of+an+early-divergent+angiosperm,+Trithuria+submersa+(Hydatellaceae).">Immunolocalization of arabinogalactan proteins (AGPs) in reproductive structures of an early-divergent angiosperm, Trithuria submersa (Hydatellaceae).</a> Annals of Botany. 111 (2), 183-190 (2013).</li><li>Costa, M., Sobral, R., Ribeiro Costa, M. M., Amorim, M. I., Coimbra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+presence+of+arabinogalactan+proteins+and+pectins+during+Quercus+suber+male+gametogenesis.">Evaluation of the presence of arabinogalactan proteins and pectins during Quercus suber male gametogenesis.</a> Annals of Botany. 115 (1), 81-92 (2015).</li><li>Hibbs, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Immunolabelling.">Fluorescence Immunolabelling.</a> Confocal Microscopy for Biologists. , (2004).</li><li>Johnson, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fading+of+Immunofluorescence+during+microscopy:+A+Study+of+the+Phenomenon+and+its+Remedy.">Fading of Immunofluorescence during microscopy: A Study of the Phenomenon and its Remedy.</a> Journal of Immunological Methods. 55 (2), 231-242 (1982).</li><li>Baird, T. R., Kaufman, D., Brown, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mercury+Free+Microscopy:+An+Opportunity+for+Core+Facility+Directors.">Mercury Free Microscopy: An Opportunity for Core Facility Directors.</a> Journal of Biomolecular Techniques. 25 (2), 48-53 (2014).</li><li>Weber, G. F., Menko, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Color+image+acquisition+using+a+monochrome+camera+and+standard+fluorescence+filter+cubes.">Color image acquisition using a monochrome camera and standard fluorescence filter cubes.</a> BioTechniques. 38 (1), 52-56 (2005).</li></ol>

ここで説明する植物における蛍光免疫局在化法は、シームレスに簡単に説明する一方で、いくつかの小さなステップの成功に依存しています。最初のサンプル調製と固定です。この最初のステップでは、ホルムアルデヒドとグルタルアルデヒドの混合物が細胞成分の大部分を架橋するために使用されます。溶液中のホルムアルデヒドは、グルタルアルデヒドが強いより永続的な結合を提供し?...

植物細胞壁は、多糖類と糖タンパク質から構成される複雑な構造です。細胞壁は、そのアーキテクチャ、組織および構成が細胞の種類、局在化、発達段階、外部および内部刺激によって異なる非常に動的な構造である 1.アラビノガラクタンタンパク質(AMP)およびペクチンは、植物細胞壁の重要な構成要素である。AGPは、高グリコシル化タンパク質およびペクチンは、その組成、量および構造が異なる植物の発生段階2、3、4の間に大きく変化するホモガラクチュロン多糖である。ASPおよびペクチン研究は、プログラムされた細胞死、無生物性ストレスへの応答、性植物の生殖、他の多くの間でのいくつかの植物プロセスへの関与を明らかにした5。これらの研究のほとんどは、免疫局在性研究から得られた情報から始まりました。
その複雑さを考えると、細胞壁の研究には多くの異なるツールが必要です。モノクローナル抗体(mAbs)を用いたグリカンエピトープの検出は、この構造に沿った多糖類および糖タンパク質分布を解決するための貴重なアプローチです。グリカンエピトープを検出するために利用可能なmAbsの大規模なコレクションがあり、各mAbの特異性は6と同様に継続的に改善されている。ここで説明する技術はすべての植物種に適用可能であり、より高価で複雑な技術を伴うかもしれない将来の研究の方向性を導くのに最適なツールです。
この技術では、特定の抗体は、FITC(フルオレセイン・イソチオシアネート)、TRITC(テトラメチルローダミン-5-(および6)-イソチオシアネート)またはいくつかのアレクサフルオール染料などの蛍光色素に化学的に結合されます。免疫蛍光は、蛍光顕微鏡下で直接観察することができるグリカンの明確かつ迅速な細胞内局在化を可能にするいくつかの利点を提供する。それは、高い特異的かつ感受性であり、試料の調製は、より少量で存在する場合であっても、抗原の自然な構造を効果的に保護することができるので。それは同じサンプルの複数の抗原の検出を可能にし、最も重要な、高品質および視覚的に美しい結果を提供する。蛍光免疫局在化研究によって提供される大きな力にもかかわらず、彼らはしばしば、手順の異なるステップの視覚化を可能にする詳細なプロトコルの欠如のために、実行し、実装することが困難であると考えられている。ここでは、この手法を実行する方法と高品質の画像を取得する方法について、いくつかの簡単なガイドラインを提供します。
ここで示すプロトコルの場合、サンプルはまず修正され、最も適切な固定を使用して埋め込む必要があります。時間がかかり、比較的面倒な技術と考えられていますが、植物試料の適切な固定と埋め込みは、免疫局在アッセイを成功させるための鍵です。この目的のために、最も通常はアルデヒドのような架橋固定剤を用いた化学固定である。架橋固定剤は、組織の分子間の化学的結合を確立し、サンプルを安定化し硬化させる。ホルムアルデヒドとグルタルアルデヒドは、架橋性固定剤であり、そして時々両方の固定剤の混合が7を使用する。ホルムアルデヒドは、組織の構造保存を大きくし、長期間にわたって、小さな組織の引き込みと免疫染色との互換性を提供します。グルタルアルデヒドは、ホルムアルデヒドと組み合わせて通常使用される、より強力で安定した固定剤です。グルタルアルデヒドの使用は、いくつかの自由なアルデヒド基を固定組織に導入し、非特異的標識を生成する可能性があるため、考慮しなければならないいくつかの欠点を有する。また、タンパク質と他の分子との架橋は、時折、抗体に対してアクセスできない標的エピトープをレンダリングする可能性があります。これを回避するには、固定の数量と期間を慎重に定義する必要があります。
固定後、サンプルは、セクションを得る前に硬化するために適切な樹脂に埋め込まれます。ロンドン樹脂(LR-白)アクリル樹脂は、免疫局在性試験に適した樹脂です。他の樹脂とは異なり、LR-Whiteは親水性であり、抗体が抗原に到達することを可能にし、それを容易にする治療を必要としない。LR-Whiteは低い自己蛍光を提供する利点もあり、免疫蛍光イメージング中のバックグラウンドノイズの低減を可能にする。
アルシアンブルー染色、トルイジンブルー染色、周期酸-シッフ(PAS)染色など、細胞壁の異なる成分を検出するために利用可能な多くの染色技術があります。これらのどれも免疫局在性分析の力を提供していません8.このアプローチは、グリカンの検出に大きな特異性を与え、細胞壁の構成と構造に関するより広大な情報を提供します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:728px;" width="728">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">25% (w/v) Gluteraldehyde</td>
			<td style="width:99px;">Agar Scientific</td>
			<td style="width:196px;">AGR1010</td>
			<td style="width:187px;">aq. Solution, methanol free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">8 wells Glass reaction slides</td>
			<td style="width:99px;">Marinfeld</td>
			<td style="width:196px;">MARI1216750</td>
			<td style="width:187px;">other brands may be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:196px;">A6283</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Anti-Rat IgG (wole molecule)-FITC antibody produce in GOAT</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:196px;">F6258</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:247px;">cover slips, 24 mm x 50 mm</td>
			<td style="width:99px;">Marinfeld</td>
			<td>MARI0100222</td>
			<td style="width:187px;">The cover slip should cover all the wells. Other brands may be used&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:247px;">ddH2O</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Ethanol absolute</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Fluorescent brightner 28</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:196px;">F-6259</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Gelatin capsules</td>
			<td style="width:99px;">Agar scientific</td>
			<td>AGG29211</td>
			<td style="width:187px;">The capsule size sould feat the size of the sample.</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:247px;">Glass vials</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;">Any simple unexpensive glass vials that can be sealed, may be used. The vials may be clean with 96% etanol after use to remove LR-White residue and reused.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="294">
			<td height="294" style="height:294px;width:247px;">LR-white medium grade, embdeding resin</td>
			<td style="width:99px;">Agar Scientific</td>
			<td>AGR1281</td>
			<td style="width:187px;">LR-White comes in several forms the medium grade provides na adequate cutting suport for most tissues for harder tissues a harder grade of LR-white may be recomendable. If possible use a resin already mixed with the polimeration activator (benzoyl peroxide), if not please folow the instructions of the suplier to prepare the resin.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Non fat dry milk</td>
			<td style="width:99px;">Nestl&#233;</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;">any non fat dry milk is adequate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Oven</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;">generic laboratory oven</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Petri dish, 10 cm x 10 cm square</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">PIPES</td>
			<td style="width:99px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:196px;">P1851</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="357">
			<td height="357" style="height:357px;width:247px;">Rat generated Monoclonal Anti-Body</td>
			<td style="width:99px;">Plant probes</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;">Several antibodies that recognize cell wall components are 
			available at both the Complex Carbohydrate research center 
			(CCRC, Georgia University USA) and Plant Probes (Paul 
			Knox Cell Wall Lab, at Leeds University UK). A short list of 
			some commonly used MABS and where they can be purchased 
			is presented in Supplemental Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Razor blades</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;">regular razor blades</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">SDS</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:196px;">L6026</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Toluidine Blue-O</td>
			<td style="width:99px;">Agar Scientific</td>
			<td>AGR1727</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Tween 20</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:196px;">P9416</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Ultramicrotome</td>
			<td style="width:99px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:196px;">UC7</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:247px;">upright epifluorescence microscope with UV and FITC fluorescence filters</td>
			<td style="width:99px;">Leica Mycrosistems</td>
			<td style="width:196px;">DMLb</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">vaccum chamber</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">vaccum pump</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="297">
			<td height="297" style="height:297px;width:247px;">Vectashield</td>
			<td style="width:99px;">vecta Labs</td>
			<td style="width:196px;">T-1000</td>
			<td style="width:187px;">Other anti-fade may be used. Please do check for compatibility with FITC and the Fluorescente brightner 28. (Note: for a non-commercial alternative, (see Jonhson et al 198218) An antifade medium can be made by mixing 25 mg/mL of 1,4-Diazobicyclo-(2,2,2)octane (DABCO) in 9:1 (v/v) glycerol to 1xPBS. Adjust pH to 8.6 with diluted HCl.)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescent immunolocalization of arabinogalactan proteins and pectins in the cell wall of plant tissues

植物の開発には、内部および外部刺激の両方に応答して、細胞壁の組成と構造の一定の調整が含まれます。細胞壁は、タンパク質、フェノール化合物および水と共にセルロースおよび非セルロース性多糖類で構成されています。細胞壁の90%は、多糖類(例えば、ペクチン)およびアラビノガラクタンタンパク質(AMP)で構成されています。植物組織学的セクションにおける特定のグリカンエピトープの蛍光免疫局在化は、壁多糖ネットワーク、構造および構成要素のリモデリングを明らかにする重要なツールであり続けています。
ここでは、植物組織中のAMPおよびペクチンからグリカンエピトープを検出するための最適化された蛍光免疫局在化手順を報告する。パラホルムアルデヒド/グルタルアルデヒド固定は、植物サンプルのLR-White埋め込みと一緒に使用され、組織構造および組成のより良い保存を可能にする。超ミクロトームで得られた埋め込みサンプルの薄い部分は、特定の抗体による免疫局在化に使用された。この手法は、大きな解像度、高い特異性、および同じサンプル内の複数のグリカンエピトープを検出する機会を提供します。この技術は、グリカンの細胞内局在化を可能にし、細胞壁に蓄積のレベルを検出します。また、発達過程におけるAGPおよびペクチン分布の時空間的パターンの決定も可能となる。このツールの使用は、最終的に研究の方向を導き、植物の特定の機能にグリカンをリンクすることができます。さらに、得られた情報は、生化学的および遺伝子発現研究を補完することができる。

実験が成功すると、二次抗体は特異的に明るい緑色の特定のエピトープの位置を一貫した方法で特定し、細胞、組織または器官の特定の発達段階で細胞壁組成物の特徴付けを可能にする。例えばLM6抗体は、1,5-アラビナン、開発中のケルカス・スバー ・アンテル(図2A)の細胞壁に豊富にラベルを付けているI型ラムノガラクチュランを有する化合物に対する高い親和...

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescent Immunolocalization of Arabinogalactan Proteins and Pectins in the Cell Wall of Plant Tissues at JoVE.com

Fluorescent Immunolocalization of Arabinogalactan Proteins and Pectins in the Cell Wall of Plant Tissues

このプロトコルは、アラビノガラクタンタンパク質およびペクチンの免疫局在化のための植物材料が固定され、親水性アクリル樹脂に埋め込まれ、切り離され、ガラススライドに取り付けられる方法を詳細に記述する。我々は、細胞壁関連エピトープが特定の抗体で検出されることを示す。

植物組織の細胞壁におけるアラビノガラクタンタンパク質およびペクチンの蛍光免疫局在化

Plant development involves constant adjustments of the cell wall composition and structure in response to both internal and external stimuli. Cell walls ...

たった1つの実験からの情報量は膨大です。これらの細胞壁ポリマーの存在を検出し、それらが細胞や組織にどのように分布しているかを正確に知ることができ、その存在量を決定することさえできます。この方法は、分析したい種の植物組織のほとんどすべての種類に適用することができるように設計されています。植物組織における免疫局在化には多くの細心の注意を払った作業が必要であり、実際に何が起こるかを見ずに説明することは困難です。植物組織サンプルを採取する前に、ガラスバイアルに十分な冷たい固定液を充填して、すべてのサンプルを完全に水没させます。次に、分析する植物組織を選択し、サンプルを16平方ミリメートル以下のサイズにトリミングします。直ちにサンプルを固定液に浸します。グルタルアルデヒドとホルムアルデヒドはどちらも優れた固定剤ですが、どちらも危険であり、フローフードで取り扱う必要があります。バイアルを真空チャンバーに移し、ゆっくりと真空を適用します。圧力が負の60キロパスカルに達すると、バイアルの浮遊材料は底に沈み始めます。部屋の圧力は、負の80キロパスカル以下で維持します。沈むプロセスには最大 2 時間かかる場合があります。サンプルが真空チャンバーに2時間入った後、真空をゆっくりと放出する。ガラスバイアルを密封し、摂氏4度で一晩冷蔵します。一晩固定した後、バイアルの底に沈んでいないサンプルを捨てます。残りのサンプルを25ミリモルPBSで10分間洗浄し、25ミリモルパイプバッファーで20分間洗浄します。固定性がサンプルに浸透していない可能性が非常に高いため、すべてのフローティングサンプルを削除することは非常に重要です。エタノール系列でサンプルを脱水し、各エタノール濃度で20分間サンプルを浸漬する。サンプルを透過するには、エタノールにLR-白色樹脂の濃度を加え、1部の樹脂からエタノールの3部に添加します。各濃度で、摂氏4度で24時間インキュベートする。LR-白樹脂をフレッシュ樹脂に交換し、さらに12時間摂氏4度でインキュベートします。埋め込みゼラチンカプセルを用意し、サンプルを樹脂に完全に封入できるようにサンプルよりわずかに大きいカプセルを選択します。インクは樹脂を汚染するので、紙のタグに鉛筆のラベルを付けます。各カプセルの底に新鮮なLR-白樹脂を1滴塗布します。各カプセルにサンプルを入れ、カプセルを新鮮な樹脂で最大容量に充填します。カプセルにキャップを置き、軽く押して密封します。樹脂を重合するには、24~48時間程度硬化するまで58°Cでカプセルを硬化させます。LR-白樹脂からゼラチンカプセルを剥離した後、樹脂ブロックをステレオ顕微鏡の下に置きます。鋭利なカミソリの刃を使用して、LR-白いブロックをサンプルに対して45度の角度でトリミングします。サンプルを回転させ、90度の角度で2回目のカットを1回目にします。同じパターンで切断を続けて、ピラミッドの頂点を持つピラミッドをサンプルの対象領域の真上に形成し、切断面がサンプルに到達するまで長軸に垂直な細かいスライスを削除します。ターゲットサンプルは、理想的には台形で囲む必要があります。トリムされた樹脂ブロックを超ミクロトームに入れる。ナイフの端と樹脂ブロックの間の角度を調整します。200~700ナノメートルの厚さのブロックから切り取ります。ワイヤーループを使用して、サンプルされたセクションを慎重にマイクロトームから持ち上げます。ガラスのスライドの上に蒸留脱イオン水の滴にそれらを置きます。50°Cのホットプレートにスライドを置くことによって水を蒸発させ、その後、セクションに汚れの滴を追加します。30秒後、汚れをすすいで顕微鏡下でスライドを観察し、断面の一般的な状態を確認し、所望の植物構造が見えることを確認します。スライドの各ウェルに蒸留脱イオン水を一滴入れることで、きれいな反応スライドを準備します。1つまたは2つのサンプルセクションを水滴に移します。スライドを10センチメートルの正方形のペトリ皿に入れ、それを覆い、摂氏50度で乾燥させます。反応スライド用のインキュベーションチャンバーを準備するには、湿らせたペーパータオルをピペットチップボックスの下部に置き、箱をアルミホイルで包みます。箱からインキュベーションチャンバーにスライドを移します。各ウェルにブロッキング溶液のピペット50マイクロリットル。スライドを10分間インキュベートした後、ブロッキング溶液を取り出し、その後、すべてのウェルをPBSで2回、毎回10分間洗浄します。原稿に記載されている一次抗体溶液を調製した後、蒸留脱イオン水で井戸の最終洗浄を5分間行う。一次抗体溶液を反応ウェルにピペットし、次いでブロッキング溶液をコントロールウェルにピペットします。インキュベーションチャンバーを閉じます。室温で2時間放置し、摂氏4度で一晩冷蔵します。ブロッキング溶液中に2次抗体の1%溶液を調製する。井戸あたり約40マイクロリットルが必要になります。溶液をアルミホイルで覆います。反応スライドのウェルをPBSで2回、蒸留脱イオン水で1回洗浄し、毎回10分間洗浄します。ブロッキングソリューションやデポジットが井戸に残らないようにしてください。二次抗体溶液を全てのウェルにピペットします。室温で3〜4時間暗い場所でスライドをインキュベートします。繰り返しますが、反応スライドのウェルをPBSで2回、蒸留脱イオン水で1回洗浄し、各ウェルにカルコフルオールホワイトを1滴加えます。洗浄せずに、各ウェルに取り付け媒体の滴を追加し、カバースリップで各井戸をカバーします。蛍光顕微鏡を用いて反応スライドのサンプル切片を観察します。観察ごとに、UVフィルタを使用してカルコフルオールで染色された細胞壁とFITCフィルタを使用して免疫局在を検出します。結果をより見やすくするために、ImageJ または類似の画像解析プログラムを使用して、各 UV フィルタ イメージを対応する FITC フィルタ イメージとマージします。特定のエピトープの局在を特定することにより、このプロトコルは細胞壁組成の特性評価を可能にする。例えば、1、5-アラビナンは、現像したケルカスの細胞壁に豊富に存在する。ほとんどエステル化されたホモガラクチロンは、典型的には、器官の機械的特性を指定するケルカスベル胚の根先に見られる。キシログラクトルナンは、ケルカス・サウバー・ドングリ成熟の最終段階で、胚乳細胞などの変性細胞に見られる。JIM13またはJIM8によって認識されるAGPのエピトープは、シロイヌズナの微小生殖に関連する細胞株や、基底性の血管精子トリトーリア水没者の汚名状乳頭および微生物など、生殖に関連する構造に見られる。このプロトコルを実装する際のよくある誤りは、通常、検出して識別するのが簡単です。この場合、開く場合、または反応ウェルを乾燥させると、通常、二次抗体がスミアとして現れます。緑色のフルオロクロムの凝集体は、非結合一次抗体が適切に洗浄されない場合に形成されます。セクションの折り畳みまたは剥離は、通常、汚れたスライドまたは積極的な洗浄の使用による接着不良に関連しています。サンプルの準備も重要です。樹脂ブロックは、明らかに見える淡い黄色から明るい茶色のサンプルと亀裂のないはずです。非効率的に埋め込まれたサンプルは、粉末状の白い斑点または領域を示す。サンプルサイズを8ミリメートル以下に保つことは、固定溶液の浸透に不可欠です。不十分な固定サンプルは、濃い茶色またはほとんど黒で表示されます。温度が過大な場合、樹脂がサンプルの切り離しを行う原因となります。免疫局在化技術の使用は、いくつかの研究の方向性を開きます。細胞壁の生化学的分析などのより具体的な技術を続けたり、分子的アプローチに進むことさえできます。この技術によって得られる結果は、細胞壁の組成を理解するのに役立つ、単純な化学分析によって分析することは非常に困難な非常に複雑な構造である。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

蛍光タンパク質の発現において<em&gt; Branchiostoma lanceolatum</em&gt;未受精卵へのmRNA注入による

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the ...

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

血管内皮幹細胞の血管形成を視覚化するための新規乳腺脂肪移植技術

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

マウス二次口蓋融合のライブイメージング

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

郭清ときのこ体の免疫蛍光染色と大人のショウジョウバエ脳光受容器ニューロン

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

全体マウント クリアとシロイヌナズナの花器官および Siliques の染色

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

微小管と 3 D培養腸 Organoids とEx Vivo腸組織における Centrosomal 蛋白質の免疫蛍光ラベリング

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone

マウス頭蓋組織および非除電骨の組織調製と免疫染色

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and ...

Use of Atomic Force Microscopy to Measure Mechanical Properties and Turgor Pressure of Plant Cells and Plant Tissues

原子間力顕微鏡を用いて植物細胞と植物組織の機械的特性とターゴール圧を測定

We present here the use of atomic force microscopy to indent plant tissues and recover its mechanical properties. Using two different microscopes in ...

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

ミクロチューブ細胞骨格の生細胞イメージングと シロイヌナズナの 微小機械的操作

Understanding cell and tissue level regulation of growth and morphogenesis has been at the forefront of biological research for many decades. Advances in ...

Isolation of Endocardial and Coronary Endothelial Cells from the Ventricular Free Wall of the Rat Heart

ラット心臓の心室自由壁からの心内膜細胞と冠状動脈内皮細胞の分離

It has been shown that endocardial endothelial cells (EECs) and coronary endothelial cells (CECs) differ in origin, development, markers, and functions. ...