Name: fluorescent immunolocalization of arabinogalactan proteins and pectins in the cell wall of plant tissues
Uploaded: 2021-02-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescent Immunolocalization of Arabinogalactan Proteins and Pectins in the Cell Wall of Plant Tissues at JoVE.com

저자는 H2020-MSCA-RISE-2015및 종자 바퀴 FCT PTDC / BIA-FBT / 27839 /2017에 의해 투자 된 EU 프로젝트 690946 '섹스 시드'(성적 식물 재생 - 종자 형성)로부터 지원을받았다. AMP는 유럽 연합의 MSCA-IF-2016 프로젝트(No. 753328)로부터 보조금을 받았습니다. MC는 FCT 박사 과정 보조금 SFRH/BD/111781/2015로부터 교부금을 받았다.

1. 샘플 준비 : 고정, 탈수 및 LR-화이트 포함
<ol><li>고정 및 탈수 참고: 고정 프로세스는 샘플을 보존하는 데 중요합니다. 분자를 교차 연결하 여 세포 대사 중단, 세포 무결성 보장 하 고 분자 확산을 방지. 고정제 및 사용된 농도는 그 목적에 맞게 조정되어야 하며, 항원이 항체와 상호 작용하기에 충분히 노출되어야 한다. 다음 프로토콜은 파라포름알데히드의 온화한 고정 능력과 ?...

<ol>
	<li>Keegstra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+Cell+Walls.">Plant Cell Walls.</a> Plant Physiology. 154 (2), 483-486 (2010).</li><li>Pereira, A. M., Lopes, A. L., Coimbra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabinogalactan+Proteins+as+Interactors+along+the+Crosstalk+between+the+Pollen+Tube+and+the+Female+Tissues.">Arabinogalactan Proteins as Interactors along the Crosstalk between the Pollen Tube and the Female Tissues.</a> Frontiers in Plant Science. 7 (7), (2016).</li><li>Showalter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabinogalactan-proteins:+structure,+expression+and+function.">Arabinogalactan-proteins: structure, expression and function.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 58 (10), 1399-1417 (2001).</li><li>Majewska-Sawka, A., Nothnagel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multiple+roles+of+arabinogalactan+proteins+in+plant+development.">The multiple roles of arabinogalactan proteins in plant development.</a> Plant Physiology. 122, 3-9 (2000).</li><li>Seifert, G., Roberts, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+arabinogalactan+proteins.">The biology of arabinogalactan proteins.</a> Annual Review of Plant Biology. 58, 137-161 (2007).</li><li>Ruprecht, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Synthetic+Glycan+Microarray+Enables+Epitope+Mapping+of+Plant+Cell+Wall+Glycan-Directed+Antibodies.">A Synthetic Glycan Microarray Enables Epitope Mapping of Plant Cell Wall Glycan-Directed Antibodies.</a> Plant Physiology. 175 (3), 1094-1104 (2017).</li><li>Verhertbruggen, Y., Walker, J. L., Guillon, F., Scheller, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparative+Study+of+Sample+Preparation+for+Staining+and+Immunodetection+of+Plant+Cell+Walls+by+Light+Microscopy.">A Comparative Study of Sample Preparation for Staining and Immunodetection of Plant Cell Walls by Light Microscopy.</a> Frontiers in Plant Science. 29 (8), 1505 (2017).</li><li>Osborn, M., Weber, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+and+immunocytochemical+procedures+with+affinity+purified+antibodies:+tubulin+containing+structures.">Immunofluorescence and immunocytochemical procedures with affinity purified antibodies: tubulin containing structures.</a> Methods in Cell Biology. 24, 97-132 (1982).</li><li>Coimbra, S., Almeida, J., Junqueira, V., Costa, M., Pereira, L. 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M., Bacic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+plant+cells+for+transmission+electron+microscopy+to+optimize+immunogold+labeling+of+carbohydrate+and+protein+epitopes.">Preparation of plant cells for transmission electron microscopy to optimize immunogold labeling of carbohydrate and protein epitopes.</a> Nature Protocols. 7 (9), 1716-1727 (2012).</li><li>Gane, A., Clarke, A., Bacic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+and+expression+of+arabinogalactan-proteins+in+the+ovaries+of+Nicotiana+alata+Link+and+Otto.">Localization and expression of arabinogalactan-proteins in the ovaries of Nicotiana alata Link and Otto.</a> Sex Plant Reproduction. 8, 278-282 (1995).</li><li>Coimbra, S., Salema, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunolocalization+of+arabinogalactan+proteins+in+Amaranthus+hypocondriacus+L.+ovules.">Immunolocalization of arabinogalactan proteins in Amaranthus hypocondriacus L. ovules.</a> Protoplasma. 199 (1-2), 75-82 (1997).</li><li>Coimbra, S., Duarte, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabinogalactan+proteins+may+facilitate+the+movement+of+pollen+tubes+from+the+stigma+to+the+ovules+in+Actinidia+deliciosa+and+Amaranthus+hypocondriacus.">Arabinogalactan proteins may facilitate the movement of pollen tubes from the stigma to the ovules in Actinidia deliciosa and Amaranthus hypocondriacus.</a> Euphytica. 133 (2), 171-178 (2003).</li><li>El-Tantawy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabinogalactan+protein+profiles+and+distribution+patterns+during+microspore+embryogenesis+and+pollen+development+in+Brassica+napus.">Arabinogalactan protein profiles and distribution patterns during microspore embryogenesis and pollen development in Brassica napus.</a> Plant Reproduction. 26 (3), 231-243 (2013).</li><li>Costa, M., Pereira, A. M., Rudall, P. J., Coimbra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunolocalization+of+arabinogalactan+proteins+(AGPs)+in+reproductive+structures+of+an+early-divergent+angiosperm,+Trithuria+submersa+(Hydatellaceae).">Immunolocalization of arabinogalactan proteins (AGPs) in reproductive structures of an early-divergent angiosperm, Trithuria submersa (Hydatellaceae).</a> Annals of Botany. 111 (2), 183-190 (2013).</li><li>Costa, M., Sobral, R., Ribeiro Costa, M. M., Amorim, M. I., Coimbra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+presence+of+arabinogalactan+proteins+and+pectins+during+Quercus+suber+male+gametogenesis.">Evaluation of the presence of arabinogalactan proteins and pectins during Quercus suber male gametogenesis.</a> Annals of Botany. 115 (1), 81-92 (2015).</li><li>Hibbs, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Immunolabelling.">Fluorescence Immunolabelling.</a> Confocal Microscopy for Biologists. , (2004).</li><li>Johnson, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fading+of+Immunofluorescence+during+microscopy:+A+Study+of+the+Phenomenon+and+its+Remedy.">Fading of Immunofluorescence during microscopy: A Study of the Phenomenon and its Remedy.</a> Journal of Immunological Methods. 55 (2), 231-242 (1982).</li><li>Baird, T. R., Kaufman, D., Brown, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mercury+Free+Microscopy:+An+Opportunity+for+Core+Facility+Directors.">Mercury Free Microscopy: An Opportunity for Core Facility Directors.</a> Journal of Biomolecular Techniques. 25 (2), 48-53 (2014).</li><li>Weber, G. F., Menko, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Color+image+acquisition+using+a+monochrome+camera+and+standard+fluorescence+filter+cubes.">Color image acquisition using a monochrome camera and standard fluorescence filter cubes.</a> BioTechniques. 38 (1), 52-56 (2005).</li></ol>

여기에 설명 된 식물의 형광 면역 지역화 방법은 원활하게 간단하면서도 여러 개의 작은 단계의 성공에 의존합니다. 첫 번째는 샘플 준비 및 고정입니다. 이 첫 번째 단계 동안, 포름알데히드와 글루타랄데히드의 혼합물은 세포 성분의 대부분을 교차 연결하는 데 사용된다. 용액의 포름알데히드는 부드럽고 뒤집을 수 있는 고정을 제공하며 글루타랄데히드는 더 영구적인 연결을 제공합니다. 두 ?...

식물 세포벽은 다당류와 당단백질로 구성된 복잡한 구조입니다. 세포벽은 세포유형, 국소화, 발달단계, 외부 및 내부 자극1에따라 건축, 조직 및 구성이 변화하는 매우 역동적인 구조이다. 아라비노갈락탄 단백질(AgPs)과 펙틴은 식물 세포벽의 중요한 성분입니다. AGP는 매우 글리코화 단백질이며펙틴은 상이한 식물 발달 단계2,3,4동안 조성물, 양 및 구조가 크게 변화하는 균질균투로난 다당류이다. AgPs와 펙틴 연구는 프로그램 된 세포 죽음, 무생물 스트레스에 대한 반응, 성적 식물 번식, 많은 다른 사람의 사이에서5와같은 여러 식물 프로세스에 참여한 것으로 나타났습니다. 이 연구의 대부분은 면역 지역화 연구 결과에서 얻은 정보로 시작했습니다.
복잡성을 감안할 때 세포벽연구에는 다양한 도구가 필요합니다. 단일 클론 항체 (mAbs)를 사용하여 글리칸 에피토페를 검출하는 것은이 구조를 따라 다당류 및 당단백질 분포를 해결하는 귀중한 접근 방식입니다. 글리칸 에피토프를 검출할 수 있는 mAbs의 큰 컬렉션이 있으며 각 mAb의 특이성은지속적으로6개뿐만 아니라 지속적으로 개선되고 있다. 여기에 설명 된 기술은 모든 식물 종에 적용 할 수 있으며, 더 비싸고 복잡한 기술을 포함 할 수있는 미래의 연구 방향을 안내하는 완벽한 도구입니다.
이 기술에서, 특정 항체는 FITC (형광이소 이소티오네이트), TRITC (테트라메틸로다민-5-(및 6)-이소티오카네이트) 또는 몇몇 알렉사 플루오르 염료와 같은 형광염염에 화학적으로 공해된다. 면역 형광은 형광 현미경으로 직접 관찰 할 수있는 글리칸의 명확하고 빠른 세포 전산화를 허용하는 몇 가지 장점을 제공합니다. 시료의 제조가 항원의 자연적인 구조를 효과적으로 보호할 수 있기 때문에, 더 낮은 양으로 존재하는 경우에도 매우 특이적이고 민감하다. 그것은 동일한 샘플에서 여러 항원검출을 허용하고 가장 중요한, 높은 품질과 시각적으로 아름다운 결과를 제공합니다. 형광 면역 지역화 연구에 의해 제공되는 큰 힘에도 불구하고, 그들은 종종 절차의 다른 단계의 시각화를 허용하는 상세한 프로토콜의 부족으로 인해 수행하고 구현하기 어려운 것으로 간주됩니다. 여기에서는 이 기술을 수행하는 방법과 고품질 이미지를 얻는 방법에 대한 몇 가지 간단한 지침을 제공합니다.
여기에 제시된 프로토콜의 경우 가장 적절한 고정을 사용하여 샘플을 먼저 수정하고 포함시켜야 합니다. 시간이 많이 걸리고 비교적 지루한 기술로 간주되지만 식물 샘플의 적절한 고정 및 포함은 성공적인 면역 지역화 분석법을 보장하는 열쇠입니다. 이 목적을 위해, 가장 일반적인 알데히드 처럼 교차 고정제를 사용 하 여 화학 고정. 교차 연결 고정제 조직의 분자 사이의 화학 결합을 설정, 안정화 및 샘플을 경화. 포름알데히드와 글루타랄데히드는 교차 연결 고정제이며, 때로는 두 고정제의 혼합이7을사용한다. 포름알데히드는 조직의 훌륭한 구조적 보존을 제공하고 오랜 시간 동안 작은 조직 후퇴를 생성하고 면역 염색과 호환됩니다. 글루타랄데히드는 포름알데히드와 함께 일반적으로 사용되는 강하고 안정적인 고정제입니다. 글루타랄데히드의 사용은 일부 특이한 라벨을 생성할 수 있는 고정 된 조직에 일부 무료 알데히드 그룹을 도입할 때 고려해야 할 몇 가지 단점이 있습니다. 또한 단백질과 다른 분자 사이의 교차 연결은 때때로 항체를 위해 접근할 수 없는 몇몇 표적 전형체를 렌더링할 수 있습니다. 이를 방지하려면 고정의 수량과 기간을 신중하게 정의해야 합니다.
고정 후 샘플을 적절한 수지에 내장하여 단면을 얻기 전에 경화합니다. 런던 수지 (LR-화이트) 아크릴 수지는 면역 지역화 연구를위한 선택의 수지입니다. 다른 수지와는 달리, LR-White는 친수성, 항원에 도달 하는 항 원을 허용, 그것을 용이 하 게 어떤 치료의 필요 없이. LR-White는 또한 낮은 자동 형광을 제공하여 면역 형광 이미징 중 배경 소음을 줄이는 장점이 있습니다.
알시안 블루 스테인링, 토루이딘 블루 스테인링 또는 주기적인 산-쉬프(PAS) 염색과 같은 세포벽의 다양한 성분을 검출할 수 있는 많은 염색 기술이 있다. 이들 중 어느 것도 면역 지역화 분석8의힘을 제공하지 않습니다. 이 접근법은 글리칸 검출에 더 큰 특이성을 제공하여 세포벽 조성 및 구조에 관한 광범위한 정보를 제공합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:728px;" width="728">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">25% (w/v) Gluteraldehyde</td>
			<td style="width:99px;">Agar Scientific</td>
			<td style="width:196px;">AGR1010</td>
			<td style="width:187px;">aq. Solution, methanol free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">8 wells Glass reaction slides</td>
			<td style="width:99px;">Marinfeld</td>
			<td style="width:196px;">MARI1216750</td>
			<td style="width:187px;">other brands may be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:196px;">A6283</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Anti-Rat IgG (wole molecule)-FITC antibody produce in GOAT</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:196px;">F6258</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:247px;">cover slips, 24 mm x 50 mm</td>
			<td style="width:99px;">Marinfeld</td>
			<td>MARI0100222</td>
			<td style="width:187px;">The cover slip should cover all the wells. Other brands may be used&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:247px;">ddH2O</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Ethanol absolute</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Fluorescent brightner 28</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:196px;">F-6259</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Gelatin capsules</td>
			<td style="width:99px;">Agar scientific</td>
			<td>AGG29211</td>
			<td style="width:187px;">The capsule size sould feat the size of the sample.</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:247px;">Glass vials</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;">Any simple unexpensive glass vials that can be sealed, may be used. The vials may be clean with 96% etanol after use to remove LR-White residue and reused.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="294">
			<td height="294" style="height:294px;width:247px;">LR-white medium grade, embdeding resin</td>
			<td style="width:99px;">Agar Scientific</td>
			<td>AGR1281</td>
			<td style="width:187px;">LR-White comes in several forms the medium grade provides na adequate cutting suport for most tissues for harder tissues a harder grade of LR-white may be recomendable. If possible use a resin already mixed with the polimeration activator (benzoyl peroxide), if not please folow the instructions of the suplier to prepare the resin.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Non fat dry milk</td>
			<td style="width:99px;">Nestl&#233;</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;">any non fat dry milk is adequate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Oven</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;">generic laboratory oven</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Petri dish, 10 cm x 10 cm square</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">PIPES</td>
			<td style="width:99px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:196px;">P1851</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="357">
			<td height="357" style="height:357px;width:247px;">Rat generated Monoclonal Anti-Body</td>
			<td style="width:99px;">Plant probes</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;">Several antibodies that recognize cell wall components are 
			available at both the Complex Carbohydrate research center 
			(CCRC, Georgia University USA) and Plant Probes (Paul 
			Knox Cell Wall Lab, at Leeds University UK). A short list of 
			some commonly used MABS and where they can be purchased 
			is presented in Supplemental Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Razor blades</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;">regular razor blades</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">SDS</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:196px;">L6026</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Toluidine Blue-O</td>
			<td style="width:99px;">Agar Scientific</td>
			<td>AGR1727</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Tween 20</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:196px;">P9416</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Ultramicrotome</td>
			<td style="width:99px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:196px;">UC7</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:247px;">upright epifluorescence microscope with UV and FITC fluorescence filters</td>
			<td style="width:99px;">Leica Mycrosistems</td>
			<td style="width:196px;">DMLb</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">vaccum chamber</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">vaccum pump</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="297">
			<td height="297" style="height:297px;width:247px;">Vectashield</td>
			<td style="width:99px;">vecta Labs</td>
			<td style="width:196px;">T-1000</td>
			<td style="width:187px;">Other anti-fade may be used. Please do check for compatibility with FITC and the Fluorescente brightner 28. (Note: for a non-commercial alternative, (see Jonhson et al 198218) An antifade medium can be made by mixing 25 mg/mL of 1,4-Diazobicyclo-(2,2,2)octane (DABCO) in 9:1 (v/v) glycerol to 1xPBS. Adjust pH to 8.6 with diluted HCl.)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescent immunolocalization of arabinogalactan proteins and pectins in the cell wall of plant tissues

식물 발달은 내부 및 외부 자극에 대한 응답으로 세포벽 조성 및 구조의 지속적인 조정을 포함한다. 세포벽은 단백질, 페놀 화합물 및 물과 함께 셀룰로오스 및 비 셀룰로오스 다당류로 구성됩니다. 세포벽의 90%는 다당류(예를 들어, 펙틴) 및 아라비노갈락탄 단백질(AGP)으로 구성된다. 식물 조직학적 섹션에서 특정 글리칸 에피토프의 형광 면역 국소화는 벽 다당류 네트워크, 구조 및 구성 요소의 리모델링을 발견하는 핵심 도구로 남아 있습니다.
여기서, 우리는 식물 조직에서 AGPs와 펙틴에서 글리칸 에피토프를 검출하기 위해 최적화 된 형광 면역 국소화 절차를보고합니다. 파라포름알데히드/글루타랄데히드 고정은 식물 샘플의 LR-White 포함과 함께 사용되어 조직 구조 및 조성물의 더 나은 보존을 가능하게 하였다. 초미세토메로 수득된 임베디드 샘플의 얇은 섹션은 특정 항체를 이용한 면역지역화를 위해 사용되었다. 이 기술은 뛰어난 해상도, 높은 특이성 및 동일한 샘플에서 여러 글리칸 에피토프를 감지 할 수있는 기회를 제공합니다. 이 기술은 글리칸의 세포 세포 소중화를 허용하고 세포벽에 축적의 그들의 수준을 검출합니다. 또한 발달 과정에서 AGP 및 펙틴 분포의 현수체 패턴의 결정을 허용합니다. 이 도구의 사용은 궁극적으로 연구 방향을 안내하고 식물의 특정 기능에 글리칸을 연결할 수 있습니다. 더욱이, 얻어진 정보는 생화학적 및 유전자 발현 연구를 보완할 수 있다.

성공적인 실험에서, 이차 항체는 특히 밝은 녹색의 특정 에피토프의 위치를 일관되게, 세포, 조직 또는 기관의 특정 발달 단계에서 세포벽 조성물의 특성화를 가능하게 할 것이다. 예를 들어 LM6 항체는 1,5-아라비난에 대한 높은 친화성을 가지며, 개발 중인 퀘르쿠스 스터버 개미(그림2A)의세포벽을 풍부하게 라벨링하는 것을 발견할 수 있는 타입-I rhamnogalacturonan을 가진...

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Fluorescent Immunolocalization of Arabinogalactan Proteins and Pectins in the Cell Wall of Plant Tissues

이 프로토콜은 아라비노갈락탄 단백질과 펙틴의 면역지역화를 위한 식물 물질이 어떻게 고정되는지, 친수성 아크릴 수지에 내장되어, 단면화및 유리 슬라이드에 장착되는지 자세히 설명합니다. 우리는 세포벽 관련 전형이 특정 항체로 검출될 것임을 보여준다.

식물 조직의 세포 벽에 있는 아라비노갈락탄 단백질과 펙틴의 형광 면역 국소화

Plant development involves constant adjustments of the cell wall composition and structure in response to both internal and external stimuli. Cell walls ...

하나의 실험에서 정보의 양은 엄청납니다. 우리는 이 세포벽 폴리머의 존재를 검출하고 세포와 조직에 어떻게 분포되는지 정확하게 알고, 심지어 그들의 풍요로움을 결정할 수 있습니다. 이 방법은 분석할 수 있는 모든 종으로부터 거의 모든 종류의 식물 조직에 적용될 수 있는 방식으로 설계되었습니다.식물 조직에 면역 지역화는 실제로 무슨 일이 일어나는지 보고 서 설명하기 어려운, 세심한 작업을 많이 포함한다. 식물 조직 샘플을 수집하기 전에 모든 샘플을 완전히 침수하기에 충분한 차가운 고정 용액으로 유리 유리 유리병을 채웁니다. 그런 다음 분석할 식물 조직을 선택하고 샘플을 16 평방 밀리미터 이하로 다듬습니다.수정 솔루션에 샘플을 즉시 침수합니다. 글루타랄데히드와 포름알데히드는 모두 우수한 고정제이지만 모두 위험하며 흐름 후드에서 처리해야합니다. 유리병을 진공 챔버로 옮기고 천천히 진공을 적용합니다.압력이 음수 60킬로 파스칼에 도달하면 바이알의 부동 재료가 바닥으로 가라앉기 시작합니다. 음수 80킬로 파스칼이하로 챔버의 압력을 유지한다. 침몰 과정은 최대 2시간이 걸릴 수 있습니다.샘플이 진공 챔버에 2 시간 동안 들어온 후 진공을 천천히 방출하십시오. 유리 유리병을 밀봉하고 섭씨 4도에서 밤새 냉장 보관하십시오. 하룻밤 고정 후 유리병 의 바닥에 가라 앉지 않은 샘플을 폐기하십시오.나머지 샘플을 25 밀리몰러 PBS로 10분 간 세척한 다음 25밀리머 PIPES 버퍼로 20분간 세척합니다. 고정이 시료에 침투하지 않았을 가능성이 높기 때문에 모든 부동 샘플을 제거하는 것이 매우 중요합니다. 에탄올 계열에서 샘플을 탈수하여 각 에탄올 농도에서 20분 동안 샘플을 침수합니다.시료를 견딜 수 있도록 에탄올에 LR-화이트 수지의 농도가 증가하고, 에탄올의 1부 수지부터 3부로 시작한다. 각 농도에서 섭씨 4도에서 24시간 동안 배양하십시오. LR-화이트 수지를 신선한 수지로 교체하고 샘플을 섭씨 4도에서 12시간 동안 추가로 배양합니다.포함 젤라틴 캡슐을 준비, 샘플보다 약간 큰 캡슐을 선택하여 샘플이 수지에 완전히 동봉 될 수 있도록. 잉크가 수지를 오염시키기 때문에 연필로 종이 태그를 레이블을 지정합니다. 각 캡슐의 바닥에 신선한 LR-화이트 수지 1방울을 바치면 됩니다.각 캡슐에 샘플을 넣고 캡슐을 신선한 수지로 최대 용량으로 채웁니다. 캡슐에 캡을 놓고 부드럽게 눌러 밀봉합니다. 수지 중합하려면 24~48시간 경화될 때까지 58°C에서 캡슐을 치료한다.LR-화이트 수지에서 젤라틴 캡슐을 벗긴 후 스테레오 현미경 아래에 수지 블록을 놓습니다. 날카로운 면도날을 사용하여 LR-화이트 블록을 45도 각도로 트리밍하여 시료에 들어보도록 합니다. 샘플을 회전시키고 첫 번째 각도로 90도 각도로 두 번째 절단을 합니다.같은 패턴으로 절단을 계속하여 시료의 관심 영역 바로 위에 피라미드의 정점을 가진 피라미드를 형성한 다음 절단 표면이 샘플에 도달할 때까지 주요 축에 수직으로 미세한 조각을 제거하기 시작합니다. 대상 샘플은 이상적으로 사다리꼴 모양으로 동봉되어야 합니다. 트림된 수지 블록을 울트라 마이크로토메에 놓습니다.칼 날과 수지 블록 사이의 각도를 조정합니다. 200~700나노미터 사이의 두께로 블록의 단면을 잘라냅니다. 와이어 루프를 사용하여 마이크로토메에서 샘플링된 일부 섹션을 조심스럽게 들어올립니다.유리 슬라이드에 증류된 탈이온 된 물 한 방울에 넣습니다. 온수 판에 50°C의 슬라이드를 배치하여 물을 증발한 다음 단면에 얼룩을 추가합니다. 30초 후, 얼룩을 헹구고 현미경 의 밑에 슬라이드를 관찰하여 단면의 일반적인 상태를 확인하고 원하는 식물 구조가 보이는지 확인한다.슬라이드의 각 우물에 증류된 탈온된 물 한 방울을 배치하여 깨끗한 반응 슬라이드를 준비합니다. 하나 또는 두 개의 샘플 섹션을 각 물 방울로 옮습니다. 10센티미터 평방 페트리 접시에 슬라이드를 놓고 덮고 섭씨 50도에서 건조시다.반응 슬라이드에 대한 인큐베이션 챔버를 준비하려면 파이펫 팁 박스 바닥에 약해진 종이 타월을 놓고 상자를 알루미늄 호일로 포장합니다. 상자에서 인큐베이션 챔버로 슬라이드를 전송합니다. 파이펫 50 마이크로리터의 블로킹 용액을 각 우물에 넣습니다.슬라이드를 10분 동안 배양한 후 차단 용액을 제거한 다음 매번 PBS로 모든 우물을 두 번 씻습니다. 원고에 설명된 바와 같이 1차 항체 용액을 준비한 후, 5분 동안 증류수로 우물의 최종 세척을 수행한다. 파이펫은 1차 항체 용액을 반응 우물로 들어간 다음 차단 용액을 제어 우물로 피펫합니다.인큐베이션 챔버를 닫습니다. 실온에서 2시간 동안 방치한 다음 섭씨 4도에서 밤새 냉장 보관하십시오. 차단 용액에서 이차 항체의 1%용액을 준비한다.우물 당 약 40 마이크로 리터가 필요합니다. 알루미늄 호일로 용액을 덮습니다. PBS로 반응 슬라이드의 우물을 두 번 씻고 매번 증류 된 탈온 화 된 물로 한 번 씻으십시오.차단 솔루션이나 예금이 우물에 남아 있지 않도록 하십시오. 이차 항체 용액을 모든 우물에 파이펫합니다. 실온에서 어둠 속에서 슬라이드를 3~4시간 동안 배양합니다.다시 말하지만, PBS로 반응 슬라이드의 우물을 두 번 씻고 증류 된 탈온 화 된 물로 한 번 씻은 다음 각 우물에 Calcofluor White 한 방울을 추가하십시오. 세탁하지 않고, 각 웰에 장착 매체의 한 방울을 추가하고 커버 슬립으로 각각 을 잘 커버. 형광 현미경을 사용하여 반응 슬라이드의 샘플 섹션을 관찰한다.각 관찰에 대해 UV 필터를 사용하여 칼코플루어와 FITC 필터에 의해 염색된 세포벽을 감지하여 면역지역화를 감지합니다. 결과를 더 잘 시각화하려면 ImageJ 또는 유사한 이미지 분석 프로그램을 사용하여 각 UV 필터 이미지를 해당 FITC 필터 이미지와 병합합니다. 특정 에피토프의 국소화를 정확히 찾아서, 프로토콜은 세포벽 조성물의 특성화를 가능하게 한다.예를 들어, 1, 5-아라비난은 개발 중인 퀘르쿠스 스터버 개미의 세포벽에 풍부하다. 드물게 에스테르화된 균갈락투로난은 일반적으로 장기의 기계적 특성을 지정하는 퀘르쿠스 스터버 배아의 근끝에서 발견된다. Xylogalacturonans는 Quercus suber 도토리 성숙의 마지막 단계 도중 내정자 세포와 같은 퇴행성 세포에서 발견됩니다.JIM13 또는 JIM8에 의해 인식된 AGP의 전형은 아라비도시스 타리아나에서 의외의 유두및 미생물과 관련된 세포주와 같은 생식과 관련된 구조에서 발견된다. 이 프로토콜을 구현하는 일반적인 실수는 일반적으로 쉽게 감지하고 식별할 수 있습니다. 세차를 건너뛰거나 반응 우물이 건조될 경우, 이차 항체는 일반적으로 얼룩으로 나타납니다.녹색 불소 크롬의 응집체는 결합되지 않은 1 차 항체가 제대로 씻겨 있지 않으면 형성됩니다. 섹션의 접이식 또는 분리는 일반적으로 부정한 슬라이드 또는 공격적인 세척의 사용으로 인한 불량 한 접착과 관련이 있습니다. 샘플 준비도 중요합니다.수지 블록은 밝은 갈색 샘플에 명확하게 보이는 옅은 노란색균열이 없어야합니다. 비효율적으로 내장된 시료는 분말백색 반점 또는 영역을 표시합니다. 샘플 크기를 8밀리미터 미만으로 유지하는 것은 고정 솔루션의 침투에 필수적입니다.잘못 고정된 샘플은 짙은 갈색 또는 거의 검은색으로 나타납니다. 과도한 온도로 인해 수지가 균열되어 시료의 단면이 불가능해질 수 있습니다. 면역 지역화 기술의 사용은 여러 연구 방향을 엽니 다.하나는 세포벽의 생화확적인 분석과 같은 보다 구체적인 기술로 따라가거나 분자 접근법을 진행할 수도 있다. 이 기술에 의해 제공된 결과는 간단한 화학 분석에 의해 분석하기가 매우 어려운 세포벽의 조성을 이해하는 데 도움이 될 수 있다.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

형광 단백질의 발현에<em&gt; 창고 기</em&gt; 미 수정 난자에 mRNA의 주입에 의한

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the ...

연구

발생학

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

혈관 내피 줄기 세포의 혈관 생성을 시각화하기위한 유방 팻 패드 이식 기술

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

Mouse Secondary Palate Fusion의 라이브 이미징

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

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해 부 및 Immunofluorescent 얼룩의 버섯 몸과 성인 초파리 melanogaster 두뇌 신경 세포 포토 리셉터

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

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전체-마운트 고 애기 꽃 기관 및 Siliques의 얼룩

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Microtubules 및 전 비보 장 조직 및 장 Organoids 3 차원 생체 외에서 Centrosomal 단백질의 면역 형광 라벨

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone

마우스 두개안면 조직 및 분해되지 않은 뼈의 조직 준비 및 면역 염색

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and ...

Use of Atomic Force Microscopy to Measure Mechanical Properties and Turgor Pressure of Plant Cells and Plant Tissues

식물 세포 및 식물 조직의 기계적 특성 및 터거 압력을 측정하기 위해 원자력 현미경 검사법 사용

We present here the use of atomic force microscopy to indent plant tissues and recover its mechanical properties. Using two different microscopes in ...

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

미생물의 미세 관 세포 골격및 아라비도시스 촬영 Apical 메리스템의 미세 기계적 조작의 라이브 세포 이미징

Understanding cell and tissue level regulation of growth and morphogenesis has been at the forefront of biological research for many decades. Advances in ...

Isolation of Endocardial and Coronary Endothelial Cells from the Ventricular Free Wall of the Rat Heart

쥐 심장의 심실 무료 벽에서 내심 내피 및 관상 내피 세포의 격리

It has been shown that endocardial endothelial cells (EECs) and coronary endothelial cells (CECs) differ in origin, development, markers, and functions. ...