Name: fluorescent immunolocalization of arabinogalactan proteins and pectins in the cell wall of plant tissues
Uploaded: 2021-02-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescent Immunolocalization of Arabinogalactan Proteins and Pectins in the Cell Wall of Plant Tissues at JoVE.com

Forfatterne fikk støtte fra EU-prosjektet 690946 'SexSeed' (Sexual Plant Reproduction – Seed Formation) finansiert av H2020-MSCA-RISE-2015 og SeedWheels FCT PTDC/BIA-FBT/27839/2017. AMP mottok et stipend fra Den europeiske unions MSCA-IF-2016-prosjekt (nr. 753328). MC mottok et stipend fra FCT PhD-stipend SFRH/BD/111781/2015.

1. Prøveforberedelse: fiksering, dehydrering og LR-hvit innebygging
<ol><li>Fiksering og dehydrering MERK: Fikseringsprosessen er avgjørende for å bevare prøven. ved å kryssbinde molekyler stoppes cellulær metabolisme, noe som sikrer cellulær integritet og forhindrer molekylær diffusjon. Fikseringsmidler og konsentrasjonen som brukes må justeres til dette formålet, slik at antigenene er tilstrekkelig utsatt for å samhandle med antistoffene. Følgende protokoll kombinerer den milde fikseri...

<ol>
	<li>Keegstra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+Cell+Walls.">Plant Cell Walls.</a> Plant Physiology. 154 (2), 483-486 (2010).</li><li>Pereira, A. M., Lopes, A. L., Coimbra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabinogalactan+Proteins+as+Interactors+along+the+Crosstalk+between+the+Pollen+Tube+and+the+Female+Tissues.">Arabinogalactan Proteins as Interactors along the Crosstalk between the Pollen Tube and the Female Tissues.</a> Frontiers in Plant Science. 7 (7), (2016).</li><li>Showalter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabinogalactan-proteins:+structure,+expression+and+function.">Arabinogalactan-proteins: structure, expression and function.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 58 (10), 1399-1417 (2001).</li><li>Majewska-Sawka, A., Nothnagel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multiple+roles+of+arabinogalactan+proteins+in+plant+development.">The multiple roles of arabinogalactan proteins in plant development.</a> Plant Physiology. 122, 3-9 (2000).</li><li>Seifert, G., Roberts, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+arabinogalactan+proteins.">The biology of arabinogalactan proteins.</a> Annual Review of Plant Biology. 58, 137-161 (2007).</li><li>Ruprecht, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Synthetic+Glycan+Microarray+Enables+Epitope+Mapping+of+Plant+Cell+Wall+Glycan-Directed+Antibodies.">A Synthetic Glycan Microarray Enables Epitope Mapping of Plant Cell Wall Glycan-Directed Antibodies.</a> Plant Physiology. 175 (3), 1094-1104 (2017).</li><li>Verhertbruggen, Y., Walker, J. L., Guillon, F., Scheller, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparative+Study+of+Sample+Preparation+for+Staining+and+Immunodetection+of+Plant+Cell+Walls+by+Light+Microscopy.">A Comparative Study of Sample Preparation for Staining and Immunodetection of Plant Cell Walls by Light Microscopy.</a> Frontiers in Plant Science. 29 (8), 1505 (2017).</li><li>Osborn, M., Weber, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+and+immunocytochemical+procedures+with+affinity+purified+antibodies:+tubulin+containing+structures.">Immunofluorescence and immunocytochemical procedures with affinity purified antibodies: tubulin containing structures.</a> Methods in Cell Biology. 24, 97-132 (1982).</li><li>Coimbra, S., Almeida, J., Junqueira, V., Costa, M., Pereira, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabinogalactan+proteins+as+molecular+markers+in+Arabidopsis+thaliana+sexual+reproduction.">Arabinogalactan proteins as molecular markers in Arabidopsis thaliana sexual reproduction.</a> Journal of Experimental Botany. 58 (15), 4027-4035 (2007).</li><li>Wilson, S. M., Bacic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+plant+cells+for+transmission+electron+microscopy+to+optimize+immunogold+labeling+of+carbohydrate+and+protein+epitopes.">Preparation of plant cells for transmission electron microscopy to optimize immunogold labeling of carbohydrate and protein epitopes.</a> Nature Protocols. 7 (9), 1716-1727 (2012).</li><li>Gane, A., Clarke, A., Bacic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+and+expression+of+arabinogalactan-proteins+in+the+ovaries+of+Nicotiana+alata+Link+and+Otto.">Localization and expression of arabinogalactan-proteins in the ovaries of Nicotiana alata Link and Otto.</a> Sex Plant Reproduction. 8, 278-282 (1995).</li><li>Coimbra, S., Salema, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunolocalization+of+arabinogalactan+proteins+in+Amaranthus+hypocondriacus+L.+ovules.">Immunolocalization of arabinogalactan proteins in Amaranthus hypocondriacus L. ovules.</a> Protoplasma. 199 (1-2), 75-82 (1997).</li><li>Coimbra, S., Duarte, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabinogalactan+proteins+may+facilitate+the+movement+of+pollen+tubes+from+the+stigma+to+the+ovules+in+Actinidia+deliciosa+and+Amaranthus+hypocondriacus.">Arabinogalactan proteins may facilitate the movement of pollen tubes from the stigma to the ovules in Actinidia deliciosa and Amaranthus hypocondriacus.</a> Euphytica. 133 (2), 171-178 (2003).</li><li>El-Tantawy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabinogalactan+protein+profiles+and+distribution+patterns+during+microspore+embryogenesis+and+pollen+development+in+Brassica+napus.">Arabinogalactan protein profiles and distribution patterns during microspore embryogenesis and pollen development in Brassica napus.</a> Plant Reproduction. 26 (3), 231-243 (2013).</li><li>Costa, M., Pereira, A. M., Rudall, P. J., Coimbra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunolocalization+of+arabinogalactan+proteins+(AGPs)+in+reproductive+structures+of+an+early-divergent+angiosperm,+Trithuria+submersa+(Hydatellaceae).">Immunolocalization of arabinogalactan proteins (AGPs) in reproductive structures of an early-divergent angiosperm, Trithuria submersa (Hydatellaceae).</a> Annals of Botany. 111 (2), 183-190 (2013).</li><li>Costa, M., Sobral, R., Ribeiro Costa, M. M., Amorim, M. I., Coimbra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+presence+of+arabinogalactan+proteins+and+pectins+during+Quercus+suber+male+gametogenesis.">Evaluation of the presence of arabinogalactan proteins and pectins during Quercus suber male gametogenesis.</a> Annals of Botany. 115 (1), 81-92 (2015).</li><li>Hibbs, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Immunolabelling.">Fluorescence Immunolabelling.</a> Confocal Microscopy for Biologists. , (2004).</li><li>Johnson, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fading+of+Immunofluorescence+during+microscopy:+A+Study+of+the+Phenomenon+and+its+Remedy.">Fading of Immunofluorescence during microscopy: A Study of the Phenomenon and its Remedy.</a> Journal of Immunological Methods. 55 (2), 231-242 (1982).</li><li>Baird, T. R., Kaufman, D., Brown, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mercury+Free+Microscopy:+An+Opportunity+for+Core+Facility+Directors.">Mercury Free Microscopy: An Opportunity for Core Facility Directors.</a> Journal of Biomolecular Techniques. 25 (2), 48-53 (2014).</li><li>Weber, G. F., Menko, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Color+image+acquisition+using+a+monochrome+camera+and+standard+fluorescence+filter+cubes.">Color image acquisition using a monochrome camera and standard fluorescence filter cubes.</a> BioTechniques. 38 (1), 52-56 (2005).</li></ol>

Den fluorescerende immunolokaliseringsmetoden i planter her beskrevet, mens det er sømløst enkelt, er avhengig av suksessen til flere små trinn. Den første av disse er prøveforberedelse og fiksering. I løpet av dette første trinnet brukes en blanding av formaldehyd og glutaraldehyd til å kryssbinde flertallet av cellekomponentene. Formaldehyd i løsningen gir en mild og reversibel fiksering mens glutaraldehyd gir en sterk mer permanent kobling; balansen mellom de to fikseringene gir riktig mengde kryssbinding, sl...

Plantecellevegger er komplekse strukturer som består av polysakkarider og glykoproteiner. Cellevegger er ekstremt dynamiske strukturer hvis arkitektur, organisering og sammensetning varierer i henhold til celletype, lokalisering, utviklingsstadium, ytre og interne stimuli1. Arabinogalactan proteiner (AgPs) og pektiner er viktige komponenter i plantecelleveggen. AgPs er svært glykosylert proteiner og pektiner er homogalacturonan polysakkarider hvis sammensetning, mengde og struktur varierer sterkt under ulike planteutviklingsstadier2,3,4. AgPs og pektin studier har avslørt deres engasjement i flere planteprosesser som programmert celledød, respons på abiotiske påkjenninger, seksuell plantegjengivelse, blant mange andre5. De fleste av disse studiene startet med informasjon hentet fra immunolokaliseringsstudier.
Gitt sin kompleksitet krever studiet av cellevegger mange forskjellige verktøy. Påvisning av glykole epitoper ved hjelp av monoklonale antistoffer (mAbs) er en verdifull tilnærming for å løse polysakkarid og glykoproteindistribusjon langs denne strukturen. Det er en stor samling av mAbs tilgjengelig for å oppdage glykol epitoper og spesifisiteten til hver mAb blir kontinuerlig forbedret samt6. Teknikken som er beskrevet er gjeldende for alle plantearter, og er et perfekt verktøy for å veilede fremtidige forskningsretninger som kan innebære dyrere og komplekse teknikker.
I denne teknikken er spesifikke antistoffer kjemisk konjugert til fluorescerende fargestoffer som FITC (fluoresceinisotyocyanat), TRITC (tetrametylrhodamine-5-(og 6)-isothiocyanat) eller flere Alexa Fluor fargestoffer. Immunofluorescens gir flere fordeler, slik at en klar og rask subcellulær lokalisering av glykoler som kan observeres direkte under et fluorescensmikroskop. Det er svært spesifikt og følsomt, siden utarbeidelsen av prøven effektivt kan beskytte antigenets naturlige struktur, selv om det er tilstede i lavere mengder. Det gjør det mulig å oppdage flere antigener i samme prøve og viktigst, gir høy kvalitet og visuelt vakre resultater. Til tross for den store kraften som tilbys av fluorescens immunolocalization studier, de er ofte ansett som vanskelig å utføre og implementere mest sannsynlig på grunn av mangel på detaljerte protokoller slik at visualisering av de ulike trinnene i prosedyren. Her gir vi noen enkle retningslinjer for hvordan du utfører denne teknikken og hvordan du får bilder av høy kvalitet.
For protokollen som presenteres her, må prøvene først festes og bygges inn ved hjelp av det mest hensiktsmessige fikseringsmiddelet. Selv om det anses som en tidkrevende og relativt kjedelig teknikk, er riktig fiksering og innebygging av planteprøven nøkkelen for å sikre en vellykket immunolokaliseringsanalyse. For dette formålet er den vanligste kjemisk fiksering ved hjelp av kryssbindingsfikser, som aldehyder. Kryssbindingsfikser etablerer kjemiske bindinger mellom molekyler i vevet, stabiliserer og herder prøven. Formaldehyd og glutaraldehyd er krysskoblingsfikser, og noen ganger brukes en blanding av begge fikseringsmidler7. Formaldehyd tilbyr stor strukturell bevaring av vev og i lengre perioder, produserer små vev tilbaketrekking og være kompatibel med immunstaining. Glutaraldehyd er et sterkere og stabilt fikseringsmiddel som vanligvis brukes i kombinasjon med formaldehyd. Bruken av glutaraldehyd har noen ulemper som må tas i betraktning som det introduserer noen gratis aldehyd grupper i fast vev, som kan generere noen uspesifik merking. Også krysskobling mellom proteiner og andre molekyler av og til kan gjøre noen mål epitoper utilgjengelige for antistoffene. For å unngå dette må antallet og varigheten av fikseringen defineres nøye.
Etter fiksering er prøver innebygd i riktig harpiks for å herde før de får delene. London Harpiks (LR-White) akrylharpiks er harpiks av valget for immunolokalisering studier. I motsetning til andre harpikser er LR-White hydrofil, slik at antistoffene kan nå sine antigener, uten behov for behandling for å lette det. LR-White har også fordelen av å tilby lav auto-fluorescens, slik at en reduksjon i bakgrunnsstøy under immunofluorescensavbildning.
Det er mange farging teknikker tilgjengelig for å oppdage ulike komponenter i celleveggen, for eksempel Alcian blå flekker, toluidin blå flekker eller periodisk syre-Schiff (PAS) farging. Ingen av disse tilbyr kraften i immunlokaliseringsanalyser8. Denne tilnærmingen gir større spesifisitet i påvisning av glykomaner, og tilbyr større informasjon om celleveggsammensetning og struktur.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:728px;" width="728">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">25% (w/v) Gluteraldehyde</td>
			<td style="width:99px;">Agar Scientific</td>
			<td style="width:196px;">AGR1010</td>
			<td style="width:187px;">aq. Solution, methanol free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">8 wells Glass reaction slides</td>
			<td style="width:99px;">Marinfeld</td>
			<td style="width:196px;">MARI1216750</td>
			<td style="width:187px;">other brands may be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:196px;">A6283</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Anti-Rat IgG (wole molecule)-FITC antibody produce in GOAT</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:196px;">F6258</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:247px;">cover slips, 24 mm x 50 mm</td>
			<td style="width:99px;">Marinfeld</td>
			<td>MARI0100222</td>
			<td style="width:187px;">The cover slip should cover all the wells. Other brands may be used&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:247px;">ddH2O</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Ethanol absolute</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Fluorescent brightner 28</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:196px;">F-6259</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Gelatin capsules</td>
			<td style="width:99px;">Agar scientific</td>
			<td>AGG29211</td>
			<td style="width:187px;">The capsule size sould feat the size of the sample.</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:247px;">Glass vials</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;">Any simple unexpensive glass vials that can be sealed, may be used. The vials may be clean with 96% etanol after use to remove LR-White residue and reused.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="294">
			<td height="294" style="height:294px;width:247px;">LR-white medium grade, embdeding resin</td>
			<td style="width:99px;">Agar Scientific</td>
			<td>AGR1281</td>
			<td style="width:187px;">LR-White comes in several forms the medium grade provides na adequate cutting suport for most tissues for harder tissues a harder grade of LR-white may be recomendable. If possible use a resin already mixed with the polimeration activator (benzoyl peroxide), if not please folow the instructions of the suplier to prepare the resin.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Non fat dry milk</td>
			<td style="width:99px;">Nestl&#233;</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;">any non fat dry milk is adequate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Oven</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;">generic laboratory oven</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Petri dish, 10 cm x 10 cm square</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">PIPES</td>
			<td style="width:99px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:196px;">P1851</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="357">
			<td height="357" style="height:357px;width:247px;">Rat generated Monoclonal Anti-Body</td>
			<td style="width:99px;">Plant probes</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;">Several antibodies that recognize cell wall components are 
			available at both the Complex Carbohydrate research center 
			(CCRC, Georgia University USA) and Plant Probes (Paul 
			Knox Cell Wall Lab, at Leeds University UK). A short list of 
			some commonly used MABS and where they can be purchased 
			is presented in Supplemental Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Razor blades</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;">regular razor blades</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">SDS</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:196px;">L6026</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Toluidine Blue-O</td>
			<td style="width:99px;">Agar Scientific</td>
			<td>AGR1727</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Tween 20</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:196px;">P9416</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Ultramicrotome</td>
			<td style="width:99px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:196px;">UC7</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:247px;">upright epifluorescence microscope with UV and FITC fluorescence filters</td>
			<td style="width:99px;">Leica Mycrosistems</td>
			<td style="width:196px;">DMLb</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">vaccum chamber</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">vaccum pump</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="297">
			<td height="297" style="height:297px;width:247px;">Vectashield</td>
			<td style="width:99px;">vecta Labs</td>
			<td style="width:196px;">T-1000</td>
			<td style="width:187px;">Other anti-fade may be used. Please do check for compatibility with FITC and the Fluorescente brightner 28. (Note: for a non-commercial alternative, (see Jonhson et al 198218) An antifade medium can be made by mixing 25 mg/mL of 1,4-Diazobicyclo-(2,2,2)octane (DABCO) in 9:1 (v/v) glycerol to 1xPBS. Adjust pH to 8.6 with diluted HCl.)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescent immunolocalization of arabinogalactan proteins and pectins in the cell wall of plant tissues

Planteutvikling innebærer konstante justeringer av celleveggsammensetningen og strukturen som svar på både interne og eksterne stimuli. Cellevegger består av cellulose og ikke-cellulosiske polysakkarider sammen med proteiner, fenoliske forbindelser og vann. 90% av celleveggen består av polysakkarider (f.eks. pektiner) og arabinogalaktanproteiner (AgPs). Den fluorescerende immunolokaliseringen av spesifikke glykole epitoper i plante histologiske seksjoner er fortsatt et viktig verktøy for å avdekke ombygging av veggpolysakkaridnettverk, struktur og komponenter.
Her rapporterer vi en optimalisert fluorescerende immunolokaliseringsprosedyre for å oppdage glykole epitoper fra AgPs og pektiner i plantevev. Paraformaldehyd/glutaraldehyd fiksering ble brukt sammen med LR-White innebygging av planteprøvene, noe som gir bedre bevaring av vevsstrukturen og sammensetningen. Tynne deler av de innebygde prøvene oppnådd med en ultramikrotom ble brukt til immunolokalisering med spesifikke antistoffer. Denne teknikken gir god oppløsning, høy spesifisitet, og muligheten til å oppdage flere glykole epitoper i samme prøve. Denne teknikken tillater subcellulær lokalisering av glykomaner og oppdager deres akkumuleringsnivå i celleveggen. Det tillater også bestemmelse av spatio-temporale mønstre av AGP og pektindistribusjon under utviklingsprosesser. Bruken av dette verktøyet kan til slutt veilede forskningsretninger og knytte glyanser til bestemte funksjoner i planter. Videre kan informasjonen som er innhentet utfylle biokjemiske og genuttrykksstudier.

I et vellykket eksperiment vil det sekundære antistoffet spesifikt finne plasseringen av den spesifikke epitopen i lys grønn, på en konsekvent måte, noe som åpner for karakterisering av celleveggsammensetningen på et bestemt utviklingsstadium av cellen, vevet eller organet. For eksempel LM6 antistoffet har en høy affinitet for 1,5-arabinan, en forbindelse med type-I rhamnogalacturonan som kan bli funnet rikelig merking celleveggen av den utviklende Quercus suber anther (Figur 2A),</st...

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescent Immunolocalization of Arabinogalactan Proteins and Pectins in the Cell Wall of Plant Tissues at JoVE.com

Fluorescent Immunolocalization of Arabinogalactan Proteins and Pectins in the Cell Wall of Plant Tissues

Denne protokollen beskriver i detalj hvordan plantematerialet for immunolokalisering av arabinogalaktane proteiner og pektiner er fast, innebygd i en hydrofil akrylharpiks, seksjonert og montert på glasssklier. Vi viser celleveggrelaterte epitoper vil bli oppdaget med spesifikke antistoffer.

Fluorescerende immunlokalisering av arabinogalaktane proteiner og pektiner i celleveggen av plantevev

Plant development involves constant adjustments of the cell wall composition and structure in response to both internal and external stimuli. Cell walls ...

Mengden informasjon fra bare ett eksperiment er enorm. Vi kan oppdage tilstedeværelsen av disse celleveggpolymerene og vite nøyaktig hvordan de fordeles i celler og vev, og til og med bestemme deres overflod. Denne metoden er utformet på en slik måte at den kan brukes på nesten alle typer plantevev fra alle arter man kanskje vil analysere.Immunolokalisering i plantevev innebærer mye omhyggelig arbeid, vanskelig å forklare uten å faktisk se hva som skjer. Før du samler plantevevsprøven, fyll et hetteglass med nok kald fikseringsmiddelløsning for å helt senke alle prøvene. Velg deretter plantevevet som skal analyseres og trimme prøvene til en størrelse på ikke mer enn 16 kvadratimender.Dypp prøvene umiddelbart i den fikseringsmiddelløsningen. Glutaraldehyd og formaldehyd er begge gode fikseringsmidler, men begge er farlige og må håndteres i strømningshetten. Overfør hetteglasset til et vakuumkammer og påfør sakte vakuum.Når trykket når negative 60 kilo pascals, vil det flytende materialet i hetteglasset begynne å synke til bunnen. Opprettholde trykket i kammeret på ikke mer enn negative 80 kilo pascals. Synkeprosessen kan ta opptil to timer.Etter at prøvene har vært i vakuumkammeret i to timer, slipp langsomt vakuumet. Forsegle hetteglasset med glass og kjøl det over natten ved fire grader Celsius. Etter fikseringen over natten, kast eventuelle prøver som ikke synker til bunnen av hetteglasset.Vask de resterende prøvene med 25 millimolar PBS i 10 minutter og vask dem deretter i 25 millimolar RØRbuffer i 20 minutter. Det er ekstremt viktig å fjerne alle flytende prøver fordi det er svært sannsynlig at fikseringen ikke har trengt inn i prøven. Dehydrere prøvene i en etanolserie, og senk prøvene i 20 minutter ved hver etanolkonsentrasjon.For å perfuse prøvene, tilsett økende konsentrasjoner av LR-hvit harpiks i etanol, som begynner med en del harpiks til tre deler etanol. Ved hver konsentrasjon inkuber i 24 timer ved fire grader Celsius. Bytt ut den LR-hvite harpiksen med fersk harpiks og inkuber prøvene i ytterligere 12 timer ved fire grader Celsius.Forbered de innebygde gelatinkapslene, og velg kapsler som er litt større enn prøvene, slik at prøvene kan være helt omsluttet av harpiksen. Merk papirkoder med blyant fordi blekk vil forurense harpiksen. Påfør en dråpe fersk LR-hvit harpiks på bunnen av hver kapsel.Plasser en prøve i hver kapsel, og fyll deretter kapslene til maksimal kapasitet med fersk harpiks. Sett hetten på kapselen og trykk forsiktig for å forsegle den. For å polymerisere harpiksen, herd kapslene ved 58 grader Celsius til de er fullt herdet rundt 24 til 48 timer.Etter peeling gelatin kapsel fra LR-hvit harpiks, plasser harpiksblokken under stereomikroskopet. Bruk et skarpt barberblad til å trimme den LR-hvite blokken i en 45 graders vinkel til prøven. Roter prøven og gjør et nytt kutt i en 90 graders vinkel til den første.Fortsett å kutte i samme mønster for å danne en pyramide med toppen av pyramiden rett over prøvens interesseområde, og begynn deretter å fjerne fine skiver vinkelrett på hovedaksen til skjæreflaten når prøven. Målprøven bør ideelt sett være omsluttet av en trapesform. Plasser den trimmede harpiksblokken i ultramikrotomen.Juster vinkelen mellom knivkanten og harpiksblokken. Klipp seksjoner fra blokken med en tykkelse mellom 200 og 700 nanometer. Bruk en trådsløyfe til å forsiktig løfte noen samplede seksjoner fra mikrotomen.Legg dem i en dråpe deionisert vann på en glasssklie. Fordamp vannet ved å plassere lysbildet på en kokeplate på 50 grader Celsius, og legg deretter til en dråpe flekk til seksjonene. Etter 30 sekunder, skyll av flekken og observer lysbildet under mikroskopet for å verifisere den generelle tilstanden til seksjonen, og at ønsket plantestruktur er synlig.Forbered en ren reaksjonssklie ved å plassere en dråpe deionisert vann i hver brønn av lysbildet. Overfør en eller to prøveseksjoner til hver vanndråpe. Plasser lysbildet i en 10 centimeter firkantet petriskål, dekk den og la den tørke ved 50 grader Celsius.For å forberede et inkubasjonskammer for reaksjonsskliene, legg noen dempede papirhåndklær nederst på en pipettetappe og pakk esken med aluminiumsfolie. Overfør lysbildene fra boksen til inkubasjonskammeret. Pipette 50 mikroliter med blokkeringsløsning i hver brønn.Etter inkubering av lysbildet i 10 minutter, fjern blokkeringsløsningen, vask deretter alle brønnene to ganger med PBS i 10 minutter hver gang. Etter å ha forberedt de primære antistoffløsningene som beskrevet i manuskriptet, utfør en endelig vask av brønnene med deionisert vann i fem minutter. Pipette den primære antistoffløsningen inn i reaksjonsbrønnene, og pipetter deretter blokkeringsløsningen inn i kontrollbrønnene.Lukk inkubasjonskammeret. La den stå i to timer ved romtemperatur og deretter kjøle den over natten ved fire grader Celsius. Forbered en 1% løsning av det sekundære antistoffet i blokkeringsløsning.Omtrent 40 mikroliter per brønn vil være nødvendig. Dekk løsningen med aluminiumsfolie. Vask brønnene på reaksjonssklie to ganger med PBS og en gang med deionisert avionisert vann i 10 minutter hver gang.Sørg for at det ikke er noen blokkeringsløsning eller avleiringer i brønnene. Pipette den sekundære antistoffløsningen i alle brønnene. Inkuber lysbildene i mørket ved romtemperatur i tre til fire timer.Igjen, vask brønnene på reaksjonssklie to ganger med PBS og en gang med deionisert deionisert vann, og legg deretter til en dråpe Calcofluor White til hver brønn. Uten vask, legg til en dråpe monteringsmedium til hver brønn og dekk hver brønn med en dekkslips. Vær oppmerksom på prøveseksjonene i reaksjonslysbildet ved hjelp av et fluorescensmikroskop.For hver observasjon, bruk et UV-filter for å oppdage cellevegger farget av Calcofluor og et FITC-filter for å oppdage immunlokalisering. For en bedre visualisering av resultatene, bruk ImageJ eller et lignende bildeanalyseprogram for å slå sammen hvert UV-filterbilde med det tilsvarende FITC-filterbildet. Ved å finne lokaliseringen av spesifikke epitoper, muliggjør protokollen karakterisering av celleveggsammensetningen.For eksempel er 1, 5-arabinan rikelig i celleveggen til den utviklende Quercus suber anther. Knapt forestret homogalacturonans er vanligvis funnet på roten spissen av Quercus suber embryo spesifisere mekaniske egenskaper av orgelet. Xylogalacturonans finnes i degenererende celler, for eksempel endspermcellen under de siste stadiene av Quercus suber eikenøttmodning.AGPs epitoper anerkjent av JIM13 eller JIM8 finnes på strukturer relatert til reproduksjon, for eksempel cellelinjer relatert til mikrogametogenesis i Arabidopsis thaliana og stigmatisk papillae og mikrobiell av basal angiosperm Trithuria submersa. Vanlige feil i implementeringen av denne protokollen er vanligvis enkle å oppdage og identifisere. Når vaskene hoppes over eller reaksjonsbrønnene får tørke, vil det sekundære antistoffet vanligvis vises som et smør.Aggregater av grønn fluorokrom vil dannes hvis det ubundne primære antistoffet ikke vaskes riktig bort. Folding eller løsrivelse av seksjonene er vanligvis relatert til dårlig vedheft på grunn av bruk av urene lysbilder eller aggressiv vask. Prøveklargjøring er også kritisk.Harpiksblokkene skal være fri for sprekker med en tydelig synlig blek gul til lysebrun prøve. Ineffektivt innebygde prøver vil vise pulverhvite flekker eller områder. Å holde prøvestørrelsen under åtte millimeter er avgjørende for penetrasjon av den fikseringsmiddelløsningen.Dårlig faste prøver vil virke mørkebrune eller nesten svarte. Overdreven temperatur kan føre til at harpiksen sprekker, noe som gjør snitting av prøven umulig. Bruken av immunolokaliseringsteknikker åpner flere forskningsretninger.Man kan følge videre med mer spesifikke teknikker som biokjemisk analyse av celleveggen eller til og med gå videre til en molekylær tilnærming. Resultatene fra denne teknikken kan bidra til å forstå sammensetningen av celleveggen, en ekstremt kompleks struktur svært vanskelig å analysere ved enkel kjemisk analyse.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

Uttrykk for Fluorescent Proteiner i<em&gt; Branchiostoma lanceolatum</em&gt; Av mRNA Injeksjon i ubefruktet Oocytter

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the ...

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

En ny mammarfettpute-transplantasjonsteknikk for å visualisere fartøygenerering av vaskulære endotelceller

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Disseksjon og Immunofluorescent flekker av sopp kropp og Photoreceptor Neurons i voksen Drosophila melanogaster hjernen

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Hele-mount Clearing og flekker av Arabidopsis blomst organer og Siliques

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Immuno-fluorescerende merking av piskehale som henger og Centrosomal proteiner i Ex Vivo tarmen Tissue og 3D In Vitro Intestinal Organoids

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone

Vev forberedelse og Immunostaining av mus Kraniofacial vev og Undecalcified Bone

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and ...

Use of Atomic Force Microscopy to Measure Mechanical Properties and Turgor Pressure of Plant Cells and Plant Tissues

Bruk av Atomic Force mikroskopi å måle mekaniske egenskaper og turgor Pressure av Plant celler og Plant vev

We present here the use of atomic force microscopy to indent plant tissues and recover its mechanical properties. Using two different microscopes in ...

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Live Cell Imaging av Microtubule Cytoskeleton og Mikromekanisk manipulering av Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Understanding cell and tissue level regulation of growth and morphogenesis has been at the forefront of biological research for many decades. Advances in ...

Isolation of Endocardial and Coronary Endothelial Cells from the Ventricular Free Wall of the Rat Heart

Isolering av endokardiale og koronar endotelceller fra Ventricular Free Wall of the Rat Heart

It has been shown that endocardial endothelial cells (EECs) and coronary endothelial cells (CECs) differ in origin, development, markers, and functions. ...