Name: fluorescent immunolocalization of arabinogalactan proteins and pectins in the cell wall of plant tissues
Uploaded: 2021-02-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescent Immunolocalization of Arabinogalactan Proteins and Pectins in the Cell Wall of Plant Tissues at JoVE.com

Os autores receberam apoio do projeto da UE 690946 'SexSeed' (Reprodução de Plantas Sexuais – Formação de Sementes) financiado pelo H2020-MSCA-RISE-2015 e pela SeedWheels FCT PTDC/BIA-FBT/27839/2017. A AMP recebeu uma subvenção do projeto MSCA-IF-2016 da União Europeia (nº 753328). A MC recebeu uma bolsa de doutorado da FCT SFRH/BD/111781/2015.

1. Preparação da amostra: fixação, desidratação e incorporação LR-White
<ol><li>Fixação e desidratação NOTA: O processo de fixação é fundamental para preservar a amostra; cruzando moléculas, o metabolismo celular é interrompido, garantindo a integridade celular e prevenindo a difusão molecular. Os agentes fixadores e a concentração utilizada devem ser ajustados a esse fim, deixando os antígenos suficientemente expostos para interagir com os anticorpos. O protocolo a seguir combi...

<ol>
	<li>Keegstra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+Cell+Walls.">Plant Cell Walls.</a> Plant Physiology. 154 (2), 483-486 (2010).</li><li>Pereira, A. M., Lopes, A. L., Coimbra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabinogalactan+Proteins+as+Interactors+along+the+Crosstalk+between+the+Pollen+Tube+and+the+Female+Tissues.">Arabinogalactan Proteins as Interactors along the Crosstalk between the Pollen Tube and the Female Tissues.</a> Frontiers in Plant Science. 7 (7), (2016).</li><li>Showalter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabinogalactan-proteins:+structure,+expression+and+function.">Arabinogalactan-proteins: structure, expression and function.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 58 (10), 1399-1417 (2001).</li><li>Majewska-Sawka, A., Nothnagel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multiple+roles+of+arabinogalactan+proteins+in+plant+development.">The multiple roles of arabinogalactan proteins in plant development.</a> Plant Physiology. 122, 3-9 (2000).</li><li>Seifert, G., Roberts, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+arabinogalactan+proteins.">The biology of arabinogalactan proteins.</a> Annual Review of Plant Biology. 58, 137-161 (2007).</li><li>Ruprecht, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Synthetic+Glycan+Microarray+Enables+Epitope+Mapping+of+Plant+Cell+Wall+Glycan-Directed+Antibodies.">A Synthetic Glycan Microarray Enables Epitope Mapping of Plant Cell Wall Glycan-Directed Antibodies.</a> Plant Physiology. 175 (3), 1094-1104 (2017).</li><li>Verhertbruggen, Y., Walker, J. L., Guillon, F., Scheller, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparative+Study+of+Sample+Preparation+for+Staining+and+Immunodetection+of+Plant+Cell+Walls+by+Light+Microscopy.">A Comparative Study of Sample Preparation for Staining and Immunodetection of Plant Cell Walls by Light Microscopy.</a> Frontiers in Plant Science. 29 (8), 1505 (2017).</li><li>Osborn, M., Weber, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+and+immunocytochemical+procedures+with+affinity+purified+antibodies:+tubulin+containing+structures.">Immunofluorescence and immunocytochemical procedures with affinity purified antibodies: tubulin containing structures.</a> Methods in Cell Biology. 24, 97-132 (1982).</li><li>Coimbra, S., Almeida, J., Junqueira, V., Costa, M., Pereira, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabinogalactan+proteins+as+molecular+markers+in+Arabidopsis+thaliana+sexual+reproduction.">Arabinogalactan proteins as molecular markers in Arabidopsis thaliana sexual reproduction.</a> Journal of Experimental Botany. 58 (15), 4027-4035 (2007).</li><li>Wilson, S. M., Bacic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+plant+cells+for+transmission+electron+microscopy+to+optimize+immunogold+labeling+of+carbohydrate+and+protein+epitopes.">Preparation of plant cells for transmission electron microscopy to optimize immunogold labeling of carbohydrate and protein epitopes.</a> Nature Protocols. 7 (9), 1716-1727 (2012).</li><li>Gane, A., Clarke, A., Bacic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+and+expression+of+arabinogalactan-proteins+in+the+ovaries+of+Nicotiana+alata+Link+and+Otto.">Localization and expression of arabinogalactan-proteins in the ovaries of Nicotiana alata Link and Otto.</a> Sex Plant Reproduction. 8, 278-282 (1995).</li><li>Coimbra, S., Salema, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunolocalization+of+arabinogalactan+proteins+in+Amaranthus+hypocondriacus+L.+ovules.">Immunolocalization of arabinogalactan proteins in Amaranthus hypocondriacus L. ovules.</a> Protoplasma. 199 (1-2), 75-82 (1997).</li><li>Coimbra, S., Duarte, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabinogalactan+proteins+may+facilitate+the+movement+of+pollen+tubes+from+the+stigma+to+the+ovules+in+Actinidia+deliciosa+and+Amaranthus+hypocondriacus.">Arabinogalactan proteins may facilitate the movement of pollen tubes from the stigma to the ovules in Actinidia deliciosa and Amaranthus hypocondriacus.</a> Euphytica. 133 (2), 171-178 (2003).</li><li>El-Tantawy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabinogalactan+protein+profiles+and+distribution+patterns+during+microspore+embryogenesis+and+pollen+development+in+Brassica+napus.">Arabinogalactan protein profiles and distribution patterns during microspore embryogenesis and pollen development in Brassica napus.</a> Plant Reproduction. 26 (3), 231-243 (2013).</li><li>Costa, M., Pereira, A. M., Rudall, P. J., Coimbra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunolocalization+of+arabinogalactan+proteins+(AGPs)+in+reproductive+structures+of+an+early-divergent+angiosperm,+Trithuria+submersa+(Hydatellaceae).">Immunolocalization of arabinogalactan proteins (AGPs) in reproductive structures of an early-divergent angiosperm, Trithuria submersa (Hydatellaceae).</a> Annals of Botany. 111 (2), 183-190 (2013).</li><li>Costa, M., Sobral, R., Ribeiro Costa, M. M., Amorim, M. I., Coimbra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+presence+of+arabinogalactan+proteins+and+pectins+during+Quercus+suber+male+gametogenesis.">Evaluation of the presence of arabinogalactan proteins and pectins during Quercus suber male gametogenesis.</a> Annals of Botany. 115 (1), 81-92 (2015).</li><li>Hibbs, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Immunolabelling.">Fluorescence Immunolabelling.</a> Confocal Microscopy for Biologists. , (2004).</li><li>Johnson, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fading+of+Immunofluorescence+during+microscopy:+A+Study+of+the+Phenomenon+and+its+Remedy.">Fading of Immunofluorescence during microscopy: A Study of the Phenomenon and its Remedy.</a> Journal of Immunological Methods. 55 (2), 231-242 (1982).</li><li>Baird, T. R., Kaufman, D., Brown, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mercury+Free+Microscopy:+An+Opportunity+for+Core+Facility+Directors.">Mercury Free Microscopy: An Opportunity for Core Facility Directors.</a> Journal of Biomolecular Techniques. 25 (2), 48-53 (2014).</li><li>Weber, G. F., Menko, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Color+image+acquisition+using+a+monochrome+camera+and+standard+fluorescence+filter+cubes.">Color image acquisition using a monochrome camera and standard fluorescence filter cubes.</a> BioTechniques. 38 (1), 52-56 (2005).</li></ol>

O método de imunolocalização fluorescente nas plantas aqui descrito, embora perfeitamente simples, conta com o sucesso de vários pequenos passos. A primeira delas é a preparação e fixação da amostra. Durante este primeiro passo, uma mistura de formaldeído e glutaraldeído é usada para cruzar a maioria dos componentes celulares. O formaldeído na solução proporciona uma fixação leve e reversível, enquanto o glutaraldeído proporciona uma ligação forte e mais permanente; o equilíbrio entre os dois fixati...

As paredes celulares das plantas são estruturas complexas compostas de polissacarídeos e glicoproteínas. As paredes celulares são estruturas extremamente dinâmicas cuja arquitetura, organização e composição variam de acordo com o tipo celular, localização, estágio de desenvolvimento, estímulos externos e internos1. Proteínas arabinogalactanas (AGPs) e pectinas são componentes importantes da parede celular vegetal. AgPs são proteínas altamente glicosylated e pectinas são polissacarídeos homogalacturoanos cuja composição, quantidade e estrutura variam muito durante diferentes estágios de desenvolvimento vegetal2,3,4. Estudos de AGPs e pectina revelaram seu envolvimento em diversos processos vegetais, como morte celular programada, resposta a estresses abióticos, reprodução sexual de plantas, entre muitos outros5. A maioria desses estudos começou com informações obtidas a partir de estudos de imunolocalização.
Dada a sua complexidade, o estudo das paredes celulares requer muitas ferramentas diferentes. A detecção de epítopos glicanos usando anticorpos monoclonais (mAbs) é uma abordagem valiosa para resolver a distribuição de polissacarídeos e glicoproteínas ao longo desta estrutura. Há uma grande coleção de mAbs disponíveis para detectar epítopos glicanos e a especificidade de cada mAb está sendo continuamente melhorada, bem como6. A técnica aqui descrita é aplicável a todas as espécies vegetais, e é uma ferramenta perfeita para orientar futuras direções de pesquisa que podem envolver técnicas mais caras e complexas.
Nesta técnica, anticorpos específicos são quimicamente conjugados a corantes fluorescentes como FITC (isotiocianato de fluoresceína), TRITC (tetrametilrhodamina-5-(e 6)-isothionato) ou vários corantes de Fluor Alexa. A imunofluorescência oferece várias vantagens, permitindo uma localização subcelular clara e rápida de glicocanos que podem ser diretamente observados sob um microscópio de fluorescência. É altamente específico e sensível, uma vez que a preparação da amostra pode efetivamente proteger a estrutura natural do antígeno, mesmo que presente em quantidades menores. Permite a detecção de múltiplos antígenos na mesma amostra e, o mais importante, oferece resultados de alta qualidade e visualmente bonitos. Apesar do grande poder oferecido pelos estudos de imunolocalização da fluorescência, muitas vezes são considerados difíceis de executar e implementar provavelmente devido à falta de protocolos detalhados que permitem a visualização das diferentes etapas do procedimento. Aqui, fornecemos algumas diretrizes simples sobre como executar essa técnica e como obter imagens de alta qualidade.
Para o protocolo aqui apresentado, as amostras devem primeiro ser fixadas e incorporadas utilizando o fixador mais adequado. Embora considerada como uma técnica demorada e relativamente tediosa, a fixação adequada e a incorporação da amostra vegetal é a chave para garantir um ensaio de imunolocalização bem-sucedido. Para isso, o mais usual é a fixação química usando fixação de crosslinking, como aldeídos. Fixações transversais estabelecem ligações químicas entre moléculas do tecido, estabilizando e endurecendo a amostra. Formaldeído e glutaraldeído são fixativos transfronteiriços, e às vezes uma mistura de ambos os fixativos é usada7. O formaldeído oferece grande preservação estrutural dos tecidos e por longos períodos de tempo, produzindo pequenas retrações teciduais e sendo compatível com a imunosstaining. Glutaraldeído é um fixador mais forte e estável geralmente usado em combinação com formaldeído. O uso de glutaraldeído tem algumas desvantagens que devem ser levadas em conta, pois introduz alguns grupos de aldeído gratuitos no tecido fixo, o que pode gerar alguma rotulagem inespecífica. Além disso, a ligação cruzada entre proteínas e outras moléculas ocasionalmente pode tornar alguns epítopos alvo inacessíveis para os anticorpos. Para evitar isso, a quantidade e a duração da fixação devem ser cuidadosamente definidas.
Após a fixação, as amostras são incorporadas na resina adequada para endurecer antes de obter as seções. Resina de Londres (LR-White) resina acrílica é a resina escolhida para estudos de imunolocalização. Ao contrário de outras resinas, lR-White é hidrofílico, permitindo que os anticorpos cheguem aos seus antígenos, sem necessidade de qualquer tratamento para facilitar isso. O LR-White também tem a vantagem de oferecer baixa fluorescência automática, permitindo uma redução do ruído de fundo durante a imagem de imunofluorescência.
Existem muitas técnicas de coloração disponíveis para detectar diferentes componentes da parede celular, como coloração azul alciano, coloração azul toluidina ou coloração periódica de ácido -Schiff (PAS). Nada disso oferece o poder das análises de imunolocalização8. Essa abordagem dá maior especificidade na detecção de glicanos, oferecendo informações mais amplas sobre a composição e estrutura da parede celular.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:728px;" width="728">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">25% (w/v) Gluteraldehyde</td>
			<td style="width:99px;">Agar Scientific</td>
			<td style="width:196px;">AGR1010</td>
			<td style="width:187px;">aq. Solution, methanol free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">8 wells Glass reaction slides</td>
			<td style="width:99px;">Marinfeld</td>
			<td style="width:196px;">MARI1216750</td>
			<td style="width:187px;">other brands may be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:196px;">A6283</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Anti-Rat IgG (wole molecule)-FITC antibody produce in GOAT</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:196px;">F6258</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:247px;">cover slips, 24 mm x 50 mm</td>
			<td style="width:99px;">Marinfeld</td>
			<td>MARI0100222</td>
			<td style="width:187px;">The cover slip should cover all the wells. Other brands may be used&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:247px;">ddH2O</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Ethanol absolute</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Fluorescent brightner 28</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:196px;">F-6259</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Gelatin capsules</td>
			<td style="width:99px;">Agar scientific</td>
			<td>AGG29211</td>
			<td style="width:187px;">The capsule size sould feat the size of the sample.</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:247px;">Glass vials</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;">Any simple unexpensive glass vials that can be sealed, may be used. The vials may be clean with 96% etanol after use to remove LR-White residue and reused.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="294">
			<td height="294" style="height:294px;width:247px;">LR-white medium grade, embdeding resin</td>
			<td style="width:99px;">Agar Scientific</td>
			<td>AGR1281</td>
			<td style="width:187px;">LR-White comes in several forms the medium grade provides na adequate cutting suport for most tissues for harder tissues a harder grade of LR-white may be recomendable. If possible use a resin already mixed with the polimeration activator (benzoyl peroxide), if not please folow the instructions of the suplier to prepare the resin.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Non fat dry milk</td>
			<td style="width:99px;">Nestl&#233;</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;">any non fat dry milk is adequate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Oven</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;">generic laboratory oven</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Petri dish, 10 cm x 10 cm square</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">PIPES</td>
			<td style="width:99px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:196px;">P1851</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="357">
			<td height="357" style="height:357px;width:247px;">Rat generated Monoclonal Anti-Body</td>
			<td style="width:99px;">Plant probes</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;">Several antibodies that recognize cell wall components are 
			available at both the Complex Carbohydrate research center 
			(CCRC, Georgia University USA) and Plant Probes (Paul 
			Knox Cell Wall Lab, at Leeds University UK). A short list of 
			some commonly used MABS and where they can be purchased 
			is presented in Supplemental Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Razor blades</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;">regular razor blades</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">SDS</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:196px;">L6026</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Toluidine Blue-O</td>
			<td style="width:99px;">Agar Scientific</td>
			<td>AGR1727</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Tween 20</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:196px;">P9416</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Ultramicrotome</td>
			<td style="width:99px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:196px;">UC7</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:247px;">upright epifluorescence microscope with UV and FITC fluorescence filters</td>
			<td style="width:99px;">Leica Mycrosistems</td>
			<td style="width:196px;">DMLb</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">vaccum chamber</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">vaccum pump</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="297">
			<td height="297" style="height:297px;width:247px;">Vectashield</td>
			<td style="width:99px;">vecta Labs</td>
			<td style="width:196px;">T-1000</td>
			<td style="width:187px;">Other anti-fade may be used. Please do check for compatibility with FITC and the Fluorescente brightner 28. (Note: for a non-commercial alternative, (see Jonhson et al 198218) An antifade medium can be made by mixing 25 mg/mL of 1,4-Diazobicyclo-(2,2,2)octane (DABCO) in 9:1 (v/v) glycerol to 1xPBS. Adjust pH to 8.6 with diluted HCl.)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescent immunolocalization of arabinogalactan proteins and pectins in the cell wall of plant tissues

O desenvolvimento da planta envolve ajustes constantes da composição e estrutura da parede celular em resposta a estímulos internos e externos. As paredes celulares são compostas de polissacarídeos de celulose e não celulósicos, juntamente com proteínas, compostos fenólicos e água. 90% da parede celular é composta de polissacarídeos (por exemplo, pectinas) e proteínas arabinogalactanas (AGPs). A imunolocalização fluorescente de epítopos glicanos específicos em seções histológicas vegetais continua sendo uma ferramenta fundamental para descobrir a remodelagem de redes, estrutura e componentes de polissacarídeos de parede.
Aqui, relatamos um procedimento otimizado de imunolocalização fluorescente para detectar epítopos glicanos de AGPs e pectinas em tecidos vegetais. A fixação de paraformaldeído/glutaraldeído foi utilizada juntamente com a incorporação LR-White das amostras da planta, permitindo uma melhor preservação da estrutura e composição do tecido. Foram utilizadas seções finas das amostras incorporadas obtidas com ultra-microtódomo para imunolocalização com anticorpos específicos. Esta técnica oferece grande resolução, alta especificidade e a chance de detectar vários epítopos glicanos na mesma amostra. Esta técnica permite a localização subcelular de glicanos e detecta seu nível de acumulação na parede celular. Também permite a determinação de padrões espátulais-temporais de AGP e distribuição de pectina durante os processos de desenvolvimento. O uso desta ferramenta pode, em última análise, orientar as instruções de pesquisa e vincular glicocanos a funções específicas nas plantas. Além disso, as informações obtidas podem complementar estudos bioquímicos e de expressão genética.

Em um experimento bem-sucedido, o anticorpo secundário identificará especificamente a localização do epítope específico em verde brilhante, de forma consistente, permitindo a caracterização da composição da parede celular em um determinado estágio de desenvolvimento da célula, tecido ou órgão. Por exemplo, o anticorpo LM6 tem uma alta afinidade por 1,5-arabinan, um composto com tipo-I rhamnogalacturonan que pode ser encontrado abundantemente rotulando a parede celular do suber anther em desenvolvim...

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Fluorescent Immunolocalization of Arabinogalactan Proteins and Pectins in the Cell Wall of Plant Tissues

Este protocolo descreve em detalhes como o material vegetal para imunolocalização de proteínas e pectinas arabinogalactanas é fixado, embutido em uma resina acrílica hidrofílica, seccionada e montada em lâminas de vidro. Mostramos que epítopos relacionados à parede celular serão detectados com anticorpos específicos.

Imunolocalização fluorescente de proteínas árabes e pectinas na parede celular de tecidos vegetais

Plant development involves constant adjustments of the cell wall composition and structure in response to both internal and external stimuli. Cell walls ...

A quantidade de informação de apenas um experimento é enorme. Podemos detectar a presença desses polímeros de parede celular e saber exatamente como eles são distribuídos em células e tecidos, e até determinar sua abundância. Este método é projetado de tal forma que pode ser aplicado a quase qualquer tipo de tecido vegetal de qualquer espécie que alguém queira analisar.A imunolocalização nos tecidos vegetais envolve muito trabalho meticuloso, difícil de explicar sem realmente ver o que acontece. Antes de coletar a amostra de tecido vegetal, encha um frasco de vidro com solução fixação fria suficiente para submergir completamente todas as amostras. Em seguida, selecione os tecidos vegetais a serem analisados e corte as amostras em um tamanho de no máximo 16 milímetros quadrados.Imerque imediatamente as amostras na solução fixativa. Glutaraldeído e formaldeído são ambos excelentes fixativos, mas ambos são perigosos e devem ser manuseados na coifa de fluxo. Transfira o frasco para uma câmara de vácuo e aplique lentamente o vácuo.Quando a pressão atingir 60 quilos negativos, o material flutuante no frasco começará a afundar até o fundo. Mantenha a pressão na câmara em não mais do que 80 quilos negativos. O processo de afundamento pode levar até duas horas.Depois que as amostras estiverem na câmara de vácuo por duas horas, solte lentamente o vácuo. Sele o frasco de vidro e leve à geladeira durante a noite a quatro graus Celsius. Após a fixação durante a noite, descarte todas as amostras que não afundaram no fundo do frasco.Lave as amostras restantes com PBS de 25 mililitros por 10 minutos e depois lave-as em 25 mililitros de pipes por 20 minutos. É extremamente importante remover todas as amostras flutuantes porque é altamente provável que o fixador não tenha penetrado na amostra. Desidratar as amostras em uma série de etanol, imergindo as amostras por 20 minutos em cada concentração de etanol.Para perfundir as amostras, adicione concentrações crescentes de resina LR-branca no etanol, começando com uma parte resina para três partes de etanol. Em cada concentração, incubar por 24 horas a quatro graus Celsius. Substitua a resina LR-branca por resina fresca e incuba as amostras por mais 12 horas a quatro graus Celsius.Prepare as cápsulas de gelatina de incorporação, selecionando cápsulas ligeiramente maiores que as amostras para que as amostras possam ser completamente incluídas na resina. Etiquetas de papel com lápis porque a tinta vai contaminar a resina. Aplique uma gota de resina LR-branca fresca no fundo de cada cápsula.Coloque uma amostra em cada cápsula e encha as cápsulas com capacidade máxima com resina fresca. Coloque a tampa na cápsula e pressione delicadamente para selá-la. Para polimerizar a resina, cure as cápsulas a 58 graus Celsius até endurecer completamente em torno de 24 a 48 horas.Depois de descascar a cápsula de gelatina da resina LR-branca, coloque o bloco de resina sob o microscópio estéreo. Usando uma lâmina afiada, corte o bloco LR-branco em um ângulo de 45 graus para a amostra. Gire a amostra e faça um segundo corte em um ângulo de 90 graus até o primeiro.Continue cortando no mesmo padrão para formar uma pirâmide com o ápice da pirâmide diretamente acima da área de interesse da amostra, em seguida, comece a remover fatias finas perpendiculares para o eixo principal até que a superfície de corte chegue à amostra. A amostra alvo deve ser idealmente incluída em uma forma trapezoide. Coloque o bloco de resina aparada no ultra microtoma.Ajuste o ângulo entre a borda da faca e o bloco de resina. Corte seções do bloco com uma espessura entre 200 e 700 nanômetros. Use um laço de fio para levantar cuidadosamente algumas seções amostradas do microtome.Coloque-os em uma gota de água destilada desionizada em um escorregador de vidro. Evaporar a água colocando o escorregador em uma placa quente a 50 graus Celsius e, em seguida, adicione uma gota de mancha às seções. Após 30 segundos, enxágue a mancha e observe o slide sob o microscópio para verificar o estado geral da seção e que a estrutura da planta desejada é visível.Prepare um slide de reação limpa colocando uma gota de água destilada desionizada em cada poço do escorregador. Transfira uma ou duas seções de amostra para cada gota de água. Coloque o slide em uma placa de Petri de 10 centímetros quadrados, cubra-o e deixe secar a 50 graus Celsius.Para preparar uma câmara de incubação para os slides de reação, coloque algumas toalhas de papel umedecidas na parte inferior de uma caixa de pontas de pipeta e enrole a caixa com papel alumínio. Transfira os slides da caixa para a câmara de incubação. Pipette 50 microliters de solução de bloqueio em cada poço.Depois de incubar o slide por 10 minutos, remova a solução de bloqueio e, em seguida, lave todos os poços duas vezes com PBS por 10 minutos cada vez. Depois de preparar as soluções primárias de anticorpos como descrito no manuscrito, realize uma lavagem final dos poços com água desomuada por cinco minutos. Pipeta a solução de anticorpos primária nos poços de reação, em seguida, pipeta a solução de bloqueio nos poços de controle.Feche a câmara de incubação. Deixe-o ficar por duas horas em temperatura ambiente e depois leve à geladeira durante a noite a quatro graus Celsius. Prepare uma solução de 1% do anticorpo secundário na solução de bloqueio.Aproximadamente 40 microliters por poço serão necessários. Cubra a solução com papel alumínio. Lave os poços do slide de reação duas vezes com PBS e uma vez com água desomada desomada por 10 minutos cada vez.Certifique-se de que nenhuma solução de bloqueio ou depósitos permaneçam nos poços. Pipeta a solução de anticorpos secundários em todos os poços. Incubar os slides no escuro à temperatura ambiente por três a quatro horas.Novamente, lave os poços do slide de reação duas vezes com PBS e uma vez com água desordenada desordenada, em seguida, adicione uma gota de Calcofluor Branco a cada poço. Sem lavar, adicione uma gota de meio de montagem para cada poço e cubra cada poço com uma mancha de cobertura. Observe as seções amostrais no slide de reação usando um microscópio de fluorescência.Para cada observação, use um filtro UV para detectar paredes celulares manchadas pelo Calcofluor e um filtro FITC para detectar a imunolocalização. Para uma melhor visualização dos resultados, use ImageJ ou um programa de análise de imagem semelhante para mesclar cada imagem do filtro UV com a imagem correspondente do filtro FITC. Ao identificar a localização de epítopos específicos, o protocolo permite a caracterização da composição da parede celular.Por exemplo, 1, 5-arabinan é abundante na parede celular do suber anther quercus em desenvolvimento. Mal esterified homogalacturonans são tipicamente encontrados na ponta raiz do embrião suber Quercus especificando propriedades mecânicas do órgão. Xylogalacturonans são encontrados em células degeneradas, como a célula endosperma durante os estágios finais da maturação da semente de sementes do subser Quercus.Os epítopos da AGP reconhecidos por JIM13 ou JIM8 são encontrados em estruturas relacionadas à reprodução, como linhas celulares relacionadas à microgametogênese em Arabidopsis thaliana e as papilas estigmatéticas e microbianas da submersa de trithuria basal angiosperm. Erros comuns na implementação deste protocolo geralmente são fáceis de detectar e identificar. Quando as lavagens são ignoradas ou os poços de reação são permitidos para secar, o anticorpo secundário geralmente aparecerá como uma mancha.Agregados de fluorocromo verde se formarão se o anticorpo primário não for lavado adequadamente. Dobrar ou desprender as seções geralmente está relacionado à má adesão devido ao uso de lâminas impuras ou lavagem agressiva. A preparação da amostra também é crítica.Os blocos de resina devem estar livres de rachaduras com uma amostra claramente visível de amarelo pálido para marrom claro. Amostras ineficientemente incorporadas mostrarão manchas brancas em pó ou áreas. Manter o tamanho da amostra abaixo de oito milímetros é essencial para a penetração da solução fixativa.Amostras mal fixas aparecerão marrom escuro ou quase pretas. A temperatura excessiva pode fazer com que a resina quebre, impossibilitando a secção da amostra. O uso de técnicas de imunolocalização abre várias direções de pesquisa.Pode-se seguir com técnicas mais específicas, como a análise bioquímica da parede celular ou até mesmo proceder a uma abordagem molecular. Os resultados fornecidos por essa técnica podem ajudar a entender a composição da parede celular, uma estrutura extremamente complexa de difícil análise por análise química simples.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

Expressão de proteínas fluorescentes em<em&gt; Branchiostoma lanceolatum</em&gt; Por injecção de mRNA em oócitos não fertilizados

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the ...

Biologia do Desenvolvimento

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

Uma nova técnica de transplante de almofada de gordura mamária para visualizar a geração de vasos de células vasculares endoteliais vasculares

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

Imagem ao vivo do mouse Fusão do palato secundário

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissecção e imunofluorescência coloração de cogumelo corpo e fotoreceptor neurônios em cérebros adultos Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

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Compensação de toda a montagem e coloração de Siliques e órgãos de flor de Arabidopsis

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Imuno-fluorescente rotulagem de microtúbulos e proteínas Centrosomal em tecido Intestinal Ex Vivo e 3D em Vitro Intestinal Organoids

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone

Preparo tecidual e imunocoloração de tecidos craniofaciais do camundongo e osso não-descalcificado

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and ...

Use of Atomic Force Microscopy to Measure Mechanical Properties and Turgor Pressure of Plant Cells and Plant Tissues

Uso da microscopia de força atômica para medir propriedades mecânicas e pressão de turgor de células vegetais e tecidos vegetais

We present here the use of atomic force microscopy to indent plant tissues and recover its mechanical properties. Using two different microscopes in ...

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Imagem celular ao vivo do citoesqueleto microtubulo e manipulação micromecânica da Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Understanding cell and tissue level regulation of growth and morphogenesis has been at the forefront of biological research for many decades. Advances in ...

Isolation of Endocardial and Coronary Endothelial Cells from the Ventricular Free Wall of the Rat Heart

Isolamento das Células Endocárdicas e Coronárias da Parede Livre Ventricular do Coração de Rato

It has been shown that endocardial endothelial cells (EECs) and coronary endothelial cells (CECs) differ in origin, development, markers, and functions. ...