Name: fluorescent immunolocalization of arabinogalactan proteins and pectins in the cell wall of plant tissues
Uploaded: 2021-02-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescent Immunolocalization of Arabinogalactan Proteins and Pectins in the Cell Wall of Plant Tissues at JoVE.com

Los autores recibieron el apoyo del proyecto de la UE 690946 'SexSeed' (Sexual Plant Reproduction – Seed Formation) financiado por H2020-MSCA-RISE-2015 y SeedWheels FCT PTDC/BIA-FBT/27839/2017. AMP recibió una subvención del proyecto MSCA-IF-2016 de la Unión Europea (núl. 753328). MC recibió una subvención de fct phD grant SFRH/BD/111781/2015.

1. Preparación de la muestra: fijación, deshidratación e incrustación LR-White
<ol><li>Fijación y deshidratación NOTA: El proceso de fijación es fundamental para conservar la muestra; cruzando moléculas el metabolismo celular se detiene, asegurando la integridad celular y evitando la difusión molecular. Los agentes fijadores y la concentración utilizada deben ajustarse a tal fin, dejando los antígenos suficientemente expuestos para interactuar con los anticuerpos. El siguiente protocolo c...

<ol>
	<li>Keegstra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+Cell+Walls.">Plant Cell Walls.</a> Plant Physiology. 154 (2), 483-486 (2010).</li><li>Pereira, A. M., Lopes, A. L., Coimbra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabinogalactan+Proteins+as+Interactors+along+the+Crosstalk+between+the+Pollen+Tube+and+the+Female+Tissues.">Arabinogalactan Proteins as Interactors along the Crosstalk between the Pollen Tube and the Female Tissues.</a> Frontiers in Plant Science. 7 (7), (2016).</li><li>Showalter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabinogalactan-proteins:+structure,+expression+and+function.">Arabinogalactan-proteins: structure, expression and function.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 58 (10), 1399-1417 (2001).</li><li>Majewska-Sawka, A., Nothnagel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multiple+roles+of+arabinogalactan+proteins+in+plant+development.">The multiple roles of arabinogalactan proteins in plant development.</a> Plant Physiology. 122, 3-9 (2000).</li><li>Seifert, G., Roberts, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+arabinogalactan+proteins.">The biology of arabinogalactan proteins.</a> Annual Review of Plant Biology. 58, 137-161 (2007).</li><li>Ruprecht, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Synthetic+Glycan+Microarray+Enables+Epitope+Mapping+of+Plant+Cell+Wall+Glycan-Directed+Antibodies.">A Synthetic Glycan Microarray Enables Epitope Mapping of Plant Cell Wall Glycan-Directed Antibodies.</a> Plant Physiology. 175 (3), 1094-1104 (2017).</li><li>Verhertbruggen, Y., Walker, J. L., Guillon, F., Scheller, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparative+Study+of+Sample+Preparation+for+Staining+and+Immunodetection+of+Plant+Cell+Walls+by+Light+Microscopy.">A Comparative Study of Sample Preparation for Staining and Immunodetection of Plant Cell Walls by Light Microscopy.</a> Frontiers in Plant Science. 29 (8), 1505 (2017).</li><li>Osborn, M., Weber, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+and+immunocytochemical+procedures+with+affinity+purified+antibodies:+tubulin+containing+structures.">Immunofluorescence and immunocytochemical procedures with affinity purified antibodies: tubulin containing structures.</a> Methods in Cell Biology. 24, 97-132 (1982).</li><li>Coimbra, S., Almeida, J., Junqueira, V., Costa, M., Pereira, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabinogalactan+proteins+as+molecular+markers+in+Arabidopsis+thaliana+sexual+reproduction.">Arabinogalactan proteins as molecular markers in Arabidopsis thaliana sexual reproduction.</a> Journal of Experimental Botany. 58 (15), 4027-4035 (2007).</li><li>Wilson, S. M., Bacic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+plant+cells+for+transmission+electron+microscopy+to+optimize+immunogold+labeling+of+carbohydrate+and+protein+epitopes.">Preparation of plant cells for transmission electron microscopy to optimize immunogold labeling of carbohydrate and protein epitopes.</a> Nature Protocols. 7 (9), 1716-1727 (2012).</li><li>Gane, A., Clarke, A., Bacic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+and+expression+of+arabinogalactan-proteins+in+the+ovaries+of+Nicotiana+alata+Link+and+Otto.">Localization and expression of arabinogalactan-proteins in the ovaries of Nicotiana alata Link and Otto.</a> Sex Plant Reproduction. 8, 278-282 (1995).</li><li>Coimbra, S., Salema, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunolocalization+of+arabinogalactan+proteins+in+Amaranthus+hypocondriacus+L.+ovules.">Immunolocalization of arabinogalactan proteins in Amaranthus hypocondriacus L. ovules.</a> Protoplasma. 199 (1-2), 75-82 (1997).</li><li>Coimbra, S., Duarte, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabinogalactan+proteins+may+facilitate+the+movement+of+pollen+tubes+from+the+stigma+to+the+ovules+in+Actinidia+deliciosa+and+Amaranthus+hypocondriacus.">Arabinogalactan proteins may facilitate the movement of pollen tubes from the stigma to the ovules in Actinidia deliciosa and Amaranthus hypocondriacus.</a> Euphytica. 133 (2), 171-178 (2003).</li><li>El-Tantawy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabinogalactan+protein+profiles+and+distribution+patterns+during+microspore+embryogenesis+and+pollen+development+in+Brassica+napus.">Arabinogalactan protein profiles and distribution patterns during microspore embryogenesis and pollen development in Brassica napus.</a> Plant Reproduction. 26 (3), 231-243 (2013).</li><li>Costa, M., Pereira, A. M., Rudall, P. J., Coimbra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunolocalization+of+arabinogalactan+proteins+(AGPs)+in+reproductive+structures+of+an+early-divergent+angiosperm,+Trithuria+submersa+(Hydatellaceae).">Immunolocalization of arabinogalactan proteins (AGPs) in reproductive structures of an early-divergent angiosperm, Trithuria submersa (Hydatellaceae).</a> Annals of Botany. 111 (2), 183-190 (2013).</li><li>Costa, M., Sobral, R., Ribeiro Costa, M. M., Amorim, M. I., Coimbra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+presence+of+arabinogalactan+proteins+and+pectins+during+Quercus+suber+male+gametogenesis.">Evaluation of the presence of arabinogalactan proteins and pectins during Quercus suber male gametogenesis.</a> Annals of Botany. 115 (1), 81-92 (2015).</li><li>Hibbs, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Immunolabelling.">Fluorescence Immunolabelling.</a> Confocal Microscopy for Biologists. , (2004).</li><li>Johnson, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fading+of+Immunofluorescence+during+microscopy:+A+Study+of+the+Phenomenon+and+its+Remedy.">Fading of Immunofluorescence during microscopy: A Study of the Phenomenon and its Remedy.</a> Journal of Immunological Methods. 55 (2), 231-242 (1982).</li><li>Baird, T. R., Kaufman, D., Brown, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mercury+Free+Microscopy:+An+Opportunity+for+Core+Facility+Directors.">Mercury Free Microscopy: An Opportunity for Core Facility Directors.</a> Journal of Biomolecular Techniques. 25 (2), 48-53 (2014).</li><li>Weber, G. F., Menko, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Color+image+acquisition+using+a+monochrome+camera+and+standard+fluorescence+filter+cubes.">Color image acquisition using a monochrome camera and standard fluorescence filter cubes.</a> BioTechniques. 38 (1), 52-56 (2005).</li></ol>

El método de inmunolocalización fluorescente en las plantas aquí descrito, aunque sin problemas sencillo, se basa en el éxito de varios pasos pequeños. El primero de los cuales es la preparación y fijación de muestras. Durante este primer paso, se utiliza una mezcla de formaldehído y glutaraldehído para reenlazar la mayoría de los componentes celulares. El formaldehído en la solución proporciona una fijación suave y reversible, mientras que el glutaraldehído proporciona una fuerte vinculación más permanen...

Las paredes de células vegetales son estructuras complejas compuestas de polisacáridos y glicoproteínas. Las paredes celulares son estructuras extremadamente dinámicas cuya arquitectura, organización y composición varían según el tipo de celda, localización, etapa de desarrollo, estímulos externos e internos1. Las proteínas arabinogalactan (AGPs) y las pectinas son componentes importantes de la pared celular vegetal. Los AGPs son proteínas y pectinas altamente glicosiladas son polisacáridos homogalacturonan cuya composición, cantidad y estructura varían mucho durante diferentes etapas de desarrollo vegetal2,3,4. Agps y estudios de pectina han revelado su participación en varios procesos vegetales como la muerte celular programada, respuesta a tensiones abióticas, reproducción de plantas sexuales, entre muchos otros5. La mayoría de estos estudios comenzaron con información obtenida de estudios de inmunolocalización.
Dada su complejidad, el estudio de las paredes celulares requiere muchas herramientas diferentes. La detección de epítopos glicanos utilizando anticuerpos monoclonales (mAbs) es un enfoque valioso para resolver la distribución de polisacáridos y glicoproteínas a lo largo de esta estructura. Hay una gran colección de mAbs disponibles para detectar epítopos glicanos y la especificidad de cada mAb se está mejorando continuamente, así como6. La técnica aquí descrita es aplicable a todas las especies vegetales, y es una herramienta perfecta para guiar futuras direcciones de investigación que podrían implicar técnicas más costosas y complejas.
En esta técnica, anticuerpos específicos se conjugan químicamente a tintes fluorescentes como FITC (isothiocyanato de fluoresceína), TRITC (tetrametilrhodamina-5-(y 6)-isothiocyanato) o varios tintes Alexa Fluor. La inmunofluorescencia ofrece varias ventajas, permitiendo una localización subcelular clara y rápida de glicanos que se pueden observar directamente bajo un microscopio de fluorescencia. Es altamente específico y sensible, ya que la preparación de la muestra puede proteger eficazmente la estructura natural del antígeno, incluso si está presente en cantidades más bajas. Permite la detección de múltiples antígenos en la misma muestra y lo más importante, ofrece resultados de alta calidad y visualmente hermosos. A pesar de la gran potencia que ofrecen los estudios de inmunolocalización de fluorescencia, a menudo se consideran difíciles de realizar e implementar muy probablemente debido a la falta de protocolos detallados que permitan la visualización de los diferentes pasos del procedimiento. Aquí, proporcionamos algunas directrices simples sobre cómo realizar esta técnica y cómo obtener imágenes de alta calidad.
Para el protocolo presentado aquí, las muestras primero deben ser fijas e incrustadas utilizando el fijador más adecuado. Aunque se considera como una técnica lenta y relativamente tediosa, la fijación e incrustación adecuada de la muestra vegetal es la clave para garantizar un ensayo de inmunolocalización exitoso. Para ello, lo más habitual es la fijación química mediante fijadores de enlace cruzado, como los aldehídos. Los fijadores de enlace cruzado establecen vínculos químicos entre moléculas del tejido, estabilizando y endureciendo la muestra. Formaldehído y glutaraldehído son fijadores de enlace cruzado, y a veces se utiliza una mezcla de ambos fijadores7. El formaldehído ofrece una gran preservación estructural de los tejidos y durante largos períodos de tiempo, produciendo pequeñas retracciones tisulares y siendo compatible con el inmunostaining. El glutaraldehído es un fijador más fuerte y estable que se utiliza generalmente en combinación con formaldehído. El uso de glutaraldehído tiene algunas desventajas que deben tenerse en cuenta ya que introduce algunos grupos de aldehído libre en el tejido fijo, lo que puede generar algún etiquetado inespecífico. También el reticulamiento entre proteínas y otras moléculas ocasionalmente puede hacer que algunos epítopos objetivo sean inaccesibles para los anticuerpos. Para evitar esto, la cantidad y la duración de la fijación deben definirse cuidadosamente.
Después de la fijación, las muestras se incrustan en la resina adecuada para endurecer antes de obtener las secciones. La resina acrílica london resina (LR-White) es la resina preferida para estudios de inmunolocalización. A diferencia de otras resinas, LR-White es hidrófilo, permitiendo que los anticuerpos alcancen sus antígenos, sin necesidad de ningún tratamiento para facilitarlo. LR-White también tiene la ventaja de ofrecer baja fluorescencia automática, permitiendo una reducción en el ruido de fondo durante las imágenes de inmunofluorescencia.
Hay muchas técnicas de tinción disponibles para detectar diferentes componentes de la pared celular, tales como manchas azules alcian, tinción azul toluidina o tinción periódica ácido-Schiff (PAS). Ninguno de ellos ofrece el poder de los análisis de inmunolocalización8. Este enfoque proporciona una mayor especificidad en la detección de glicanos, ofreciendo información más vasta sobre la composición y estructura de la pared celular.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:728px;" width="728">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">25% (w/v) Gluteraldehyde</td>
			<td style="width:99px;">Agar Scientific</td>
			<td style="width:196px;">AGR1010</td>
			<td style="width:187px;">aq. Solution, methanol free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">8 wells Glass reaction slides</td>
			<td style="width:99px;">Marinfeld</td>
			<td style="width:196px;">MARI1216750</td>
			<td style="width:187px;">other brands may be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:196px;">A6283</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Anti-Rat IgG (wole molecule)-FITC antibody produce in GOAT</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:196px;">F6258</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:247px;">cover slips, 24 mm x 50 mm</td>
			<td style="width:99px;">Marinfeld</td>
			<td>MARI0100222</td>
			<td style="width:187px;">The cover slip should cover all the wells. Other brands may be used&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:247px;">ddH2O</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Ethanol absolute</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Fluorescent brightner 28</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:196px;">F-6259</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Gelatin capsules</td>
			<td style="width:99px;">Agar scientific</td>
			<td>AGG29211</td>
			<td style="width:187px;">The capsule size sould feat the size of the sample.</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:247px;">Glass vials</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;">Any simple unexpensive glass vials that can be sealed, may be used. The vials may be clean with 96% etanol after use to remove LR-White residue and reused.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="294">
			<td height="294" style="height:294px;width:247px;">LR-white medium grade, embdeding resin</td>
			<td style="width:99px;">Agar Scientific</td>
			<td>AGR1281</td>
			<td style="width:187px;">LR-White comes in several forms the medium grade provides na adequate cutting suport for most tissues for harder tissues a harder grade of LR-white may be recomendable. If possible use a resin already mixed with the polimeration activator (benzoyl peroxide), if not please folow the instructions of the suplier to prepare the resin.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Non fat dry milk</td>
			<td style="width:99px;">Nestl&#233;</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;">any non fat dry milk is adequate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Oven</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;">generic laboratory oven</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Petri dish, 10 cm x 10 cm square</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">PIPES</td>
			<td style="width:99px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:196px;">P1851</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="357">
			<td height="357" style="height:357px;width:247px;">Rat generated Monoclonal Anti-Body</td>
			<td style="width:99px;">Plant probes</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;">Several antibodies that recognize cell wall components are 
			available at both the Complex Carbohydrate research center 
			(CCRC, Georgia University USA) and Plant Probes (Paul 
			Knox Cell Wall Lab, at Leeds University UK). A short list of 
			some commonly used MABS and where they can be purchased 
			is presented in Supplemental Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Razor blades</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;">regular razor blades</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">SDS</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:196px;">L6026</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Toluidine Blue-O</td>
			<td style="width:99px;">Agar Scientific</td>
			<td>AGR1727</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Tween 20</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:196px;">P9416</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Ultramicrotome</td>
			<td style="width:99px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:196px;">UC7</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:247px;">upright epifluorescence microscope with UV and FITC fluorescence filters</td>
			<td style="width:99px;">Leica Mycrosistems</td>
			<td style="width:196px;">DMLb</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">vaccum chamber</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">vaccum pump</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="297">
			<td height="297" style="height:297px;width:247px;">Vectashield</td>
			<td style="width:99px;">vecta Labs</td>
			<td style="width:196px;">T-1000</td>
			<td style="width:187px;">Other anti-fade may be used. Please do check for compatibility with FITC and the Fluorescente brightner 28. (Note: for a non-commercial alternative, (see Jonhson et al 198218) An antifade medium can be made by mixing 25 mg/mL of 1,4-Diazobicyclo-(2,2,2)octane (DABCO) in 9:1 (v/v) glycerol to 1xPBS. Adjust pH to 8.6 with diluted HCl.)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescent immunolocalization of arabinogalactan proteins and pectins in the cell wall of plant tissues

El desarrollo de la planta implica ajustes constantes de la composición y estructura de la pared celular en respuesta a estímulos internos y externos. Las paredes celulares se componen de celulosa y polisacáridos no celulósicos junto con proteínas, compuestos fenólicos y agua. El 90% de la pared celular se compone de polisacáridos (por ejemplo, pectinas) y proteínas arabinogalactanas (AGPs). La inmunolocalización fluorescente de epítopos glicanos específicos en secciones histológicas vegetales sigue siendo una herramienta clave para descubrir la remodelación de redes, estructura y componentes de polisacáridos de pared.
Aquí, informamos de un procedimiento optimizado de inmunolocalización fluorescente para detectar epitopos glicanos de AGPs y pectinas en tejidos vegetales. Se utilizó la fijación de paraformaldehído/glutaraldehído junto con la incrustación LR-White de las muestras de la planta, lo que permite una mejor preservación de la estructura y composición del tejido. Secciones delgadas de las muestras incrustadas obtenidas con un ultra-microtome se utilizaron para la inmunolocalización con anticuerpos específicos. Esta técnica ofrece una gran resolución, alta especificidad y la posibilidad de detectar múltiples epítopos glicanos en la misma muestra. Esta técnica permite la localización subcelular de glicanos y detecta su nivel de acumulación en la pared celular. También permite la determinación de patrones espacio-temporales de distribución de AGP y pectina durante los procesos de desarrollo. El uso de esta herramienta puede, en última instancia, guiar las instrucciones de investigación y vincular glicanos a funciones específicas en las plantas. Además, la información obtenida puede complementar estudios bioquímicos y de expresión génica.

En un experimento exitoso, el anticuerpo secundario identificará específicamente la ubicación del epítopo específico en verde brillante, de manera consistente, permitiendo la caracterización de la composición de la pared celular en una cierta etapa de desarrollo de la célula, tejido u órgano. Por ejemplo, el anticuerpo LM6 tiene una alta afinidad por 1,5-arabinan, un compuesto con rhamnogalacturonan tipo I que se puede encontrar etiquetando abundantemente la pared celular del anéter quercus suber en de...

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Fluorescent Immunolocalization of Arabinogalactan Proteins and Pectins in the Cell Wall of Plant Tissues

Este protocolo describe en detalle cómo se fija el material vegetal para la inmunolocalización de proteínas y pectinas arabinogalactanas, incrustado en una resina acrílica hidrófila, seccionado y montado en toboganes de vidrio. Mostramos que los epítopos relacionados con la pared celular se detectarán con anticuerpos específicos.

Inmunolocalización fluorescente de proteínas arabinogalactanas y pectinas en la pared celular de los tejidos vegetales

Plant development involves constant adjustments of the cell wall composition and structure in response to both internal and external stimuli. Cell walls ...

La cantidad de información de un solo experimento es enorme. Podemos detectar la presencia de estos polímeros de pared celular y saber exactamente cómo se distribuyen en células y tejidos, e incluso determinar su abundancia. Este método está diseñado de tal manera que se puede aplicar a casi cualquier tipo de tejido vegetal de cualquier especie que uno pueda querer analizar.La inmunolocalización en los tejidos vegetales implica mucho trabajo meticuloso, difícil de explicar sin ver realmente lo que sucede. Antes de recoger la muestra de tejido vegetal, llene un vial de vidrio con suficiente solución fijativa en frío para sumergir completamente todas las muestras. A continuación, seleccione los tejidos vegetales que desea analizar y recorte las muestras a un tamaño no superior a 16 milímetros cuadrados.Sumerja inmediatamente las muestras en la solución fijativa. El glutaraldehído y el formaldehído son excelentes fijativos, pero ambos son peligrosos y deben ser manejados en la campana de flujo. Transfiera el vial a una cámara de vacío y aplique lentamente el vacío.Cuando la presión alcanza los pascales negativos de 60 kilos, el material flotante en el vial comenzará a hundirse hasta el fondo. Mantenga la presión en la cámara en no más de 80 kilos de pascales negativos. El proceso de hundimiento puede tardar hasta dos horas.Después de que las muestras hayan estado en la cámara de vacío durante dos horas, suelte lentamente el vacío. Sella el vial de vidrio y refrigerarlo durante la noche a cuatro grados centígrados. Después de la fijación durante la noche, deseche cualquier muestra que no se hundiera en la parte inferior del vial.Lave las muestras restantes con 25 PBS mililitroles durante 10 minutos y luego lávelas en 25 mililitros durante 20 minutos. Es extremadamente importante eliminar todas las muestras flotantes porque es muy probable que el fijador no haya penetrado en la muestra. Deshidratar las muestras en una serie de etanol, sumergiendo las muestras durante 20 minutos en cada concentración de etanol.Para perfundir las muestras, agregue concentraciones crecientes de resina LR-blanca en etanol, comenzando con una parte de resina a tres partes de etanol. En cada concentración, incuba durante 24 horas a cuatro grados centígrados. Reemplace la resina LR-blanca por resina fresca e incuba las muestras durante 12 horas adicionales a cuatro grados Centígrados.Prepare las cápsulas de gelatina de incrustación, seleccionando cápsulas ligeramente más grandes que las muestras para que las muestras puedan estar completamente encerradas en la resina. Etiquete las etiquetas de papel con lápiz porque la tinta contaminará la resina. Aplique una gota de resina fresca LR-blanca en la parte inferior de cada cápsula.Coloque una muestra en cada cápsula y, a continuación, llene las cápsulas a la máxima capacidad con resina fresca. Coloque la tapa en la cápsula y presione suavemente para sellarla. Para polimerizar la resina, cura las cápsulas a 58 grados Celsius hasta que estén completamente endurecidas alrededor de 24 a 48 horas.Después de pelar la cápsula de gelatina de la resina LR-blanca, coloque el bloque de resina debajo del microscopio estéreo. Con una cuchilla de afeitar afilada, recorte el bloque blanco LR en un ángulo de 45 grados a la muestra. Gire la muestra y haga un segundo corte en un ángulo de 90 grados hasta el primero.Continúe cortando en el mismo patrón para formar una pirámide con el ápice de la pirámide directamente por encima del área de interés de la muestra, luego comience a eliminar rodajas finas perpendiculares al eje principal hasta que la superficie de corte llegue a la muestra. Idealmente, la muestra objetivo debe estar encerrada en una forma trapezoidal. Coloque el bloque de resina recortada en el microtome ultra.Ajuste el ángulo entre el borde del cuchillo y el bloque de resina. Corte secciones del bloque con un espesor entre 200 y 700 nanómetros. Utilice un bucle de alambre para levantar cuidadosamente algunas secciones muestreada del microtome.Colóquelos en una gota de agua desionizada destilada en un tobogán de vidrio. Evapore el agua colocando el tobogán en una placa caliente a 50 grados Celsius, luego agregue una gota de mancha a las secciones. Después de 30 segundos, enjuague la mancha y observe la diapositiva debajo del microscopio para verificar el estado general de la sección y que la estructura de la planta deseada sea visible.Prepare un tobogán de reacción limpio colocando una gota de agua desionizada destilada en cada pozo del tobogán. Transfiera una o dos secciones de muestra a cada gota de agua. Coloque el tobogán en una placa petri cuadrada de 10 centímetros, cúbralo y déjelo secar a 50 grados centígrados.Para preparar una cámara de incubación para los toboganes de reacción, coloque algunas toallas de papel humedecidas en la parte inferior de una caja de puntas de pipeta y envuelva la caja con papel de aluminio. Transfiera las diapositivas de la caja a la cámara de incubación. Pipeta 50 microlitros de solución de bloqueo en cada pozo.Después de incubar la diapositiva durante 10 minutos, retire la solución de bloqueo y, a continuación, lave todos los pozos dos veces con PBS durante 10 minutos cada vez. Después de preparar las principales soluciones de anticuerpos como se describe en el manuscrito, realice un lavado final de los pozos con agua desionizada destilada durante cinco minutos. Pipetear la solución principal de anticuerpos en los pozos de reacción, luego pipetear la solución de bloqueo en los pozos de control.Cierre la cámara de incubación. Deje reposarlo durante dos horas a temperatura ambiente y luego refrigerarlo durante la noche a cuatro grados centígrados. Prepare una solución del 1% del anticuerpo secundario en la solución de bloqueo.Se necesitarán aproximadamente 40 microlitros por pozo. Cubra la solución con papel de aluminio. Lave los pozos de la reacción dos veces con PBS y una vez con agua desionizada destilada durante 10 minutos cada vez.Asegúrese de que ninguna solución de bloqueo o depósitos permanezcan en los pozos. Pipetear la solución secundaria de anticuerpos en todos los pozos. Incubar los toboganes en la oscuridad a temperatura ambiente durante tres a cuatro horas.Una vez más, lave los pozos de la reacción deslice dos veces con PBS y una vez con agua desionizada destilada, luego agregue una gota de Calcofluor White a cada pozo. Sin lavar, agregue una gota de medio de montaje a cada pozo y cubra cada pozo con un coverlip. Observe las secciones de muestra en la diapositiva de reacción utilizando un microscopio de fluorescencia.Para cada observación, utilice un filtro UV para detectar paredes celulares manchadas por el Calcofluor y un filtro FITC para detectar la inmunolocalización. Para una mejor visualización de los resultados, utilice ImageJ o un programa de análisis de imágenes similar para combinar cada imagen de filtro UV con la imagen de filtro FITC correspondiente. Al identificar la localización de epítopos específicos, el protocolo permite la caracterización de la composición de la pared celular.Por ejemplo, 1, 5-arabinan es abundante en la pared celular del anéter quercus suber en desarrollo. Los homogalacturonans apenas esterificados se encuentran típicamente en la punta raíz del embrión suber Quercus especificando las propiedades mecánicas del órgano. Los xylogalacturonanos se encuentran en células degenerantes, como la célula endosperm durante las etapas finales de la maduración de bellota de suber Quercus.Los epítopos de AGP reconocidos por JIM13 o JIM8 se encuentran en estructuras relacionadas con la reproducción, tales como líneas celulares relacionadas con la microgametogénesis en Arabidopsis thaliana y las papilas estigmatizas y microbianas de la angiospermo basal Trithuria submersa. Los errores comunes en la implementación de este protocolo suelen ser fáciles de detectar e identificar. Cuando se omiten los lavados o se permite que los pozos de reacción se sequen, el anticuerpo secundario generalmente aparecerá como un frotis.Se formarán agregados de fluorocromo verde si el anticuerpo primario no consolidado no se lava correctamente. El plegado o desprendimiento de las secciones suele estar relacionado con una mala adherencia debido al uso de toboganes impuros o lavado agresivo. La preparación de la muestra también es fundamental.Los bloques de resina deben estar libres de grietas con una muestra claramente visible de color amarillo pálido a marrón claro. Las muestras incrustadas ineficientemente mostrarán manchas o áreas blancas polvorientas. Mantener el tamaño de la muestra por debajo de ocho milímetros es esencial para la penetración de la solución fija.Las muestras mal fijas aparecerán de color marrón oscuro o casi negro. La temperatura excesiva puede hacer que la resina se agriete haciendo imposible la sección de la muestra. El uso de técnicas de inmunolocalización abre varias direcciones de investigación.Uno puede seguir con técnicas más específicas como el análisis bioquímico de la pared celular o incluso proceder a un enfoque molecular. Los resultados proporcionados por esta técnica pueden ayudar a entender la composición de la pared celular, una estructura extremadamente compleja muy difícil de analizar mediante un simple análisis químico.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

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Expresión de proteínas fluorescentes en<em&gt; Lanceolatum Branchiostoma</em&gt; Por mRNA La inyección en ovocitos no fecundados

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the ...

Investigación

Biología del Desarrollo

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