Name: fluorescent immunolocalization of arabinogalactan proteins and pectins in the cell wall of plant tissues
Uploaded: 2021-02-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescent Immunolocalization of Arabinogalactan Proteins and Pectins in the Cell Wall of Plant Tissues at JoVE.com

Författarna fick stöd från EU-projektet 690946 "SexSeed" (Sexual Plant Reproduction – Seed Formation) finansierat av H2020-MSCA-RISE-2015 och SeedWheels FCT PTDC/BIA-FBT/27839/2017. AMP fick ett bidrag från EU:s MSCA-IF-2016-projekt (nr 753328). MC fick ett bidrag från FCT PhD grant SFRH/BD/111781/2015.

1. Provberedning: fixering, uttorkning och LR-vit inbäddning
<ol><li>Fixering och uttorkning FIXERINGSPROCESSEN är avgörande för att bevara provet. genom att korsa samman molekyler stoppas cellulär metabolism, vilket säkerställer cellulär integritet och förhindrar molekylär diffusion. Fixeringsmedel och den koncentration som används måste anpassas till detta ändamål, så att antigenerna är tillräckligt exponerade för att interagera med antikropparna. Följande protokoll kombinerar d...

<ol>
	<li>Keegstra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+Cell+Walls.">Plant Cell Walls.</a> Plant Physiology. 154 (2), 483-486 (2010).</li><li>Pereira, A. M., Lopes, A. L., Coimbra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabinogalactan+Proteins+as+Interactors+along+the+Crosstalk+between+the+Pollen+Tube+and+the+Female+Tissues.">Arabinogalactan Proteins as Interactors along the Crosstalk between the Pollen Tube and the Female Tissues.</a> Frontiers in Plant Science. 7 (7), (2016).</li><li>Showalter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabinogalactan-proteins:+structure,+expression+and+function.">Arabinogalactan-proteins: structure, expression and function.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 58 (10), 1399-1417 (2001).</li><li>Majewska-Sawka, A., Nothnagel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multiple+roles+of+arabinogalactan+proteins+in+plant+development.">The multiple roles of arabinogalactan proteins in plant development.</a> Plant Physiology. 122, 3-9 (2000).</li><li>Seifert, G., Roberts, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+arabinogalactan+proteins.">The biology of arabinogalactan proteins.</a> Annual Review of Plant Biology. 58, 137-161 (2007).</li><li>Ruprecht, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Synthetic+Glycan+Microarray+Enables+Epitope+Mapping+of+Plant+Cell+Wall+Glycan-Directed+Antibodies.">A Synthetic Glycan Microarray Enables Epitope Mapping of Plant Cell Wall Glycan-Directed Antibodies.</a> Plant Physiology. 175 (3), 1094-1104 (2017).</li><li>Verhertbruggen, Y., Walker, J. L., Guillon, F., Scheller, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparative+Study+of+Sample+Preparation+for+Staining+and+Immunodetection+of+Plant+Cell+Walls+by+Light+Microscopy.">A Comparative Study of Sample Preparation for Staining and Immunodetection of Plant Cell Walls by Light Microscopy.</a> Frontiers in Plant Science. 29 (8), 1505 (2017).</li><li>Osborn, M., Weber, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+and+immunocytochemical+procedures+with+affinity+purified+antibodies:+tubulin+containing+structures.">Immunofluorescence and immunocytochemical procedures with affinity purified antibodies: tubulin containing structures.</a> Methods in Cell Biology. 24, 97-132 (1982).</li><li>Coimbra, S., Almeida, J., Junqueira, V., Costa, M., Pereira, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabinogalactan+proteins+as+molecular+markers+in+Arabidopsis+thaliana+sexual+reproduction.">Arabinogalactan proteins as molecular markers in Arabidopsis thaliana sexual reproduction.</a> Journal of Experimental Botany. 58 (15), 4027-4035 (2007).</li><li>Wilson, S. M., Bacic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+plant+cells+for+transmission+electron+microscopy+to+optimize+immunogold+labeling+of+carbohydrate+and+protein+epitopes.">Preparation of plant cells for transmission electron microscopy to optimize immunogold labeling of carbohydrate and protein epitopes.</a> Nature Protocols. 7 (9), 1716-1727 (2012).</li><li>Gane, A., Clarke, A., Bacic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+and+expression+of+arabinogalactan-proteins+in+the+ovaries+of+Nicotiana+alata+Link+and+Otto.">Localization and expression of arabinogalactan-proteins in the ovaries of Nicotiana alata Link and Otto.</a> Sex Plant Reproduction. 8, 278-282 (1995).</li><li>Coimbra, S., Salema, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunolocalization+of+arabinogalactan+proteins+in+Amaranthus+hypocondriacus+L.+ovules.">Immunolocalization of arabinogalactan proteins in Amaranthus hypocondriacus L. ovules.</a> Protoplasma. 199 (1-2), 75-82 (1997).</li><li>Coimbra, S., Duarte, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabinogalactan+proteins+may+facilitate+the+movement+of+pollen+tubes+from+the+stigma+to+the+ovules+in+Actinidia+deliciosa+and+Amaranthus+hypocondriacus.">Arabinogalactan proteins may facilitate the movement of pollen tubes from the stigma to the ovules in Actinidia deliciosa and Amaranthus hypocondriacus.</a> Euphytica. 133 (2), 171-178 (2003).</li><li>El-Tantawy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabinogalactan+protein+profiles+and+distribution+patterns+during+microspore+embryogenesis+and+pollen+development+in+Brassica+napus.">Arabinogalactan protein profiles and distribution patterns during microspore embryogenesis and pollen development in Brassica napus.</a> Plant Reproduction. 26 (3), 231-243 (2013).</li><li>Costa, M., Pereira, A. M., Rudall, P. J., Coimbra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunolocalization+of+arabinogalactan+proteins+(AGPs)+in+reproductive+structures+of+an+early-divergent+angiosperm,+Trithuria+submersa+(Hydatellaceae).">Immunolocalization of arabinogalactan proteins (AGPs) in reproductive structures of an early-divergent angiosperm, Trithuria submersa (Hydatellaceae).</a> Annals of Botany. 111 (2), 183-190 (2013).</li><li>Costa, M., Sobral, R., Ribeiro Costa, M. M., Amorim, M. I., Coimbra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+presence+of+arabinogalactan+proteins+and+pectins+during+Quercus+suber+male+gametogenesis.">Evaluation of the presence of arabinogalactan proteins and pectins during Quercus suber male gametogenesis.</a> Annals of Botany. 115 (1), 81-92 (2015).</li><li>Hibbs, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Immunolabelling.">Fluorescence Immunolabelling.</a> Confocal Microscopy for Biologists. , (2004).</li><li>Johnson, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fading+of+Immunofluorescence+during+microscopy:+A+Study+of+the+Phenomenon+and+its+Remedy.">Fading of Immunofluorescence during microscopy: A Study of the Phenomenon and its Remedy.</a> Journal of Immunological Methods. 55 (2), 231-242 (1982).</li><li>Baird, T. R., Kaufman, D., Brown, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mercury+Free+Microscopy:+An+Opportunity+for+Core+Facility+Directors.">Mercury Free Microscopy: An Opportunity for Core Facility Directors.</a> Journal of Biomolecular Techniques. 25 (2), 48-53 (2014).</li><li>Weber, G. F., Menko, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Color+image+acquisition+using+a+monochrome+camera+and+standard+fluorescence+filter+cubes.">Color image acquisition using a monochrome camera and standard fluorescence filter cubes.</a> BioTechniques. 38 (1), 52-56 (2005).</li></ol>

Den fluorescerande immunolocalization metoden i växter här beskrivs, medan sömlöst okomplicerad, förlitar sig på framgången för flera små steg. Den första är provberedning och fixering. Under detta första steg används en blandning av formaldehyd och glutaraldehyd för att korsa huvuddelen av cellkomponenterna. Formaldehyden i lösningen ger en mild och reversibel fixering medan glutaraldehyden ger en stark mer permanent länkning; Balansen mellan de två fixativen ger lämplig mängd korslänkning, vilket g?...

Växtcellväggar är komplexa strukturer bestående av polysackarider och glykoproteiner. Cellväggar är extremt dynamiska strukturer vars arkitektur, organisation och sammansättning varierar beroende på celltyp, lokalisering, utvecklingsstadium, yttre och inre stimuli1. Arabinogalactan proteiner (AGPs) och pectins är viktiga komponenter i växtcellväggen. AGPs är mycket glykosylerade proteiner och pectins är homogalacturonan polysackarider vars sammansättning, mängd och struktur varierar kraftigt under olika växtutvecklingsstadier2,3,4. AGPs och pektin studier har visat deras engagemang i flera växtprocesser såsom programmerad celldöd, svar på abiotiska påfrestningar, sexuell växtreproduktion, bland många andra5. De flesta av dessa studier började med information från immunolokaliseringsstudier.
Med tanke på dess komplexitet kräver studien av cellväggar många olika verktyg. Detektion av glykanepotoper med monoklonala antikroppar (mAbs) är ett värdefullt tillvägagångssätt för att lösa polysackarid och glykoproteinfördelning längs denna struktur. Det finns en stor samling mAbs tillgängliga för att upptäcka glykan epitoper och specificiteten för varje mAb förbättras kontinuerligt samt6. Tekniken här beskrivs är tillämplig på alla växtarter och är ett perfekt verktyg för att vägleda framtida forskningsriktningar som kan innebära dyrare och mer komplexa tekniker.
I denna teknik är specifika antikroppar kemiskt konjugerade till fluorescerande färgämnen som FITC (fluorescein isothiocyanate), TRITC (tetramethylrhodamine-5-(och 6)-isothiocyanate) eller flera Alexa Fluor färgämnen. Immunofluorescens erbjuder flera fördelar, vilket möjliggör en tydlig och snabb subcellulär lokalisering av glykaner som kan observeras direkt under ett fluorescensmikroskop. Det är mycket specifikt och känsligt, eftersom beredningen av provet effektivt kan skydda antigenens naturliga struktur, även om det förekommer i lägre mängder. Det gör det möjligt att upptäcka flera antigener i samma prov och viktigast av allt, erbjuder högkvalitativa och visuellt vackra resultat. Trots den stora kraften som erbjuds av fluorescens immunolocalization studier, betraktas de ofta som svåra att utföra och genomföra troligen på grund av bristen på detaljerade protokoll som tillåter visualisering av de olika stegen i förfarandet. Här ger vi några enkla riktlinjer för hur man utför denna teknik och hur man får högkvalitativa bilder.
För protokollet som presenteras här måste proverna först åtgärdas och bäddas in med det lämpligaste fixeringen. Även om betraktas som en tidskrävande och relativt tråkig teknik, korrekt fixering och inbäddning av växtprovet är nyckeln till att säkerställa en framgångsrik immunolocalization analys. För detta ändamål är den vanligaste kemisk fixering med hjälp av korslänkande fixativ, som aldehyder. Korslänkande fixativ upprättar kemiska bindningar mellan vävnadens molekyler, stabiliserar och härdar provet. Formaldehyd och glutaraldehyd är korslänkande fixativ, och ibland används en blandning av bådafixativen 7. Formaldehyd erbjuder stor strukturell bevarande av vävnader och under längre tidsperioder, producerar små vävnadsupprullningar och är kompatibel med immunostaining. Glutaraldehyd är ett starkare och stabilt fixativ som vanligtvis används i kombination med formaldehyd. Användningen av glutaraldehyd har vissa nackdelar som måste beaktas eftersom det introducerar vissa fria aldehydgrupper i den fasta vävnaden, vilket kan generera viss ospecificerad märkning. Även korskopplingen mellan proteiner och andra molekyler kan ibland göra vissa målepotoper otillgängliga för antikropparna. För att undvika detta måste fixeringens kvantitet och varaktighet noggrant definieras.
Efter fixering är proverna inbäddade i rätt harts för att härda innan sektionerna erhålls. London Harts (LR-White) akrylharts är det harts som val för immunolokaliseringsstudier. Till skillnad från andra hartser är LR-White hydrofil, vilket gör att antikropparna kan nå sina antigener, utan att behöva någon behandling för att underlätta det. LR-White har också fördelen att erbjuda låg auto-fluorescens, vilket möjliggör en minskning av bakgrundsljud under immunofluorescensavbildning.
Det finns många färgningstekniker tillgängliga för att upptäcka olika komponenter i cellväggen, såsom alciansk blå färgning, toluidinblå färgning eller periodisk syra-Schiff (PAS) färgning. Ingen av dessa erbjuder kraften i immunolocalization analyser8. Detta tillvägagångssätt ger större specificitet vid detektion av glykaner och erbjuder större information om cellväggens sammansättning och struktur.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:728px;" width="728">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">25% (w/v) Gluteraldehyde</td>
			<td style="width:99px;">Agar Scientific</td>
			<td style="width:196px;">AGR1010</td>
			<td style="width:187px;">aq. Solution, methanol free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">8 wells Glass reaction slides</td>
			<td style="width:99px;">Marinfeld</td>
			<td style="width:196px;">MARI1216750</td>
			<td style="width:187px;">other brands may be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:196px;">A6283</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Anti-Rat IgG (wole molecule)-FITC antibody produce in GOAT</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:196px;">F6258</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:247px;">cover slips, 24 mm x 50 mm</td>
			<td style="width:99px;">Marinfeld</td>
			<td>MARI0100222</td>
			<td style="width:187px;">The cover slip should cover all the wells. Other brands may be used&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:247px;">ddH2O</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Ethanol absolute</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Fluorescent brightner 28</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:196px;">F-6259</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Gelatin capsules</td>
			<td style="width:99px;">Agar scientific</td>
			<td>AGG29211</td>
			<td style="width:187px;">The capsule size sould feat the size of the sample.</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:247px;">Glass vials</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;">Any simple unexpensive glass vials that can be sealed, may be used. The vials may be clean with 96% etanol after use to remove LR-White residue and reused.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="294">
			<td height="294" style="height:294px;width:247px;">LR-white medium grade, embdeding resin</td>
			<td style="width:99px;">Agar Scientific</td>
			<td>AGR1281</td>
			<td style="width:187px;">LR-White comes in several forms the medium grade provides na adequate cutting suport for most tissues for harder tissues a harder grade of LR-white may be recomendable. If possible use a resin already mixed with the polimeration activator (benzoyl peroxide), if not please folow the instructions of the suplier to prepare the resin.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Non fat dry milk</td>
			<td style="width:99px;">Nestl&#233;</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;">any non fat dry milk is adequate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Oven</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;">generic laboratory oven</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Petri dish, 10 cm x 10 cm square</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">PIPES</td>
			<td style="width:99px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:196px;">P1851</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="357">
			<td height="357" style="height:357px;width:247px;">Rat generated Monoclonal Anti-Body</td>
			<td style="width:99px;">Plant probes</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;">Several antibodies that recognize cell wall components are 
			available at both the Complex Carbohydrate research center 
			(CCRC, Georgia University USA) and Plant Probes (Paul 
			Knox Cell Wall Lab, at Leeds University UK). A short list of 
			some commonly used MABS and where they can be purchased 
			is presented in Supplemental Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Razor blades</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;">regular razor blades</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">SDS</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:196px;">L6026</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Toluidine Blue-O</td>
			<td style="width:99px;">Agar Scientific</td>
			<td>AGR1727</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Tween 20</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:196px;">P9416</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Ultramicrotome</td>
			<td style="width:99px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:196px;">UC7</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:247px;">upright epifluorescence microscope with UV and FITC fluorescence filters</td>
			<td style="width:99px;">Leica Mycrosistems</td>
			<td style="width:196px;">DMLb</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">vaccum chamber</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">vaccum pump</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="297">
			<td height="297" style="height:297px;width:247px;">Vectashield</td>
			<td style="width:99px;">vecta Labs</td>
			<td style="width:196px;">T-1000</td>
			<td style="width:187px;">Other anti-fade may be used. Please do check for compatibility with FITC and the Fluorescente brightner 28. (Note: for a non-commercial alternative, (see Jonhson et al 198218) An antifade medium can be made by mixing 25 mg/mL of 1,4-Diazobicyclo-(2,2,2)octane (DABCO) in 9:1 (v/v) glycerol to 1xPBS. Adjust pH to 8.6 with diluted HCl.)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescent immunolocalization of arabinogalactan proteins and pectins in the cell wall of plant tissues

Växtutveckling innebär ständiga justeringar av cellväggens sammansättning och struktur som svar på både inre och yttre stimuli. Cellväggarna består av cellulosa och icke-cellulosapolysackarider tillsammans med proteiner, fenolföreningar och vatten. 90% av cellväggen består av polysackarider (t.ex. pectins) och arabinogalactanproteiner (AGPs). Fluorescerande immunolokalisering av specifika glykan epitoper i växt histologiska sektioner är fortfarande ett viktigt verktyg för att avslöja ombyggnad av vägg polysackarid nätverk, struktur och komponenter.
Här rapporterar vi en optimerad fluorescerande immunolocalization förfarande för att upptäcka glycan epitopes från AGPs och pectins i växtvävnader. Paraformaldehyd/glutaraldehyd fixering användes tillsammans med LR-Vit inbäddning av växtproverna, vilket möjliggör ett bättre bevarande av vävnadsstrukturen och kompositionen. Tunna delar av de inbäddade prover som erhållits med en ultra-microtome användes för immunolocalization med specifika antikroppar. Denna teknik erbjuder bra upplösning, hög specificitet och chansen att upptäcka flera glykanepotoper i samma prov. Denna teknik möjliggör subcellulär lokalisering av glykaner och detekterar deras ackumuleringsnivå i cellväggen. Det tillåter också bestämning av spatio-temporala mönster av AGP och pektin distribution under utvecklingsprocesser. Användningen av detta verktyg kan i slutändan vägleda forskningsriktningar och länka glykaner till specifika funktioner i växter. Dessutom kan den erhållna informationen komplettera biokemiska studier och genuttrycksstudier.

I ett framgångsrikt experiment kommer den sekundära antikroppen specifikt att fastställa platsen för den specifika epitopen i ljusgrönt, på ett konsekvent sätt, vilket möjliggör karakterisering av cellväggens sammansättning på ett visst utvecklingsstadium av cellen, vävnaden eller organet. Till exempel har LM6-antikroppen en hög affinitet för 1,5-arabinan, en förening med typ-I rhamnogalacturonan som finns rikligt med en märkning av cellväggen i den utvecklande Quercus-underkäke längre (<stro...

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescent Immunolocalization of Arabinogalactan Proteins and Pectins in the Cell Wall of Plant Tissues at JoVE.com

Fluorescent Immunolocalization of Arabinogalactan Proteins and Pectins in the Cell Wall of Plant Tissues

Detta protokoll beskriver i detalj hur växtmaterialet för immunlokalisering av arabinogalaktanproteiner och pectiner är fixerat, inbäddat i ett hydrofilt akrylharts, sektionerat och monterat på glasrutschbanor. Vi visar cellvägg relaterade epitopes kommer att upptäckas med specifika antikroppar.

Fluorescerande immunlokalisering av arabinogalaktanproteiner och pectiner i växtvävnadernas cellvägg

Plant development involves constant adjustments of the cell wall composition and structure in response to both internal and external stimuli. Cell walls ...

Mängden information från endast ett experiment är enorm. Vi kan upptäcka närvaron av dessa cellväggpolymerer och veta exakt hur de distribueras i celler och vävnader, och till och med bestämma deras överflöd. Denna metod är utformad på ett sådant sätt att den kan appliceras på nästan alla typer av växtvävnad från vilken art som helst som man kanske vill analysera.Immunlokalisering i växtvävnader innebär mycket noggrant arbete, svårt att förklara utan att faktiskt se vad som händer. Innan du samlar växtvävnadsprovet, fyll en glasflaska med tillräckligt med kall fixativ lösning för att helt dränka alla prover. Välj sedan de växtvävnader som ska analyseras och trimma proverna till en storlek på högst 16 kvadratiska millimeter.Doppa omedelbart proverna i den fixativa lösningen. Glutaraldehyd och formaldehyd är båda utmärkta fixativ, men båda är farliga och måste hanteras i flödeshuven. Överför injektionsflaskan till en vakuumkammare och applicera långsamt vakuum.När trycket når negativa 60 kilo pascal börjar det flytande materialet i injektionsflaskan sjunka till botten. Håll trycket i kammaren på högst negativa 80 kilo pascal. Förlisningsprocessen kan ta upp till två timmar.När proverna har legat i vakuumkammaren i två timmar släpper du långsamt vakuumet. Försegla glasflaskan och kyl den över natten vid fyra grader Celsius. Efter fixeringen över natten, kassera alla prover som inte sjönk till botten av injektionsflaskan.Tvätta de återstående proverna med 25 millimolar PBS i 10 minuter och tvätta dem sedan i 25 millimolar PIPES-buffert i 20 minuter. Det är extremt viktigt att ta bort alla flytande prover eftersom det är mycket troligt att fixativet inte har trängt in i provet. Dehydrera proverna i en etanolserie och doppa proverna i 20 minuter vid varje etanolkoncentration.För att granska proverna, tillsätt ökande koncentrationer av LR-vitt harts i etanol, som börjar med en del harts i tre delar etanol. Vid varje koncentration, inkubera i 24 timmar vid fyra grader Celsius. Ersätt det LR-vita hartset med färskt harts och inkubera proverna i ytterligare 12 timmar vid fyra grader Celsius.Förbered de inbäddade gelatinkapslarna och välj kapslar som är något större än proverna så att proverna kan vara helt inneslutna i hartset. Etikettpapperstaggar med blyerts eftersom bläck förorenar hartset. Applicera en droppe färskt LR-vitt harts på botten av varje kapsel.Placera ett prov i varje kapsel och fyll sedan kapslarna till maximal kapacitet med färskt harts. Sätt locket på kapseln och tryck försiktigt för att försegla den. För att polymerisera hartset, härda kapslarna vid 58 grader Celsius tills de är helt härdade runt 24 till 48 timmar.Efter skalning av gelatinkapseln från det LR-vita hartset placerar du hartsblocket under stereomikroskopet. Använd ett vasst rakblad och trimma det LR-vita blocket i 45 graders vinkel mot provet. Rotera provet och gör ett andra snitt i 90 graders vinkel till det första.Fortsätt att skära i samma mönster för att bilda en pyramid med pyramidens spets direkt ovanför provets intresseområde och börja sedan ta bort fina skivor vinkelrätt mot huvudaxeln tills skärytan når provet. Målprovet ska helst omges i trapetsform. Placera det trimmade hartsblocket i ultramikrotomen.Justera vinkeln mellan knivkanten och hartsblocket. Skär sektioner från blocket med en tjocklek mellan 200 och 700 nanometer. Använd en trådslinga för att försiktigt lyfta några provsmakta sektioner från mikrotomen.Placera dem i en droppe destillerat avjoniserat vatten på en glasrutschbana. Avdunsta vattnet genom att placera rutschkanan på en värmeplatta vid 50 grader Celsius och tillsätt sedan en droppe fläck till sektionerna. Efter 30 sekunder, skölj av fläcken och observera bilden under mikroskopet för att kontrollera avsnittets allmänna tillstånd och att önskad växtstruktur är synlig.Förbered en ren reaktionsrutschbana genom att placera en droppe destillerat avjoniserat vatten i varje brunn i bilden. Överför en eller två provsektioner till varje droppe vatten. Placera rutschkanan i en 10 centimeter fyrkantig Petri-skål, täck den och låt den torka vid 50 grader Celsius.För att förbereda en inkubationskammare för reaktionsrutschbanorna, placera några dämpade pappershanddukar längst ner på en pipettspetslåda och linda lådan med aluminiumfolie. Överför bilderna från lådan till inkubationskammaren. Pipett 50 mikroliter blockeringslösning i varje brunn.Efter att ha inkuberade bilden i 10 minuter, ta bort blockeringslösningen och tvätta sedan alla brunnar två gånger med PBS i 10 minuter varje gång. Efter att ha förberett de primära antikroppslösningarna som beskrivs i manuskriptet, utför en slutlig tvättning av brunnarna med destillerat vatten i fem minuter. Pipett den primära antikroppslösningen i reaktionsbrunnarna, sedan pipett blockeringslösningen i kontrollbrunnarna.Stäng inkubationskammaren. Låt den stå i två timmar vid rumstemperatur och kyl den sedan över natten vid fyra grader Celsius. Förbered en 1%-lösning av den sekundära antikroppen i blockeringslösningen.Cirka 40 mikroliter per brunn kommer att behövas. Täck lösningen med aluminiumfolie. Tvätta reaktionsrutschbanorna två gånger med PBS och en gång med destillerat avjoniserat vatten i 10 minuter varje gång.Se till att ingen blockeringslösning eller avlagringar finns kvar i brunnarna. Pipett den sekundära antikroppslösningen i alla brunnar. Inkubera rutschkanorna i mörker vid rumstemperatur i tre till fyra timmar.Återigen, tvätta brunnarna i reaktionsrutschbanan två gånger med PBS och en gång med destillerat avjoniserat vatten och tillsätt sedan en droppe Calcofluor White till varje brunn. Utan tvätt, tillsätt en droppe monteringsmedium till varje brunn och täck varje brunn med ett täckglas. Observera provsektionerna i reaktionsbilden med hjälp av ett fluorescensmikroskop.För varje observation, använd ett UV-filter för att upptäcka cellväggar färgade av Calcofluor och ett FITC-filter för att upptäcka immunlokalisering. För en bättre visualisering av resultaten, använd ImageJ eller ett liknande bildanalysprogram för att sammanfoga varje UV-filterbild med motsvarande FITC-filterbild. Genom att fastställa lokaliseringen av specifika epitoper möjliggör protokollet karakterisering av cellväggens sammansättning.Till exempel är 1, 5-arabinan riklig i cellväggen på den utvecklande Quercus-subern längre. Knappt esterifierade homogalacturonans finns typisk på roten spetsen av Quercus suberembryon som specificerar mekaniska rekvisita av organ. Xylogalacturonans finns i degenererande celler, såsom frövitscellen under de sista stadierna av Quercus suber ekollon mognad.AGP epitopes erkända av JIM13 eller JIM8 finns på strukturer relaterade till reproduktion, såsom cellinjer relaterade till microgametogenesis i Arabidopsis thaliana och stigmatisk papillae och mikrobiell av den basala angiosperm Trithuria submersa. Vanliga misstag i genomförandet av detta protokoll är vanligtvis lätta att upptäcka och identifiera. När tvättarna hoppas över eller reaktionsbrunnarna får torka, visas den sekundära antikroppen vanligtvis som ett utstryk.Aggregat av grön fluorokrom bildas om den obundna primära antikroppen inte tvättas bort ordentligt. Vikning eller lossning av sektionerna är vanligtvis relaterad till dålig vidhäftning på grund av användning av orena diabilder eller aggressiv tvättning. Provberedning är också avgörande.Hartsblocken ska vara fria från sprickor med ett tydligt synligt ljusgult till ljusbrunt prov. Ineffektiva inbäddade prover visar pudriska vita fläckar eller områden. Att hålla provstorleken under åtta millimeter är avgörande för penetration av den fixativa lösningen.Dåligt fixerade prover kommer att verka mörkbruna eller nästan svarta. Överdriven temperatur kan orsaka att hartset spricker vilket gör det omöjligt att dela upp provet. Användningen av immunlokaliseringstekniker öppnar flera forskningsanvisningar.Man kan följa vidare med mer specifika tekniker som biokemisk analys av cellväggen eller till och med gå vidare till ett molekylärt tillvägagångssätt. Resultaten från denna teknik kan hjälpa till att förstå cellväggens sammansättning, en extremt komplex struktur som är mycket svår att analysera genom enkel kemisk analys.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

Uttryck av fluorescerande proteiner i<em&gt; Lansettfisk</em&gt; Av mRNA Injektion i Obefruktade Oocyter

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the ...

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

En ny mammografisk feta padtransplantationsteknik för att visualisera fartygsgenerering av vaskulära endotelceller

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissektion och Immunofluorescerande färgning av svamp kropp och ljusmätare nervceller i vuxen Drosophila melanogaster hjärnor

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Hela-mount Clearing och färgning av Arabidopsis blomma organ och Siliques

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Immuno-fluorescerande märkning av mikrotubuli och Centrosomal proteiner i Ex Vivo Tarmvävnaden och 3D In Vitro Intestinal Organoids

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone

Vävnads beredning och immunofärgning av mus kraniofaciala vävnader och Undecalcified Bone

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and ...

Use of Atomic Force Microscopy to Measure Mechanical Properties and Turgor Pressure of Plant Cells and Plant Tissues

Användning av atomkraft mikroskopi för att mäta mekaniska egenskaper och turgor trycket av växtceller och växt vävnader

We present here the use of atomic force microscopy to indent plant tissues and recover its mechanical properties. Using two different microscopes in ...

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Live Cell Imaging av Microtubule Cytoskelett och mikromekanisk manipulation av den Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Understanding cell and tissue level regulation of growth and morphogenesis has been at the forefront of biological research for many decades. Advances in ...

Isolation of Endocardial and Coronary Endothelial Cells from the Ventricular Free Wall of the Rat Heart

Isolering av endokardiella och koronar endotelceller från Ventrikulärt Fria väggen i Råtthjärtat

It has been shown that endocardial endothelial cells (EECs) and coronary endothelial cells (CECs) differ in origin, development, markers, and functions. ...