Name: fluorescent immunolocalization of arabinogalactan proteins and pectins in the cell wall of plant tissues
Uploaded: 2021-02-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescent Immunolocalization of Arabinogalactan Proteins and Pectins in the Cell Wall of Plant Tissues at JoVE.com

Yazarlar, H2020-MSCA-RISE-2015 ve SeedWheels FCT PTDC/BIA-FBT/27839/2017 tarafından finanse edilen AB projesi 690946 'SexSeed' (Cinsel Bitki Üretimi - Tohum Oluşumu) tarafından destek aldı. AMP, Avrupa Birliği'nin MSCA-IF-2016 projesinden (no. 753328) hibe aldı. MC, FCT PhD hibesi SFRH/BD/111781/2015'ten hibe aldı.

1. Örnek Hazırlama: fiksasyon, dehidrasyon ve LR-White gömme
<ol><li>Fiksasyon ve dehidrasyon NOT: Sabitleme işlemi örneği korumak için kritik öneme sahiptir; molekülleri çapraz bağlayarak hücresel metabolizma durdurulur, hücresel bütünlük sağlanır ve moleküler difüzyonu önler. Fiksatif ajanlar ve kullanılan konsantrasyon bu amaca göre ayarlanmalıdır ve antijenler antikorlarla etkileşime girmeye yeterince maruz kalmalıdır. Aşağıdaki protokol, paraformaldehitin hafif fi...

<ol>
	<li>Keegstra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+Cell+Walls.">Plant Cell Walls.</a> Plant Physiology. 154 (2), 483-486 (2010).</li><li>Pereira, A. M., Lopes, A. L., Coimbra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabinogalactan+Proteins+as+Interactors+along+the+Crosstalk+between+the+Pollen+Tube+and+the+Female+Tissues.">Arabinogalactan Proteins as Interactors along the Crosstalk between the Pollen Tube and the Female Tissues.</a> Frontiers in Plant Science. 7 (7), (2016).</li><li>Showalter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabinogalactan-proteins:+structure,+expression+and+function.">Arabinogalactan-proteins: structure, expression and function.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 58 (10), 1399-1417 (2001).</li><li>Majewska-Sawka, A., Nothnagel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multiple+roles+of+arabinogalactan+proteins+in+plant+development.">The multiple roles of arabinogalactan proteins in plant development.</a> Plant Physiology. 122, 3-9 (2000).</li><li>Seifert, G., Roberts, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+arabinogalactan+proteins.">The biology of arabinogalactan proteins.</a> Annual Review of Plant Biology. 58, 137-161 (2007).</li><li>Ruprecht, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Synthetic+Glycan+Microarray+Enables+Epitope+Mapping+of+Plant+Cell+Wall+Glycan-Directed+Antibodies.">A Synthetic Glycan Microarray Enables Epitope Mapping of Plant Cell Wall Glycan-Directed Antibodies.</a> Plant Physiology. 175 (3), 1094-1104 (2017).</li><li>Verhertbruggen, Y., Walker, J. L., Guillon, F., Scheller, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparative+Study+of+Sample+Preparation+for+Staining+and+Immunodetection+of+Plant+Cell+Walls+by+Light+Microscopy.">A Comparative Study of Sample Preparation for Staining and Immunodetection of Plant Cell Walls by Light Microscopy.</a> Frontiers in Plant Science. 29 (8), 1505 (2017).</li><li>Osborn, M., Weber, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+and+immunocytochemical+procedures+with+affinity+purified+antibodies:+tubulin+containing+structures.">Immunofluorescence and immunocytochemical procedures with affinity purified antibodies: tubulin containing structures.</a> Methods in Cell Biology. 24, 97-132 (1982).</li><li>Coimbra, S., Almeida, J., Junqueira, V., Costa, M., Pereira, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabinogalactan+proteins+as+molecular+markers+in+Arabidopsis+thaliana+sexual+reproduction.">Arabinogalactan proteins as molecular markers in Arabidopsis thaliana sexual reproduction.</a> Journal of Experimental Botany. 58 (15), 4027-4035 (2007).</li><li>Wilson, S. M., Bacic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+plant+cells+for+transmission+electron+microscopy+to+optimize+immunogold+labeling+of+carbohydrate+and+protein+epitopes.">Preparation of plant cells for transmission electron microscopy to optimize immunogold labeling of carbohydrate and protein epitopes.</a> Nature Protocols. 7 (9), 1716-1727 (2012).</li><li>Gane, A., Clarke, A., Bacic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+and+expression+of+arabinogalactan-proteins+in+the+ovaries+of+Nicotiana+alata+Link+and+Otto.">Localization and expression of arabinogalactan-proteins in the ovaries of Nicotiana alata Link and Otto.</a> Sex Plant Reproduction. 8, 278-282 (1995).</li><li>Coimbra, S., Salema, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunolocalization+of+arabinogalactan+proteins+in+Amaranthus+hypocondriacus+L.+ovules.">Immunolocalization of arabinogalactan proteins in Amaranthus hypocondriacus L. ovules.</a> Protoplasma. 199 (1-2), 75-82 (1997).</li><li>Coimbra, S., Duarte, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabinogalactan+proteins+may+facilitate+the+movement+of+pollen+tubes+from+the+stigma+to+the+ovules+in+Actinidia+deliciosa+and+Amaranthus+hypocondriacus.">Arabinogalactan proteins may facilitate the movement of pollen tubes from the stigma to the ovules in Actinidia deliciosa and Amaranthus hypocondriacus.</a> Euphytica. 133 (2), 171-178 (2003).</li><li>El-Tantawy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabinogalactan+protein+profiles+and+distribution+patterns+during+microspore+embryogenesis+and+pollen+development+in+Brassica+napus.">Arabinogalactan protein profiles and distribution patterns during microspore embryogenesis and pollen development in Brassica napus.</a> Plant Reproduction. 26 (3), 231-243 (2013).</li><li>Costa, M., Pereira, A. M., Rudall, P. J., Coimbra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunolocalization+of+arabinogalactan+proteins+(AGPs)+in+reproductive+structures+of+an+early-divergent+angiosperm,+Trithuria+submersa+(Hydatellaceae).">Immunolocalization of arabinogalactan proteins (AGPs) in reproductive structures of an early-divergent angiosperm, Trithuria submersa (Hydatellaceae).</a> Annals of Botany. 111 (2), 183-190 (2013).</li><li>Costa, M., Sobral, R., Ribeiro Costa, M. M., Amorim, M. I., Coimbra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+presence+of+arabinogalactan+proteins+and+pectins+during+Quercus+suber+male+gametogenesis.">Evaluation of the presence of arabinogalactan proteins and pectins during Quercus suber male gametogenesis.</a> Annals of Botany. 115 (1), 81-92 (2015).</li><li>Hibbs, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Immunolabelling.">Fluorescence Immunolabelling.</a> Confocal Microscopy for Biologists. , (2004).</li><li>Johnson, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fading+of+Immunofluorescence+during+microscopy:+A+Study+of+the+Phenomenon+and+its+Remedy.">Fading of Immunofluorescence during microscopy: A Study of the Phenomenon and its Remedy.</a> Journal of Immunological Methods. 55 (2), 231-242 (1982).</li><li>Baird, T. R., Kaufman, D., Brown, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mercury+Free+Microscopy:+An+Opportunity+for+Core+Facility+Directors.">Mercury Free Microscopy: An Opportunity for Core Facility Directors.</a> Journal of Biomolecular Techniques. 25 (2), 48-53 (2014).</li><li>Weber, G. F., Menko, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Color+image+acquisition+using+a+monochrome+camera+and+standard+fluorescence+filter+cubes.">Color image acquisition using a monochrome camera and standard fluorescence filter cubes.</a> BioTechniques. 38 (1), 52-56 (2005).</li></ol>

Burada açıklanan bitkilerdeki floresan immünolocalizasyon yöntemi, sorunsuz bir şekilde basit olsa da, birkaç küçük adımın başarısına dayanır. Bunlardan ilki örnek hazırlama ve sabitlemedir. Bu ilk adım sırasında, hücre bileşenlerinin çoğunu çapraz bağlamak için formaldehit ve glutaraldehit karışımı kullanılır. Çözeltideki formaldehit hafif ve geri dönüşümlü bir fiksasyon sağlarken glutaraldehit daha kalıcı güçlü bir bağlantı sağlar; iki fiksatif arasındaki denge, epitopl...

Bitki hücre duvarları polisakkaritler ve glikoproteinlerden oluşan karmaşık yapılardır. Hücre duvarları, mimarisi, organizasyonu ve bileşimi hücre tipine, lokalizasyona, gelişim aşamasına, dış ve iç uyaranlara göre değişen son derece dinamik yapılardır1. Arabinogalactan proteinleri (AGP'ler) ve pektinler bitki hücre duvarının önemli bileşenleridir. AGP'ler oldukça glikosillenmiş proteinlerdir ve pektinler, farklı bitki gelişim aşamalarında bileşimi, miktarı ve yapısı büyük ölçüde değişen homogalacturonan polisakkaritlerdir2,3,4. AGP'ler ve pektin çalışmaları, programlanmış hücre ölümü,biyotik streslere yanıt, cinsel bitki üremesi gibi çeşitli bitki süreçlerinde rollerini ortaya koydu5. Bu çalışmaların çoğu immünolokalizasyon çalışmalarından elde edilen bilgilerle başlamıştır.
Karmaşıklığı göz önüne alındığında, hücre duvarlarının incelenmesi birçok farklı araç gerektirir. Glikan epitoplarının monoklonal antikorlar (mAbs) kullanılarak saptanması, bu yapı boyunca polisakkarit ve glikoprotein dağılımını çözmek için değerli bir yaklaşımdır. Glikan epitoplarını tespit etmek için geniş bir mAb koleksiyonu vardır ve her mAb'nin özgüllüğü sürekli olarak iyileştirilmektedir6. Burada açıklanan teknik tüm bitki türleri için geçerlidir ve daha pahalı ve karmaşık teknikler içerebilecek gelecekteki araştırma yönlerine rehberlik etmek için mükemmel bir araçtır.
Bu teknikte spesifik antikorlar FITC (floresan izotiyosiyanat), TRITC (tetrametrinhodamin-5-(ve 6)-izotiyosiyanat) veya birkaç Alexa Fluor boyası gibi floresan boyalara kimyasal olarak konjuge edilir. İmmünoresans, floresan mikroskobu altında doğrudan gözlemlenebilen glikanların net ve hızlı bir hücre altı lokalizasyonuna izin veren çeşitli avantajlar sunar. Son derece spesifik ve hassastır, çünkü numunenin hazırlanması, daha düşük miktarlarda mevcut olsa bile antijenin doğal yapısını etkili bir şekilde koruyabilir. Aynı örnekte ve en önemlisi birden fazla antijenin tespit edilmesine izin verir, yüksek kaliteli ve görsel olarak güzel sonuçlar sunar. Floresan immünolocalizasyon çalışmalarının sunduğu büyük güce rağmen, genellikle prosedürün farklı adımlarının görselleştirilmesine izin eden ayrıntılı protokollerin olmaması nedeniyle yapılması ve uygulanması zor olarak kabul edilirler. Burada, bu tekniğin nasıl gerçekleştirilacağı ve yüksek kaliteli görüntülerin nasıl eldeılacağı hakkında bazı basit yönergeler sunuyoruz.
Burada sunulan protokol için, örneklerin öncelikle en uygun sabitleyici kullanılarak sabitlenilmesi ve gömülmesi gerekir. Zaman alıcı ve nispeten sıkıcı bir teknik olarak düşünülse de, bitki örneğinin uygun şekilde sabitlenmesi ve gömülmesi, başarılı bir immünolocalizasyon tahlilini sağlamanın anahtarıdır. Bu amaçla, en olağan olanı aldehitler gibi çapraz bağlama fiksatifleri kullanılarak kimyasal fiksasyondur. Çapraz bağlama fiksatifleri, doku molekülleri arasında kimyasal bağlar kurarak numuneyi stabilize eder ve sertleşir. Formaldehit ve glutaraldehit, fiksatifleri çapraz bağlar ve bazen her iki fiksatifin bir karışımı kullanılır7. Formaldehit, dokuların ve uzun sürelerin büyük yapısal korunmasını, küçük doku geri çekilmeleri üretilmesini ve immünostaining ile uyumlu olmasını sunar. Glutaraldehit, genellikle formaldehit ile birlikte kullanılan daha güçlü ve kararlı bir fiksatiftir. Glutaraldehit kullanımı, bazı serbest aldehit gruplarını sabit dokuya soktuğu için dikkate alınması gereken bazı dezavantajlara sahiptir, bu da bazı belirsiz etiketlemeler oluşturabilir. Ayrıca proteinler ve diğer moleküller arasındaki çapraz bağlantı bazen bazı hedef epitopları antikorlar için erişilemez hale getirebilir. Bunu önlemek için, fiksasyonun miktarı ve süresi dikkatlice tanımlanmalıdır.
Sabitlemeden sonra, numuneler bölümleri elde etmeden önce sertleştirmek için uygun reçineye gömülür. Londra Reçinesi (LR-White) akrilik reçine, immünolokalizasyon çalışmaları için tercih edilmesi olan reçinedir. Diğer reçinelerin aksine, LR-White hidrofiliktir ve antikorların antijenlerine ulaşmasını sağlar ve bunu kolaylaştırmak için herhangi bir tedaviye gerek yoktur. LR-White ayrıca düşük otomatik floresan sunma avantajına sahiptir ve immünoresans görüntülemesi sırasında arka plan gürültüsünde bir azalma sağlar.
Alcian mavisi boyama, toluidin mavisi boyama veya Periyodik asit-Schiff (PAS) lekeleme gibi hücre duvarının farklı bileşenlerini tespit etmek için birçok boyama tekniği mevcuttur. Bunların hiçbiri immünolokalizasyon analizlerinin gücünü sunmaz8. Bu yaklaşım glikanların tespitinde daha fazla özgüllük sağlar ve hücre duvarı bileşimi ve yapısı hakkında daha geniş bilgiler sunar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:728px;" width="728">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">25% (w/v) Gluteraldehyde</td>
			<td style="width:99px;">Agar Scientific</td>
			<td style="width:196px;">AGR1010</td>
			<td style="width:187px;">aq. Solution, methanol free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">8 wells Glass reaction slides</td>
			<td style="width:99px;">Marinfeld</td>
			<td style="width:196px;">MARI1216750</td>
			<td style="width:187px;">other brands may be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:196px;">A6283</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Anti-Rat IgG (wole molecule)-FITC antibody produce in GOAT</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:196px;">F6258</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:247px;">cover slips, 24 mm x 50 mm</td>
			<td style="width:99px;">Marinfeld</td>
			<td>MARI0100222</td>
			<td style="width:187px;">The cover slip should cover all the wells. Other brands may be used&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:247px;">ddH2O</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Ethanol absolute</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Fluorescent brightner 28</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:196px;">F-6259</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Gelatin capsules</td>
			<td style="width:99px;">Agar scientific</td>
			<td>AGG29211</td>
			<td style="width:187px;">The capsule size sould feat the size of the sample.</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:247px;">Glass vials</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;">Any simple unexpensive glass vials that can be sealed, may be used. The vials may be clean with 96% etanol after use to remove LR-White residue and reused.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="294">
			<td height="294" style="height:294px;width:247px;">LR-white medium grade, embdeding resin</td>
			<td style="width:99px;">Agar Scientific</td>
			<td>AGR1281</td>
			<td style="width:187px;">LR-White comes in several forms the medium grade provides na adequate cutting suport for most tissues for harder tissues a harder grade of LR-white may be recomendable. If possible use a resin already mixed with the polimeration activator (benzoyl peroxide), if not please folow the instructions of the suplier to prepare the resin.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Non fat dry milk</td>
			<td style="width:99px;">Nestl&#233;</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;">any non fat dry milk is adequate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Oven</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;">generic laboratory oven</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Petri dish, 10 cm x 10 cm square</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">PIPES</td>
			<td style="width:99px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:196px;">P1851</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="357">
			<td height="357" style="height:357px;width:247px;">Rat generated Monoclonal Anti-Body</td>
			<td style="width:99px;">Plant probes</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;">Several antibodies that recognize cell wall components are 
			available at both the Complex Carbohydrate research center 
			(CCRC, Georgia University USA) and Plant Probes (Paul 
			Knox Cell Wall Lab, at Leeds University UK). A short list of 
			some commonly used MABS and where they can be purchased 
			is presented in Supplemental Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Razor blades</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;">regular razor blades</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">SDS</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:196px;">L6026</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Toluidine Blue-O</td>
			<td style="width:99px;">Agar Scientific</td>
			<td>AGR1727</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Tween 20</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:196px;">P9416</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Ultramicrotome</td>
			<td style="width:99px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:196px;">UC7</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:247px;">upright epifluorescence microscope with UV and FITC fluorescence filters</td>
			<td style="width:99px;">Leica Mycrosistems</td>
			<td style="width:196px;">DMLb</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">vaccum chamber</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">vaccum pump</td>
			<td style="width:99px;">na</td>
			<td style="width:196px;">na</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="297">
			<td height="297" style="height:297px;width:247px;">Vectashield</td>
			<td style="width:99px;">vecta Labs</td>
			<td style="width:196px;">T-1000</td>
			<td style="width:187px;">Other anti-fade may be used. Please do check for compatibility with FITC and the Fluorescente brightner 28. (Note: for a non-commercial alternative, (see Jonhson et al 198218) An antifade medium can be made by mixing 25 mg/mL of 1,4-Diazobicyclo-(2,2,2)octane (DABCO) in 9:1 (v/v) glycerol to 1xPBS. Adjust pH to 8.6 with diluted HCl.)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescent immunolocalization of arabinogalactan proteins and pectins in the cell wall of plant tissues

Bitki gelişimi, hem iç hem de dış uyaranlara yanıt olarak hücre duvarı bileşiminin ve yapısının sürekli olarak ayarlanmasını içerir. Hücre duvarları proteinler, fenolik bileşikler ve su ile birlikte selüloz ve selülozik olmayan polisakkaritlerden oluşur. Hücre duvarının %90'ı polisakkaritler (örneğin pektinler) ve arabinogalactan proteinlerinden (AGP) oluşur. Bitki histolojik bölümlerindeki spesifik glikan epitoplarının floresan immünolocalizasyonu, duvar polisakkarit ağlarının, yapısının ve bileşenlerinin yeniden şekillendirilmesini ortaya çıkarmak için önemli bir araç olmaya devam etmektedir.
Burada, bitki dokularındaki AGP'lerden ve pektinlerden glikan epitopları tespit etmek için optimize edilmiş bir floresan immünolocalizasyon prosedürü rapor ediyoruz. Paraformaldehit/glutaraldehit fiksasyonu, bitki örneklerinin LR-White gömülmesi ile birlikte kullanıldı ve doku yapısının ve bileşiminin daha iyi korunmasını sağladı. Ultra mikrotom ile elde edilen gömülü örneklerin ince bölümleri spesifik antikorlarla immünokokalizasyon için kullanılmıştır. Bu teknik büyük çözünürlük, yüksek özgüllük ve aynı örnekte birden fazla glikan epitop tespit etme şansı sunar. Bu teknik glikanların hücre altı lokalizasyonunu sağlar ve hücre duvarındaki birikim düzeylerini algılar. Ayrıca gelişimsel süreçler sırasında AGP ve pektin dağılımının mekansal-zamansal paternlerinin belirlenmesine izin sağlar. Bu aracın kullanımı sonuçta araştırma yönlerine rehberlik edebilir ve glikanları bitkilerdeki belirli işlevlere bağlayabilir. Ayrıca elde edilen bilgiler biyokimyasal ve gen ekspresyon çalışmalarını tamamlayabilir.

Başarılı bir deneyde, ikincil antikor özellikle hücre, doku veya organın belirli bir gelişim aşamasında hücre duvarı bileşiminin karakterize edilmesine izin vererek, belirli epitopun yerini parlak yeşil, tutarlı bir şekilde belirleyecektir. Örneğin LM6 antikoru, gelişmekte olan Quercus suber anther'in hücre duvarını bolca etiketleyen tip-I rhamnogalacturonan içeren bir bileşik olan 1,5-arabinan için yüksek bir benzeşime sahiptir (Şekil 2A), böylece bu tü...

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescent Immunolocalization of Arabinogalactan Proteins and Pectins in the Cell Wall of Plant Tissues at JoVE.com

Fluorescent Immunolocalization of Arabinogalactan Proteins and Pectins in the Cell Wall of Plant Tissues

Bu protokol, Arabinogalactan proteinlerinin ve pektinlerinin immünolokalizasyonu için bitki materyalinin hidrofilik akrilik reçineye gömülü, bölümlenmiş ve cam slaytlara monte edilmiş nasıl sabitlendiğini ayrıntılı olarak açıklar. Hücre duvarı ile ilgili epitopların spesifik antikorlarla tespit edileceğini gösteriyoruz.

Bitki Dokularının Hücre Duvarındaki Arabinogalactan Protein ve Pektinlerin Floresan İmmünolokalizasyonu

Plant development involves constant adjustments of the cell wall composition and structure in response to both internal and external stimuli. Cell walls ...

Sadece bir deneyden elde edilen bilgi miktarı çok büyük. Bu hücre duvarı polimerlerinin varlığını tespit edebilir ve hücre ve dokularda tam olarak nasıl dağıtıldıklarını bileceğiz ve hatta bolluklarını belirleyebiliriz. Bu yöntem, analiz etmek isteyebileceğiniz herhangi bir türden hemen hemen her tür bitki dokusuna uygulanabilecek şekilde tasarlanmıştır.Bitki dokularında immünosalizasyon, gerçekte ne olduğunu görmeden açıklanması zor, çok titiz bir çalışma içerir. Bitki dokusu örneğini toplamadan önce, bir cam şişeyi tüm örnekleri tamamen batırmak için yeterli soğuk fiksatif çözelti ile doldurun. Daha sonra analiz edilecek bitki dokularını seçin ve numuneleri en fazla 16 milimetre karelik bir boyuta kırpın.Örnekleri hemen sabit çözüme daldırın. Glutaraldehit ve formaldehit her ikisi de mükemmel fiksatiflerdir, ancak her ikisi de tehlikelidir ve akış başlığında ele alınmalıdır. Şişeyi bir vakum odasına aktarın ve yavaşça vakum uygulayın.Basınç negatif 60 kilo pascals ulaştığında, şişedeki yüzen malzeme dibe batmaya başlayacaktır. Odadaki basıncı negatif 80 kilo pascal'dan fazla tutmayın. Batma işlemi iki saat kadar sürebilir.Numuneler iki saat boyunca vakum odasında kaldıktan sonra, vakumun yavaşça serbest bırakılmasının ardından. Cam şişeyi kapatın ve dört santigrat derecede gece boyunca soğutun. Gece sabitlemeden sonra, şişenin dibine batmayan örnekleri atın.Kalan numuneleri 25 milimolar PBS ile 10 dakika yıkadıktan sonra 25 milimolar PIPES tamponunda 20 dakika yıkayın. Tüm kayan örneklerin çıkarılması son derece önemlidir, çünkü fiksatifin numuneye nüfuz etmemiş olması muhtemeldir. Numuneleri bir etanol serisinde susuz bırakın, numuneleri her etanol konsantrasyonunda 20 dakika daldırin.Örnekleri boğmak için, üç parça etanol için bir parça reçine ile başlayarak etanolde artan LR-beyaz reçine konsantrasyonları ekleyin. Her konsantrasyonda, dört santigrat derecede 24 saat kuluçkaya yatır. LR-beyaz reçinesini taze reçine ile değiştirin ve numuneleri dört santigrat derecede 12 saat daha kuluçkaya yatırın.Yerleştirme jelatin kapsüllerini hazırlayın, numunelerden biraz daha büyük kapsülleri seçin, böylece numuneler reçineye tamamen kapatılabilir. Mürekkep reçineyi kirleteceğinden kağıt etiketleri kalemle etiketleyin. Her kapsülün altına bir damla taze LR-beyaz reçine uygulayın.Her kapsüle bir örnek yerleştirin, ardından kapsülleri taze reçine ile maksimum kapasiteye doldurun. Kapağı kapsülün üzerine koyun ve mühürlemek için hafifçe bastırın. Reçineyi polimerize etmek için kapsülleri 58 santigrat derecede yaklaşık 24 ila 48 saat sertleşene kadar iyileştirin.Jelatin kapsülü LR-beyaz reçineden soyduktan sonra, reçine bloğunu stereo mikroskobun altına yerleştirin. Keskin bir jilet kullanarak, LR-beyaz bloğu numuneye 45 derecelik bir açıyla kırpın. Örneği döndürün ve ilkine 90 derecelik bir açıyla ikinci bir kesim yapın.Piramidin tepe noktasından numunenin ilgi alanının hemen üzerinde bir piramit oluşturmak için aynı desende kesmeye devam edin, ardından kesme yüzeyi örneğe ulaşana kadar ana eksene dik ince dilimleri çıkarmaya başlayın. Hedef örnek ideal olarak yamuk şeklinde kapatılmalıdır. Kesilmiş reçine bloğunu ultra mikrotom içine yerleştirin.Bıçak kenarı ile reçine bloğu arasındaki açıyı ayarlayın. 200 ila 700 nanometre kalınlığında bloktan kesitler kesin. Mikrotomdan örneklenmiş bazı bölümleri dikkatlice kaldırmak için bir tel halka kullanın.Onları cam bir kaydırağa damıtılmış deiyonize su damlasına yerleştirin. Slaydı 50 santigrat derecede sıcak bir tabağa yerleştirerek suyu buharlaştır, ardından bölümlere bir damla leke ekleyin. 30 saniye sonra lekeyi durulayın ve bölümün genel durumunu ve istenen bitki yapısının görünür olduğunu doğrulamak için mikroskop altında slaytı gözlemleyin.Slaydın her kuyusuna bir damla damıtılmış deiyonize su yerleştirerek temiz bir reaksiyon kaydırağı hazırlayın. Her su damlasına bir veya iki örnek bölüm aktarın. Kaydırağı 10 santimetre kare petri kabına yerleştirin, örtün ve 50 santigrat derecede kurumasına izin verin.Reaksiyon slaytları için bir kuluçka odası hazırlamak için, pipet uçları kutusunun altına sönümlenmiş kağıt havlular yerleştirin ve kutuyu alüminyum folyo ile sarın. Slaytları kutudan kuluçka odasına aktarın. Pipet Her kuyuya 50 mikrolitre blokaj çözeltisi.Slaydı 10 dakika kuluçkaya yatırdıktan sonra, engelleme çözeltisini çıkarın, ardından tüm kuyuları pbs ile her seferinde 10 dakika boyunca iki kez yıkayın. El yazmasında açıklandığı gibi birincil antikor çözeltilerini hazırladıktan sonra, kuyuların beş dakika boyunca damıtılmış deiyonize su ile son bir yıkamasını gerçekleştirin. Ana antikor çözeltisini reaksiyon kuyularına pipet, daha sonra engelleme solüsyonlarını kontrol kuyularına pipetle.Kuluçka odasını kapatın. Oda sıcaklığında iki saat bekletin ve sonra dört santigrat derecede gece boyunca soğutun. Blokaj çözeltisinde ikincil antikorun%1'lik bir çözeltisini hazırlayın.Kuyu başına yaklaşık 40 mikrolitreye ihtiyaç duyulacaktır. Çözeltiyi alüminyum folyo ile örtün. Reaksiyonun kuyularını PBS ile iki kez ve her seferinde 10 dakika damıtılmış deiyonize su ile bir kez yıkayın.Kuyularda hiçbir engelleme çözümünün veya birikintisinin kalmadığından emin olun. İkincil antikor çözeltisini tüm kuyulara pipetle. Slaytları oda sıcaklığında üç ila dört saat boyunca karanlıkta kuluçkaya yatırın.Yine, reaksiyonun kuyularını PBS ile iki kez ve bir kez damıtılmış deiyonize suyla yıkayın, ardından her kuyuya bir damla Calcofluor White ekleyin. Yıkamadan, her kuyuya bir damla montaj ortamı ekleyin ve her kuyunun üzerini bir kapakla örtün. Floresan mikroskobu kullanarak reaksiyon kaydırağındaki örnek bölümleri gözlemleyin.Her gözlem için, Calcofluor tarafından boyanmış hücre duvarlarını tespit etmek için bir UV filtresi ve immünokokalizasyonu tespit etmek için bir FITC filtresi kullanın. Sonuçların daha iyi görselleştirilmesi için, her UV filtre görüntüsünü ilgili FITC filtre görüntüsüyle birleştirmek için ImageJ veya benzer bir görüntü analiz programını kullanın. Protokol, belirli epitopların yerelleştirilmesini belirleyerek hücre duvarı bileşiminin karakterizasyonuna olanak tanır.Örneğin, gelişmekte olan Quercus suber anther hücre duvarında 1, 5-arabinan bol miktarda bulunur. Az esterleşmiş homogalacturonans tipik olarak organın mekanik özelliklerini belirten Quercus suber embriyosunun kök ucunda bulunur. Ksylogalacturonans, Quercus suber meşe palamudu olgunlaşmasının son aşamalarında endosperm hücresi gibi dejenere hücrelerde bulunur.AGP'nin JIM13 veya JIM8 tarafından tanınan epitopları, Arabidopsis thaliana'daki mikrogametogenez ile ilgili hücre hatları ve bazal anjiyosperm Trithuria submersasının stigmatik papilla ve mikrobiyal gibi üreme ile ilgili yapılarda bulunur. Bu protokolün uygulanmasındaki yaygın hataların algılanıp tanımlanması genellikle kolaydır. Yıkamalar atlandığında veya reaksiyon kuyularının kurumasına izin verildiğinde, ikincil antikor genellikle bir smear olarak görünecektir.İlişkisiz primer antikor düzgün bir şekilde yıkanmazsa yeşil florokrom agregaları oluşacaktır. Bölümlerin katlanması veya müfrezesi genellikle temiz olmayan slaytların kullanılması veya agresif yıkama nedeniyle zayıf yapışıklıkla ilgilidir. Numune hazırlama da kritik öneme sahiptir.Reçine blokları açıkça görülebilen soluk sarıdan açık kahverengi örneğe sahip çatlaklardan arındırılmalıdır. Verimsiz gömülü numuneler tozlu beyaz lekeler veya alanlar gösterecektir. Numune boyutunu sekiz milimetrenin altında tutmak, fiksatif çözeltinin nüfuz etmesi için gereklidir.Kötü sabitlenmiş numuneler koyu kahverengi veya neredeyse siyah görünecektir. Aşırı sıcaklık, reçinenin çatlayarak numunenin kesitini imkansız hale gelmesine neden olabilir. İmmünolokalizasyon tekniklerinin kullanımı çeşitli araştırma yönleri açar.Hücre duvarının biyokimyasal analizi gibi daha spesifik tekniklerle takip edilebilir veya hatta moleküler bir yaklaşıma geçilebilir. Bu tekniğin sağladığı sonuçlar, basit kimyasal analizle analiz etmesi çok zor olan son derece karmaşık bir yapı olan hücre duvarının bileşimini anlamaya yardımcı olabilir.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

Floresan protein ifadesindeki<em&gt; Branchiostoma lanceolatum</em&gt; Döllenmemiş Oositlerinin içine mRNA Enjeksiyon

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the ...

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

Vasküler Endotelyal Kök Hücrelerin Damar Oluşumunu Görselleştirmek İçin Yeni Bir Göğüs Göğsü Transplantasyon Tekniği

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

Fare İkincil Palin Füzyonunun Canlı Görüntüsü

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Diseksiyon ve mantar vücut immünfloresan boyama ve yetişkin Drosophila melanogaster beynindeki nöronlar Photoreceptor

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Bütün Dağı takas ve Arabidopsis çiçek organ ve Siliques boyama

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

IMMUNO florasan mikrotübüller ve Ex Vivo bağırsak dokusu ve 3D Vitro bağırsak Organoids Centrosomal proteinler etiketleme

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone

Fare Kraniyofacial dokularda ve Undecalcified kemik doku hazırlama ve Immünostasyon

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and ...

Use of Atomic Force Microscopy to Measure Mechanical Properties and Turgor Pressure of Plant Cells and Plant Tissues

Santral hücreleri ve bitki dokularının mekanik özelliklerini ve Turgor basıncını ölçmek için Atomic Force Microkopi kullanımı

We present here the use of atomic force microscopy to indent plant tissues and recover its mechanical properties. Using two different microscopes in ...

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Mikrotübül Sitoiskeletinin Canlı Hücre Görüntülemesi ve Arabidopsis Shoot Apikal Meristem'in Mikromekanik Manipülasyonu

Understanding cell and tissue level regulation of growth and morphogenesis has been at the forefront of biological research for many decades. Advances in ...

Isolation of Endocardial and Coronary Endothelial Cells from the Ventricular Free Wall of the Rat Heart

Endokardiyal ve Koroner Endotel Hücrelerinin Sıçan Kalbinin Ventriküler Serbest Duvarından İzolasyon

It has been shown that endocardial endothelial cells (EECs) and coronary endothelial cells (CECs) differ in origin, development, markers, and functions. ...