Name: using flow cytometry to detect and quantitate altered blood formation in the developing zebrafish
Uploaded: 2021-04-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Flow Cytometry to Detect and Quantitate Altered Blood Formation in the Developing Zebrafish at JoVE.com

تم توفير التمويل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (المعاهد القومية للصحة: R15 DK114732-01 إلى D.L.S.) ، والمؤسسة الوطنية للعلوم (NSF: MRI 1626406 إلى D.L.S.) ، ومن برنامج الشرف في جامعة ولاية كاليفورنيا شيكو (إلى K.F.R. ). يشكر المؤلفان بيتسي تاميتي على إدارة المختبر وكاثي جونز على المساعدة الإدارية.

وافق المجلس الاستشاري للجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) في جامعة ولاية كاليفورنيا، شيكو، على جميع الأساليب المذكورة أدناه.
ملاحظة: ينصح بمعالجة الأجنة مع 1-فينيل 2-ثيورينا (PTU; الجدول 1) في 24 ساعة postfertilization (hpf) لمنع التصبغ الذي يؤثر سلبا على التمييز الفل...

<ol>
	<li>Driever, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+for+mutations+affecting+embryogenesis+in+zebrafish.">A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish.</a> Development. 123, 37-46 (1996).</li><li>Weinstein, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+mutations+in+the+zebrafish.">Hematopoietic mutations in the zebrafish.</a> Development. , 303-309 (1996).</li><li>Ransom, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+zebrafish+mutants+with+defects+in+embryonic+hematopoiesis.">Characterization of zebrafish mutants with defects in embryonic hematopoiesis.</a> Development. 123, 311-319 (1996).</li><li>Amsterdam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large-scale+insertional+mutagenesis+screen+in+zebrafish.">A large-scale insertional mutagenesis screen in zebrafish.</a> Genes &amp; Development. 13, 2713-2724 (1999).</li><li>Gaiano, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+mutagenesis+and+rapid+cloning+of+essential+genes+in+zebrafish.">Insertional mutagenesis and rapid cloning of essential genes in zebrafish.</a> Nature. 383, 829-832 (1996).</li><li>Yeh, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovering+chemical+modifiers+of+oncogene-regulated+hematopoietic+differentiation.">Discovering chemical modifiers of oncogene-regulated hematopoietic differentiation.</a> Nature Chemical Biology. 5, 236-243 (2009).</li><li>Paik, E. J., de Jong, J. L., Pugach, E., Opara, P., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+genetic+screen+in+zebrafish+for+pathways+interacting+with+cdx4+in+primitive+hematopoiesis.">A chemical genetic screen in zebrafish for pathways interacting with cdx4 in primitive hematopoiesis.</a> Zebrafish. 7, 61-68 (2010).</li><li>Ridges, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+screen+identifies+novel+compound+with+selective+toxicity+against+leukemia.">Zebrafish screen identifies novel compound with selective toxicity against leukemia.</a> Blood. 119, 5621-5631 (2012).</li><li>North, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostaglandin+E2+regulates+vertebrate+haematopoietic+stem+cell+homeostasis.">Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis.</a> Nature. 447, 1007-1011 (2007).</li><li>Astuti, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Functional+Bioluminescent+Zebrafish+Screen+for+Enhancing+Hematopoietic+Cell+Homing.">A Functional Bioluminescent Zebrafish Screen for Enhancing Hematopoietic Cell Homing.</a> Stem Cell Reports. 8, 177-190 (2017).</li><li>Stachura, D. L., Traver, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+dissection+of+zebrafish+hematopoiesis.">Cellular dissection of zebrafish hematopoiesis.</a> Methods in Cell Biology. 133, 11-53 (2016).</li><li>Berrun, A. C., Stachura, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+In+Vitro+Assay+to+Quantitate+Hematopoietic+Stem+and+Progenitor+Cells+(HSPCs)+in+Developing+Zebrafish+Embryos.">Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (129), e56836 (2017).</li><li>Westerfield, M., Zon, L. I., Detrich, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Essential Zebrafish Methods: Cell and Developmental Biology. , (2009).</li><li>Drummond, I. A., Davidson, A. J., Detrich, H. W., Westerfield, M., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Kidney+Development.">Zebrafish Kidney Development.</a> The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, Part A. 100, 233-260 (2010).</li><li>Traver, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+and+in+vivo+imaging+of+multilineage+engraftment+in+zebrafish+bloodless+mutants.">Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants.</a> Nature Immunology. 4, 1238-1246 (2003).</li><li>Ganis, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+globin+switching+occurs+in+two+developmental+stages+and+is+controlled+by+the+LCR.">Zebrafish globin switching occurs in two developmental stages and is controlled by the LCR.</a> Developmental Biology. 366, 185-194 (2012).</li><li>Renshaw, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation.">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108, 3976-3978 (2006).</li><li>Lin, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+thrombocyte+development+in+CD41-GFP+transgenic+zebrafish.">Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish.</a> Blood. 106, 3803-3810 (2005).</li><li>Page, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evolutionarily+conserved+program+of+B-cell+development+and+activation+in+zebrafish.">An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish.</a> Blood. 122, e1-e11 (2013).</li><li>Ding, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+High-Throughput+Flow+Cytometry+in+Early+Drug+Discovery:+An+AstraZeneca+Perspective.">Application of High-Throughput Flow Cytometry in Early Drug Discovery: An AstraZeneca Perspective.</a> SLAS Discovery. 23, 719-731 (2018).</li><li>Ding, M., Kaspersson, K., Murray, D., Bardelle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+flow+cytometry+for+drug+discovery:+principles,+applications,+and+case+studies.">High-throughput flow cytometry for drug discovery: principles, applications, and case studies.</a> Drug Discovery Today. 22, 1844-1850 (2017).</li><li>Joslin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Fully+Automated+High-Throughput+Flow+Cytometry+Screening+System+Enabling+Phenotypic+Drug+Discovery.">A Fully Automated High-Throughput Flow Cytometry Screening System Enabling Phenotypic Drug Discovery.</a> SLAS Discovery. 23, 697-707 (2018).</li></ol>

حمار وحشي هي نظام نموذج ممتاز لدراسة الهيماتوبويز الفقارية البدائية والنهائية. على مدى العقود القليلة الماضية، تم تطوير العديد من المقايسات وصقلها، مما يسمح لسمك الحمار الوحشي بأن يصبح نموذجا سريعا واقتصاديا لاختبار الأدوية، وتوليد واختبار المسوخ الوراثية، والسماح بشكل عام للباحثين ب?...

إنتاج الدم (الهيماتوبويز) هو عملية تنموية أساسية تبدأ لأول مرة في الجنين المبكر. تبدأ هذه العملية بتوليد خلايا الدم الحمراء البدائية وال الضامة مباشرة من mesoderm ، وتتحول في وقت لاحق نحو إنتاج الخلايا الجذعية والذرية الدموية (HSPCs). هذه الخلايا الجذعية، التي هي متعددة القدرات، وتوليد جميع أنواع خلايا الدم الناضجة في الكائن الحي. ويمكن تجديد النظام ذاتيا، ويتم تجديده باستمرار من خلال هذه المركبات الهيدروفلورية. في حين أن هذه العملية تبدأ في وقت مبكر من التنمية ، يستمر التهاب الدم لحياة الحيوان ، مما يوفر القدرة على نقل الأكسجين إلى مواقع بعيدة من الجسم ، ووقف النزيف بعد الإصابة ، وحماية الجسم من العدوى. يتم التحكم في تطوير هذا النظام المعقد زمنيا ومكانيا أثناء التطور وأي اضطراب في إنتاج خلايا الدم يمكن أن يكون كارثيا على الكائن الحي ، مما يؤدي إلى فقر الدم والجلطات الدموية واللوكوبينيا وسرطان الدم.
وهناك نموذج شعبية تستخدم للبحوث الدم هو حمار وحشي(دانيو rerio)لأن لديهم نمو الدم مماثلة بالمقارنة مع البشر. في الواقع، يتم الحفاظ على العديد من الجينات والمسارات الجزيئية المستخدمة أثناء الهيماتوبويز طوال تطور الفقاريات، مما يسمح لنا بالتعرف على الجينات البشرية من خلال دراسة سمك الحمار الوحشي. الأهم من ذلك ، تتطور أجنة حمار وحشي خارج الجسم وخلال 7 أيام ولدت أنواع خلايا الدم الأكثر نضجا ، مما يسمح بالتصور المباشر للنظام الدموي في فترة قصيرة من الزمن. كما أن سمك الحمار الوحشي براز للغاية، مما يسمح للباحثين بمراقبة عدد أكبر من العينات في إطار زمني قصير، وهو أمر مهم أيضا لتوليد بيانات قابلة للاستنساخ. يوفر زمن الجيل القصير من سمك الحمار الوحشي والتطور الخارجي سهولة التلاعب والمراقبة أثناء دراسات تكوين الطفرات1و2و3و4و5 وفحص المخدرات6و7و8و9و10. وهذا يسمح للوحة من المركبات العلاجية الواعدة لاضطرابات الدم البشري ليتم اختبارها بسرعة وكفاءة.
الأهم من ذلك، حمار وحشي هي أيضا قابلة وراثيا، ويتم تسلسل الجينوم والشروح. تسمح قابلية التجريب هذه بإجراء تقنيات علم الوراثة العكسية مثل المورفولينو -(MO-) بوساطة الضربة القاضية والاجتثاث الوراثي بوساطة CRISPR. وقد أثبتت حمار وحشي أيضا فائدتها كنموذج لأداء الشاشات الوراثية إلى الأمام; وقد تم اكتشاف العديد من الجينات الأساسية والمسارات المشاركة في تكوين الدم الفقاري بهذه الطريقة. كما تم تطوير العديد من الطرق لمراقبة خلايا الدم في حمار وحشي. في حين أن تقنيات تلطيخ الهسولوجية التقليدية موجودة ، فمن الممكن أيضا إجراء التهجين في الموقع للنصوص الخاصة بالدم. الأهم من ذلك، العديد من خطوط المعدلة وراثيا من الأسماك موجودة أيضا حيث يتم التعبير عن البروتينات الفلورية من قبل المروجين النسب محددة، مما يسمح لوضع العلامات على خلايا الدم محددة مع البروتينات الفلورية11. وهذا يسمح للباحثين بإجراء مراقبة دقيقة لنشأة خلايا الدم وتوسعها وتنظيمها في كائن حي بمرور الوقت.
وعموما، فإن الحفاظ على نظام الهيماتوبويات، ووجود خطوط معدلة وراثيا وتطويرها بسهولة، وسهولة التصور، ووقت الجيل القصير جعل من سمك الحمار الوحشي نموذجا اقتصاديا وسريعا وقابلا للتكيف لنظم الدم. لتحسين مجموعة أدوات التقنيات المتاحة للباحثين حمار وحشي، وضعنا هذا المقايسة لكمية قوية من خلايا الدم في الأجنة. تتضمن الطريقة هضم الحيوانات المعدلة وراثيا وإجراء قياس التدفق الخلوي لخلايا الدم الفلورية. وبهذه الطريقة ، يمكن تحليل خلايا الدم من الحيوانات المتحولة ، وتأثير تعديل MO و CRISPR ، وتأثير الجزيئات الصغيرة كميا بطريقة سريعة وقابلة للاستنساخ. هذه المقايسات هي طرق سهلة الاستخدام واقتصادية لتعداد خلايا الدم ، مما يسمح بفحص جيلها وانتشارها وصيانتها بمرور الوقت.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 ml MCF tube</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mm Polystyrene easygrip Petri dish</td>
			<td>Corning Falcon</td>
			<td>351008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml Polystyrene round bottom tube with cell strainer cap</td>
			<td>Corning Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria Fusion flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiolthreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>646563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (10x) with Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14080-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS 500 mL</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>100-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone PBS (1x)</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>sh30256.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Librease</td>
			<td>Roche Sigma-Aldrich</td>
			<td>5401119001</td>
			<td>dissociation protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Roche Sigma-Aldrich</td>
			<td>11459643001</td>
			<td>dechorionation protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Red Dead Cell Stain</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>S34859</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using flow cytometry to detect and quantitate altered blood formation in the developing zebrafish

ينشأ تنوع أنساب الخلايا التي تضم دما ناضجا في الحيوانات الفقارية من تمايز الخلايا الجذعية والذرية الدموية (HSPCs). وهذه عملية حاسمة تحدث طوال عمر الكائنات الحية، ويمكن أن يكون لاضطراب المسارات الجزيئية التي ينطوي عليها تكوين الأجنة عواقب كارثية على المدى الطويل. لعدة أسباب، أصبح حمار وحشي(دانيو rerio)كائن حي نموذجي لدراسة الدم. تتطور أجنة سمك الحمار الوحشي خارجيا ، وبحلول 7 أيام أنتجت بعد الولادة (dpf) معظم الأنواع الفرعية لخلايا الدم النهائية التي ستستمر طوال حياتها. وقد تم تطوير المقايسات لتقييم عدد الخلايا الدموية، وذلك أساسا باستخدام بقع النسيجية محددة، وتقنيات التهجين في الموقع، ومجهر الحيوانات المعدلة وراثيا التي تستخدم المروجين خلايا الدم محددة يقود التعبير عن البروتينات الفلورية. ومع ذلك، فإن معظم المقايسات تلطيخ وتقنيات التهجين في الموقع لا كمية بدقة عدد خلايا الدم الموجودة؛ يتم تصور الاختلافات الكبيرة فقط في أرقام الخلايا بسهولة. يمكن إجراء استخدام الحيوانات المعدلة وراثيا وتحليل الأفراد الذين يعانون من المجهر الفلوري أو الكونفوجال ، ولكن كمية هذه المقايسات تعتمد إما على العد يدويا أو استخدام برامج التصوير باهظة الثمن ، وكلاهما يمكن أن يخطئ. إن تطوير طرق إضافية لتقييم أعداد خلايا الدم سيكون اقتصاديا وأسرع، بل ويمكن أن يكون آليا لتقييم تأثير التعديل الوراثي بوساطة CRISPR بسرعة، والحد من النسخ بوساطة مورفولينو، وتأثير مركبات الأدوية التي تؤثر على حالات الهيماتوبويز على نطاق واسع. يتم إجراء هذا الفحص الجديد لكمية خلايا الدم عن طريق فصل أجنة حمار وحشي كاملة وتحليل كمية خلايا الدم الموسومة بالفلورسنت الموجودة. وينبغي أن تسمح هذه المقايسات بتجلي المسارات الجزيئية المسؤولة عن توليد خلايا الدم، والتوسع، والتنظيم أثناء تكوين الأجنة، مما سيسمح للباحثين باكتشاف المزيد من العوامل الجديدة التي تم تغييرها أثناء أمراض الدم، وكذلك المسارات الضرورية أثناء تطور الهيماتوبويز الفقارية.

لتعداد خلايا الدم الحمراء في حمار وحشي الجنينية, lcr:تم حقن GFP16 الأجنة في مرحلة خلية واحدة مع برنامج تلفزيوني, 7.0 نانوغرام / nL ism1 MO, أو 7.0 نانوغرام / nL ism1 MO مع 7.0 نانوغرام ism1 مرنا12. في 48 حصان تم هضمها وتخضع لتحليل تدفق قياس الخلايا. بع?...

Watch this Scientific Journal Video about Using Flow Cytometry to Detect and Quantitate Altered Blood Formation in the Developing Zebrafish at JoVE.com

Using Flow Cytometry to Detect and Quantitate Altered Blood Formation in the Developing Zebrafish

هذا المقايسة هي طريقة بسيطة لكمية الخلايا الدموية في تطوير حمار وحشي الجنينية. تخضع خلايا الدم من سمك الحمار الوحشي المفكك لتحليل تدفق قياس الخلايا. وهذا يسمح للكشف عن عيوب الدم في الحيوانات المتحولة وبعد التعديل الوراثي.

استخدام قياس التدفق الخلوي للكشف عن تكوين الدم المعدل وكميته في سمك الحمار الوحشي النامي

The diversity of cell lineages that comprise mature blood in vertebrate animals arise from the differentiation of hematopoietic stem and progenitor cells ...

هذا البروتوكول مهم لأنه يسمح بالضربة القاضية والتعبير عن الجينات في الأسماك النامية ، وكمية تلك الآثار المصب على خلايا الدم. هذا البروتوكول هو سريع وسهل الأداء واقتصادية وسهلة لأتمتة مع الوصول إلى الأجهزة المناسبة. إثبات هذا الإجراء سيكون كريستين رويب، باحثة جامعية في المختبر.ابدأ بنقل ما بين 5 و 200، 48 ساعة بعد الإخصاب الأجنة في طبق بيتري البلاستيك 10 سم. إمالة الطبق حتى يغرق الجنين إلى الحافة السفلية، وإزالة أكبر قدر من المتوسط E3 من الطبق ممكن. ثم أضف 500 ميكرولتر من بروتياز dechorionation إلى الأجنة.بعد خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، قم بقلب جميع الأجنة إلى الحافة السفلية من الطبق مرة أخرى واضغط بلطف على جانب الطبق، مما يسمح للأجنة بفرك الجزء السفلي من الطبق بلطف لإزالة المشيمات الخاصة بها تماما. باستخدام زجاجة ضغط إضافة ما يقرب من 20 ملليلتر من E3 المتوسطة لتمييع البروتيز، والسماح للأجنة لتسوية. ثم decant المتوسطة، وشطف الأجنة ثلاث مرات أخرى مع المتوسطة الطازجة كما أظهرت للتو لإزالة جميع آثار البروتيز.لإعداد الأجنة للتفكك، استخدم ماصة P1000 لنقل خمسة إلى 10 أجنة إلى أنبوب طرد مركزي صغير واحد، 1.5 ملليلتر، ونسيخ وسيط E3 المنقول. ثم أضف ملليلتر واحد من 10 ملليمولار DTT في E3 المتوسطة إلى حمار وحشي الجنينية، ووضع أنبوب الطرد الدقيق في وضع أفقي لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لإزالة طلاء المخاط. فصاحة الأجنة، اغسل الأجنة المعالجة DTT ثلاث مرات مع ملليلتر واحد من DPBS المكمل بالكالسيوم والمغنيسيوم لكل غسل.قبل إضافة 500 ميكرولتر من DPBS المكملة بالكالسيوم والمغنيسيوم، وخمسة ميكرولترات من خمسة ملليغرام لكل ملليلتر، بروتياز التفكك. ثم احتضان العينات في 37 درجة مئوية على شاكر مداري أفقي في 185 ثورة في الدقيقة لمدة 60 دقيقة. تأكد من فحص الأجنة بشكل دوري، حتى لا تفرط في هضمها.عندما يمكن ملاحظة عينة غير متجانسة تماما مع بعض الأنسجة الصلبة الموجودة، تريتورات الأجنة مع ماصة P1000 حتى يتم فصل العينة تماما. لإعداد الخلايا الجنينية حمار وحشي فصل لتدفق قياس الخلايا، ونقل عينة الخلية بأكملها على الخزان العلوي من خمسة ملليلتر البوليسترين جولة أنبوب أسفل، مع غطاء خلية مصفاة 35 ميكرومتر. شطف الغطاء مع أربعة ملليلتر من برنامج تلفزيوني دون الكالسيوم أو المغنيسيوم، بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي.ثم إعادة إنفاق الخلايا في 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني دون الكالسيوم والمغنيسيوم لكل أنبوب. لتحليل التدفق الخلوي للخلايا الجنينية حمار وحشي، دوامة بلطف تعليق الخلية قبل إضافة تخفيف واحد إلى ألف من وصمة عار الخلايا الميتة الحمراء إلى كل أنبوب. في غضون 30 دقيقة من تطبيق وصمة عار الخلية الميتة، وتفريغ خزان النفايات، وملء خزان غمد مع الحل المناسب، وبدء نظام السوائل من تدفق السيتومتر.في برنامج التحليل ، رسم خمس مؤامرات ، وتعيين أول مؤامرة لقياس الأمام مقابل الجانب مبعثر. تعيين مبعثر إلى الأمام إلى خطي، وجانب مبعثر إلى لوغاريتمي. تعيين المخطط الثاني لقياس ارتفاع مبعثر إلى الأمام مقابل عرض مبعثر إلى الأمام، والمؤامرة الثالثة لقياس ارتفاع مبعثر مقابل عرض مبعثر الجانب.تعيين المؤامرة الرابعة لقياس وصمة عار الخلية الميتة الحمراء على محور س، وتشتت الجانب على المحور ص للسماح للتمييز من العيش من الخلايا الميتة. يجب تعيين المؤامرة الخامسة لقياس الفلوروفور المفضل. عند تعيين كافة المؤامرات، قم بتحميل العينة على مقياس الخلايا وقلل معدل التدفق بحيث لا تنفد الخلايا بسرعة.ضبط إعدادات مبعثر إلى الأمام والجانب بحيث يمكن ملاحظة الجزء الأكبر من السكان الخلية بوضوح، ورسم بوابة حول السكان الخلية. تسمية خلايا البوابة هذه. مع مؤامرة نقطة الثانية مسور على الخلايا، بوابة على مبعثر إلى الأمام وفردية مبعثر الجانب لاستبعاد doublets.في المؤامرة الرابعة، وضبط إعدادات بقعة الخلية الميتة الحمراء بحيث يكون هناك عدد السكان سلبية بشكل واضح. رسم بوابة حول هذه الخلايا وتسمية هذه البوابة الخلايا الحية. في المؤامرة الخامسة، بوابة على الخلايا الحية ورسم بوابة حول الخلايا الإيجابية، ثم تشغيل كل عينة جمع ما لا يقل عن 25،000 أحداث الخلايا الحية.عندما يتم تحليل جميع العينات، اتبع إجراء إيقاف التشغيل لإيقاف السوائل، وإعادة ملء خزان الغمد وتفريغ خزان النفايات. بعد تحليل النسبة المئوية لخلايا الدم الحمراء الإيجابية GFP من كل عينة حمار وحشي جنينية ، يمكن حساب متوسط جميع مجموعة التحكم. بشكل عام، يتم تعيين المتوسط كواحد ويتم حساب كافة النسب المئوية من هذه النقطة المرجعية.في هذا التحليل التمثيلي، تقرر أن الحد من نص ISM1 مع مورفولينو محددة، والحد من عدد خلايا الدم الحمراء الإيجابية GFP موجودة في غضون 48 ساعة بعد الأجنة الإخصاب. إنقاذ هذا الانخفاض في مستويات مورفولينو ISM1 مع الحمض النووي الريبي الخارجي، والعودة عدد خلايا الدم الحمراء إلى وضعها الطبيعي. الهضم السليم على العينات أمر بالغ الأهمية.إذا كنت الإفراط في الهضم أو تحت هضم، فإنك لن تحصل على النتائج الصحيحة. إذا كان جهاز الفاكس متوفرا، يمكن للباحثين جمع خلايا الدم عن طريق الفرز لثقافة المختبر، وتسلسل الحمض النووي الريبي والكمية RT-PCR.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

تحليل الزرد اليرقات الهيكل العظمي النزاهة العضلات مع ايفانز الأزرق صبغ

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

تقنية لاستهداف حقن مكروي إلى البلدان النامية<em&gt; القيطم</em&gt; الكلى

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

باستخدام ورقة ضوء مضان المجهري لصورة التنمية الزرد العين

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

تحديد أسلاف ريدثروميلويد وذريتهم في الجنين الماوس عن طريق التدفق الخلوي

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

Isolating and Analyzing Cells of the Pancreas Mesenchyme by Flow Cytometry

عزل وتحليل خلايا البنكرياس اللحمة المتوسطة عن طريق التدفق الخلوي

The pancreas is comprised of epithelial cells that are required for food digestion and blood glucose regulation. Cells of the pancreas microenvironment, ...

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

تشكيل بيليه غضروفي من الخلايا الجذعية المحفزة المستمدة من الدم الحبلية

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells HSPCs in Developing Zebrafish Embryos

تطوير التحليل في المختبر كوانتيتاتي الجذعية المكونة للدم والسلف الخلايا (هسبكس) في تطوير الأجنة الزرد

Hematopoiesis is an essential cellular process in which hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) differentiate into the multitude of different cell ...

Use of Hematopoietic Stem Cell Transplantation to Assess the Origin of Myelodysplastic Syndrome

استخدام زرع الخلايا الجذعية المكونة للدم لتقييم أصل متلازمة ميلوديسبلاستيك

Myelodysplastic syndromes (MDS) are a diverse group of hematopoietic stem cell disorders that are defined by ineffective hematopoiesis, peripheral blood ...

Real-time Live-cell Flow Cytometry to Investigate Calcium Influx, Pore Formation, and Phagocytosis by P2X7 Receptors in Adult Neural Progenitor Cells

في الوقت الحقيقي يعيش خلية تدفق الخلوي للتحقيق في تدفق الكالسيوم وتشكيل المسام والبلعمه من مستقبلات P2X7 في خلايا السلف العصبية الكبار

Live-cell flow cytometry is increasingly used among cell biologists to quantify biological processes in a living cell culture. This protocol describes a ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

التهجين الكامل في الموقع في أجنة حمار وحشي وأنبوب تشكيل اساي في iPSC-ECs لدراسة دور Endoglin في التنمية الوعائية

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...