Name: using flow cytometry to detect and quantitate altered blood formation in the developing zebrafish
Uploaded: 2021-04-29T14:00:00
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资金由国家卫生研究院（NIH：R15 DK114732-01到D.L.S.）、国家科学基金会（NSF：MRI 1626406到D.L.S.）以及加州州立大学奇科分校的荣誉项目（到K.F.R.）提供。作者感谢贝西·塔米埃蒂的实验室管理和凯西·约翰斯的行政援助。

加州州立大学奇科分校机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 顾问委员会批准了以下所有方法。
注：建议用1-苯2-硫酸酯（PTU） 治疗胚胎：表1）在 24 小时受精后 （hpf）， 以防止色素化， 通过流动细胞学对荧光歧视产生负面影响。下面列出的所有程序对于流动细胞测量和荧光激活细胞分类 （FACS） 都是可以接受的。但是，如果一个人的目标是在 FACS 之后培养造血?...

<ol>
	<li>Driever, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+for+mutations+affecting+embryogenesis+in+zebrafish.">A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish.</a> Development. 123, 37-46 (1996).</li><li>Weinstein, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+mutations+in+the+zebrafish.">Hematopoietic mutations in the zebrafish.</a> Development. , 303-309 (1996).</li><li>Ransom, D. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+globin+switching+occurs+in+two+developmental+stages+and+is+controlled+by+the+LCR.">Zebrafish globin switching occurs in two developmental stages and is controlled by the LCR.</a> Developmental Biology. 366, 185-194 (2012).</li><li>Renshaw, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation.">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108, 3976-3978 (2006).</li><li>Lin, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+thrombocyte+development+in+CD41-GFP+transgenic+zebrafish.">Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish.</a> Blood. 106, 3803-3810 (2005).</li><li>Page, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evolutionarily+conserved+program+of+B-cell+development+and+activation+in+zebrafish.">An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish.</a> Blood. 122, e1-e11 (2013).</li><li>Ding, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+High-Throughput+Flow+Cytometry+in+Early+Drug+Discovery:+An+AstraZeneca+Perspective.">Application of High-Throughput Flow Cytometry in Early Drug Discovery: An AstraZeneca Perspective.</a> SLAS Discovery. 23, 719-731 (2018).</li><li>Ding, M., Kaspersson, K., Murray, D., Bardelle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+flow+cytometry+for+drug+discovery:+principles,+applications,+and+case+studies.">High-throughput flow cytometry for drug discovery: principles, applications, and case studies.</a> Drug Discovery Today. 22, 1844-1850 (2017).</li><li>Joslin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Fully+Automated+High-Throughput+Flow+Cytometry+Screening+System+Enabling+Phenotypic+Drug+Discovery.">A Fully Automated High-Throughput Flow Cytometry Screening System Enabling Phenotypic Drug Discovery.</a> SLAS Discovery. 23, 697-707 (2018).</li></ol>

斑马鱼是研究原始和明确的脊椎动物造血的优良模型系统。在过去的几十年里，已经开发和完善了多种检测方法，使斑马鱼成为测试药物、生成和测试基因突变体的快速和经济模型，并总体上使研究人员能够分析造血所必需的分子通路。该协议利用胚胎斑马鱼，它允许快速的数据收集，使用比成年动物更少的物理空间，并使用更少的药物用于大型化学屏幕。它还允许在mRNA过度表达、产生CRISPR突变...

血液生产（造血）是一个基本的发育过程，首先开始于早期胚胎。这个过程从直接从中皮产生原始红血球和巨噬细胞开始，然后转向造血干细胞和祖细胞（HSPCs）的产生。这些干细胞是多能的，在生物体中产生所有成熟的血细胞品种。该系统能够自我更新，通过这些 HSPC 不断补充。虽然这个过程在发育早期就开始了，但造血症继续为动物的生命服务，提供将氧气输送到身体的遥远部位、受伤后止血和保护身体免受感染的能力。这种复杂系统的发展在发育过程中被暂时和空间控制，血细胞生产中的任何扰动都可能对生物体造成灾难性后果，导致贫血、血小板下降、白血病和白血病。
用于造血研究的一种流行的动物模型是斑马鱼（Danio rerio），因为它们与人类有相似的血液发育。事实上，在造血过程中使用的许多基因和分子通路在整个脊椎动物进化过程中都得到了保护，使我们能够通过研究斑马鱼来了解人类的基因。重要的是，斑马鱼胚胎在体外发育，并在7天内产生最成熟的血细胞类型，从而能够在短时间内直接可视化造血系统。斑马鱼也是极其肥肉的，这使得研究人员能够在短时间内观察到更多的样本，这对生成可重复的数据也很重要。斑马鱼的短代时间和外部发展提供了更容易操纵和观察在诱变研究1，2，3，4，5和药物筛选6，7，8，9，10。这使得一组有希望的治疗人类血液疾病的化合物能够快速有效地进行测试。
重要的是，斑马鱼在基因上也是适宜的，基因组是测序和注释的。这种可牵引性允许进行反向遗传学技术，如莫索利诺-（MO-）调解的击倒和CRISPR介质的基因消融。斑马鱼也证明了它们作为执行前瞻性基因筛选的模型的效用：以这种方式发现了许多涉及脊椎动物血液形成的基本基因和途径。斑马鱼还开发了许多观察血细胞的方法。虽然存在传统的病理染色技术，但也可以对血液特异性成绩单进行原位杂交。重要的是，许多转基因鱼类线也存在，荧光蛋白是由血统特定的促进者表达的，允许用荧光蛋白11标记特定的血细胞。这样，研究人员可以随着时间的推移对活体体内的血细胞起源、扩张和调节进行最新观察。
总体而言，造血系统的保存、转基因线的存在和易于开发、易于可视化和短代时间，使斑马鱼成为经济、快速、适应性的造血模式。为了改进斑马鱼研究人员可用的技术工具箱，我们开发了这种检测方法，以有力地量化胚胎中的血细胞数量。该方法包括消化转基因动物和对荧光血球进行流动细胞测量。这样，可以快速、可重复地对突变动物的血细胞、MO和CRISPR改性的影响以及小分子的效果进行定量分析。这些检测是用户友好和经济的方式来列举血细胞，允许检查其生成，增殖和维护随着时间的推移。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 ml MCF tube</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mm Polystyrene easygrip Petri dish</td>
			<td>Corning Falcon</td>
			<td>351008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml Polystyrene round bottom tube with cell strainer cap</td>
			<td>Corning Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria Fusion flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiolthreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>646563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (10x) with Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14080-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS 500 mL</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>100-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone PBS (1x)</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>sh30256.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Librease</td>
			<td>Roche Sigma-Aldrich</td>
			<td>5401119001</td>
			<td>dissociation protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Roche Sigma-Aldrich</td>
			<td>11459643001</td>
			<td>dechorionation protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Red Dead Cell Stain</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>S34859</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using flow cytometry to detect and quantitate altered blood formation in the developing zebrafish

构成脊椎动物成熟血液的细胞血统的多样性源于造血干细胞和祖细胞（HSPCs）的分化。这是一个关键的过程，发生在生物体的整个生命周期，在胚胎生成过程中涉及的分子通路的中断可能会有灾难性的长期后果。由于种种原因，斑马鱼（达尼奥·雷里奥）已成为研究造血症的模型生物体。斑马鱼胚胎在外部发育，到受精后7天（dpf）已经产生了大部分最终血细胞的亚型，这些亚型将持续一生。已开发出评估造血细胞数量的检测方法，主要利用特定的组织学污渍、原位杂交技术和转基因动物的显微镜，利用血细胞特异性促进剂推动荧光蛋白的表达。然而，大多数染色检测和原位杂交技术不能准确量化存在血细胞的数量：只有细胞数量的巨大差异才易于可视化。利用转基因动物和分析个人荧光或共聚焦显微镜可以执行，但这些检测的量化依赖于手动计数或使用昂贵的成像软件，这两者都可能出错。开发评估血细胞数量的其他方法将经济、更快，甚至可以自动化，以快速评估CRISPR介导的基因改造、莫索利诺介导的转录减少以及大规模影响造血症的药物化合物的影响。这种对血细胞进行量化的新型检测方法是分离整个斑马鱼胚胎并分析存在荧光标记的血细胞的数量。这些检测结果应允许阐明在胚胎生成过程中负责血细胞生成、扩张和调节的分子通路，从而使研究人员能够进一步发现血液疾病期间改变的新因素，以及脊椎动物造血过程中必不可少的通路。

为了列举胚胎斑马鱼中的红血球 ，lcr：GFP16 胚胎在单细胞阶段与 PBS、7.0 ng/nL ism1 MO 或 7.0 ng/nL ism1 MO 与 7.0 ng ism1 mRNA12一体注射。在48马力时，他们被消化并接受流动细胞学分析。在分析每个样本中的GFP+ 红血球百分比后（每个样本是5个随机选择的胚胎; 图1A），计算了所有对照组?...

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Using Flow Cytometry to Detect and Quantitate Altered Blood Formation in the Developing Zebrafish

这种检测方法是测量发育胚胎斑马鱼的造血细胞的简单方法。分离斑马鱼的血细胞接受流动细胞学分析。这允许检测突变动物的血液缺陷和基因改造后。

使用流动细胞测量来检测和量化正在发育的斑马鱼中改变的血液形成

The diversity of cell lineages that comprise mature blood in vertebrate animals arise from the differentiation of hematopoietic stem and progenitor cells ...

这个协议意义重大，因为它允许在发育中的鱼类中敲击和过度表达基因，以及这些下游对血细胞的影响的量化。此协议快速、易于执行、经济且易于自动化，可访问适当的仪器。证明这一程序的将是克里斯汀·鲁布，实验室的本科生研究员。首先，在5至200之间，48小时后将受精胚胎转移到10厘米长的塑料培养皿中。倾斜菜，使胚胎下沉到底部边缘，并从菜中去除尽可能多的E3介质。然后在胚胎中加入500微升的脱毛蛋白酶。在室温下5分钟后，将所有胚胎再次倒入盘子的底边缘，轻轻敲击盘子的侧面，让胚胎轻轻地摩擦盘子底部，完全去除它们的胆汁。使用挤压瓶添加约20毫升的E3介质稀释蛋白酶，并让胚胎沉淀。然后去除介质，用新鲜的介质再冲洗胚胎三次，就像刚刚证明的那样去除蛋白酶的所有痕迹。要准备分离胚胎，使用 P1000 移液器将 5 到 10 个胚胎转移到一个 1.5 毫升的微离心管中，并吸气转移的 E3 介质。然后在E3介质中加入一毫升10毫升DTT到胚胎斑马鱼，并在室温下将微中线管置于水平位置30分钟，以去除粘液涂层。对于胚胎分离，用一毫升的DPBS来清洗DTT处理的胚胎三次，每次洗涤都补充钙和镁。在加入500微升的DPBS补充钙和镁，和5微升每毫升5毫克，分离蛋白酶之前。然后在水平轨道摇床上以每分钟185转的速度在37摄氏度下孵化样品，时间为60分钟。一定要定期检查胚胎，这样你就不会过度消化它们了。当一个不完全均匀的样品与一些固体组织存在时，用P1000移液器对胚胎进行三叉，直到样品完全分离。为了准备分离的斑马鱼胚胎细胞进行流动细胞测量，将整个细胞样本转移到一个5毫升聚苯乙烯圆底管的顶部储层，并带有35微米的细胞过滤器盖。用四毫升没有钙或镁的PBS冲洗盖子，并通过离心颗粒细胞。然后在PBS的500微升中恢复细胞，每管不含钙和镁。对于斑马鱼胚胎细胞的流动细胞学分析，在给每个管子添加一千到一千个红死细胞污渍之前，轻轻漩涡细胞悬浮。在应用死细胞污渍的30分钟内，清空废水箱，用适当的溶液填充护套罐，启动流动细胞仪的流体系统。在分析软件中，绘制五个绘图，并设置第一个绘图以测量前方与侧面散射。将向前散射设置为线性，侧面分散到对数。设置第二个图来测量前散射高度与前散射宽度，第三个图测量散射高度与侧散射宽度。设置第四个绘图，以测量 x 轴上的红色死细胞污渍，并在 y 轴上侧散射，以便对死细胞中的活体进行区分。第五个情节应该设置为测量选择的氟。当所有绘图都设置完后，将样品加载到细胞仪上并降低流速，使细胞不会很快耗尽。调整前部和侧面散射设置，以便可以清楚地观察到大部分细胞群，并在细胞群周围绘制一个门。标记此门单元格。随着第二个点图门控在细胞上，门在前进散射和侧面散射单打，以排除双打。在第四个情节中，调整红色死细胞污渍设置，以便有明显的负数。在这些细胞周围画一个门，并标记此门活细胞。在第五个情节中，在活细胞上打开大门，在正细胞周围画一个门，然后运行每个样本，收集至少25，000个活细胞事件。分析所有样品后，按照关闭程序关闭流体，重新填充护套罐并清空废水箱。在分析每个胚胎斑马鱼样本中GFP阳性红血球的百分比后，可以计算所有对照组的平均值。通常，平均值设置为一个百分比，所有百分比都是从此参考点计算的。在这一具有代表性的分析中，确定用特定的变形金刚减少ISM1成绩单，减少受精胚胎后48小时内出现的GFP阳性红血球数量。通过外源性mRNA挽救ISM1变形金刚水平的降低，使红血球数量恢复正常。对样品进行适当的消化至关重要。如果你过度消化或消化不足，你不会得到正确的结果。如果有传真机，研究人员可以通过对体外培养、RNA测序和定量RT-PCR进行分类来收集血细胞。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

斑马鱼幼虫骨骼肌诚信与伊文思蓝分析

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

科研

发育生物学

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

技术目标显微注射到显影<em&gt;爪</em&gt;肾

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

采用轻质板材荧光显微镜到图像斑马鱼眼睛发育

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

通过流式细胞术鉴定小鼠胚胎中的红细胞生成素及其后代

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

Isolating and Analyzing Cells of the Pancreas Mesenchyme by Flow Cytometry

隔离并通过流式细胞仪分析胰腺间充质细胞

The pancreas is comprised of epithelial cells that are required for food digestion and blood glucose regulation. Cells of the pancreas microenvironment, ...

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

脐带血诱导的多能干细胞的软骨形成颗粒形成

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells HSPCs in Developing Zebrafish Embryos

定量造血干和祖细胞 (HSPCs) 在斑马鱼胚胎发育中的体外试验研究

Hematopoiesis is an essential cellular process in which hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) differentiate into the multitude of different cell ...

Use of Hematopoietic Stem Cell Transplantation to Assess the Origin of Myelodysplastic Syndrome

应用造血干细胞移植评估骨髓增生异常综合征的起源

Myelodysplastic syndromes (MDS) are a diverse group of hematopoietic stem cell disorders that are defined by ineffective hematopoiesis, peripheral blood ...

Real-time Live-cell Flow Cytometry to Investigate Calcium Influx, Pore Formation, and Phagocytosis by P2X7 Receptors in Adult Neural Progenitor Cells

P2X7 受体实时活细胞流式细胞仪检测成人神经祖细胞中的钙影响、毛孔形成和吞噬作用

Live-cell flow cytometry is increasingly used among cell biologists to quantify biological processes in a living cell culture. This protocol describes a ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

斑马鱼胚胎全山原位杂交和管状测定在iPSC-ECs中研究恩多林在血管发育中的作用

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...