Name: using flow cytometry to detect and quantitate altered blood formation in the developing zebrafish
Uploaded: 2021-04-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Flow Cytometry to Detect and Quantitate Altered Blood Formation in the Developing Zebrafish at JoVE.com

Finansieringen blev ydet af National Institutes of Health (NIH: R15 DK114732-01 til D.L.S.), National Science Foundation (NSF: MRI 1626406 til D.L.S.), og fra Honor's Program på California State University Chico (til K.F.R.). Forfatterne takker Betsey Tamietti for laboratorieledelse og Kathy Johns for administrativ bistand.

Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) advisory board ved California State University, Chico, godkendte alle nedenstående metoder.
BEMÆRK: Det anbefales at behandle embryoner med 1-phenyl 2-thiourea (PTU; Tabel 1) 24 timer efter udfrugtning (hpf) for at forhindre pigmentering, som påvirker fluorescensdiskriminationen negativt ved strømningscytometik. Alle nedenstående procedurer er acceptable for flowcytometry og fluorescensaktiveret cellesortering (FACS). Me...

<ol>
	<li>Driever, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+for+mutations+affecting+embryogenesis+in+zebrafish.">A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish.</a> Development. 123, 37-46 (1996).</li><li>Weinstein, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+mutations+in+the+zebrafish.">Hematopoietic mutations in the zebrafish.</a> Development. , 303-309 (1996).</li><li>Ransom, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+zebrafish+mutants+with+defects+in+embryonic+hematopoiesis.">Characterization of zebrafish mutants with defects in embryonic hematopoiesis.</a> Development. 123, 311-319 (1996).</li><li>Amsterdam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large-scale+insertional+mutagenesis+screen+in+zebrafish.">A large-scale insertional mutagenesis screen in zebrafish.</a> Genes &amp; Development. 13, 2713-2724 (1999).</li><li>Gaiano, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+mutagenesis+and+rapid+cloning+of+essential+genes+in+zebrafish.">Insertional mutagenesis and rapid cloning of essential genes in zebrafish.</a> Nature. 383, 829-832 (1996).</li><li>Yeh, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovering+chemical+modifiers+of+oncogene-regulated+hematopoietic+differentiation.">Discovering chemical modifiers of oncogene-regulated hematopoietic differentiation.</a> Nature Chemical Biology. 5, 236-243 (2009).</li><li>Paik, E. J., de Jong, J. L., Pugach, E., Opara, P., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+genetic+screen+in+zebrafish+for+pathways+interacting+with+cdx4+in+primitive+hematopoiesis.">A chemical genetic screen in zebrafish for pathways interacting with cdx4 in primitive hematopoiesis.</a> Zebrafish. 7, 61-68 (2010).</li><li>Ridges, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+screen+identifies+novel+compound+with+selective+toxicity+against+leukemia.">Zebrafish screen identifies novel compound with selective toxicity against leukemia.</a> Blood. 119, 5621-5631 (2012).</li><li>North, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostaglandin+E2+regulates+vertebrate+haematopoietic+stem+cell+homeostasis.">Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis.</a> Nature. 447, 1007-1011 (2007).</li><li>Astuti, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Functional+Bioluminescent+Zebrafish+Screen+for+Enhancing+Hematopoietic+Cell+Homing.">A Functional Bioluminescent Zebrafish Screen for Enhancing Hematopoietic Cell Homing.</a> Stem Cell Reports. 8, 177-190 (2017).</li><li>Stachura, D. L., Traver, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+dissection+of+zebrafish+hematopoiesis.">Cellular dissection of zebrafish hematopoiesis.</a> Methods in Cell Biology. 133, 11-53 (2016).</li><li>Berrun, A. C., Stachura, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+In+Vitro+Assay+to+Quantitate+Hematopoietic+Stem+and+Progenitor+Cells+(HSPCs)+in+Developing+Zebrafish+Embryos.">Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (129), e56836 (2017).</li><li>Westerfield, M., Zon, L. I., Detrich, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Essential Zebrafish Methods: Cell and Developmental Biology. , (2009).</li><li>Drummond, I. A., Davidson, A. J., Detrich, H. W., Westerfield, M., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Kidney+Development.">Zebrafish Kidney Development.</a> The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, Part A. 100, 233-260 (2010).</li><li>Traver, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+and+in+vivo+imaging+of+multilineage+engraftment+in+zebrafish+bloodless+mutants.">Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants.</a> Nature Immunology. 4, 1238-1246 (2003).</li><li>Ganis, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+globin+switching+occurs+in+two+developmental+stages+and+is+controlled+by+the+LCR.">Zebrafish globin switching occurs in two developmental stages and is controlled by the LCR.</a> Developmental Biology. 366, 185-194 (2012).</li><li>Renshaw, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation.">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108, 3976-3978 (2006).</li><li>Lin, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+thrombocyte+development+in+CD41-GFP+transgenic+zebrafish.">Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish.</a> Blood. 106, 3803-3810 (2005).</li><li>Page, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evolutionarily+conserved+program+of+B-cell+development+and+activation+in+zebrafish.">An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish.</a> Blood. 122, e1-e11 (2013).</li><li>Ding, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+High-Throughput+Flow+Cytometry+in+Early+Drug+Discovery:+An+AstraZeneca+Perspective.">Application of High-Throughput Flow Cytometry in Early Drug Discovery: An AstraZeneca Perspective.</a> SLAS Discovery. 23, 719-731 (2018).</li><li>Ding, M., Kaspersson, K., Murray, D., Bardelle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+flow+cytometry+for+drug+discovery:+principles,+applications,+and+case+studies.">High-throughput flow cytometry for drug discovery: principles, applications, and case studies.</a> Drug Discovery Today. 22, 1844-1850 (2017).</li><li>Joslin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Fully+Automated+High-Throughput+Flow+Cytometry+Screening+System+Enabling+Phenotypic+Drug+Discovery.">A Fully Automated High-Throughput Flow Cytometry Screening System Enabling Phenotypic Drug Discovery.</a> SLAS Discovery. 23, 697-707 (2018).</li></ol>

Zebrafisk er et fremragende modelsystem til at studere primitiv og endelig hvirveldyr hæmatopoiesis. I løbet af de sidste par årtier er flere analyser blevet udviklet og raffineret, hvilket gør det muligt for zebrafisk at blive en hurtig og økonomisk model til test af lægemidler, generere og teste genetiske mutanter og generelt give forskere mulighed for at analysere molekylære veje, der er afgørende for hæmatopoiesis. Denne protokol anvender embryonale zebrafisk, som giver mulighed for hurtig dataindsamling, br...

Blodproduktion (hæmatopoiesis) er en væsentlig udviklingsproces, der først starter i det tidlige foster. Denne proces begynder med at generere primitive røde blodlegemer og makrofager direkte fra mesoderm, og senere skifter til produktion af hæmatopoietiske stamceller og stamceller (HSC'er). Disse stamceller, som er multipotente, genererer alle sorter af modne blodlegemer i organismen. Systemet er i stand til selvfornyelse og genopfyldes løbende gennem disse HSC'er. Mens denne proces starter tidligt i udviklingen, fortsætter hæmatopoiesis for dyrets liv, hvilket giver evnen til at transportere ilt til fjerne steder i kroppen, stoppe blødning efter skade og beskytte kroppen mod infektion. Udviklingen af dette komplekse system styres tidsmæssigt og rumligt under udvikling, og eventuelle linger i blodcelleproduktionen kan være katastrofale for organismen, hvilket resulterer i anæmi, trombocytopeni, leukæmi og leukæmi.
En populær dyremodel, der bruges til hæmatopoietisk forskning, er zebrafisken (Danio rerio), fordi de har lignende blodudvikling sammenlignet med mennesker. Faktisk bevares mange af de gener og molekylære veje, der bruges under hæmatopoiesis, gennem hvirveldyrudviklingen, så vi kan lære om menneskelige gener ved at studere zebrafisk. Det er vigtigt, zebrafisk embryoner udvikle sig uden for kroppen og inden for 7 dage har genereret mest modne blodlegemer typer, der giver mulighed for direkte visualisering af det hæmatopoietiske system i en kort tid. Zebrafisk er også ekstremt fecund, hvilket gør det muligt for forskere at observere et større antal prøver inden for en kort tidsramme, hvilket også er vigtigt for at generere reproducerbare data. Zebrafiskens korte generationstid og eksterne udvikling giver mulighed for lettere manipulation og observation under mutagenesisstudier1,2,3,4,5 og lægemiddelscreening6,7,8,9,10. Dette gør det muligt hurtigt og effektivt at teste et panel af lovende terapeutiske forbindelser til menneskelige blodsygdomme.
Det er vigtigt, at zebrafisk også er genetisk modtagelige, og genomet er sekventeret og kommenteret. Denne trækkraft gør det muligt at udføre omvendt genetikteknikker som morpholino- (MO-) medieret knockdown og CRISPR-medieret genetisk ablation. Zebrafisk har også bevist deres nytte som en model til at udføre fremad genetiske skærme; mange væsentlige gener og veje, der er involveret i hvirveldyr bloddannelse er blevet opdaget på denne måde. Talrige metoder til observation af blodlegemer er også blevet udviklet i zebrafisk. Mens traditionelle histologiske farvningsteknikker findes, er det også muligt at udføre in situ-hybridisering for blodspecifikke udskrifter. Det er vigtigt, at der også findes talrige transgene fiskelinjer, hvorved fluorescerende proteiner udtrykkes af afstamningsspecifikke initiativtagere, hvilket gør det muligt at mærke specifikke blodlegemer med fluorescerende proteiner11. Dette gør det muligt for forskere at udføre up-to-the-minute observation af blodcellegenese, ekspansion og regulering i en levende organisme over tid.
Samlet set har bevarelse af det hæmatopoietiske system, tilstedeværelsen og den nemme udvikling af transgene linjer, nem visualisering og kort generationstid gjort zebrafisken til en økonomisk, hurtig og tilpasningsbar model af hæmatopoiesis. For at forbedre værktøjskassen af teknikker til rådighed for zebrafisk forskere, udviklede vi denne analyse til robust at kvantificere antallet af blodlegemer i embryoner. Metoden indebærer fordøje transgene dyr og udfører flow cytometry for fluorescerende blodlegemer. På denne måde kan blodceller fra mutante dyr, effekten af MO og CRISPR modifikation, og effekten af små molekyler kvantitativt analyseres på en hurtig og reproducerbar måde. Disse assays er brugervenlige og økonomiske måder at opregne blodlegemer, så undersøgelse af deres generation, spredning og vedligeholdelse over tid.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 ml MCF tube</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mm Polystyrene easygrip Petri dish</td>
			<td>Corning Falcon</td>
			<td>351008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml Polystyrene round bottom tube with cell strainer cap</td>
			<td>Corning Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria Fusion flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiolthreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>646563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (10x) with Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14080-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS 500 mL</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>100-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone PBS (1x)</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>sh30256.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Librease</td>
			<td>Roche Sigma-Aldrich</td>
			<td>5401119001</td>
			<td>dissociation protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Roche Sigma-Aldrich</td>
			<td>11459643001</td>
			<td>dechorionation protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Red Dead Cell Stain</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>S34859</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using flow cytometry to detect and quantitate altered blood formation in the developing zebrafish

Mangfoldigheden af celleafstamler, der omfatter modent blod hos hvirveldyr, skyldes differentieringen af hæmatopoietiske stamceller og stamceller (HSC'er). Dette er en kritisk proces, der opstår i hele organismernes levetid, og forstyrrelse af de molekylære veje, der er involveret under embryogenese, kan have katastrofale langsigtede konsekvenser. Af en lang række årsager er zebrafisk (Danio rerio) blevet en modelorganisme til at studere hæmatopoiesis. Zebrafisk embryoner udvikle sig eksternt, og ved 7 dage efterfertilisering (dpf) har produceret de fleste af de undertyper af endelige blodlegemer, der vil vare ved i deres levetid. Der er udviklet assays til vurdering af antallet af hæmatopoietiske celler, hovedsagelig ved hjælp af specifikke histologiske pletter, in situ-hybridiseringsteknikker og mikroskopi af transgene dyr, der bruger blodcellespecifikke promotorer, der driver ekspressionen af fluorescerende proteiner. Men de fleste farvning assays og in situ hybridisering teknikker ikke præcist kvantificere antallet af blodlegemer til stede; Kun store forskelle i cellenumre kan let visualiseres. Brug af transgene dyr og analyse af personer med fluorescerende eller konfokal mikroskopi kan udføres, men kvantantitationen af disse assays afhænger af enten at tælle manuelt eller bruge dyre billedbehandlingssoftware, som begge kan begå fejl. Udvikling af yderligere metoder til vurdering af blodcellenumre ville være økonomisk, hurtigere og kunne endda automatiseres til hurtigt at vurdere effekten af CRISPR-medieret genetisk modifikation, morpholino-medieret transskriptionsreduktion og effekten af lægemiddelforbindelser, der påvirker hæmatopoiesis i stor skala. Denne nye analyse for at kvantificere blodlegemer udføres ved at adskille hele zebrafiskembryoner og analysere mængden af fluorescerende mærkede blodlegemer til stede. Disse assays bør give mulighed for belysning af molekylære veje, der er ansvarlige for blodcellegenerering, ekspansion og regulering under embryogenese, hvilket vil gøre det muligt for forskere yderligere at opdage nye faktorer ændret under blodsygdomme samt veje, der er afgørende under udviklingen af hvirveldyr hæmatopoiesis.

For at opregne røde blodlegemer i embryonale zebrafisk blev derinjiceret16 embryoner i encellet fase med PBS, 7,0 ng/nL ism1 MO eller 7,0 ng/nL ism1 MO med 7,0 ng ism1 mRNA12. Ved 48 hkf blev de fordøjet og udsat for flowcytometrianalyse. Efter at have analyseret procentdelen af GFP+ røde blodlegemer fra hver prøve (hver prøve er 5 tilfældigt udvalgte embryoner; Figur ...

Watch this Scientific Journal Video about Using Flow Cytometry to Detect and Quantitate Altered Blood Formation in the Developing Zebrafish at JoVE.com

Using Flow Cytometry to Detect and Quantitate Altered Blood Formation in the Developing Zebrafish

Denne analyse er en simpel metode til at kvantificere hæmatopoietiske celler i udviklingen af embryonale zebrafisk. Blodlegemer fra dissociated zebrafisk udsættes for flow cytometri analyse. Dette gør det muligt at opdage bloddefekter hos mutante dyr og efter genetisk modifikation.

Brug Af Flow Cytometry til at opdage og kvantificere ændret bloddannelse i den udviklende zebrafisk

The diversity of cell lineages that comprise mature blood in vertebrate animals arise from the differentiation of hematopoietic stem and progenitor cells ...

Denne protokol er betydelig, fordi den tillader knockdown og over ekspression af gener i en fisk under udvikling og kvantantitationen af disse downstream-virkninger på blodlegemer. Denne protokol er hurtig, nem at udføre, økonomisk og nem at automatisere med adgang til den korrekte instrumentering. Demonstration af denne procedure vil blive Kristen Rueb, en bachelor forsker i laboratoriet.Begynd med at overføre mellem fem og 200, 48 timer efter befrugtning embryoner i en plastik 10 centimeter Petri parabol. Vip skålen, så embryoet synker til den nederste kant, og fjern så meget E3 medium fra skålen som muligt. Derefter tilsættes 500 mikroliter af dechorionation protease til embryonerne.Efter fem minutter ved stuetemperatur skal du tippe alle embryonerne til pladens nederste kant igen og forsigtigt trykke på siden af skålen, så embryonerne forsigtigt gnider mod bunden af pladen for helt at fjerne deres chorions. Ved hjælp af en klemmeflaske tilsættes ca. 20 milliliter E3-medium for at fortynde proteasen og lade embryonerne slå sig ned. Derefter dekanteres mediet, og skyl embryonerne tre gange mere med frisk medium, som det netop er påvist for at fjerne alle spor af proteasen.For at forberede embryonerne til dissociation skal du bruge en P1000-pipette til at overføre fem til 10 embryoner til et, 1,5 milliliter mikrocentrifugerør og indsug det overførte E3-medium. Derefter tilsættes en milliliter på 10 millimolar DTT i E3 medium til den embryonale zebrafisk, og læg mikrocentrifugerøret i vandret position i 30 minutter ved stuetemperatur for at fjerne slimbelægningen. Til dissociation af embryoner vaskes de DTT-behandlede embryoner tre gange med en milliliter DPBS suppleret med calcium og magnesium pr. vask.Før der tilsættes 500 mikroliter DPBS suppleret med calcium og magnesium, og fem mikroliter på fem milligram per milliliter, dissociation protease. Derefter inkuberes prøverne ved 37 grader Celsius på en vandret orbital shaker ved 185 omdrejninger i minuttet i 60 minutter. Sørg for med jævne mellemrum at kontrollere embryonerne, så du ikke fordøjer dem.Når der kan observeres en ikke helt homogen prøve med noget fast væv til stede, triturat embryonerne med en P1000 pipette, indtil prøven er helt adskilt. For at forberede de dissociated zebrafish embryonale celler til flow cytometry, overføre hele celleprøven på det øverste reservoir af en fem milliliter polystyren runde bundrør, med en 35 mikrometer celle si hætte. Skyl hætten med fire milliliter PBS uden calcium eller magnesium, og pellet cellerne ved centrifugering.Derefter genbruges cellerne i 500 mikroliter af PBS uden calcium og magnesium per rør. For flow cytometrisk analyse af zebrafisk embryonale celler, forsigtigt vortex cellen suspensioner, før du tilføjer en en-til-en tusind fortynding af røde døde celle pletten til hvert rør. Inden for 30 minutter efter påføring af den døde celleplet, tøm affaldstanken, fyld kappetanken med den relevante løsning, og start flowcytometerets fluidiske system.I analysesoftwaren skal du tegne fem plots og indstille det første plot til at måle frem mod side scatter. Indstil det forreste punkt til lineært, og sidespredningen til logaritmisk. Indstil den anden afbildning til at måle spredningshøjden fremad i forhold til den forreste spredningsbredde, og den tredje afbildning, der måler punkthøjden i forhold til sidespredningsbredden.Indstil det fjerde plot til at måle den røde døde celleplet på x-aksen, og side scatter på y-aksen for at tillade forskelsbehandling af levende fra døde celler. Det femte område bør indstilles til at måle den foretrukne fluorophore. Når alle observationsområderne er indstillet, skal prøven indlæses på cytometeret og reducere strømningshastigheden, så cellerne ikke løber ud for hurtigt.Juster indstillingerne for frem- og sidespredning, så hovedparten af cellepopulationen tydeligt kan observeres, og tegn en port omkring cellepopulationen. Mærk portcellerne. Med den anden prik plot gated på cellerne, gate på fremad scatter og side scatter singlets at udelukke doublets.I det fjerde plot skal du justere indstillingerne for rød død celleplet, så der er en klart negativ population. Tegn en port omkring disse celler og mærke denne port levende celler. I det femte plot, gate på de levende celler og tegne en port omkring de positive celler, derefter køre hver prøve indsamle mindst 25.000 levende celle begivenheder.Når alle prøverne er blevet analyseret, skal du følge nedlukningsproceduren for at slukke for fluidics, genopfylde kappetanken og tømme affaldstanken. Efter at have analyseret procentdelen af GFP positive røde blodlegemer fra hver embryonale zebrafiskprøve, kan gennemsnittet af hele kontrolgruppen beregnes. Gennemsnittet angives typisk som én, og alle procenter beregnes ud fra dette referencepunkt.I denne repræsentative analyse blev det fastslået, at reducere ISM1 udskrift med en bestemt morpholino, reducere antallet af GFP positive røde blodlegemer til stede inden for 48 timer efter befrugtning embryoner. Hvis du redder denne reduktion i ISM1-morfolinoniveauer med eksogen mRNA, returneres antallet af røde blodlegemer til det normale. Korrekt fordøjelse på prøverne er kritisk.Hvis du over-fordøje eller under-fordøje, vil du ikke få de rigtige resultater. Hvis en faxmaskine er tilgængelig, kan forskere indsamle blodcellerne ved at sortere for in vitro kultur, RNA sekventering og kvantitative RT-PCR.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse af zebrafisk Larver Skeletmuskel Integritet med Evans blå farvestof

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Teknik Target Mikroinjektion til udviklingslandene<em&gt; Xenopus</em&gt; Nyre

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Brug Light Sheet Fluorescens mikroskopi til billede zebrafisk Eye Development

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Identifikation af erythromyeloidprogenitorer og deres afkom i musembryoen ved flowcytometri

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

Isolating and Analyzing Cells of the Pancreas Mesenchyme by Flow Cytometry

Isolering og analysere celler i bugspytkirtlen mesenchym ved flowcytometri

The pancreas is comprised of epithelial cells that are required for food digestion and blood glucose regulation. Cells of the pancreas microenvironment, ...

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Kondrogen pelletsdannelse fra ledningsblod-afledte inducerede pluripotente stamceller

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells HSPCs in Developing Zebrafish Embryos

Udvikling af et In Vitro Assay at kvantificere hæmatopoietisk stilk og stamfader celler (HSPCs) i at udvikle zebrafisk embryoner

Hematopoiesis is an essential cellular process in which hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) differentiate into the multitude of different cell ...

Use of Hematopoietic Stem Cell Transplantation to Assess the Origin of Myelodysplastic Syndrome

Brug af hæmatopoietisk stamcelletransplantation at vurdere oprindelsen af myelodysplastisk syndrom

Myelodysplastic syndromes (MDS) are a diverse group of hematopoietic stem cell disorders that are defined by ineffective hematopoiesis, peripheral blood ...

Real-time Live-cell Flow Cytometry to Investigate Calcium Influx, Pore Formation, and Phagocytosis by P2X7 Receptors in Adult Neural Progenitor Cells

Realtids Live-celle flowcytometri at undersøge Calcium tilstrømning, Pore dannelse og fagocytose af P2X7 receptorer i voksne neurale stamceller

Live-cell flow cytometry is increasingly used among cell biologists to quantify biological processes in a living cell culture. This protocol describes a ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Whole-Mount In Situ Hybridization i Zebrafish Embryoner og Tube Formation Assay i iPSC-ECs at studere den rolle, Endoglin i vaskulær udvikling

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...