Name: using flow cytometry to detect and quantitate altered blood formation in the developing zebrafish
Uploaded: 2021-04-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Flow Cytometry to Detect and Quantitate Altered Blood Formation in the Developing Zebrafish at JoVE.com

De financiering werd verstrekt door de National Institutes of Health (NIH: R15 DK114732-01 aan D.L.S.), de National Science Foundation (NSF: MRI 1626406 tot D.L.S.), en van het Honor's Program aan california state university Chico (naar K.F.R.). De auteurs bedanken Betsey Tamietti voor laboratoriumbeheer en Kathy Johns voor administratieve hulp.

De Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) adviesraad van de California State University, Chico, keurde alle hieronder beschreven methoden goed.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om embryo's te behandelen met 1-fenyl 2-thiourea (PTU; Tabel 1) na 24 uur postfertilisatie (hpf) om pigmentatie te voorkomen die een negatieve invloed heeft op fluorescentiediscriminatie door flowcytometrie. Alle onderstaande procedures zijn aanvaardbaar voor flowcytometrie en fluorescentie-...

<ol>
	<li>Driever, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+for+mutations+affecting+embryogenesis+in+zebrafish.">A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish.</a> Development. 123, 37-46 (1996).</li><li>Weinstein, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+mutations+in+the+zebrafish.">Hematopoietic mutations in the zebrafish.</a> Development. , 303-309 (1996).</li><li>Ransom, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+zebrafish+mutants+with+defects+in+embryonic+hematopoiesis.">Characterization of zebrafish mutants with defects in embryonic hematopoiesis.</a> Development. 123, 311-319 (1996).</li><li>Amsterdam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large-scale+insertional+mutagenesis+screen+in+zebrafish.">A large-scale insertional mutagenesis screen in zebrafish.</a> Genes &amp; Development. 13, 2713-2724 (1999).</li><li>Gaiano, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+mutagenesis+and+rapid+cloning+of+essential+genes+in+zebrafish.">Insertional mutagenesis and rapid cloning of essential genes in zebrafish.</a> Nature. 383, 829-832 (1996).</li><li>Yeh, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovering+chemical+modifiers+of+oncogene-regulated+hematopoietic+differentiation.">Discovering chemical modifiers of oncogene-regulated hematopoietic differentiation.</a> Nature Chemical Biology. 5, 236-243 (2009).</li><li>Paik, E. J., de Jong, J. L., Pugach, E., Opara, P., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+genetic+screen+in+zebrafish+for+pathways+interacting+with+cdx4+in+primitive+hematopoiesis.">A chemical genetic screen in zebrafish for pathways interacting with cdx4 in primitive hematopoiesis.</a> Zebrafish. 7, 61-68 (2010).</li><li>Ridges, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+screen+identifies+novel+compound+with+selective+toxicity+against+leukemia.">Zebrafish screen identifies novel compound with selective toxicity against leukemia.</a> Blood. 119, 5621-5631 (2012).</li><li>North, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostaglandin+E2+regulates+vertebrate+haematopoietic+stem+cell+homeostasis.">Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis.</a> Nature. 447, 1007-1011 (2007).</li><li>Astuti, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Functional+Bioluminescent+Zebrafish+Screen+for+Enhancing+Hematopoietic+Cell+Homing.">A Functional Bioluminescent Zebrafish Screen for Enhancing Hematopoietic Cell Homing.</a> Stem Cell Reports. 8, 177-190 (2017).</li><li>Stachura, D. L., Traver, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+dissection+of+zebrafish+hematopoiesis.">Cellular dissection of zebrafish hematopoiesis.</a> Methods in Cell Biology. 133, 11-53 (2016).</li><li>Berrun, A. C., Stachura, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+In+Vitro+Assay+to+Quantitate+Hematopoietic+Stem+and+Progenitor+Cells+(HSPCs)+in+Developing+Zebrafish+Embryos.">Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (129), e56836 (2017).</li><li>Westerfield, M., Zon, L. I., Detrich, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Essential Zebrafish Methods: Cell and Developmental Biology. , (2009).</li><li>Drummond, I. A., Davidson, A. J., Detrich, H. W., Westerfield, M., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Kidney+Development.">Zebrafish Kidney Development.</a> The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, Part A. 100, 233-260 (2010).</li><li>Traver, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+and+in+vivo+imaging+of+multilineage+engraftment+in+zebrafish+bloodless+mutants.">Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants.</a> Nature Immunology. 4, 1238-1246 (2003).</li><li>Ganis, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+globin+switching+occurs+in+two+developmental+stages+and+is+controlled+by+the+LCR.">Zebrafish globin switching occurs in two developmental stages and is controlled by the LCR.</a> Developmental Biology. 366, 185-194 (2012).</li><li>Renshaw, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation.">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108, 3976-3978 (2006).</li><li>Lin, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+thrombocyte+development+in+CD41-GFP+transgenic+zebrafish.">Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish.</a> Blood. 106, 3803-3810 (2005).</li><li>Page, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evolutionarily+conserved+program+of+B-cell+development+and+activation+in+zebrafish.">An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish.</a> Blood. 122, e1-e11 (2013).</li><li>Ding, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+High-Throughput+Flow+Cytometry+in+Early+Drug+Discovery:+An+AstraZeneca+Perspective.">Application of High-Throughput Flow Cytometry in Early Drug Discovery: An AstraZeneca Perspective.</a> SLAS Discovery. 23, 719-731 (2018).</li><li>Ding, M., Kaspersson, K., Murray, D., Bardelle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+flow+cytometry+for+drug+discovery:+principles,+applications,+and+case+studies.">High-throughput flow cytometry for drug discovery: principles, applications, and case studies.</a> Drug Discovery Today. 22, 1844-1850 (2017).</li><li>Joslin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Fully+Automated+High-Throughput+Flow+Cytometry+Screening+System+Enabling+Phenotypic+Drug+Discovery.">A Fully Automated High-Throughput Flow Cytometry Screening System Enabling Phenotypic Drug Discovery.</a> SLAS Discovery. 23, 697-707 (2018).</li></ol>

Zebravissen zijn een uitstekend modelsysteem voor het bestuderen van primitieve en definitieve gewervelde hematopoiese. In de afgelopen decennia zijn meerdere tests ontwikkeld en verfijnd, waardoor zebravissen een snel en economisch model kunnen worden voor het testen van medicijnen, het genereren en testen van genetische mutanten, en over het algemeen kunnen onderzoekers moleculaire paden analyseren die essentieel zijn voor hematopoiese. Dit protocol maakt gebruik van embryonale zebravissen die snelle gegevensverzamelin...

Bloedproductie (hematopoiese) is een essentieel ontwikkelingsproces dat voor het eerst begint in het vroege embryo. Dit proces begint met het genereren van primitieve rode bloedcellen en macrofagen rechtstreeks van mesoderm, en verschuift later naar de productie van hematopoëtische stam- en voorlopercellen (HSPCs). Deze stamcellen, die multipotent zijn, genereren alle variëteiten van volwassen bloedcellen in het organisme. In staat tot zelfvernieuwing wordt het systeem voortdurend aangevuld via deze HSPCs. Hoewel dit proces vroeg in de ontwikkeling begint, gaat hematopoiese door voor het leven van het dier, waardoor zuurstof naar verre plaatsen van het lichaam kan worden getransporteerd, bloedingen na letsel kunnen worden gestopt en het lichaam tegen infectie kan worden beschermd. De ontwikkeling van dit complexe systeem wordt tijdelijk en ruimtelijk gecontroleerd tijdens de ontwikkeling en eventuele verstoringen in de bloedcelproductie kunnen catastrofaal zijn voor het organisme, wat resulteert in bloedarmoede, trombocytopenie, leukopenie en leukemie.
Een populair diermodel dat wordt gebruikt voor hematopoëtisch onderzoek is de zebravis (Danio rerio) omdat ze een vergelijkbare bloedontwikkeling hebben in vergelijking met mensen. In feite worden veel van de genen en moleculaire paden die tijdens hematopoiese worden gebruikt, bewaard tijdens de evolutie van gewervelde dieren, waardoor we meer te weten kunnen komen over menselijke genen door zebravissen te bestuderen. Belangrijk is dat zebravisembryo's zich buiten het lichaam ontwikkelen en binnen 7 dagen de meeste volwassen bloedceltypen hebben gegenereerd, waardoor het hematopoëtische systeem in korte tijd direct kan worden gevist. Zebravissen zijn ook extreem vruchtbaar, waardoor onderzoekers in korte tijd een groter aantal monsters kunnen observeren, wat ook belangrijk is voor het genereren van reproduceerbare gegevens. De korte generatietijd en externe ontwikkeling van de zebravis zorgt voor eenvoudigere manipulatie en observatie tijdens mutagenesestudies1,2,3,4,5 en drugsscreening6,7,8,9,10. Hierdoor kan een panel van veelbelovende therapeutische verbindingen voor menselijke bloedaandoeningen snel en efficiënt worden getest.
Belangrijk is dat zebravissen ook genetisch vatbaar zijn en dat het genoom wordt gesequenced en geannoteerd. Deze tractabiliteit maakt het mogelijk om omgekeerde genetische technieken zoals morfolino- (MO-) gemedieerde knockdown en CRISPR-gemedieerde genetische ablatie uit te voeren. Zebravissen hebben ook hun nut bewezen als model om voorwaartse genetische schermen uit te voeren; veel essentiële genen en paden die betrokken zijn bij gewervelde bloedvorming zijn op deze manier ontdekt. Talrijke methoden voor het observeren van bloedcellen zijn ook ontwikkeld bij zebravissen. Hoewel er traditionele histologische kleuringstechnieken bestaan, is het ook mogelijk om in situ hybridisatie uit te voeren voor bloedspecifieke transcripties. Belangrijk is dat er ook tal van transgene vislijnen bestaan waarbij fluorescerende eiwitten worden uitgedrukt door afstammingsspecifieke promotors, waardoor de etikettering van specifieke bloedcellen met fluorescerende eiwitten11mogelijk is. Dit stelt onderzoekers in staat om up-to-the-minute observatie van het ontstaan, de expansie en de regulatie van bloedcellen in een levend organisme in de loop van de tijd uit te voeren.
Over het algemeen heeft het behoud van het hematopoëtische systeem, de aanwezigheid en gemakkelijke ontwikkeling van transgene lijnen, eenvoudige visualisatie en korte generatietijd de zebravis een economisch, snel en aanpasbaar model van hematopoiese gemaakt. Om de toolbox met technieken voor zebravisonderzoekers te verbeteren, ontwikkelden we deze test om het aantal bloedcellen in embryo's robuust te kwantificeren. De methode omvat het verteren van transgene dieren en het uitvoeren van flowcytometrie voor fluorescerende bloedcellen. Op deze manier kunnen bloedcellen van gemuteerde dieren, het effect van MO- en CRISPR-modificatie en het effect van kleine moleculen op een snelle en reproduceerbare manier kwantitatief worden geanalyseerd. Deze onderzoeken zijn gebruiksvriendelijke en economische manieren om bloedcellen op te sommen, waardoor onderzoek van hun generatie, proliferatie en onderhoud in de loop van de tijd mogelijk is.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 ml MCF tube</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mm Polystyrene easygrip Petri dish</td>
			<td>Corning Falcon</td>
			<td>351008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml Polystyrene round bottom tube with cell strainer cap</td>
			<td>Corning Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria Fusion flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiolthreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>646563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (10x) with Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14080-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS 500 mL</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>100-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone PBS (1x)</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>sh30256.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Librease</td>
			<td>Roche Sigma-Aldrich</td>
			<td>5401119001</td>
			<td>dissociation protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Roche Sigma-Aldrich</td>
			<td>11459643001</td>
			<td>dechorionation protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Red Dead Cell Stain</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>S34859</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using flow cytometry to detect and quantitate altered blood formation in the developing zebrafish

De diversiteit van cellijnen die volwassen bloed in gewervelde dieren omvatten, komt voort uit de differentiatie van hematopoëtische stam- en voorlopercellen (HSPCs). Dit is een kritisch proces dat optreedt gedurende de hele levensduur van organismen, en verstoring van de moleculaire paden die betrokken zijn bij embryogenese kan catastrofale gevolgen op lange termijn hebben. Om een veelheid van redenen is zebravis (Danio rerio) een modelorganisme geworden om hematopoiese te bestuderen. Zebravisembryo's ontwikkelen zich extern en hebben na 7 dagen postfertilisatie (dpf) de meeste subtypes van definitieve bloedcellen geproduceerd die hun leven lang zullen aanhouden. Er zijn testen ontwikkeld om het aantal hematopoëtische cellen te beoordelen, voornamelijk met behulp van specifieke histologische vlekken, in situ hybridisatietechnieken en microscopie van transgene dieren die bloedcelspecifieke promotors gebruiken die de expressie van fluorescerende eiwitten stimuleren. De meeste kleuringstesten en in situ hybridisatietechnieken kwantificeren echter niet nauwkeurig het aantal aanwezige bloedcellen; alleen grote verschillen in celnummers zijn gemakkelijk te visualiseren. Het gebruik van transgene dieren en het analyseren van individuen met fluorescerende of confocale microscopie kan worden uitgevoerd, maar de kwantificering van deze testen is afhankelijk van handmatig tellen of het gebruik van dure beeldvormingssoftware, die beide fouten kunnen maken. De ontwikkeling van aanvullende methoden om het aantal bloedcellen te beoordelen zou economisch, sneller en zelfs geautomatiseerd zijn om snel het effect van CRISPR-gemedieerde genetische modificatie, morfolino-gemedieerde transcriptiereductie en het effect van medicijnverbindingen die hematopoiese op grote schaal beïnvloeden, snel te beoordelen. Deze nieuwe test om bloedcellen te kwantificeren wordt uitgevoerd door hele zebravisembryo's te dissocieren en de hoeveelheid fluorescerend gelabelde bloedcellen te analyseren. Deze assays moeten het mogelijk maken om moleculaire routes op te helderen die verantwoordelijk zijn voor de vorming, uitbreiding en regulatie van bloedcellen tijdens embryogenese, waardoor onderzoekers nieuwe factoren kunnen ontdekken die zijn veranderd tijdens bloedziekten, evenals paden die essentieel zijn tijdens de evolutie van gewervelde hematopoiese.

Om rode bloedcellen in embryonale zebravissen op te sommen, werden lcr:GFP16 embryo's geïnjecteerd in het eencellige stadium met PBS, 7,0 ng/nL ism1 MO, of 7,0 ng/nL ism1 MO met 7,0 ng ism1 mRNA12. Bij 48 hpf werden ze verteerd en onderworpen aan flow cytometrie analyse. Na analyse van het percentage GFP+ rode bloedcellen uit elk monster (elk monster bestaat uit 5 willekeurig geselecteerde embr...

Watch this Scientific Journal Video about Using Flow Cytometry to Detect and Quantitate Altered Blood Formation in the Developing Zebrafish at JoVE.com

Using Flow Cytometry to Detect and Quantitate Altered Blood Formation in the Developing Zebrafish

Deze test is een eenvoudige methode om hematopoëtische cellen te kwantificeren bij de ontwikkeling van embryonale zebravissen. Bloedcellen van gedissocieerde zebravissen worden onderworpen aan flow cytometrie analyse. Dit maakt het mogelijk om bloeddefecten bij gemuteerde dieren en na genetische modificatie te detecteren.

Flowcytometrie gebruiken om veranderde bloedvorming in de zich ontwikkelende zebravis te detecteren en te kwantificeren

The diversity of cell lineages that comprise mature blood in vertebrate animals arise from the differentiation of hematopoietic stem and progenitor cells ...

Dit protocol is belangrijk omdat het de knockdown en overexpressie van genen in een zich ontwikkelende vis mogelijk maakt, en de kwantificering van die downstream-effecten op bloedcellen. Dit protocol is snel, eenvoudig uit te voeren, economisch en eenvoudig te automatiseren met toegang tot de juiste instrumentatie. Kristen Rueb, een niet-gegradueerde onderzoeker in het laboratorium, demonstreert deze procedure.Begin met het overbrengen van tussen de vijf en 200, 48 uur na de bevruchting embryo's in een plastic petrischaal van 10 centimeter. Kantel de schaal zodat het embryo naar de onderrand zakt en verwijder zoveel mogelijk E3-medium uit de schaal. Voeg vervolgens 500 microliter dechorionatie protease toe aan de embryo's.Na vijf minuten bij kamertemperatuur, kantel alle embryo's opnieuw naar de onderkant van de plaat en tik voorzichtig op de zijkant van de schaal, zodat de embryo's zachtjes tegen de bodem van de plaat kunnen wrijven om hun koraal volledig te verwijderen. Voeg met behulp van een knijpfles ongeveer 20 milliliter E3-medium toe om het protease te verdunnen en de embryo's te laten bezinken. Decanteer vervolgens het medium en spoel de embryo's nog drie keer met vers medium, zoals zojuist is aangetoond om alle sporen van het protease te verwijderen.Om de embryo's voor te bereiden op dissociatie, gebruikt u een P1000 pipet om vijf tot tien embryo's over te brengen in één microcentrifugebuis van 1,5 milliliter en het overgedragen E3-medium te aspireren. Voeg vervolgens een milliliter van 10 millimolar DTT in E3 medium toe aan de embryonale zebravis en plaats de microcentrifugebuis gedurende 30 minuten horizontaal bij kamertemperatuur om de slijmlaag te verwijderen. Was voor embryodissociatie de met DTT behandelde embryo's driemaal met één milliliter DPBS aangevuld met calcium en magnesium per wasbeurt.Alvorens 500 microliter DPBS aangevuld met calcium en magnesium toe te voegen, en vijf microliter van vijf milligram per milliliter, dissociatie protease. Incubeer vervolgens de monsters bij 37 graden Celsius op een horizontale orbitale shaker met 185 omwentelingen per minuut gedurende 60 minuten. Zorg ervoor dat u de embryo's regelmatig controleert, zodat u ze niet te veel verteert.Wanneer een niet volledig homogeen monster met wat vast weefsel aanwezig kan worden waargenomen, tritureer de embryo's met een P1000 pipet totdat het monster volledig is gedissocieerd. Om de gedissocieerde zebravis embryonale cellen voor te bereiden op flowcytometrie, brengt u het hele celmonster over op het bovenste reservoir van een vijf milliliter polystyreen ronde bodembuis, met een 35 micrometer celzeefdop. Spoel de dop af met vier milliliter PBS zonder calcium of magnesium en pellet de cellen door centrifugeren.Resuspend de cellen vervolgens in 500 microliters PBS zonder calcium en magnesium per tube. Voor flow cytometrische analyse van de zebravis embryonale cellen, draai voorzichtig de cel suspensussingen voordat een een-op-een duizend verdunning van rode dode cel vlek toe te voegen aan elke buis. Binnen 30 minuten na het aanbrengen van de dode celvlek, leeg de afvaltank, vul de manteltank met de juiste oplossing en start het vloeistofsysteem van de flowcytometer.Teken in de analysesoftware vijf plots en stel de eerste plot in om voorwaarts versus zijverstrooiing te meten. Stel de voorwaartse spreiding in op lineair en de zijstrooiing op logaritmisch. Stel de tweede plot in om de voorwaartse spreidingshoogte versus de breedte van de voorwaartse spreiding te meten en de derde plot om de spreidingshoogte versus de breedte van de zijstrooiing te meten.Stel de vierde plot in om de rode dode celvlek op de x-as te meten en zijverstrooiing op de y-as om de discriminatie van leven uit dode cellen mogelijk te maken. Het vijfde perceel moet worden ingesteld om de fluorofoor van keuze te meten. Wanneer alle plots zijn ingesteld, laadt u het monster op de cytometer en vermindert u het debiet, zodat de cellen niet snel opraken.Pas de instellingen voor voor- en zijstrooiing aan, zodat het grootste deel van de celpopulatie duidelijk kan worden waargenomen en teken een poort rond de celpopulatie. Label deze poortcellen. Met de tweede punt plot gated op de cellen, gate op voorwaartse scatter en de side scatter singlets om doubletten uit te sluiten.Pas in het vierde plot de instellingen voor rode dode celvlekken aan zodat er een duidelijk negatieve populatie is. Teken een poort rond deze cellen en label deze poort levende cellen. In het vijfde perceel, poort op de levende cellen en teken een poort rond de positieve cellen, voer dan elk monster uit dat ten minste 25.000 live celgebeurtenissen verzamelt.Wanneer alle monsters zijn geanalyseerd, volgt u de uitschakelingsprocedure om de fluidics uit te schakelen, de manteltank bij te vullen en de afvaltank te legen. Na analyse van het percentage GFP-positieve rode bloedcellen van elk embryonaal zebravismonster, kan het gemiddelde van alle controlegroep worden berekend. Meestal wordt het gemiddelde ingesteld als één en worden alle percentages berekend op basis van dit referentiepunt.In deze representatieve analyse werd vastgesteld dat het verminderen van het ISM1-transcript met een specifiek morfolino het aantal GFP-positieve rode bloedcellen binnen 48 uur na de bevruchting van embryo's vermindert. Door deze verlaging van de ISM1-morfolinospiegels met exogene mRNA te redden, wordt het aantal rode bloedcellen weer normaal. Een goede spijsvertering van de monsters is van cruciaal belang.Als u over- of onderverteerd wordt, krijgt u niet de juiste resultaten. Als er een faxapparaat beschikbaar is, kunnen onderzoekers de bloedcellen verzamelen door te sorteren op in vitro kweek, RNA-sequencing en kwantitatieve RT-PCR.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse van de zebravis Larven skeletspieren Integriteit met Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Micro-injectie techniek om Target aan de ontwikkelingslanden<em&gt; Xenopus</em&gt; Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Met behulp van Light Sheet fluorescentiemicroscopie met Afbeelding zebravis Eye Development

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Identificatie van Erythromyeloid Progenitors En Hun Nakomelingen In De Muis Embryo Door Flow Cytometry

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

Isolating and Analyzing Cells of the Pancreas Mesenchyme by Flow Cytometry

Isoleren en analyseren van cellen van de pancreas mesenchym door flowcytometrie

The pancreas is comprised of epithelial cells that are required for food digestion and blood glucose regulation. Cells of the pancreas microenvironment, ...

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Chondrogenische Pelletvorming van Koord Bloed afgeleide geïnduceerde Pluripotente Stamcellen

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells HSPCs in Developing Zebrafish Embryos

Ontwikkeling van een In Vitro Assay voor het kwantificeren van hematopoietische stamcellen en voorlopercellen cellen (HSPCs) bij de ontwikkeling van de zebravis embryo 's

Hematopoiesis is an essential cellular process in which hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) differentiate into the multitude of different cell ...

Use of Hematopoietic Stem Cell Transplantation to Assess the Origin of Myelodysplastic Syndrome

Gebruik van hematopoietische stamceltransplantatie te beoordelen van de oorsprong van myelodysplastisch syndroom

Myelodysplastic syndromes (MDS) are a diverse group of hematopoietic stem cell disorders that are defined by ineffective hematopoiesis, peripheral blood ...

Real-time Live-cell Flow Cytometry to Investigate Calcium Influx, Pore Formation, and Phagocytosis by P2X7 Receptors in Adult Neural Progenitor Cells

Real-Time Live-cel Stroom Cytometry te onderzoeken Calcium toestroom, porie vorming en fagocytose door P2X7 receptoren in volwassen neurale voorlopercellen

Live-cell flow cytometry is increasingly used among cell biologists to quantify biological processes in a living cell culture. This protocol describes a ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Whole-Mount In Situ Hybridisatie in Zebrafish Embryo's en Tube Formation Assay in iPSC-ECs om de rol van Endoglin in vasculaire ontwikkeling te bestuderen

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...