Name: using flow cytometry to detect and quantitate altered blood formation in the developing zebrafish
Uploaded: 2021-04-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Flow Cytometry to Detect and Quantitate Altered Blood Formation in the Developing Zebrafish at JoVE.com

Le financement a été fourni par les National Institutes of Health (NIH: R15 DK114732-01 à D.L.S.), la National Science Foundation (NSF: MRI 1626406 à D.L.S.), et du Programme d’honneur à l’Université d’État de Californie Chico (à K.F.R.). Les auteurs remercient Betsey Tamietti pour la gestion de laboratoire et Kathy Johns pour leur assistance administrative.

Le conseil consultatif du Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de la California State University de Chico a approuvé toutes les méthodes décrites ci-dessous.
REMARQUE : Il est conseillé de traiter les embryons avec 1-phényle 2-thiourea (PTU; Tableau 1) à 24 heures postfertilization (hpf) pour empêcher la pigmentation qui affecte négativement la discrimination de fluorescence par cytométrie de flux. Toutes les procédures énumérées ci-dessous sont acc...

<ol>
	<li>Driever, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+for+mutations+affecting+embryogenesis+in+zebrafish.">A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish.</a> Development. 123, 37-46 (1996).</li><li>Weinstein, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+mutations+in+the+zebrafish.">Hematopoietic mutations in the zebrafish.</a> Development. , 303-309 (1996).</li><li>Ransom, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+zebrafish+mutants+with+defects+in+embryonic+hematopoiesis.">Characterization of zebrafish mutants with defects in embryonic hematopoiesis.</a> Development. 123, 311-319 (1996).</li><li>Amsterdam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large-scale+insertional+mutagenesis+screen+in+zebrafish.">A large-scale insertional mutagenesis screen in zebrafish.</a> Genes &amp; Development. 13, 2713-2724 (1999).</li><li>Gaiano, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+mutagenesis+and+rapid+cloning+of+essential+genes+in+zebrafish.">Insertional mutagenesis and rapid cloning of essential genes in zebrafish.</a> Nature. 383, 829-832 (1996).</li><li>Yeh, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovering+chemical+modifiers+of+oncogene-regulated+hematopoietic+differentiation.">Discovering chemical modifiers of oncogene-regulated hematopoietic differentiation.</a> Nature Chemical Biology. 5, 236-243 (2009).</li><li>Paik, E. J., de Jong, J. L., Pugach, E., Opara, P., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+genetic+screen+in+zebrafish+for+pathways+interacting+with+cdx4+in+primitive+hematopoiesis.">A chemical genetic screen in zebrafish for pathways interacting with cdx4 in primitive hematopoiesis.</a> Zebrafish. 7, 61-68 (2010).</li><li>Ridges, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+screen+identifies+novel+compound+with+selective+toxicity+against+leukemia.">Zebrafish screen identifies novel compound with selective toxicity against leukemia.</a> Blood. 119, 5621-5631 (2012).</li><li>North, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostaglandin+E2+regulates+vertebrate+haematopoietic+stem+cell+homeostasis.">Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis.</a> Nature. 447, 1007-1011 (2007).</li><li>Astuti, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Functional+Bioluminescent+Zebrafish+Screen+for+Enhancing+Hematopoietic+Cell+Homing.">A Functional Bioluminescent Zebrafish Screen for Enhancing Hematopoietic Cell Homing.</a> Stem Cell Reports. 8, 177-190 (2017).</li><li>Stachura, D. L., Traver, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+dissection+of+zebrafish+hematopoiesis.">Cellular dissection of zebrafish hematopoiesis.</a> Methods in Cell Biology. 133, 11-53 (2016).</li><li>Berrun, A. C., Stachura, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+In+Vitro+Assay+to+Quantitate+Hematopoietic+Stem+and+Progenitor+Cells+(HSPCs)+in+Developing+Zebrafish+Embryos.">Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (129), e56836 (2017).</li><li>Westerfield, M., Zon, L. I., Detrich, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Essential Zebrafish Methods: Cell and Developmental Biology. , (2009).</li><li>Drummond, I. A., Davidson, A. J., Detrich, H. W., Westerfield, M., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Kidney+Development.">Zebrafish Kidney Development.</a> The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, Part A. 100, 233-260 (2010).</li><li>Traver, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+and+in+vivo+imaging+of+multilineage+engraftment+in+zebrafish+bloodless+mutants.">Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants.</a> Nature Immunology. 4, 1238-1246 (2003).</li><li>Ganis, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+globin+switching+occurs+in+two+developmental+stages+and+is+controlled+by+the+LCR.">Zebrafish globin switching occurs in two developmental stages and is controlled by the LCR.</a> Developmental Biology. 366, 185-194 (2012).</li><li>Renshaw, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation.">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108, 3976-3978 (2006).</li><li>Lin, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+thrombocyte+development+in+CD41-GFP+transgenic+zebrafish.">Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish.</a> Blood. 106, 3803-3810 (2005).</li><li>Page, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evolutionarily+conserved+program+of+B-cell+development+and+activation+in+zebrafish.">An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish.</a> Blood. 122, e1-e11 (2013).</li><li>Ding, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+High-Throughput+Flow+Cytometry+in+Early+Drug+Discovery:+An+AstraZeneca+Perspective.">Application of High-Throughput Flow Cytometry in Early Drug Discovery: An AstraZeneca Perspective.</a> SLAS Discovery. 23, 719-731 (2018).</li><li>Ding, M., Kaspersson, K., Murray, D., Bardelle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+flow+cytometry+for+drug+discovery:+principles,+applications,+and+case+studies.">High-throughput flow cytometry for drug discovery: principles, applications, and case studies.</a> Drug Discovery Today. 22, 1844-1850 (2017).</li><li>Joslin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Fully+Automated+High-Throughput+Flow+Cytometry+Screening+System+Enabling+Phenotypic+Drug+Discovery.">A Fully Automated High-Throughput Flow Cytometry Screening System Enabling Phenotypic Drug Discovery.</a> SLAS Discovery. 23, 697-707 (2018).</li></ol>

Le poisson zèbre est un excellent système modèle pour étudier l’hématopoïèse vertébrée primitive et définitive. Au cours des dernières décennies, de multiples essais ont été développés et affinés, permettant au poisson zèbre de devenir un modèle rapide et économique pour tester des médicaments, générer et tester des mutants génétiques, et dans l’ensemble permettant aux chercheurs d’analyser les voies moléculaires essentielles à l’hématopoïèse. Ce protocole utilise le poisson zèbre e...

La production de sang (hématopoïèse) est un processus de développement essentiel qui commence d’abord dans l’embryon précoce. Ce processus commence par générer des globules rouges primitifs et des macrophages directement à partir du mésoderm, puis se déplace vers la production de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPCs). Ces cellules souches, qui sont multipotentes, génèrent toutes les variétés de cellules sanguines matures dans l’organisme. Capable de se renouveler, le système est continuellement réapprovisionné par l’intermédiaire de ces SPPC. Bien que ce processus commence tôt dans le développement, l’hématopoïèse se poursuit pour la vie de l’animal, fournissant la capacité de transporter l’oxygène vers des sites éloignés du corps, d’arrêter de saigner après une blessure, et de protéger le corps contre l’infection. Le développement de ce système complexe est contrôlé temporellement et spatialement pendant le développement et toutes les perturbations dans la production de cellules sanguines peuvent être catastrophiques pour l’organisme, ayant pour résultat l’anémie, la thrombocytopénie, la leukopenia, et la leucémie.
Un modèle animal populaire utilisé pour la recherche hématopoïétique est le poisson zèbre (Danio rerio) parce qu’ils ont un développement sanguin similaire par rapport aux humains. En fait, bon nombre des gènes et des voies moléculaires utilisés pendant l’hématopoïèse sont conservés tout au long de l’évolution des vertébrés, ce qui nous permet d’en apprendre davantage sur les gènes humains en étudiant le poisson zèbre. Fait important, les embryons de poisson zèbre se développent à l’extérieur du corps et dans les 7 jours ont généré la plupart des types de cellules sanguines matures, permettant une visualisation directe du système hématopoïétique en peu de temps. Le poisson zèbre est également extrêmement fécond, ce qui permet aux chercheurs d’observer un plus grand nombre d’échantillons dans un court laps de temps, ce qui est également important pour générer des données reproductibles. Le temps de courte génération et le développement externe du poisson zèbre facilitent la manipulation et l’observation pendant les études de mutagenèse1,2,3,4,5 et le dépistage des médicaments6,7,8,9,10. Cela permet de tester rapidement et efficacement un panel de composés thérapeutiques prometteurs pour les troubles sanguins humains.
Fait important, le poisson zèbre est également génétiquement aménageable, et le génome est séquencé et annoté. Cette tractabilité permet d’effectuer des techniques génétiques inverses telles que le knockdown morpholino-(MO-) et l’ablation génétique crispr-médiée. Le poisson zèbre a également prouvé son utilité en tant que modèle pour effectuer des écrans génétiques avancés; de nombreux gènes et voies essentiels impliqués dans la formation de sang vertébré ont été découverts de cette manière. De nombreuses méthodes d’observation des cellules sanguines ont également été développées chez le poisson zèbre. Bien qu’il existe des techniques traditionnelles de coloration histologique, il est également possible d’effectuer une hybridation in situ pour les transcriptions spécifiques au sang. Fait important, il existe également de nombreuses lignées de poissons transgéniques par lesquelles les protéines fluorescentes sont exprimées par des promoteurs spécifiques à la lignée, ce qui permet l’étiquetage de cellules sanguines spécifiques avec des protéines fluorescentes11. Cela permet aux chercheurs d’effectuer une observation à jour de la genèse, de l’expansion et de la régulation des cellules sanguines dans un organisme vivant au fil du temps.
Dans l’ensemble, la conservation du système hématopoïétique, la présence et le développement facile des lignes transgéniques, la visualisation facile et le temps de génération courte ont fait du poisson zèbre un modèle économique, rapide et adaptable d’hématopoïèse. Afin d’améliorer la boîte à outils des techniques mises à la disposition des chercheurs du poisson zèbre, nous avons mis au point cet essai pour quantifier solidement le nombre de cellules sanguines dans les embryons. La méthode consiste à digérer les animaux transgéniques et à effectuer une cytométrie d’écoulement pour les cellules sanguines fluorescentes. De cette façon, les cellules sanguines des animaux mutants, l’effet de la modification MO et CRISPR, et l’effet des petites molécules peuvent être analysés quantitativement d’une manière rapide et reproductible. Ces analyses sont des moyens conviviaux et économiques d’énumérer les cellules sanguines, permettant d’examiner leur génération, leur prolifération et leur entretien au fil du temps.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 ml MCF tube</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mm Polystyrene easygrip Petri dish</td>
			<td>Corning Falcon</td>
			<td>351008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml Polystyrene round bottom tube with cell strainer cap</td>
			<td>Corning Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria Fusion flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiolthreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>646563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (10x) with Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14080-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS 500 mL</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>100-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone PBS (1x)</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>sh30256.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Librease</td>
			<td>Roche Sigma-Aldrich</td>
			<td>5401119001</td>
			<td>dissociation protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Roche Sigma-Aldrich</td>
			<td>11459643001</td>
			<td>dechorionation protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Red Dead Cell Stain</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>S34859</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using flow cytometry to detect and quantitate altered blood formation in the developing zebrafish

La diversité des lignées cellulaires qui composent le sang mature chez les vertébrés provient de la différenciation des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (PSHC). Il s’agit d’un processus critique qui se produit tout au long de la durée de vie des organismes, et la perturbation des voies moléculaires impliquées pendant l’embryogenèse peut avoir des conséquences catastrophiques à long terme. Pour une multitude de raisons, le poisson zèbre (Danio rerio) est devenu un organisme modèle pour étudier l’hématopoïèse. Les embryons de poisson zèbre se développent à l’extérieur, et par 7 jours après la fécondation (dpf) ont produit la plupart des sous-types de cellules sanguines définitives qui persisteront pendant leur vie. Des analyses pour évaluer le nombre de cellules hématopoïétiques ont été développées, utilisant principalement des taches histologiques spécifiques, des techniques d’hybridation in situ et la microscopie d’animaux transgéniques qui utilisent des promoteurs spécifiques aux cellules sanguines conduisant à l’expression de protéines fluorescentes. Cependant, la plupart des analyses de coloration et des techniques d’hybridation in situ ne quantifient pas avec précision le nombre de cellules sanguines présentes; seules de grandes différences dans le nombre de cellules sont facilement visualisées. L’utilisation d’animaux transgéniques et l’analyse d’individus avec une microscopie fluorescente ou confococale peuvent être effectuées, mais la quantitation de ces analyses repose soit sur le comptage manuel, soit sur l’utilisation de logiciels d’imagerie coûteux, qui peuvent tous deux faire des erreurs. Le développement de méthodes supplémentaires pour évaluer le nombre de cellules sanguines serait économique, plus rapide, et pourrait même être automatisé pour évaluer rapidement l’effet de la modification génétique CRISPR-médiée, de la réduction de transcription morpholino-médiée, et de l’effet des composés de drogue qui affectent l’hématopoiesis sur une grande échelle. Ce nouvel essai pour quantifier les cellules sanguines est effectué en dissociant des embryons entiers de poisson zèbre et en analysant la quantité de cellules sanguines étiquetées fluorescentes présentes. Ces analyses devraient permettre l’élucidation des voies moléculaires responsables de la génération, de l’expansion et de la régulation des cellules sanguines pendant l’embryogenèse, ce qui permettra aux chercheurs de découvrir davantage de nouveaux facteurs modifiés pendant les maladies du sang, ainsi que des voies essentielles lors de l’évolution de l’hématopoïèse vertébrée.

Pour énumérer les globules rouges dans le poisson zèbre embryonnaire, lcr:GFP16 embryons ont été injectés au stade d’une cellule avec PBS, 7,0 ng/nL ism1 MO, ou 7,0 ng/nL ism1 MO avec 7,0 ng ism1 mRNA12. À 48 hpf ils ont été digérés et soumis à l’analyse de cytométrie de flux. Après avoir analysé le pourcentage de GFP+ globules rouges de chaque échantillon (chaque échantillo...

Watch this Scientific Journal Video about Using Flow Cytometry to Detect and Quantitate Altered Blood Formation in the Developing Zebrafish at JoVE.com

Using Flow Cytometry to Detect and Quantitate Altered Blood Formation in the Developing Zebrafish

Cet essai est une méthode simple pour quantifier les cellules hématopoïétiques dans le développement du poisson zèbre embryonnaire. Les cellules sanguines du poisson zèbre dissocié sont soumises à l’analyse de cytométrie de flux. Cela permet la détection de défauts sanguins chez les animaux mutants et après modification génétique.

Utilisation de la cytométrie du débit pour détecter et quantifier la formation de sang altérée chez le poisson zèbre en développement

The diversity of cell lineages that comprise mature blood in vertebrate animals arise from the differentiation of hematopoietic stem and progenitor cells ...

Ce protocole est significatif parce qu’il permet le renversement et la sur-expression des gènes chez un poisson en développement, et la quantitation de ces effets en aval sur les cellules sanguines. Ce protocole est rapide, facile à exécuter, économique et facile à automatiser avec accès à l’instrumentation appropriée. Kristen Rueb, chercheuse de premier cycle au laboratoire, démontrera cette procédure.Commencez par transférer entre cinq et 200 embryons après fécondation de 48 heures dans une boîte de Pétri en plastique de 10 centimètres. Inclinez le plat pour que l’embryon descende vers le bord inférieur et retirez autant d’E3 moyen du plat que possible. Ajouter ensuite 500 microlitres de protéase de déchorionation aux embryons.Après cinq minutes à température ambiante, inclinez tous les embryons vers le bord inférieur de la plaque à nouveau et appuyez doucement sur le côté du plat, permettant aux embryons de frotter doucement contre le fond de la plaque pour enlever complètement leurs chorions. À l’aide d’une bouteille pressée, ajouter environ 20 millilitres de milieu E3 pour diluer la protéase et permettre aux embryons de se déposer. Puis décanter le milieu, et rincer les embryons trois fois de plus avec un milieu frais comme juste démontré pour enlever toutes les traces de la protéase.Pour préparer les embryons à la dissociation, utilisez une pipette P1000 pour transférer de cinq à dix embryons dans un tube de micro centrifugeuse de 1,5 millilitre et aspirez le milieu E3 transféré. Ajouter ensuite un millilitre de TNT de 10 millimolaires dans le milieu E3 au poisson zèbre embryonnaire, et placer le tube de microcentrifugeuse en position horizontale pendant 30 minutes à température ambiante pour enlever le revêtement du mucus. Pour la dissociation embryonnaire, laver les embryons traités par TNT trois fois avec un millilitre de DPBS complété par du calcium et du magnésium par lavage.Avant d’ajouter 500 microlitres de DPBS complétés avec du calcium et du magnésium, et cinq microlitres de cinq milligrammes par millilitre, protéase de dissociation. Puis incuber les échantillons à 37 degrés Celsius sur un shaker orbital horizontal à 185 révolutions par minute pendant 60 minutes. Assurez-vous de vérifier périodiquement les embryons, afin de ne pas trop les digérer.Lorsqu’un échantillon pas complètement homogène avec un peu de tissu solide présent peut être observé, triturer les embryons avec une pipette P1000 jusqu’à ce que l’échantillon soit entièrement dissocié. Pour préparer les cellules embryonnaires dissociées du poisson zèbre à la cytométrie d’écoulement, transférez l’échantillon cellulaire entier sur le réservoir supérieur d’un tube de fond rond en polystyrène de cinq millilitres, avec un bouchon de passoire cellulaire de 35 micromètres. Rincer le bouchon avec quatre millilitres de PBS sans calcium ni magnésium, et pelleter les cellules par centrifugation.Puis résuspendez les cellules en 500 microlitres de PBS sans calcium et magnésium par tube. Pour l’analyse cytométrique d’écoulement des cellules embryonnaires de zebrafish, vortex doucement les suspensions cellulaires avant d’ajouter une dilution d’un à mille de tache rouge de cellules mortes à chaque tube. Dans les 30 minutes qui ont après l’application de la tache de cellule morte, videz le réservoir de déchets, remplissez le réservoir de gaine avec la solution appropriée et démarrez le système fluidique du cytomètre d’écoulement.Dans le logiciel d’analyse, dessiner cinq parcelles, et définir la première parcelle pour mesurer vers l’avant par rapport à la dispersion latérale. Réglez la dispersion vers l’avant en linéaire, et le côté se disperse en logarithmique. Réglez la deuxième parcelle pour mesurer la hauteur de dispersion vers l’avant par rapport à la largeur de dispersion avant, et la troisième parcelle pour mesurer la hauteur de dispersion par rapport à la largeur latérale de dispersion.Réglez la quatrième parcelle pour mesurer la tache rouge de cellules mortes sur l’axe x, et la dispersion latérale sur l’axe y pour permettre la discrimination de vivre à partir de cellules mortes. La cinquième parcelle doit être réglée pour mesurer le fluorophore de choix. Lorsque toutes les parcelles ont été réglées, chargez l’échantillon sur le cytomètre et réduisez le débit afin que les cellules ne s’épuisent pas rapidement.Ajustez les paramètres de dispersion avant et latéral de sorte que la majeure partie de la population cellulaire puisse être clairement observée, et dessinez une barrière autour de la population cellulaire. Étiquetez ces cellules de porte. Avec la deuxième parcelle de point fermée sur les cellules, porte sur la dispersion vers l’avant et les singlets de dispersion latérale pour exclure les doublets.Dans la quatrième parcelle, ajuster les paramètres de tache de cellules mortes rouges de sorte qu’il y ait une population clairement négative. Dessinez une porte autour de ces cellules et étiquetez cette porte cellules vivantes. Dans la cinquième parcelle, portez les cellules vivantes et dessinez une porte autour des cellules positives, puis exécutez chaque échantillon recueillant au moins 25 000 événements cellulaires vivants.Lorsque tous les échantillons ont été analysés, suivez la procédure d’arrêt pour éteindre les fluides, remplir le réservoir de gaine et vider le réservoir de déchets. Après avoir analysé le pourcentage de globules rouges positifs GFP de chaque échantillon embryonnaire de poisson zèbre, la moyenne de tout le groupe témoin peut être calculée. En règle générale, la moyenne est définie comme un seul et tous les pourcentages sont calculés à partir de ce point de référence.Dans cette analyse représentative, il a été déterminé que la réduction de la transcription ISM1 avec un morpholino spécifique, réduire le nombre de globules rouges positifs GFP présents dans les 48 heures après la fécondation embryons. Sauver cette réduction des niveaux ISM1 morpholino avec l’ARNm exogène, retourner le nombre de globules rouges à la normale. Une bonne digestion sur les échantillons est essentielle.Si vous sur-digérer ou sous-digérer, vous n’obtiendrez pas les bons résultats. Si un télécopieur est disponible, les chercheurs peuvent recueillir les cellules sanguines en triant pour la culture in vitro, le séquençage de l’ARN et le RT-PCR quantitatif.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse des Muscle intégrité poisson zèbre larves squelettique avec colorant bleu Evans

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Recherche

Biologie du développement

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique à la cible microinjection du Developing<em&gt; Xenopus</em&gt; Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Utilisation de feuilles Lumière Fluorescence Microscopy à l&#39;image du développement Zebrafish Eye

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Identification des progéniteurs érythromyélidiens et de leur descendance dans l&#39;embryon de souris par cytométrie de flux

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

Isolating and Analyzing Cells of the Pancreas Mesenchyme by Flow Cytometry

Isoler et analyse des cellules du pancréas Mesenchyme par cytométrie de flux

The pancreas is comprised of epithelial cells that are required for food digestion and blood glucose regulation. Cells of the pancreas microenvironment, ...

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Formation de granulés chondrogéniques à partir de cellules souches pluripotentes induites par sang de cordon

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells HSPCs in Developing Zebrafish Embryos

Développement d’un test In Vitro pour doser les progéniteurs et souches hématopoïétiques cellules (HSPCs) dans le développement des embryons de poisson-zèbre

Hematopoiesis is an essential cellular process in which hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) differentiate into the multitude of different cell ...

Use of Hematopoietic Stem Cell Transplantation to Assess the Origin of Myelodysplastic Syndrome

Utilisation de la greffe de cellules souches hématopoïétiques pour évaluer l’origine du Syndrome myélodysplasique

Myelodysplastic syndromes (MDS) are a diverse group of hematopoietic stem cell disorders that are defined by ineffective hematopoiesis, peripheral blood ...

Real-time Live-cell Flow Cytometry to Investigate Calcium Influx, Pore Formation, and Phagocytosis by P2X7 Receptors in Adult Neural Progenitor Cells

Cytométrie en cellules vivantes en temps réel d’enquêter sur l’Influx calcique, la Formation de pores et phagocytose par les récepteurs P2X7 dans des cellules progénitrices neurales adultes

Live-cell flow cytometry is increasingly used among cell biologists to quantify biological processes in a living cell culture. This protocol describes a ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Hybridation in situ à monture entière chez les embryons de poissons zèbres et l’essai de formation de tubes dans iPSC-ECs pour étudier le rôle de l’Endoglin dans le développement vasculaire

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...