Name: using flow cytometry to detect and quantitate altered blood formation in the developing zebrafish
Uploaded: 2021-04-29T14:00:00
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Die Finanzierung erfolgte durch die National Institutes of Health (NIH: R15 DK114732-01 an D.L.S.), die National Science Foundation (NSF: MRT 1626406 bis D.L.S.) und das Honor es Program an der California State University Chico (nach K.F.R.). Die Autoren danken Betsey Tamietti für das Labormanagement und Kathy Johns für die Amtshilfe.

Der Beirat des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der California State University, Chico, genehmigte alle unten beschriebenen Methoden.
HINWEIS: Es wird empfohlen, Embryonen mit 1-Phenyl 2-Thiourea (PTU; Tabelle 1) nach der Nachfruchtung (hpf) nach 24 Stunden, um Pigmentierung zu verhindern, die sich negativ auf die Fluoreszenzdiskriminierung durch Durchflusszytometrie auswirkt. Alle unten aufgeführten Verfahren sind für die Durchflusszytometrie und Fluor...

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	<li>Driever, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+for+mutations+affecting+embryogenesis+in+zebrafish.">A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish.</a> Development. 123, 37-46 (1996).</li><li>Weinstein, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+mutations+in+the+zebrafish.">Hematopoietic mutations in the zebrafish.</a> Development. , 303-309 (1996).</li><li>Ransom, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+zebrafish+mutants+with+defects+in+embryonic+hematopoiesis.">Characterization of zebrafish mutants with defects in embryonic hematopoiesis.</a> Development. 123, 311-319 (1996).</li><li>Amsterdam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large-scale+insertional+mutagenesis+screen+in+zebrafish.">A large-scale insertional mutagenesis screen in zebrafish.</a> Genes &amp; Development. 13, 2713-2724 (1999).</li><li>Gaiano, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+mutagenesis+and+rapid+cloning+of+essential+genes+in+zebrafish.">Insertional mutagenesis and rapid cloning of essential genes in zebrafish.</a> Nature. 383, 829-832 (1996).</li><li>Yeh, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovering+chemical+modifiers+of+oncogene-regulated+hematopoietic+differentiation.">Discovering chemical modifiers of oncogene-regulated hematopoietic differentiation.</a> Nature Chemical Biology. 5, 236-243 (2009).</li><li>Paik, E. J., de Jong, J. L., Pugach, E., Opara, P., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+genetic+screen+in+zebrafish+for+pathways+interacting+with+cdx4+in+primitive+hematopoiesis.">A chemical genetic screen in zebrafish for pathways interacting with cdx4 in primitive hematopoiesis.</a> Zebrafish. 7, 61-68 (2010).</li><li>Ridges, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+screen+identifies+novel+compound+with+selective+toxicity+against+leukemia.">Zebrafish screen identifies novel compound with selective toxicity against leukemia.</a> Blood. 119, 5621-5631 (2012).</li><li>North, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostaglandin+E2+regulates+vertebrate+haematopoietic+stem+cell+homeostasis.">Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis.</a> Nature. 447, 1007-1011 (2007).</li><li>Astuti, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Functional+Bioluminescent+Zebrafish+Screen+for+Enhancing+Hematopoietic+Cell+Homing.">A Functional Bioluminescent Zebrafish Screen for Enhancing Hematopoietic Cell Homing.</a> Stem Cell Reports. 8, 177-190 (2017).</li><li>Stachura, D. L., Traver, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+dissection+of+zebrafish+hematopoiesis.">Cellular dissection of zebrafish hematopoiesis.</a> Methods in Cell Biology. 133, 11-53 (2016).</li><li>Berrun, A. C., Stachura, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+In+Vitro+Assay+to+Quantitate+Hematopoietic+Stem+and+Progenitor+Cells+(HSPCs)+in+Developing+Zebrafish+Embryos.">Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (129), e56836 (2017).</li><li>Westerfield, M., Zon, L. I., Detrich, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Essential Zebrafish Methods: Cell and Developmental Biology. , (2009).</li><li>Drummond, I. A., Davidson, A. J., Detrich, H. W., Westerfield, M., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Kidney+Development.">Zebrafish Kidney Development.</a> The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, Part A. 100, 233-260 (2010).</li><li>Traver, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+and+in+vivo+imaging+of+multilineage+engraftment+in+zebrafish+bloodless+mutants.">Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants.</a> Nature Immunology. 4, 1238-1246 (2003).</li><li>Ganis, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+globin+switching+occurs+in+two+developmental+stages+and+is+controlled+by+the+LCR.">Zebrafish globin switching occurs in two developmental stages and is controlled by the LCR.</a> Developmental Biology. 366, 185-194 (2012).</li><li>Renshaw, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation.">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108, 3976-3978 (2006).</li><li>Lin, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+thrombocyte+development+in+CD41-GFP+transgenic+zebrafish.">Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish.</a> Blood. 106, 3803-3810 (2005).</li><li>Page, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evolutionarily+conserved+program+of+B-cell+development+and+activation+in+zebrafish.">An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish.</a> Blood. 122, e1-e11 (2013).</li><li>Ding, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+High-Throughput+Flow+Cytometry+in+Early+Drug+Discovery:+An+AstraZeneca+Perspective.">Application of High-Throughput Flow Cytometry in Early Drug Discovery: An AstraZeneca Perspective.</a> SLAS Discovery. 23, 719-731 (2018).</li><li>Ding, M., Kaspersson, K., Murray, D., Bardelle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+flow+cytometry+for+drug+discovery:+principles,+applications,+and+case+studies.">High-throughput flow cytometry for drug discovery: principles, applications, and case studies.</a> Drug Discovery Today. 22, 1844-1850 (2017).</li><li>Joslin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Fully+Automated+High-Throughput+Flow+Cytometry+Screening+System+Enabling+Phenotypic+Drug+Discovery.">A Fully Automated High-Throughput Flow Cytometry Screening System Enabling Phenotypic Drug Discovery.</a> SLAS Discovery. 23, 697-707 (2018).</li></ol>

Zebrafische sind ein ausgezeichnetes Modellsystem für das Studium der primitiven und definitiven Wirbeltierhämatopoese. In den letzten Jahrzehnten wurden mehrere Assays entwickelt und verfeinert, die es Zebrafischen ermöglichten, ein schnelles und wirtschaftliches Modell für das Testen von Medikamenten, die Erzeugung und Erprobung genetischer Mutanten zu werden und insgesamt es Forschern zu ermöglichen, molekulare Pfade zu analysieren, die für hämatopoese unerlässlich sind. Dieses Protokoll verwendet embryonale Z...

Die Blutproduktion (Hämatopoese) ist ein wesentlicher Entwicklungsprozess, der zuerst im frühen Embryo beginnt. Dieser Prozess beginnt mit der Erzeugung primitiver roter Blutkörperchen und Makrophagen direkt aus dem Mesoderm und verschiebt sich später in Richtung der Produktion von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs). Diese Stammzellen, die multipotent sind, erzeugen alle Sorten von reifen Blutzellen im Organismus. Das System ist in der Lage, sich selbst zu erneuern, und wird durch diese HSPCs kontinuierlich aufgefüllt. Während dieser Prozess früh in der Entwicklung beginnt, Hämatopoese setzt sich für das Leben des Tieres, bietet die Fähigkeit, Sauerstoff zu entfernten Stellen des Körpers zu transportieren, Blutungen nach Verletzungen zu stoppen, und den Körper vor Infektionen zu schützen. Die Entwicklung dieses komplexen Systems wird zeitlich und räumlich während der Entwicklung gesteuert und jegliche Störungen in der Blutzellproduktion können für den Organismus katastrophal sein, was zu Anämie, Thrombozytopenie, Leukopenie und Leukämie führt.
Ein beliebtes Tiermodell für die hämatopoetische Forschung ist der Zebrafisch (Danio rerio), weil sie eine ähnliche Blutentwicklung im Vergleich zum Menschen haben. Tatsächlich werden viele der Gene und molekularen Bahnen, die während der Hämatopoese verwendet werden, während der Gesamten der Wirbeltierentwicklung konserviert, so dass wir durch das Studium von Zebrafischen mehr über menschliche Gene lernen können. Wichtig ist, dass zebrafischische Embryonen außerhalb des Körpers entstehen und innerhalb von 7 Tagen die meisten reifen Blutzelltypen erzeugt haben, was eine direkte Visualisierung des hämatopoetischen Systems in kurzer Zeit ermöglicht. Zebrafische sind auch extrem fecund, was es Forschern ermöglicht, eine größere Anzahl von Proben in einem kurzen Zeitrahmen zu beobachten, was auch für die Generierung reproduzierbarer Daten wichtig ist. Die kurze Erzeugungszeit und die externe Entwicklung des Zebrafisches ermöglicht eine einfachere Manipulation und Beobachtung während der Mutagenesestudien1,2,3,4,5 und Drogenscreening6,7,8,9,10. Dies ermöglicht es, eine Gruppe vielversprechender therapeutischer Verbindungen für menschliche Bluterkrankungen schnell und effizient zu testen.
Wichtig ist, dass Zebrafische auch genetisch freundlich sind, und das Genom wird sequenziert und mit Anmerkungen benotet. Diese Traktionsfähigkeit ermöglicht reverse genetische Techniken wie Morpholino- (MO-) vermittelten Knockdown und CRISPR-vermittelte genetische Ablation durchzuführen. Zebrafische haben auch ihre Nützlichkeit als Modell bewiesen, um vorn genetische Bildschirme durchzuführen; viele wesentliche Gene und Wege, die an der Wirbeltierblutbildung beteiligt sind, wurden auf diese Weise entdeckt. Zahlreiche Methoden zur Beobachtung von Blutzellen wurden auch bei Zebrafischen entwickelt. Während es traditionelle histologische Färbetechniken gibt, ist es auch möglich, in situ-Hybridisierung für blutspezifische Transkripte durchzuführen. Wichtig ist, dass es auch zahlreiche transgene Fischlinien gibt, bei denen fluoreszierende Proteine durch linienspezifische Promotoren exprimiert werden, was die Kennzeichnung bestimmter Blutzellen mit fluoreszierenden Proteinen11ermöglicht. Dies ermöglicht es Forschern, die Entstehung, Expansion und Regulierung von Blutzellen in einem lebenden Organismus im Laufe der Zeit aktuell zu beobachten.
Insgesamt hat die Erhaltung des hämatopoetischen Systems, das Vorhandensein und die einfache Entwicklung von transgenen Linien, einfache Visualisierung und kurze Erzeugungszeit den Zebrafisch zu einem wirtschaftlichen, schnellen und anpassungsfähigen Modell der Hämatopoese gemacht. Um die Toolbox der Techniken zu verbessern, die für Zebrafischforscher zur Verfügung stehen, haben wir diesen Test entwickelt, um die Anzahl der Blutzellen in Embryonen robust zu quantisieren. Die Methode beinhaltet die Verdauung transgener Tiere und die Durchführung von Durchflusszytometrie für fluoreszierende Blutzellen. Auf diese Weise können Blutzellen von mutierten Tieren, die Wirkung der MO- und CRISPR-Modifikation und die Wirkung kleiner Moleküle schnell und reproduzierbar quantitativ analysiert werden. Diese Assays sind benutzerfreundliche und wirtschaftliche Möglichkeiten, Blutzellen aufzuzählen, was die Untersuchung ihrer Erzeugung, Proliferation und Wartung im Laufe der Zeit ermöglicht.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 ml MCF tube</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mm Polystyrene easygrip Petri dish</td>
			<td>Corning Falcon</td>
			<td>351008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml Polystyrene round bottom tube with cell strainer cap</td>
			<td>Corning Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria Fusion flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiolthreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>646563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (10x) with Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14080-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS 500 mL</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>100-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone PBS (1x)</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>sh30256.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Librease</td>
			<td>Roche Sigma-Aldrich</td>
			<td>5401119001</td>
			<td>dissociation protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Roche Sigma-Aldrich</td>
			<td>11459643001</td>
			<td>dechorionation protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Red Dead Cell Stain</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>S34859</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using flow cytometry to detect and quantitate altered blood formation in the developing zebrafish

Die Vielfalt der Zelllinien, die reifes Blut bei Wirbeltieren umfassen, ergibt sich aus der Differenzierung von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs). Dies ist ein kritischer Prozess, der während der gesamten Lebensdauer von Organismen auftritt, und Störungen der molekularen Bahnen, die während der Embryogenese beteiligt sind, können katastrophale langfristige Folgen haben. Aus einer Vielzahl von Gründen ist Zebrafisch (Danio rerio) zu einem Modellorganismus geworden, um Hämatopoese zu studieren. Zebrafisch-Embryonen entwickeln sich extern, und durch 7 Tage Nachfertilisation (dpf) haben die meisten subtypen der endgültigen Blutzellen produziert, die für ihre Lebensdauer bestehen bleiben. Es wurden Assays zur Bewertung der Anzahl hämatopoetischer Zellen entwickelt, die hauptsächlich spezifische histologische Flecken, In-situ-Hybridisierungstechniken und Mikroskopie von transgenen Tieren verwenden, die blutzellspezifische Promotoren verwenden, die die Expression fluoreszierender Proteine fördern. Die meisten Färbe-Assays und In-situ-Hybridisierungstechniken quantifizieren jedoch nicht genau die Anzahl der vorhandenen Blutzellen; nur große Unterschiede in der Zellenzahl sind leicht zu visualisieren. Die Verwendung transgener Tiere und die Analyse von Personen mit fluoreszierender oder konfokaler Mikroskopie kann durchgeführt werden, aber die Quantifizierung dieser Assays beruht entweder auf der manuellen Zählung oder der Verwendung teurer Bildgebungssoftware, die beide Fehler machen können. Die Entwicklung zusätzlicher Methoden zur Beurteilung der Blutzellzahlen wäre wirtschaftlich, schneller und könnte sogar automatisiert werden, um die Wirkung der CRISPR-vermittelten genetischen Veränderung, der Morpholino-vermittelten Transkriptreduktion und der Wirkung von Wirkstoffverbindungen, die Hämatopoese in großem Maßstab beeinflussen, schnell zu bewerten. Dieser neuartige Test zur Quantifizierung von Blutzellen wird durchgeführt, indem ganze Zebrafischembryonen getrennt und die Menge der fluoreszierend markierten Blutzellen analysiert wird. Diese Assays sollten eine Aufklärung der molekularen Bahnen ermöglichen, die für die Entstehung, Expansion und Regulation von Blutzellen während der Embryogenese verantwortlich sind, was es den Forschern ermöglichen wird, neue Faktoren, die während Blutkrankheiten verändert wurden, sowie Die Wege, die während der Evolution der Wirbeltierhämatopoese wesentlich sind, weiter zu entdecken.

Um rote Blutkörperchen in embryonalen Zebrafischen aufzuzählen, wurden lcr:GFP16 Embryonen im Einzellstadium mit PBS, 7,0 ng/nL ism1 MO oder 7,0 ng/nL ism1 MO mit 7,0 ng ism1 mRNA12injiziert. Bei 48 hpf wurden sie verdaut und einer Strömungszytometrie-Analyse unterzogen. Nach der Analyse des Prozentsatzes der GFP+ rote Blutkörperchen aus jeder Probe (jede Probe ist 5 zufällig ausgewählte E...

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Using Flow Cytometry to Detect and Quantitate Altered Blood Formation in the Developing Zebrafish

Dieser Test ist eine einfache Methode, um hämatopoetische Zellen bei der Entwicklung embryonaler Zebrafische zu quantitieren. Blutzellen von dissoziierten Zebrafischen werden einer Durchflusszytometrie-Analyse unterzogen. Dies ermöglicht den Nachweis von Blutdefekten bei mutierten Tieren und nach genetischer Veränderung.

Verwendung der Durchflusszytometrie zum Erkennen und Quantitieren veränderter Blutbildung in den sich entwickelnden Zebrafischen

The diversity of cell lineages that comprise mature blood in vertebrate animals arise from the differentiation of hematopoietic stem and progenitor cells ...

Dieses Protokoll ist wichtig, weil es den Knockdown und die Überexpression von Genen in einem sich entwickelnden Fisch und die Quantifizierung dieser nachgelagerten Effekte auf Blutzellen ermöglicht. Dieses Protokoll ist schnell, einfach durchzuführen, wirtschaftlich und einfach zu automatisieren mit Demzugriff auf die richtige Instrumentierung. Demonstriert wird dieses Verfahren von Kristen Rueb, einer Forscherin im Labor.Beginnen Sie mit der Übertragung zwischen fünf und 200, 48 Stunden nach der Befruchtung Embryonen in eine Kunststoff 10 Zentimeter Petrischale. Neigen Sie die Schale so, dass der Embryo an den unteren Rand sinken, und entfernen Sie so viel E3 Medium wie möglich aus der Schale. Dann 500 Mikroliter Dechorionation Protease zu den Embryonen hinzufügen.Nach fünf Minuten bei Raumtemperatur alle Embryonen wieder an den unteren Rand der Platte kippen und sanft auf die Seite der Schale tippen, so dass die Embryonen sanft an der Unterseite der Platte reiben können, um ihre Krähen vollständig zu entfernen. Mit einer Squeeze-Flasche etwa 20 Milliliter E3 Medium hinzufügen, um die Protease zu verdünnen, und lassen Sie die Embryonen absetzen. Dann dekantieren Sie das Medium, und spülen Sie die Embryonen dreimal mit frischem Medium, wie gerade gezeigt, um alle Spuren der Protease zu entfernen.Um die Embryonen auf die Dissoziation vorzubereiten, verwenden Sie eine P1000 Pipette, um fünf bis zehn Embryonen in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr zu übertragen und das übertragene E3-Medium anzusaugen. Dann fügen Sie einen Milliliter 10 Millimolar DTT in E3 Medium zu den embryonalen Zebrafischen, und legen Sie das Mikrozentrifugenrohr in einer horizontalen Position für 30 Minuten bei Raumtemperatur, um die Schleimbeschichtung zu entfernen. Für die Embryodissoziation die von DTT behandelten Embryonen dreimal mit einem Milliliter DPBS, ergänzt mit Kalzium und Magnesium pro Wäsche, waschen.Vor zugabe von 500 Mikroliter dPBS, ergänzt mit Kalzium und Magnesium, und fünf Mikroliter von fünf Milligramm pro Milliliter, Dissoziation Protease. Dann inkubieren Sie die Proben bei 37 Grad Celsius auf einem horizontalen Orbital-Shaker bei 185 Umdrehungen pro Minute für 60 Minuten. Achten Sie darauf, regelmäßig auf die Embryonen zu überprüfen, so dass Sie sie nicht überverdauen.Wenn eine nicht vollständig homogene Probe mit etwas festem Gewebe beobachtet werden kann, trituieren Sie die Embryonen mit einer P1000 Pipette, bis die Probe vollständig getrennt ist. Um die dissoziierten Zebrafisch-Embryonalzellen auf die Durchflusszytometrie vorzubereiten, übertragen Sie die gesamte Zellprobe auf das obere Reservoir eines fünf Milliliter Polystyrol-Rundbodenrohrs mit einer 35 Mikrometer-Zellsiebkappe. Spülen Sie die Kappe mit vier Millilitern PBS ohne Kalzium oder Magnesium und pellet die Zellen durch Zentrifugation.Dann setzen Sie die Zellen in 500 Mikroliter PBS ohne Kalzium und Magnesium pro Tube wieder aus. Für die zytometrische Analyse der embryonalen Zebrafische wirbeln die Zellsuspensionen sanft, bevor Sie jeder Röhre eine Verdünnung roter toter Zellen hinzufügen. Innerhalb von 30 Minuten nach dem Auftragen des toten Zellflecks, leeren Sie den Abfallbehälter, füllen Sie den Manteltank mit der entsprechenden Lösung, und starten Sie das Fluidsystem des Durchflusszytometers.Zeichnen Sie in der Analysesoftware fünf Diagramme, und legen Sie das erste Diagramm fest, um vorwärts versus seitenstreuend zu messen. Legen Sie die Vorwärtsstreuung auf linear und die Seitenstreuung auf logarithmisch fest. Legen Sie das zweite Diagramm fest, um die Vorwärtsstreuhöhe im Vergleich zur Streubreite nach vorne zu messen, und das dritte Diagramm, um die Streuhöhe im Vergleich zur Seitenstreuungsbreite zu messen.Legen Sie das vierte Diagramm fest, um den roten Fleck für tote Zellen auf der x-Achse und die Seitenstreuung auf der y-Achse zu messen, um die Diskriminierung von Leben von toten Zellen zu ermöglichen. Das fünfte Diagramm sollte so festgelegt werden, dass das Fluorophor der Wahl gemessen wird. Wenn alle Diagramme festgelegt sind, laden Sie die Probe auf das Zytometer, und reduzieren Sie den Durchfluss, damit die Zellen nicht schnell auslaufen.Passen Sie die Einstellungen für die Vorwärts- und Seitenstreuung so an, dass der Großteil der Zellpopulation deutlich beobachtet werden kann, und zeichnen Sie ein Tor um die Zellpopulation. Beschriften Sie diese Gate-Zellen. Mit dem zweiten Punkt-Plot auf den Zellen, Tor auf Vorwärts-Streuung und die Seite Streuner Singlets, um Doublets auszuschließen.Passen Sie im vierten Diagramm die Einstellungen für rote tote Zellen so an, dass eine deutlich negative Population vorhanden ist. Zeichnen Sie ein Tor um diese Zellen und beschriften Sie dieses Tor als lebende Zellen. Im fünften Plot, Tor auf den lebenden Zellen und zeichnen Sie ein Tor um die positiven Zellen, dann laufen jede Probe sammeln mindestens 25 000 Live-Zell-Ereignisse.Wenn alle Proben analysiert wurden, folgen Sie dem Abschaltvorgang, um die Fluide auszuschalten, den Manteltank nachzufüllen und den Abfallbehälter zu entleeren. Nach der Analyse des Prozentsatzes der GFP-positiven roten Blutkörperchen aus jeder embryonalen Zebrafischprobe kann der Durchschnitt aller Kontrollgruppen berechnet werden. In der Regel wird der Durchschnitt als eins festgelegt, und alle Prozentsätze werden von diesem Referenzpunkt berechnet.In dieser repräsentativen Analyse wurde festgestellt, dass die Reduzierung der ISM1-Transkription mit einem spezifischen Morpholino die Anzahl der GFP-positiven roten Blutkörperchen innerhalb von 48 Stunden nach der Befruchtung Embryonen reduzieren. Durch die Rettung dieser Reduktion des ISM1-Morpholinospiegels mit exogener mRNA wird die Anzahl der roten Blutkörperchen wieder normalisiert. Die richtige Verdauung der Proben ist entscheidend.Wenn Sie über- oder unter-verdauen, erhalten Sie nicht die richtigen Ergebnisse. Wenn ein Faxgerät zur Verfügung steht, können Forscher die Blutzellen sammeln, indem sie nach In-vitro-Kultur, RNA-Sequenzierung und quantitativer RT-PCR sortieren.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse von Zebrafisch-Larven Skelettmuskel Integrität mit Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technik auf Zielmikroinjektions an die Entwicklungs<em&gt; Xenopus</em&gt; Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Mit Lichtblatt Fluoreszenzmikroskopie Bild Zebrabärbling Augenentwicklung

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Identifizierung von Erythromyeloid Progenitoren und deren Nachkommen in der Maus Embryo Durch Durchflusszytometrie

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

Isolating and Analyzing Cells of the Pancreas Mesenchyme by Flow Cytometry

Isolierung und Analyse von Zellen des Pankreas Mesenchyme durch Durchflusszytometrie

The pancreas is comprised of epithelial cells that are required for food digestion and blood glucose regulation. Cells of the pancreas microenvironment, ...

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Chondrogene Pelletbildung aus Cord Blut-induzierten induzierten pluripotenten Stammzellen

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells HSPCs in Developing Zebrafish Embryos

Entwicklung eines In-vitro- Assay, hämatopoetischen Stammzellen und Vorläuferzellen Quantitate Zellen (HSPCs) bei der Entwicklung von Zebrafish Embryos

Hematopoiesis is an essential cellular process in which hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) differentiate into the multitude of different cell ...

Use of Hematopoietic Stem Cell Transplantation to Assess the Origin of Myelodysplastic Syndrome

Einsatz von hämatopoetischen Stammzelltransplantation zu beurteilen, den Ursprung des myelodysplastischen Syndroms

Myelodysplastic syndromes (MDS) are a diverse group of hematopoietic stem cell disorders that are defined by ineffective hematopoiesis, peripheral blood ...

Real-time Live-cell Flow Cytometry to Investigate Calcium Influx, Pore Formation, and Phagocytosis by P2X7 Receptors in Adult Neural Progenitor Cells

Echtzeit Live-Zelle Durchflusszytometrie, Calcium Zustrom, Porenbildung und Phagozytose durch P2X7-Rezeptoren im Erwachsenen neurale Vorläuferzellen zu untersuchen

Live-cell flow cytometry is increasingly used among cell biologists to quantify biological processes in a living cell culture. This protocol describes a ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Ganz-Mount-In-Situ-Hybridisierung in Zebrafisch-Embryonen und Tube-Formations-Assay in iPSC-ECs zur Untersuchung der Rolle von Endoglin in der Gefäßentwicklung

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...