Name: using flow cytometry to detect and quantitate altered blood formation in the developing zebrafish
Uploaded: 2021-04-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Flow Cytometry to Detect and Quantitate Altered Blood Formation in the Developing Zebrafish at JoVE.com

המימון ניתן על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH: R15 DK114732-01 ל- D.L.S.), הקרן הלאומית למדע (NSF: MRI 1626406 ל- D.L.S.), ומתוכנית הכבוד באוניברסיטת קליפורניה צ'יקו (ל- K.F.R.). המחברים מודים לבטסי טמיאטי על ניהול המעבדה וקתי ג'ונס על הסיוע האדמיניסטרטיבי.

הוועדה המייעצת לטיפול ושימוש בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) באוניברסיטת קליפורניה סטייט, צ'יקו, אישרה את כל השיטות המתוארות להלן.
הערה: מומלץ לטפל בעוברים עם 1-פניל 2-תיוריאה (PTU; טבלה 1) ב 24 שעות לאחר ההפרה (hpf) כדי למנוע פיגמנטציה אשר משפיע לרעה על אפליה פלואורסצנטית על ידי cyto...

<ol>
	<li>Driever, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+for+mutations+affecting+embryogenesis+in+zebrafish.">A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish.</a> Development. 123, 37-46 (1996).</li><li>Weinstein, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+mutations+in+the+zebrafish.">Hematopoietic mutations in the zebrafish.</a> Development. , 303-309 (1996).</li><li>Ransom, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+zebrafish+mutants+with+defects+in+embryonic+hematopoiesis.">Characterization of zebrafish mutants with defects in embryonic hematopoiesis.</a> Development. 123, 311-319 (1996).</li><li>Amsterdam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large-scale+insertional+mutagenesis+screen+in+zebrafish.">A large-scale insertional mutagenesis screen in zebrafish.</a> Genes &amp; Development. 13, 2713-2724 (1999).</li><li>Gaiano, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+mutagenesis+and+rapid+cloning+of+essential+genes+in+zebrafish.">Insertional mutagenesis and rapid cloning of essential genes in zebrafish.</a> Nature. 383, 829-832 (1996).</li><li>Yeh, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovering+chemical+modifiers+of+oncogene-regulated+hematopoietic+differentiation.">Discovering chemical modifiers of oncogene-regulated hematopoietic differentiation.</a> Nature Chemical Biology. 5, 236-243 (2009).</li><li>Paik, E. J., de Jong, J. L., Pugach, E., Opara, P., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+genetic+screen+in+zebrafish+for+pathways+interacting+with+cdx4+in+primitive+hematopoiesis.">A chemical genetic screen in zebrafish for pathways interacting with cdx4 in primitive hematopoiesis.</a> Zebrafish. 7, 61-68 (2010).</li><li>Ridges, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+screen+identifies+novel+compound+with+selective+toxicity+against+leukemia.">Zebrafish screen identifies novel compound with selective toxicity against leukemia.</a> Blood. 119, 5621-5631 (2012).</li><li>North, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostaglandin+E2+regulates+vertebrate+haematopoietic+stem+cell+homeostasis.">Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis.</a> Nature. 447, 1007-1011 (2007).</li><li>Astuti, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Functional+Bioluminescent+Zebrafish+Screen+for+Enhancing+Hematopoietic+Cell+Homing.">A Functional Bioluminescent Zebrafish Screen for Enhancing Hematopoietic Cell Homing.</a> Stem Cell Reports. 8, 177-190 (2017).</li><li>Stachura, D. L., Traver, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+dissection+of+zebrafish+hematopoiesis.">Cellular dissection of zebrafish hematopoiesis.</a> Methods in Cell Biology. 133, 11-53 (2016).</li><li>Berrun, A. C., Stachura, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+In+Vitro+Assay+to+Quantitate+Hematopoietic+Stem+and+Progenitor+Cells+(HSPCs)+in+Developing+Zebrafish+Embryos.">Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (129), e56836 (2017).</li><li>Westerfield, M., Zon, L. I., Detrich, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Essential Zebrafish Methods: Cell and Developmental Biology. , (2009).</li><li>Drummond, I. A., Davidson, A. J., Detrich, H. W., Westerfield, M., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Kidney+Development.">Zebrafish Kidney Development.</a> The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, Part A. 100, 233-260 (2010).</li><li>Traver, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+and+in+vivo+imaging+of+multilineage+engraftment+in+zebrafish+bloodless+mutants.">Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants.</a> Nature Immunology. 4, 1238-1246 (2003).</li><li>Ganis, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+globin+switching+occurs+in+two+developmental+stages+and+is+controlled+by+the+LCR.">Zebrafish globin switching occurs in two developmental stages and is controlled by the LCR.</a> Developmental Biology. 366, 185-194 (2012).</li><li>Renshaw, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation.">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108, 3976-3978 (2006).</li><li>Lin, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+thrombocyte+development+in+CD41-GFP+transgenic+zebrafish.">Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish.</a> Blood. 106, 3803-3810 (2005).</li><li>Page, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evolutionarily+conserved+program+of+B-cell+development+and+activation+in+zebrafish.">An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish.</a> Blood. 122, e1-e11 (2013).</li><li>Ding, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+High-Throughput+Flow+Cytometry+in+Early+Drug+Discovery:+An+AstraZeneca+Perspective.">Application of High-Throughput Flow Cytometry in Early Drug Discovery: An AstraZeneca Perspective.</a> SLAS Discovery. 23, 719-731 (2018).</li><li>Ding, M., Kaspersson, K., Murray, D., Bardelle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+flow+cytometry+for+drug+discovery:+principles,+applications,+and+case+studies.">High-throughput flow cytometry for drug discovery: principles, applications, and case studies.</a> Drug Discovery Today. 22, 1844-1850 (2017).</li><li>Joslin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Fully+Automated+High-Throughput+Flow+Cytometry+Screening+System+Enabling+Phenotypic+Drug+Discovery.">A Fully Automated High-Throughput Flow Cytometry Screening System Enabling Phenotypic Drug Discovery.</a> SLAS Discovery. 23, 697-707 (2018).</li></ol>

דגי זברה הם מערכת מודל מצוינת לחקר המטופוזיס פרימיטיבי ומוחלט של בעלי חוליות. במהלך העשורים האחרונים פותחו ושוכללו מבחנים מרובים, המאפשרים לדגי זברה להפוך למודל מהיר וחסכוני לבדיקת תרופות, יצירה ובדיקה של מוטנטים גנטיים, ובסך הכל מאפשרים לחוקרים לנתח מסלולים מולקולריים החיוניים להמטופו...

ייצור דם (hematopoiesis) הוא תהליך התפתחותי חיוני שמתחיל לראשונה בעובר המוקדם. תהליך זה מתחיל על ידי יצירת תאי דם אדומים פרימיטיביים מקרופאגים ישירות mesoderm, ומאוחר יותר נע לעבר הייצור של גזע hematopoietic ותאי אב (HSPCs). תאי גזע אלה, שהם רב-פוטנטיים, מייצרים את כל הזנים של תאי דם בוגרים באורגניזם. המערכת, המסוגלת לחדש את עצמה, מתחדשת ללא הרף באמצעות HSPCs אלה. בעוד תהליך זה מתחיל בשלב מוקדם בפיתוח, hematopoiesis ממשיך בחייו של החיה, מתן היכולת להעביר חמצן לאתרים רחוקים של הגוף, להפסיק דימום לאחר פציעה, כדי להגן על הגוף מפני זיהום. ההתפתחות של מערכת מורכבת זו נשלטת זמנית וספטילית במהלך הפיתוח וכל הפרעה בייצור תאי הדם יכולה להיות קטסטרופלית עבור האורגניזם, וכתוצאה מכך אנמיה, תרומבוציטופניה, לויקופניה ולוקמיה.
מודל חיה פופולרי המשמש למחקר hematopoietic הוא דג הזברה (דניו rerio) כי יש להם התפתחות דם דומה בהשוואה לבני אדם. למעשה, רבים מהגנים והמסלולים המולקולריים המשמשים במהלך hematopoiesis נשמרים לאורך האבולוציה החולייתנית, ומאפשרים לנו ללמוד על הגנים האנושיים על ידי לימוד זברה. חשוב לציין, עוברי זברה מתפתחים מחוץ לגוף ובתוך 7 ימים יצרו את סוגי תאי הדם הבוגרים ביותר, המאפשרים הדמיה ישירה של המערכת hematopoietic בתוך זמן קצר. דגי זברה הם גם פוריים ביותר, מה שמאפשר לחוקרים להתבונן במספר גדול יותר של דגימות במסגרת זמן קצרה, שחשובה גם ליצירת נתונים הניתנים לשחזור. זמן הדור הקצר של הזברה ופיתוח חיצוני מספק מניפולציה קלה יותר והתבוננות במהלך מחקרי mutagenesis1,2,3,4,5 ו סינון סמים6,7,8,9,10. זה מאפשר פאנל של תרכובות טיפוליות מבטיחות עבור הפרעות דם אנושי להיבדק במהירות וביעילות.
חשוב לציין, דגי זברה הם גם נוחים מבחינה גנטית, ואת הגנום הוא רצף ביאורים. אחיזה זו מאפשרת לבצע טכניקות גנטיקה הפוכה כגון הפלה בתיווך מורפולינו (MO-) ואבלציה גנטית בתיווך CRISPR. דגי זברה הוכיחו גם את התועלת שלהם כמודל לביצוע מסכים גנטיים קדמיים; גנים ומסלולים חיוניים רבים המעורבים בהיווצרות דם בעלי חוליות התגלו באופן זה. שיטות רבות של התבוננות בתאי דם פותחו גם זברה. בעוד טכניקות כתמים היסטולוגיות מסורתיות קיימות, ניתן גם לבצע במקום הכלאה עבור תעתיקים ספציפיים לדם. חשוב לציין, קווים מהונדסים רבים של דגים קיימים גם לפיה חלבונים פלואורסצנטיים באים לידי ביטוי על ידי מקדמים ספציפיים לשושלת, המאפשר תיוג של תאי דם ספציפיים עם חלבונים פלואורסצנטיים11. זה מאפשר לחוקרים לבצע תצפית עדכנית של בראשית תאי הדם, התרחבות ורגולציה באורגניזם חי לאורך זמן.
בסך הכל, שימור המערכת hematopoietic, נוכחות ופיתוח קל של קווים מהונדסים, הדמיה קלה, וזמן הדור הקצר הפך את דג הזברה מודל חסכוני, מהיר, הסתגלות של hematopoiesis. כדי לשפר את ארגז הכלים של טכניקות הזמינות לחוקרי זברה, פיתחנו את ההסמכה הזו כדי לכמת באופן חזק את מספר תאי הדם בעוברים. השיטה כוללת עיכול בעלי חיים מהונדסים וביצוע ציטומטריית זרימה לתאי דם פלואורסצנטיים. בדרך זו, תאי דם מבעלי חיים מוטנטים, ההשפעה של שינוי MO ו CRISPR, ואת ההשפעה של מולקולות קטנות ניתן לנתח כמותית באופן מהיר לשחזור. מבחנים אלה הם דרכים ידידותיות למשתמש וחסכוניות לספירת תאי דם, המאפשרות בדיקה של הדור שלהם, התפשטות, ותחזוקה לאורך זמן.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 ml MCF tube</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mm Polystyrene easygrip Petri dish</td>
			<td>Corning Falcon</td>
			<td>351008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml Polystyrene round bottom tube with cell strainer cap</td>
			<td>Corning Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria Fusion flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiolthreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>646563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (10x) with Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14080-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS 500 mL</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>100-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone PBS (1x)</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>sh30256.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Librease</td>
			<td>Roche Sigma-Aldrich</td>
			<td>5401119001</td>
			<td>dissociation protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Roche Sigma-Aldrich</td>
			<td>11459643001</td>
			<td>dechorionation protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Red Dead Cell Stain</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>S34859</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using flow cytometry to detect and quantitate altered blood formation in the developing zebrafish

המגוון של שושלת התאים המרכיבים דם בוגר בבעלי חוליות נובע מההבחנה בין תאי גזע וחולי אב מהמטופויטיים (HSPCs). זהו תהליך קריטי המתרחש לאורך תוחלת החיים של אורגניזמים, ושיבוש המסלולים המולקולריים המעורבים במהלך עובר יכול להיות בעל השלכות קטסטרופליות לטווח ארוך. מסיבות רבות, דג זברה (דניו rerio) הפך אורגניזם מודל ללמוד hematopoiesis. עוברי זברה מתפתחים מבחוץ, ובמשך 7 ימים לאחר ההפרה (dpf) יצרו את רוב תת-הסוגים של תאי דם סופיים שיימשכו לאורך חייהם. בדיקות להערכת מספר התאים ההמטופיאטיים פותחו, בעיקר תוך שימוש בכתמים היסטולוגיים ספציפיים, בטכניקות הכלאה במקום, ובמיקרוסקופיה של בעלי חיים מהונדסים המשתמשים ביחצנים ספציפיים לתאי הדם המניעים את הביטוי של חלבונים פלואורסצנטיים. עם זאת, רוב מבחני הכתמים ובטכניקות הכלאה באתרו אינם מכמתים במדויק את מספר תאי הדם הקיימים; ניתן לראות בקלות רק הבדלים גדולים במספרי התאים. שימוש בבעלי חיים מהונדסים וניתוח אנשים עם מיקרוסקופיה פלואורסצנטית או confocal ניתן לבצע, אבל הכמות של מבחנים אלה מסתמך על ספירה ידנית או ניצול תוכנת הדמיה יקרה, שניהם יכולים לעשות טעויות. פיתוח שיטות נוספות להערכת מספרי תאי הדם יהיה חסכוני, מהיר יותר, ואף יכול להיות אוטומטי כדי להעריך במהירות את ההשפעה של שינוי גנטי בתיווך CRISPR, הפחתת תעתיק בתיווך מורפולינו, ואת ההשפעה של תרכובות סמים המשפיעים hematopoiesis בקנה מידה גדול. זה מבחנים חדשניים כדי לכמת תאי דם מבוצעת על ידי ניתוק עוברי זברה שלמים וניתוח כמות תאי הדם שכותרתו פלואורסצנטית נוכח. מבחנים אלה צריכים לאפשר הבהרות של מסלולים מולקולריים האחראים על ייצור תאי הדם, התרחבות ורגולציה במהלך העובר, אשר יאפשר לחוקרים לגלות עוד יותר גורמים חדשניים ששונו במהלך מחלות דם, כמו גם מסלולים חיוניים במהלך האבולוציה של hematopoiesis בעלי חוליות.

כדי למנות תאי דם אדומים בזברה עוברית, lcr:GFP16 עוברים הוזרקו בשלב אחד עם PBS, 7.0 ng/nL ism1 MO, או 7.0 ng/nL ism1 MO עם 7.0 ng ism1 mRNA12. ב 48 hpf הם התעכלו ונתנו ניתוח cytometry זרימה. לאחר ניתוח אחוז GFP+ כדוריות דם אדומות מכל מדגם (כל מדגם הוא 5 עוברים שנבח?...

Watch this Scientific Journal Video about Using Flow Cytometry to Detect and Quantitate Altered Blood Formation in the Developing Zebrafish at JoVE.com

Using Flow Cytometry to Detect and Quantitate Altered Blood Formation in the Developing Zebrafish

בדיקה זו היא שיטה פשוטה לכמת תאים hematopoietic בפיתוח זברה עוברית. תאי דם של דגי זברה מנותקים נתונים לניתוח ציטומטריה זרימה. זה מאפשר גילוי של מומים בדם בבעלי חיים מוטנטים ולאחר שינוי גנטי.

שימוש בציטומטריית זרימה כדי לזהות ולכמת היווצרות דם שהשתנתה בדגי הזברה המתפתחים

The diversity of cell lineages that comprise mature blood in vertebrate animals arise from the differentiation of hematopoietic stem and progenitor cells ...

פרוטוקול זה הוא משמעותי משום שהוא מאפשר הפלה וביטוי יתר של גנים בדג מתפתח, ואת הכמות של אלה השפעות במורד הזרם על תאי הדם. פרוטוקול זה מהיר, קל לביצוע, חסכוני וקל לאוטומציה עם גישה למכשור הנכון. הדגמת הליך זה תהיה קריסטן רוב, חוקרת לתואר ראשון במעבדה.התחל על ידי העברת בין חמש ל 200, 48 שעות לאחר הפריה עוברים לתוך צלחת פלסטיק 10 ס"מ פטרי. להטות את המנה כך העובר לשקוע לקצה התחתון, ולהסיר כמה שיותר E3 בינוני מן המנה ככל האפשר. לאחר מכן להוסיף 500 מיקרוליטרים של פרוטאז dechorionation לעוברים.לאחר חמש דקות בטמפרטורת החדר, להטות את כל העוברים לקצה התחתון של הצלחת שוב בעדינות להקיש על הצד של המנה, המאפשר לעוברים לשפשף בעדינות על החלק התחתון של הצלחת כדי להסיר לחלוטין את chorions שלהם. באמצעות בקבוק לסחוט להוסיף כ 20 מיליליטר של E3 בינוני כדי לדלל את הפרוטאז, ולאפשר לעוברים להתיישב. ואז decant המדיום, ולשטוף את העוברים שלוש פעמים נוספות עם מדיום טרי כפי שהוכח רק כדי להסיר את כל העקבות של פרוטאז.כדי להכין את העוברים לניתוק, השתמש בפיפט P1000 כדי להעביר חמישה עד עשרה עוברים לצינור צנטריפוגה אחד, 1.5 מיליליטר מיקרו, ושואף את המדיום E3 שהועבר. לאחר מכן הוסיפו מיליליטר אחד של 10 מילימולאר DTT במדיום E3 לדג הזברה העוברי, והניחו את צינור המיקרוצנטריפוגה במצב אופקי במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי להסיר את ציפוי הריר. לניתוק עוברים, שטפו את העוברים שטופלו ב-DTT שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של DPBS בתוספת סידן ומגנזיום לכביסה.לפני הוספת 500 מיקרוליטרים של DPBS בתוספת סידן ומגנזיום, וחמישה microliters של חמישה מיליגרם למיליליטר, פרוטאז דיסוציאציה. ואז להדגיר את הדגימות ב 37 מעלות צלזיוס על שייקר מסלולי אופקי ב 185 מהפכות לדקה במשך 60 דקות. הקפד לבדוק מעת לעת על העוברים, כך שאתה לא מעל לעכל אותם.כאשר מדגם לא הומוגני לחלוטין עם כמה רקמה מוצקה נוכח ניתן לראות, triturate העוברים עם P1000 פיפטה עד המדגם מנותק לחלוטין. כדי להכין את התאים העובריים של זברה-דג מנותקים לציטומטריית זרימה, העבירו את כל דגימת התא למאגר העליון של צינור תחתונה עגול של 5 מיליליטר פוליסטירן, עם כובע מסננת תאים של 35 מיקרומטר. לשטוף את הכובע עם ארבעה מיליליטר של PBS ללא סידן או מגנזיום, וכדור התאים על ידי צנטריפוגה.ואז resuspend התאים ב 500 מיקרוליטרים של PBS ללא סידן ומגנזיום לכל צינור. לניתוח ציטומטרי זרימה של תאים עובריים זברה, בעדינות מערבולת התא השעיות לפני הוספת דילול של אחד לאלף של כתם תא מת אדום לכל צינור. תוך 30 דקות מיישום כתם התא המת, רוקנו את מיכל הפסולת, מלאו את מיכל הנדן בתמיסה המתאימה, והתחילו את המערכת הנוזלית של ציטומטר הזרימה.בתוכנת הניתוח, צייר חמש חלקות והגדר את העלילה הראשונה למדידה קדימה לעומת פיזור צדדי. הגדר את הפיזור קדימה ליניארי, ואת פיזור הצד ללוגריתמי. הגדר את החלקה השניה כך תמדוד גובה פיזור קדימה לעומת רוחב פיזור קדימה, ואת החלקה השלישית למדידת גובה הפיזור לעומת רוחב הפיזור הצדדי.הגדר את העלילה הרביעית כדי למדוד את כתם התא המת האדום על ציר ה- x, ואת פיזור הצד על ציר y כדי לאפשר אפליה של חיים מתאים מתים. העלילה החמישית צריכה להיות מוגדרת כדי למדוד את הפלואורופור של בחירה. כאשר כל ההתוויות הוגדרו, טען את הדגימה על הסייטומטר והפחת את קצב הזרימה כך שהתאים לא ייגמרו במהירות.התאם את הגדרות הפיזור קדימה וצד כך שניתן יהיה לצפות בבירור בחלק הארי של אוכלוסיית התאים, וצייר שער סביב אוכלוסיית התאים. תייג את תאי השער האלה. עם עלילת הנקודה השנייה מגודרת על התאים, שער על פיזור קדימה ואת סינגלים פיזור בצד כדי לא לכלול כפילויות.בחלקה הרביעית, להתאים את הגדרות כתם התא המת האדום, כך שיש אוכלוסייה שלילית בבירור. צייר שער סביב תאים אלה ולתייג את השער הזה תאים חיים. בחלקה החמישית, שער על התאים החיים ולצייר שער סביב התאים החיוביים, ואז להפעיל כל מדגם איסוף לפחות 25, 000 אירועים תא חי.כאשר כל הדגימות נותחו, בצע את הליך הכיבוי כדי לכבות את fluidics, למלא את מיכל נדן ולרוקן את מיכל האשפה. לאחר ניתוח אחוז תאי הדם האדומים החיוביים של GFP מכל דגימת זברה עוברית, ניתן לחשב את הממוצע של כל קבוצת הביקורת. בדרך כלל, הממוצע מוגדר כאחד וכל האחוזים מחושבים מנקודת התייחסות זו.בניתוח מייצג זה, נקבע כי הפחתת תעתיק ISM1 עם מורפולינו ספציפי, להפחית את מספר תאי הדם האדומים החיוביים GFP נוכח בתוך 48 שעות לאחר הפריה עוברים. הצלת ירידה זו ברמות מורפולינו ISM1 עם mRNA אקסוגני, להחזיר את מספר תאי הדם האדומים לנורמלי. עיכול נכון על הדגימות הוא קריטי.אם אתה מעכל יתר על הערך או מעכל, לא תקבל את התוצאות הנכונות. אם מכשיר פקס זמין, החוקרים יכולים לאסוף את תאי הדם על ידי מיון עבור תרבות במבחנה, רצף RNA ו RT-PCR כמותי.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

ניתוח של יושרה שריר שלד דג הזברה זחלים עם אוונס הכחול צבע

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

טכניקה לכוון Microinjection אל פיתוח<em&gt; Xenopus</em&gt; כליה

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי גיליון אור פיתוח תמונה דג הזברה העין

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

זיהוי של אבות אריתרומיאלואידים צאצאיהם בעובר עכבר על ידי זרימת cytometry

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

Isolating and Analyzing Cells of the Pancreas Mesenchyme by Flow Cytometry

בידוד וניתוח תאים של mesenchyme הלבלב ידי cytometry הזרימה

The pancreas is comprised of epithelial cells that are required for food digestion and blood glucose regulation. Cells of the pancreas microenvironment, ...

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Chondrogenic גלולה היווצרות דם טבורי הנגזרות Pluripotent תאים גזעיים

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells HSPCs in Developing Zebrafish Embryos

התפתחות במבחנה הנועד Quantitate גזע Hematopoietic, קדמון תאים (HSPCs) בפיתוח עוברי דג זברה

Hematopoiesis is an essential cellular process in which hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) differentiate into the multitude of different cell ...

Use of Hematopoietic Stem Cell Transplantation to Assess the Origin of Myelodysplastic Syndrome

השימוש השתלת תא גזע Hematopoietic להעריך את מקורם של התסמונת המיאלודיספלסטית

Myelodysplastic syndromes (MDS) are a diverse group of hematopoietic stem cell disorders that are defined by ineffective hematopoiesis, peripheral blood ...

Real-time Live-cell Flow Cytometry to Investigate Calcium Influx, Pore Formation, and Phagocytosis by P2X7 Receptors in Adult Neural Progenitor Cells

Cytometry זרימה לחיות תאים בזמן אמת כדי לחקור סידן זרם היווצרות נקבובית, Phagocytosis על ידי רצפטורים P2X7 ובתאים עצבית למבוגרים

Live-cell flow cytometry is increasingly used among cell biologists to quantify biological processes in a living cell culture. This protocol describes a ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

הר שלם בתוך היברידיזציה ב-Zebrafish עוברים ושיטת היווצרות צינור ב-iPSC-ECs ללמוד את התפקיד של אנגלין בפיתוח כלי דם

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...