Name: using flow cytometry to detect and quantitate altered blood formation in the developing zebrafish
Uploaded: 2021-04-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Flow Cytometry to Detect and Quantitate Altered Blood Formation in the Developing Zebrafish at JoVE.com

I finanziamenti sono stati forniti dal National Institutes of Health (NIH: R15 DK114732-01 a D.L.S.), dalla National Science Foundation (NSF: MRI 1626406 to D.L.S.), e dal Honor's Program della California State University Chico (a K.F.R.). Gli autori ringraziano Betsey Tamietti per la gestione del laboratorio e Kathy Johns per l'assistenza amministrativa.

Il comitato consultivo institutional animal care and use committee (IACUC) della California State University di Chico ha approvato tutti i metodi descritti di seguito.
NOTA: Si consiglia di trattare embrioni con 1-fenil 2-tiourea (PTU; Tabella 1) La commissione per l' a 24 ore di postfertilizzazione (hpf) per prevenire la pigmentazione che influisce negativamente sulla discriminazione della fluorescenza per citometria del flusso. Tutte le procedure elencate di seguito sono acc...

<ol>
	<li>Driever, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+for+mutations+affecting+embryogenesis+in+zebrafish.">A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish.</a> Development. 123, 37-46 (1996).</li><li>Weinstein, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+mutations+in+the+zebrafish.">Hematopoietic mutations in the zebrafish.</a> Development. , 303-309 (1996).</li><li>Ransom, D. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovering+chemical+modifiers+of+oncogene-regulated+hematopoietic+differentiation.">Discovering chemical modifiers of oncogene-regulated hematopoietic differentiation.</a> Nature Chemical Biology. 5, 236-243 (2009).</li><li>Paik, E. J., de Jong, J. L., Pugach, E., Opara, P., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+genetic+screen+in+zebrafish+for+pathways+interacting+with+cdx4+in+primitive+hematopoiesis.">A chemical genetic screen in zebrafish for pathways interacting with cdx4 in primitive hematopoiesis.</a> Zebrafish. 7, 61-68 (2010).</li><li>Ridges, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+screen+identifies+novel+compound+with+selective+toxicity+against+leukemia.">Zebrafish screen identifies novel compound with selective toxicity against leukemia.</a> Blood. 119, 5621-5631 (2012).</li><li>North, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostaglandin+E2+regulates+vertebrate+haematopoietic+stem+cell+homeostasis.">Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis.</a> Nature. 447, 1007-1011 (2007).</li><li>Astuti, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Functional+Bioluminescent+Zebrafish+Screen+for+Enhancing+Hematopoietic+Cell+Homing.">A Functional Bioluminescent Zebrafish Screen for Enhancing Hematopoietic Cell Homing.</a> Stem Cell Reports. 8, 177-190 (2017).</li><li>Stachura, D. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+globin+switching+occurs+in+two+developmental+stages+and+is+controlled+by+the+LCR.">Zebrafish globin switching occurs in two developmental stages and is controlled by the LCR.</a> Developmental Biology. 366, 185-194 (2012).</li><li>Renshaw, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation.">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108, 3976-3978 (2006).</li><li>Lin, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+thrombocyte+development+in+CD41-GFP+transgenic+zebrafish.">Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish.</a> Blood. 106, 3803-3810 (2005).</li><li>Page, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evolutionarily+conserved+program+of+B-cell+development+and+activation+in+zebrafish.">An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish.</a> Blood. 122, e1-e11 (2013).</li><li>Ding, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+High-Throughput+Flow+Cytometry+in+Early+Drug+Discovery:+An+AstraZeneca+Perspective.">Application of High-Throughput Flow Cytometry in Early Drug Discovery: An AstraZeneca Perspective.</a> SLAS Discovery. 23, 719-731 (2018).</li><li>Ding, M., Kaspersson, K., Murray, D., Bardelle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+flow+cytometry+for+drug+discovery:+principles,+applications,+and+case+studies.">High-throughput flow cytometry for drug discovery: principles, applications, and case studies.</a> Drug Discovery Today. 22, 1844-1850 (2017).</li><li>Joslin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Fully+Automated+High-Throughput+Flow+Cytometry+Screening+System+Enabling+Phenotypic+Drug+Discovery.">A Fully Automated High-Throughput Flow Cytometry Screening System Enabling Phenotypic Drug Discovery.</a> SLAS Discovery. 23, 697-707 (2018).</li></ol>

Gli zebrafish sono un eccellente sistema modello per lo studio dell'ematopoiesi vertebrata primitiva e definitiva. Negli ultimi decenni, sono stati sviluppati e perfezionati diversi test, consentendo al pesce zebra di diventare un modello rapido ed economico per testare farmaci, generare e testare mutanti genetici e, nel complesso, consentire ai ricercatori di analizzare percorsi molecolari essenziali per l'ematopoiesi. Questo protocollo utilizza zebrafish embrionali che consente una rapida raccolta dei dati, l'uso di me...

La produzione di sangue (ematopoiesi) è un processo di sviluppo essenziale che inizia per la prima volta nell'embrione precoce. Questo processo inizia generando globuli rossi primitivi e macrofagi direttamente dal mesoderma, e successivamente si sposta verso la produzione di cellule staminali ematopoietiche e progenitrici (HSPC). Queste cellule staminali, che sono multipotenti, generano tutte le varietà di cellule del sangue mature nell'organismo. In grado di auto-rinnovarsi, il sistema viene continuamente rifornito attraverso questi HSPC. Mentre questo processo inizia all'inizio dello sviluppo, l'ematopoiesi continua per la vita dell'animale, fornendo la capacità di trasportare ossigeno in siti lontani del corpo, di fermare il sanguinamento dopo la lesione e di proteggere il corpo dall'infezione. Lo sviluppo di questo complesso sistema è controllato temporaneamente e spazialmente durante lo sviluppo e qualsiasi perturbazione nella produzione di cellule del sangue può essere catastrofica per l'organismo, con conseguente anemia, trombocitopenia, leucopenia e leucemia.
Un modello animale popolare utilizzato per la ricerca ematopoietica è il pesce zebra (Danio rerio) perché hanno uno sviluppo del sangue simile rispetto all'uomo. Infatti, molti dei geni e delle vie molecolari utilizzate durante l'ematopoiesi sono conservati in tutta l'evoluzione dei vertebrati, permettendoci di conoscere i geni umani studiando il pesce zebra. È importante sottolineare che gli embrioni di zebrafish si sviluppano al di fuori del corpo ed entro 7 giorni hanno generato la maggior parte dei tipi di cellule del sangue mature, consentendo la visualizzazione diretta del sistema ematopoietico in breve tempo. Gli zebrafish sono anche estremamente fecondi, il che consente ai ricercatori di osservare un numero maggiore di campioni in un breve lasso di tempo, che è anche importante per generare dati riproducibili. Il tempo di breve generazione e lo sviluppo esterno del pesce zebra facilitano la manipolazione e l'osservazione durante gli studi di mutagenesi1,2,3,4,5 e lo screeningfarmacologico 6,7,8,9,10. Ciò consente di testare in modo rapido ed efficiente un pannello di composti terapeutici promettenti per i disturbi del sangue umano.
È importante sottolineare che anche i pesci zebra sono geneticamente suscettibili e il genoma viene sequenziato e annotato. Questa trattabilità consente di eseguire tecniche di genetica inversa come la knockdown mediata da morfolino- (MO-) e l'ablazione genetica mediata da CRISPR. Zebrafish ha anche dimostrato la sua utilità come modello per eseguire schermi genetici in avanti; molti geni e percorsi essenziali coinvolti nella formazione del sangue dei vertebrati sono stati scoperti in questo modo. Numerosi metodi di osservazione delle cellule del sangue sono stati sviluppati anche nel pesce zebra. Mentre esistono tecniche di colorazione istologica tradizionali, è anche possibile eseguire l'ibridazione in situ per trascrizioni specifiche del sangue. È importante sottolineare che esistono anche numerose linee transgeniche di pesci in cui le proteine fluorescenti sono espresse da promotori specifici del lignaggio, consentendo l'etichettatura di cellule del sangue specifiche con proteinefluorescenti 11. Ciò consente ai ricercatori di eseguire un'osservazione fino al minuto della genesi, dell'espansione e della regolazione delle cellule del sangue in un organismo vivente nel tempo.
Nel complesso, la conservazione del sistema ematopoietico, la presenza e il facile sviluppo di linee transgeniche, la facile visualizzazione e il tempo di breve generazione hanno reso il pesce zebra un modello economico, veloce e adattabile di ematopoiesi. Per migliorare la cassetta degli attrezzi delle tecniche disponibili per i ricercatori di zebrafish, abbiamo sviluppato questo saggio per quantificare saldamente il numero di cellule del sangue negli embrioni. Il metodo prevede la digestione di animali transgenici e l'esecuzione della citometria a flusso per le cellule del sangue fluorescenti. In questo modo, le cellule del sangue di animali mutanti, l'effetto della modifica MO e CRISPR e l'effetto di piccole molecole possono essere analizzati quantitativamente in modo rapido e riproducibile. Questi test sono modi intuitivi ed economici per enumerare le cellule del sangue, consentendo l'esame della loro generazione, proliferazione e manutenzione nel tempo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 ml MCF tube</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mm Polystyrene easygrip Petri dish</td>
			<td>Corning Falcon</td>
			<td>351008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml Polystyrene round bottom tube with cell strainer cap</td>
			<td>Corning Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria Fusion flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiolthreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>646563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (10x) with Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14080-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS 500 mL</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>100-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone PBS (1x)</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>sh30256.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Librease</td>
			<td>Roche Sigma-Aldrich</td>
			<td>5401119001</td>
			<td>dissociation protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Roche Sigma-Aldrich</td>
			<td>11459643001</td>
			<td>dechorionation protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Red Dead Cell Stain</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>S34859</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using flow cytometry to detect and quantitate altered blood formation in the developing zebrafish

La diversità dei lignaggi cellulari che comprendono sangue maturo negli animali vertebrati deriva dalla differenziazione delle cellule staminali ematopoietiche e progenitrici (HSPC). Questo è un processo critico che si verifica per tutta la durata della vita degli organismi, e l'interruzione delle vie molecolari coinvolte durante l'embriogenesi può avere conseguenze catastrofiche a lungo termine. Per una moltitudine di motivi, il pesce zebra (Danio rerio) è diventato un organismo modello per studiare l'ematopoiesi. Gli embrioni di zebrafish si sviluppano esternamente e entro 7 giorni la postfertilizzazione (dpf) ha prodotto la maggior parte dei sottotipi di cellule del sangue definitive che persisteranno per tutta la vita. Sono stati sviluppati saggi per valutare il numero di cellule ematopoietiche, utilizzando principalmente specifiche macchie istologiche, tecniche di ibridazione in situ e microscopia di animali transgenici che utilizzano promotori specifici delle cellule del sangue che guidano l'espressione di proteine fluorescenti. Tuttavia, la maggior parte dei saggi di colorazione e delle tecniche di ibridazione in situ non quantificano accuratamente il numero di cellule del sangue presenti; solo grandi differenze nei numeri di cella sono facilmente visualizzabili. È possibile eseguire l'utilizzo di animali transgenici e l'analisi di individui con microscopia fluorescente o confocale, ma la quantificazione di questi test si basa sul conteggio manuale o sull'utilizzo di costosi software di imaging, entrambi in grado di commetti errori. Lo sviluppo di metodi aggiuntivi per valutare il numero di cellule del sangue sarebbe economico, più veloce e potrebbe anche essere automatizzato per valutare rapidamente l'effetto della modificazione genetica mediata dalla CRISPR, la riduzione della trascrizione mediata dal morfolino e l'effetto dei composti farmacologici che influenzano l'ematopoiesi su larga scala. Questo nuovo saggio per quantificare le cellule del sangue viene eseguito dissociando interi embrioni di zebrafish e analizzando la quantità di cellule del sangue etichettate fluorescentmente presenti. Questi test dovrebbero consentire la spiegazione delle vie molecolari responsabili della generazione, dell'espansione e della regolazione delle cellule del sangue durante l'embriogenesi, che consentirà ai ricercatori di scoprire ulteriormente nuovi fattori alterati durante le malattie del sangue, nonché percorsi essenziali durante l'evoluzione dell'ematopoiesi dei vertebrati.

Per enumerare i globuli rossi nel pesce zebra embrionale, lcr:GFP16 embrioni sono stati iniettati in una fase a una cellula con PBS, 7.0 ng/nL ism1 MO, o 7.0 ng/nL ism1 MO con 7.0 ng ism1 mRNA12. A 48 HPF sono stati digeriti e sottoposti ad analisi citometriche di flusso. Dopo aver analizzato la percentuale di GFP+ globuli rossi da ogni campione (ogni campione è 5 embrioni selezionati casualmen...

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Using Flow Cytometry to Detect and Quantitate Altered Blood Formation in the Developing Zebrafish

Questo saggio è un metodo semplice per quantificare le cellule ematopoietiche nello sviluppo di zebrafish embrionali. Le cellule del sangue di zebrafish dissociate sono sottoposte ad analisi citometriche a flusso. Ciò consente di rilevare difetti del sangue negli animali mutanti e dopo la modificazione genetica.

Utilizzo della citometria a flusso per rilevare e quantificare la formazione di sangue alterato nel pesce zebra in via di sviluppo

The diversity of cell lineages that comprise mature blood in vertebrate animals arise from the differentiation of hematopoietic stem and progenitor cells ...

Questo protocollo è significativo perché consente l'espressione knockdown e over dei geni in un pesce in via di sviluppo, e la quantificazione di quegli effetti a valle sulle cellule del sangue. Questo protocollo è rapido, facile da eseguire, economico e facile da automatizzare con l'accesso alla strumentazione corretta. A dimostrare questa procedura sarà Kristen Rueb, una ricercatrice universitaria in laboratorio.Inizia trasferendo tra cinque e 200, 48 ore dopo la fecondazione degli embrioni in una piastra di Petri di plastica di 10 centimetri. Inclinare il piatto in modo che l'embrione affondi sul bordo inferiore e rimuovere il mezzo E3 dal piatto il più possibile. Quindi aggiungere 500 microlitri di proteasi di dechorionazione agli embrioni.Dopo cinque minuti a temperatura ambiente, puntare nuovamente tutti gli embrioni sul bordo inferiore del piatto e toccare delicatamente il lato del piatto, consentendo agli embrioni di strofinare delicatamente contro il fondo del piatto per rimuovere completamente i loro coriaci. Utilizzando una bottiglia di compressione aggiungere circa 20 millilitri di mezzo E3 per diluire la proteasi e consentire agli embrioni di depositarsi. Quindi decantare il mezzo e sciacquare gli embrioni altre tre volte con un mezzo fresco, come appena dimostrato per rimuovere tutte le tracce della proteasi.Per preparare gli embrioni per la dissociazione, utilizzare una pipetta P1000 per trasferire da cinque a 10 embrioni in uno, 1,5 millilitro microtubo di centrifuga e aspirare il mezzo E3 trasferito. Quindi aggiungere un millilitro di 10 millimolare DTT in mezzo E3 al pesce zebra embrionale e posizionare il tubo di microcentrifugo in posizione orizzontale per 30 minuti a temperatura ambiente per rimuovere il rivestimento del muco. Per la dissociazione dell'embrione, lavare gli embrioni trattati con DTT tre volte con un millilitro di DPBS integrato con calcio e magnesio per lavaggio.Prima di aggiungere 500 microlitri di DPBS integrati con calcio e magnesio e cinque microlitri di cinque milligrammi per millilitro, proteasi di dissociazione. Quindi incubare i campioni a 37 gradi Celsius su uno shaker orbitale orizzontale a 185 giri al minuto per 60 minuti. Assicurati di controllare periodicamente gli embrioni, in modo da non digerirli troppo.Quando si può osservare un campione non completamente omogeneo con qualche tessuto solido presente, triturare gli embrioni con una pipetta P1000 fino a quando il campione non è completamente dissociato. Per preparare le cellule embrionali di zebrafish dissociate per la citometria a flusso, trasferire l'intero campione cellulare sul serbatoio superiore di un tubo inferiore rotondo in polistirolo a cinque millilitri, con un tappo del filtro cellulare da 35 micrometri. Risciacquare il cappuccio con quattro millilitri di PBS senza calcio o magnesio e pelletare le cellule per centrifugazione.Quindi rimospend le cellule in 500 microlitri di PBS senza calcio e magnesio per tubo. Per l'analisi citometrica del flusso delle cellule embrionali del pesce zebra, vortice delicatamente le sospensioni cellulari prima di aggiungere una diluizione uno a mille di macchie di globuli morti rossi ad ogni tubo. Entro 30 minuti dall'applicazione della macchia della cella morta, svuotare il serbatoio dei rifiuti, riempire il serbatoio della tona con la soluzione appropriata e avviare il sistema fluido del citometro di flusso.Nel software di analisi, disegna cinque grafici e imposta il primo grafico per misurare la dispersione avanti rispetto a quella laterale. Impostare la dispersione in avanti su lineare e la dispersione laterale sul logaritmico. Impostate il secondo plottaggio per misurare l'altezza di dispersione in avanti rispetto alla larghezza di dispersione in avanti e il terzo grafico per misurare l'altezza di dispersione rispetto alla larghezza di dispersione laterale.Impostare il quarto grafico per misurare la macchia rossa dei globuli morti sull'asse x e la dispersione laterale sull'asse y per consentire la discriminazione del vivere da cellule morte. Il quinto appezzamento dovrebbe essere impostato per misurare il fluoroforo di scelta. Una volta impostati tutti i grafici, caricare il campione sul citometro e ridurre la portata in modo che le celle non si esaurisano rapidamente.Regolare le impostazioni di dispersione avanti e laterale in modo che la maggior parte della popolazione cellulare possa essere chiaramente osservata e disegnare un cancello intorno alla popolazione cellulare. Etichettare queste celle del cancello. Con il secondo grafico a punti recintato sulle celle, gate on forward scatter e i singlet a dispersione laterale per escludere i farsa.Nel quarto grafico, regolare le impostazioni delle macchie dei globuli morti rossi in modo che ci sia una popolazione chiaramente negativa. Disegna un cancello intorno a queste celle ed etichetta queste cellule vive del cancello. Nel quinto grafico, cancello sulle cellule vive e disegnare un cancello intorno alle cellule positive, quindi eseguire ogni campione raccogliendo almeno 25.000 eventi di cellule vive.Una volta analizzati tutti i campioni, seguire la procedura di arresto per spegnere la fluidic, riempire il serbatoio della torcia e svuotare il serbatoio dei rifiuti. Dopo aver analizzato la percentuale di globuli rossi positivi alla GFP da ogni campione di zebrafish embrionale, è possibile calcolare la media di tutto il gruppo di controllo. In genere, la media è impostata come una e tutte le percentuali vengono calcolate da questo punto di riferimento.In questa analisi rappresentativa, è stato determinato che riducendo la trascrizione ISM1 con uno specifico morfolino, si riduce il numero di globuli rossi positivi alla GFP presenti entro 48 ore dopo gli embrioni di fecondazione. Salvando questa riduzione dei livelli di morfolino ISM1 con mRNA esogeno, riportare il numero di globuli rossi alla normalità. Una corretta digestione sui campioni è fondamentale.Se digerisci troppo o sotto-digerisci, non otterrai i risultati corretti. Se è disponibile un fax, i ricercatori possono raccogliere le cellule del sangue smistando per la coltura in vitro, il sequenziamento dell'RNA e l'RT-PCR quantitativo.

Research

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Developmental Biology

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