Name: using flow cytometry to detect and quantitate altered blood formation in the developing zebrafish
Uploaded: 2021-04-29T14:00:00
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資金は、国立衛生研究所(NIH:R15 DK114732-01からD.L.S.)、国立科学財団(NSF:MRI 1626406からD.L.S.)、カリフォルニア州立大学チコ校の名誉プログラム(K.F.R.)から提供されました。著者らは、ベッツィー・タミエッティの研究室運営とキャシー・ジョンズの行政支援に感謝する。

カリフォルニア州立大学チコ校の制度的動物管理・使用委員会(IACUC)諮問委員会は、以下に記載されているすべての方法を承認しました。
注:1フェニル2-チオ尿素(PTU;) 表 1)24時間受精後(hpf)で、フローサイトメトリーによる蛍光差別に悪影響を及ぼす色素沈着を防ぎます。以下に示すすべての手順は、フローサイトメトリーおよび蛍光活性化細胞の分類(FACS)に?...

<ol>
	<li>Driever, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+for+mutations+affecting+embryogenesis+in+zebrafish.">A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish.</a> Development. 123, 37-46 (1996).</li><li>Weinstein, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+mutations+in+the+zebrafish.">Hematopoietic mutations in the zebrafish.</a> Development. , 303-309 (1996).</li><li>Ransom, D. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+globin+switching+occurs+in+two+developmental+stages+and+is+controlled+by+the+LCR.">Zebrafish globin switching occurs in two developmental stages and is controlled by the LCR.</a> Developmental Biology. 366, 185-194 (2012).</li><li>Renshaw, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation.">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108, 3976-3978 (2006).</li><li>Lin, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+thrombocyte+development+in+CD41-GFP+transgenic+zebrafish.">Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish.</a> Blood. 106, 3803-3810 (2005).</li><li>Page, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evolutionarily+conserved+program+of+B-cell+development+and+activation+in+zebrafish.">An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish.</a> Blood. 122, e1-e11 (2013).</li><li>Ding, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+High-Throughput+Flow+Cytometry+in+Early+Drug+Discovery:+An+AstraZeneca+Perspective.">Application of High-Throughput Flow Cytometry in Early Drug Discovery: An AstraZeneca Perspective.</a> SLAS Discovery. 23, 719-731 (2018).</li><li>Ding, M., Kaspersson, K., Murray, D., Bardelle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+flow+cytometry+for+drug+discovery:+principles,+applications,+and+case+studies.">High-throughput flow cytometry for drug discovery: principles, applications, and case studies.</a> Drug Discovery Today. 22, 1844-1850 (2017).</li><li>Joslin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Fully+Automated+High-Throughput+Flow+Cytometry+Screening+System+Enabling+Phenotypic+Drug+Discovery.">A Fully Automated High-Throughput Flow Cytometry Screening System Enabling Phenotypic Drug Discovery.</a> SLAS Discovery. 23, 697-707 (2018).</li></ol>

ゼブラフィッシュは、原始的で決定的な脊椎動物造形を研究するための優れたモデルシステムです。過去数十年にわたり、複数のアッセイが開発され、精製され、ゼブラフィッシュが薬物の検査、遺伝子変異体の生成と検査、および造血に不可欠な分子経路を分析することを可能にする全体的な迅速かつ経済的なモデルになることを可能にしました。このプロトコルは、迅速なデータ収集、?...

血液産生(造血)は、初期胚で始まる必須の発達過程である。このプロセスは、中皮から直接原始的な赤血球およびマクロファージを生成することから始まり、後に造血幹細胞および前駆細胞(HSPCs)の産生に向けてシフトする。多能であるこれらの幹細胞は、生物中の成熟した血液細胞のすべての品種を生成する。自己更新が可能なシステムは、これらのHSPを通じて継続的に補充されます。このプロセスは開発の早い段階で始まりますが、造血は動物の生命のために続き、身体の遠くの部位に酸素を輸送し、傷害後の出血を止め、感染から体を保護する能力を提供する。この複雑なシステムの開発は、開発中に時間的および空間的に制御され、血液細胞産生の任意の摂動は、貧血、血小板減少症、白血病をもたらす、生物にとって壊滅的なことができます。
造血研究に使用される人気の動物モデルは、人間と比較して同様の血液発達を持つため、ゼブラフィッシュ(ダニオ・レリオ)です。実際、造形中に使用される遺伝子や分子経路の多くは脊椎動物の進化を通じて保存されており、ゼブラフィッシュを研究することでヒト遺伝子について学ぶことができます。重要なことに、ゼブラフィッシュ胚は体内外で発達し、7日以内にほとんどの成熟した血液細胞タイプを生成し、短時間で造血系を直接可視化することが可能である。ゼブラフィッシュも非常にフェクンドであり、研究者は短期間でより多くのサンプルを観察することができ、再現可能なデータを生成するためにも重要です。ゼブラフィッシュの短い生成時間と外部開発は、変異生成研究1、2、3、4、5および薬物スクリーニング6、7、8、9、10の間に容易な操作および観察を提供する。これにより、ヒト血液疾患に対する有望な治療化合物のパネルを迅速かつ効率的に試験することができます。
重要なことに、ゼブラフィッシュも遺伝的に適しており、ゲノムは配列決定され、アノケン化されています。この難解性により、モルフォリノ(MO-)媒介型ノックダウンやCRISPR媒介性遺伝的アブレーションなどの逆遺伝学技術が実行される。ゼブラフィッシュはまた、前方の遺伝的スクリーンを実行するためのモデルとしての有用性を証明しています。脊椎動物の血液形成に関与する多くの必須遺伝子および経路が、この方法で発見されている。ゼブラフィッシュでは、血液細胞を観察する数多くの方法も開発されています。従来の組織学的染色技術が存在する一方で、血液特異的転写物に対してその際のハイブリダイゼーションを行うことも可能である。重要なことに、多数の魚類のトランスジェニックラインも存在し、それによって蛍光タンパク質が系統特異的プロモーターによって発現され、蛍光タンパク質11を有する特定の血液細胞の標識を可能にする。これにより、研究者は、時間の経過とともに生きている生物の血球の起源、拡張、および調節の最新の観察を行うことができます。
全体的に、造血系の保存、トランスジェニックラインの存在と容易な発達、容易な視覚化、および短い生成時間は、ゼブラフィッシュを経済的で迅速で適応可能な造血モデルにした。ゼブラフィッシュの研究者が利用できる技術のツールボックスを改善するために、我々は胚の血液細胞の数を堅牢に定量化するためにこのアッセイを開発しました。この方法は、トランスジェニック動物を消化し、蛍光血液細胞のフローサイトメトリーを行うことを含む。このように、変異動物由来の血液細胞、MOおよびCRISPR修飾の効果、および小分子の効果を迅速かつ再現可能な方法で定量的に分析することができる。これらのアッセイは、血液細胞を列挙するユーザーフレンドリーで経済的な方法であり、時間の経過とともにその生成、増殖、および維持の検査を可能にする。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 ml MCF tube</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mm Polystyrene easygrip Petri dish</td>
			<td>Corning Falcon</td>
			<td>351008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml Polystyrene round bottom tube with cell strainer cap</td>
			<td>Corning Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria Fusion flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiolthreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>646563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (10x) with Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14080-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS 500 mL</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>100-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone PBS (1x)</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>sh30256.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Librease</td>
			<td>Roche Sigma-Aldrich</td>
			<td>5401119001</td>
			<td>dissociation protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Roche Sigma-Aldrich</td>
			<td>11459643001</td>
			<td>dechorionation protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Red Dead Cell Stain</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>S34859</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using flow cytometry to detect and quantitate altered blood formation in the developing zebrafish

脊椎動物の成熟した血液を構成する細胞系統の多様性は造血幹細胞と前駆細胞(HSPC)の分化から生じる。これは生物の寿命を通して起こる重要なプロセスであり、胚発生中に関与する分子経路の破壊は壊滅的な長期的な結果をもたらす可能性があります。多くの理由から、ゼブラフィッシュ(ダニオ・レリオ)は造形学を研究するモデル生物となっています。ゼブラフィッシュ胚は外部に発達し、7日までに受精後(dpf)は、生涯持続する決定的な血液細胞のサブタイプのほとんどを産生している。造血細胞の数を評価するアッセイは、主に特異的な組織学的染色を利用して、その場でのハイブリダイゼーション技術において、および蛍光タンパク質の発現を駆動する血液細胞特異的プロモーターを利用するトランスジェニック動物の顕微鏡検査を行って開発されている。しかし、ほとんどの染色アッセイおよび現場でのハイブリダイゼーション技術では、存在する血液細胞の数を正確に定量化しません。セル番号の大きな違いだけが容易に視覚化されます。トランスジェニック動物を利用し、蛍光顕微鏡や共焦点顕微鏡で個人を分析することができますが、これらのアッセイの定量は手動でカウントするか、高価なイメージングソフトウェアを使用することに依存しており、どちらもエラーを引き起こす可能性があります。血液細胞数を評価する追加の方法の開発は、経済的で迅速であり、CRISPR媒介性遺伝子組み換え、モルフォリノ媒介性転写物の減少、および造血に影響を与える薬物化合物の大規模な影響を迅速に評価するために自動化することさえできる。この新しい血液細胞を定量化するためのアッセイは、ゼブラフィッシュ胚全体を解離し、存在する蛍光標識された血液細胞の量を分析することによって行われる。これらのアッセイは、胚発生中の血液細胞の生成、拡張、および調節を担う分子経路の解明を可能にする必要があり、研究者は血液疾患の間に変化した新しい要因、ならびに脊椎動物造血の進化の間に不可欠な経路をさらに発見することを可能にする。

胚性ゼブラフィッシュの赤血球を列挙するために、lcr:GFP16胚をPBS、7.0 ng/nL ism1 MO、または7.0 ng/nL ism1 MOと共に1細胞段階で注射した。48 hpfで彼らは消化され、フローサイトメトリー分析を行った。各サンプルからGFP+赤血球の割合を分析した後(各サンプルは5無作為に選択された胚です。<strong class="xfi...

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Using Flow Cytometry to Detect and Quantitate Altered Blood Formation in the Developing Zebrafish

このアッセイは、胚性ゼブラフィッシュの開発における造血細胞を定量化する簡単な方法です。解離されたゼブラフィッシュからの血液細胞は、フローサイトメトリー分析を行う。これにより、変異動物および遺伝子改変後の血液欠陥の検出が可能となる。

発達中のゼブラフィッシュにおける変化した血液形成を検出し定量するためのフローサイトメトリーの使用

The diversity of cell lineages that comprise mature blood in vertebrate animals arise from the differentiation of hematopoietic stem and progenitor cells ...

このプロトコルは、発達中の魚の遺伝子のノックダウンと過剰発現、および血液細胞に対するそれらの下流の影響の定量を可能にするので重要である。このプロトコルは、迅速で、実行が容易で、経済的で、適切な計測器へのアクセスで自動化が容易です。この手順を実証することは、クリステン・ルーブです, 研究室の学部研究者.受精後5~200時間、48時間の間でプラスチック10センチメートルのペトリ皿に移すことから始めます。胚が下端に沈むように皿を傾け、できるだけ多くのE3媒体を皿から取り除きます。次に、500マイクロリットルのデコールリオネーションプロテアーゼを胚に加える。室温で5分後、すべての胚をプレートの下端にもう一度チップし、皿の側面を静かにタップし、胚がプレートの底に軽くこすって帯状子を完全に取り除きます。スクイーズボトルを使用すると、プロテアーゼを希釈するために約20ミリリットルのE3培地を加え、胚が沈着します。次に、培地をデカントし、プロテアーゼのすべての痕跡を除去することを実証したように、新鮮な培地でさらに3回胚をリンスする。解離のために胚を準備するには、P1000ピペットを使用して5〜10個の胚を1個に、1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに移し、移されたE3培地を吸引する。次いで、胚性ゼブラフィッシュにE3培地に10ミリモルDTTの1ミリリットルを加え、マイクロ遠心チューブを室温で30分間水平位置に置き、粘液コーティングを除去します。胚解離の場合、DTT処理胚を1回のDPBSで3回洗浄し、1回の洗浄でカルシウムとマグネシウムを補います。カルシウムとマグネシウムを添加したDPBSの500マイクロリットルを加える前に、5ミリリットル/ミリリットル、解離プロテアーゼ。その後、水平軌道シェーカーで1分あたり185回転で摂氏37度でサンプルを60分間インキュベートします。胚を消化し過ぎないように、定期的に胚をチェックしてください。固体組織が存在する完全に均質でないサンプルが観察される場合、サンプルが完全に解約されるまでP1000ピペットで胚を三分子化する。解離されたゼブラフィッシュ胚細胞をフローサイトメトリー用に調製するには、細胞サンプル全体を5ミリリットルポリスチレン丸底管の上部貯留層に移し、35マイクロメートルの細胞ストレーナーキャップを付けます。カルシウムやマグネシウムを含まない4ミリリットルのPBSでキャップをリンスし、遠心分離によって細胞をペレットにします。その後、チューブ当たりのカルシウムとマグネシウムなしでPBSの500マイクロリットルで細胞を再懸濁します。ゼブラフィッシュ胚細胞のフローサイトメトリック解析では、各チューブに赤死細胞染色の1〜1000希釈を加える前に、細胞懸濁液を穏やかに渦液する。死細胞染色を施してから30分以内に、廃棄物タンクを空にし、シースタンクに適切な溶液を充填し、流動サイトメーターの流体システムを開始する。解析ソフトウェアでは、5 つのプロットを描画し、前方対側散乱を測定する最初のプロットを設定します。前方散乱を線形に、側面散布を対数に設定します。2 番目のプロットは、前方散乱の高さと前方の散乱幅を測定するように設定し、3 番目のプロットは、散乱高さと側面の散乱幅を測定します。X軸上の赤死細胞染色を測定する4番目のプロットを設定し、死んだ細胞からの生きた細胞の識別を可能にするためにy軸上の側面散乱を設定します。第5のプロットは、選択した蛍光素を測定するために設定する必要があります。すべてのプロットが設定されたら、サンプルをサイトメーターにロードし、流量を減らしてセルがすぐに不足しないようにします。細胞集団の大部分を明確に観察できるように前方および側面の散乱設定を調整し、細胞集団の周囲にゲートを描画する。このゲートセルにラベルを付けます。2 番目のドット プロットがセルにゲート付きで、前方散乱にゲートを設定し、側面がダブレットを除外する横の散布のシングルを配置します。4番目のプロットでは、赤死細胞染色設定を調整して、明らかに負の母集団が存在するようにします。これらのセルの周りにゲートを描画し、このゲートのライブ セルにラベルを付けます。5番目のプロットでは、生細胞にゲートを付けて正のセルの周りにゲートを描画し、各サンプルを実行して少なくとも25,000個のライブセルイベントを収集します。すべてのサンプルを分析したら、シャットダウン手順に従って流体をオフにし、シースタンクを補充し、廃棄物タンクを空にします。各胚性ゼブラフィッシュ試料からのGFP陽性赤血球の割合を分析した後、全ての対照群の平均を算出することができる。通常、平均は 1 として設定され、すべてのパーセンテージがこの参照点から計算されます。本代表分析では、特定のモルフォリノを用いてISM1転写産物を減少させ、受精胚の48時間以内に存在するGFP陽性赤血球の数を減少させることが決定された。外因性mRNAを有するISM1モルフォリノレベルのこの減少を救い、赤血球の数を正常に戻す。サンプルの適切な消化は重要です。あなたが過剰に消化または過少消化した場合、あなたは正しい結果を得ることはありません。ファックス機が利用可能な場合、研究者は、インビトロ培養、RNAシーケンシング、定量RT-PCRを選別することによって血液細胞を収集することができます。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

エバンスブルー色素でゼブラフィッシュ幼生骨格筋の整合性の分析

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

開発にターゲットマイクロインジェクションのテクニック<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;腎臓

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

イメージゼブラフィッシュアイ開発にライトシート蛍光顕微鏡を用いて、

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

フローサイトメトリーによるマウス胚における赤血球系前駆細胞およびその子孫の同定

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

Isolating and Analyzing Cells of the Pancreas Mesenchyme by Flow Cytometry

フローサイトメトリーによる膵臓間葉の細胞を単離と解析

The pancreas is comprised of epithelial cells that are required for food digestion and blood glucose regulation. Cells of the pancreas microenvironment, ...

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

臍帯血由来誘導多能性幹細胞からの軟骨形成ペレット形成

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells HSPCs in Developing Zebrafish Embryos

ゼブラフィッシュ初期胚細胞 (HSPCs) を造血幹・前駆細胞の量的にIn Vitroアッセイの開発

Hematopoiesis is an essential cellular process in which hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) differentiate into the multitude of different cell ...

Use of Hematopoietic Stem Cell Transplantation to Assess the Origin of Myelodysplastic Syndrome

骨髄異形成症候群の起源を評価するために造血幹細胞移植の使用

Myelodysplastic syndromes (MDS) are a diverse group of hematopoietic stem cell disorders that are defined by ineffective hematopoiesis, peripheral blood ...

Real-time Live-cell Flow Cytometry to Investigate Calcium Influx, Pore Formation, and Phagocytosis by P2X7 Receptors in Adult Neural Progenitor Cells

大人の神経前駆細胞における P2X7 受容体を貪食、細孔の形成、カルシウム流入を調査するためのリアルタイム生細胞フローサイトメトリー

Live-cell flow cytometry is increasingly used among cell biologists to quantify biological processes in a living cell culture. This protocol describes a ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

iPSC-ICにおけるゼブラフィッシュ胚の全山ハイブリダイゼーションとチューブ形成アッセイは血管開発におけるエンドリンの役割を研究する

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...