Name: using flow cytometry to detect and quantitate altered blood formation in the developing zebrafish
Uploaded: 2021-04-29T14:00:00
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기금은 국립 보건원 (NIH: R15 DK14732-01에서 D.L.S.), 국립 과학 재단 (NSF: MRI 1626406에서 D.L.S.까지), 캘리포니아 주립 대학 치코 (K.F.R.에)의 명예 프로그램에서 제공되었습니다. 저자는 실험실 관리에 대한 벳시 타미에티와 행정 지원을 캐시 존스 감사합니다.

캘리포니아 주립 대학 치코의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 자문위원회는 아래에 설명 된 모든 방법을 승인했습니다.
참고: 1페닐 2-티오레아(PTU)로 배아를 치료하는 것이 좋습니다. 표 1) 24시간 후유증(hpf)에서 유동 세포측정에 의한 형광 차별에 부정적인 영향을 미치는 색소 침착을 방지한다. 아래에 나열된 모든 절차는 유동 세포 측정 및 형광 활성화 세?...

<ol>
	<li>Driever, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+for+mutations+affecting+embryogenesis+in+zebrafish.">A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish.</a> Development. 123, 37-46 (1996).</li><li>Weinstein, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+mutations+in+the+zebrafish.">Hematopoietic mutations in the zebrafish.</a> Development. , 303-309 (1996).</li><li>Ransom, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+zebrafish+mutants+with+defects+in+embryonic+hematopoiesis.">Characterization of zebrafish mutants with defects in embryonic hematopoiesis.</a> Development. 123, 311-319 (1996).</li><li>Amsterdam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large-scale+insertional+mutagenesis+screen+in+zebrafish.">A large-scale insertional mutagenesis screen in zebrafish.</a> Genes &amp; Development. 13, 2713-2724 (1999).</li><li>Gaiano, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+mutagenesis+and+rapid+cloning+of+essential+genes+in+zebrafish.">Insertional mutagenesis and rapid cloning of essential genes in zebrafish.</a> Nature. 383, 829-832 (1996).</li><li>Yeh, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovering+chemical+modifiers+of+oncogene-regulated+hematopoietic+differentiation.">Discovering chemical modifiers of oncogene-regulated hematopoietic differentiation.</a> Nature Chemical Biology. 5, 236-243 (2009).</li><li>Paik, E. J., de Jong, J. L., Pugach, E., Opara, P., Zon, L. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostaglandin+E2+regulates+vertebrate+haematopoietic+stem+cell+homeostasis.">Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis.</a> Nature. 447, 1007-1011 (2007).</li><li>Astuti, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Functional+Bioluminescent+Zebrafish+Screen+for+Enhancing+Hematopoietic+Cell+Homing.">A Functional Bioluminescent Zebrafish Screen for Enhancing Hematopoietic Cell Homing.</a> Stem Cell Reports. 8, 177-190 (2017).</li><li>Stachura, D. L., Traver, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+dissection+of+zebrafish+hematopoiesis.">Cellular dissection of zebrafish hematopoiesis.</a> Methods in Cell Biology. 133, 11-53 (2016).</li><li>Berrun, A. C., Stachura, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+In+Vitro+Assay+to+Quantitate+Hematopoietic+Stem+and+Progenitor+Cells+(HSPCs)+in+Developing+Zebrafish+Embryos.">Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (129), e56836 (2017).</li><li>Westerfield, M., Zon, L. I., Detrich, H. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+globin+switching+occurs+in+two+developmental+stages+and+is+controlled+by+the+LCR.">Zebrafish globin switching occurs in two developmental stages and is controlled by the LCR.</a> Developmental Biology. 366, 185-194 (2012).</li><li>Renshaw, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation.">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108, 3976-3978 (2006).</li><li>Lin, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+thrombocyte+development+in+CD41-GFP+transgenic+zebrafish.">Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish.</a> Blood. 106, 3803-3810 (2005).</li><li>Page, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evolutionarily+conserved+program+of+B-cell+development+and+activation+in+zebrafish.">An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish.</a> Blood. 122, e1-e11 (2013).</li><li>Ding, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+High-Throughput+Flow+Cytometry+in+Early+Drug+Discovery:+An+AstraZeneca+Perspective.">Application of High-Throughput Flow Cytometry in Early Drug Discovery: An AstraZeneca Perspective.</a> SLAS Discovery. 23, 719-731 (2018).</li><li>Ding, M., Kaspersson, K., Murray, D., Bardelle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+flow+cytometry+for+drug+discovery:+principles,+applications,+and+case+studies.">High-throughput flow cytometry for drug discovery: principles, applications, and case studies.</a> Drug Discovery Today. 22, 1844-1850 (2017).</li><li>Joslin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Fully+Automated+High-Throughput+Flow+Cytometry+Screening+System+Enabling+Phenotypic+Drug+Discovery.">A Fully Automated High-Throughput Flow Cytometry Screening System Enabling Phenotypic Drug Discovery.</a> SLAS Discovery. 23, 697-707 (2018).</li></ol>

Zebrafish는 원시적이고 확실한 척추동물 조혈을 연구하기위한 훌륭한 모델 시스템입니다. 지난 수십 년 동안 여러 분석이 개발되고 정제되어 제브라피쉬가 약물 검사, 유전 돌연변이 생성 및 테스트, 전체적으로 조혈에 필수적인 분자 경로를 분석할 수 있도록 하는 빠르고 경제적인 모델이 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 빠른 데이터 수집, 성인 동물보다 적은 물리적 공간의 사용, 대규모 화학 스?...

혈액 생산 (혈종)은 초기 배아에서 처음 시작되는 필수적인 발달 과정입니다. 이 과정은 원시적 적혈구와 대식세포를 중구로부터 직접 생성하여 시작하여 나중에 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC)의 생산으로 전환합니다. 다능성 인 이 줄기 세포는 유기체에서 성숙한 혈액 세포의 모든 종류를 생성합니다. 자체 갱신이 가능한 이 시스템은 이러한 HSPC를 통해 지속적으로 보충됩니다. 이 과정은 개발 초기에 시작되는 동안, 혈액 조혈은 동물의 생명을 위해 계속, 신체의 먼 사이트에 산소를 수송 하는 기능을 제공, 부상 후 출혈을 중지, 감염에서 시체를 보호. 이 복잡한 시스템의 발달은 발달 도중 시간적으로 그리고 공간적으로 통제되고 혈액 세포 생산에 있는 어떤 동요든지 유기체를 위한 치명적일 수 있습니다, 빈혈, 혈소판감소증, 백혈병 및 백혈병의 결과로.
조혈 연구에 사용되는 인기있는 동물 모델은 인간과 비교할 때 혈액 발달이 유사하기 때문에 제브라피시(Danio rerio)입니다. 사실, 조혈 중에 사용된 많은 유전자와 분자 통로는 척추 동물 진화 전반에 걸쳐 보존되어 제브라피시를 연구하여 인간 유전자에 대해 배울 수 있게 합니다. 중요한 것은, 제브라피시 배아는 바디 외부에서 발전하고 7 일 안에 가장 성숙한 혈액 세포 모형을 생성했습니다, 짧은 시간에 조혈 계통의 직접적인 가시화를 허용하. Zebrafish는 또한 매우 fecund, 이는 연구원이 재현 가능한 데이터를 생성하는 데 중요한 짧은 시간 프레임에서 샘플의 더 많은 수를 관찰 할 수 있습니다. 제브라피쉬의 짧은 생성 시간 및 외부 발달은 돌연변이 발생 연구1,2,3,4,5 및 약물 스크리닝6,7,8,9,10동안 보다 쉽게 조작 및 관찰을 제공한다. 이것은 인간 혈액 무질서를 위한 유망한 치료 화합물의 패널이 신속하고 능명하게 시험될 수 있게 합니다.
중요한 것은, 제브라피쉬는 또한 유전적으로 순종하며, 게놈은 순서와 부가된다. 이 기관성은 모르폴리노와 같은 역유전학 기술을 허용합니다-(MO-) 중재된 녹다운 및 CRISPR 매개 유전 절제술이 수행될 수 있습니다. Zebrafish는 또한 앞으로 유전 스크린을 수행하는 모델로 자신의 유틸리티를 입증했다; 척추 동물 혈액 형성에 관련 된 많은 필수 유전자와 경로이러한 방식으로 발견 되었습니다. 혈액 세포를 관찰하는 수많은 방법은 또한 제브라피시에서 개발되었습니다. 전통적인 조직학적 염색 기술이 존재하지만 혈액 특이적 성적증명서에 대한 시투 혼성화에서도 수행할 수 있습니다. 중요한 것은, 수많은 형질전환선도 존재하여 형광 단백질이 계보 특이적 프로모터에 의해 발현되어 형광단백질(11)을가진 특정 혈액 세포의 라벨링을 허용한다. 이것은 연구원이 시간이 지남에 따라 살아있는 유기체에 있는 혈액 세포 창세기, 확장 및 규정의 상시 관측을 능력을 발휘할 수 있습니다.
전반적으로, 조혈 시스템의 보존, 형질 대사의 존재와 쉬운 개발, 쉬운 시각화, 짧은 세대 시간은 제브라피쉬가 패혈증의 경제적이고 빠르며 적응 가능한 모델로 만들었습니다. Zebrafish 연구원을 위해 사용할 수 있는 기술의 도구 상자를 개선하기 위해, 우리는 태아에 있는 혈액 세포의 수를 강력하게 양을 하기 위하여 이 분석법을 개발했습니다. 이 방법은 형질전환 동물을 소화하고 형광 혈액 세포를 위한 유동 세포측정을 능력을 발휘하는 관련시킵니다. 이러한 방식으로, 돌연변이 동물로부터의 혈액 세포, MO 및 CRISPR 수정의 효과 및 소분자의 효과는 빠르고 재현 가능한 방식으로 정량적으로 분석될 수 있다. 이러한 소는 시간이 지남에 따라 그들의 세대, 증식 및 유지 보수의 검사를 허용, 혈액 세포를 열거 하는 사용자 친화적 이고 경제적인 방법.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 ml MCF tube</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mm Polystyrene easygrip Petri dish</td>
			<td>Corning Falcon</td>
			<td>351008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml Polystyrene round bottom tube with cell strainer cap</td>
			<td>Corning Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria Fusion flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiolthreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>646563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (10x) with Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14080-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS 500 mL</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>100-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone PBS (1x)</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>sh30256.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Librease</td>
			<td>Roche Sigma-Aldrich</td>
			<td>5401119001</td>
			<td>dissociation protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Roche Sigma-Aldrich</td>
			<td>11459643001</td>
			<td>dechorionation protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Red Dead Cell Stain</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>S34859</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using flow cytometry to detect and quantitate altered blood formation in the developing zebrafish

척추 동물에서 성숙한 혈액을 포함하는 세포 혈통의 다양성은 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC)의 분화에서 발생합니다. 이것은 유기체의 수명 내내 생기는 중요한 프로세스이고, 배아 발생 도중 관련시킨 분자 통로의 중단은 치명적인 장기 결과를 가질 수 있습니다. 여러 가지 이유로, 제브라피쉬(다리오레리오)는조혈을 연구하는 모델 유기체가 되었습니다. Zebrafish 배아는 외부적으로 발전하고, 7일 후에 풍부하게함 (dpf)까지 그들의 일생을 위해 지속될 결정적인 혈액 세포의 대부분의 특수형을 생성했습니다. 조혈 세포의 수를 평가하는 분석이 개발되었으며, 주로 특정 조직학적 얼룩, 시상 혼성화 기술 및 형광 단백질의 발현을 유도하는 혈액 세포 별 프로모터를 활용하는 형질 세포 특이적 프로모터를 활용하는 형질 동물의 현미경 검사를 활용하고 있다. 그러나, 대부분의 염색 된 애법과 현장에서 혼성화 기술은 정확하게 존재하는 혈액 세포의 수를 양량하지 않습니다; 셀 수의 큰 차이만 쉽게 시각화할 수 있습니다. 형질 또는 공초점 현미경 검사를 가진 개별을 분석하는 것은 수행될 수 있습니다, 그러나 이 분석의 양은 수동으로 계산하거나 고가의 화상 진찰 소프트웨어를 이용에 의존합니다, 둘 다 오류를 만들 수 있습니다. 혈액 세포 수를 평가하는 추가 방법의 개발은 경제적일 것이고, 더 빨리, 심지어 CRISPR 매개 유전자 수정의 효력, 모르폴리노 중재한 성적증명서 감소 및 대규모에 조혈증에 영향을 미치는 약 화합물의 효력을 신속하게 평가하기 위하여 자동화될 수 있었습니다. 혈액 세포를 양화하는 이 새로운 분석은 전체 제브라피시 배아를 해리하고 존재하는 형광표 혈액 세포의 양을 분석해서 수행됩니다. 이 분석서는 혈액 세포 생성, 확장 및 태아 발생 도중 규칙에 책임 있는 분자 통로의 elucidation를 허용해야 합니다, 이는 연구원이 혈액 질병 도중 변경된 새로운 요인을 추가로 발견할 수 있을 것입니다, 뿐만 아니라 척추 동물 조혈의 진화 도중 필수적인 통로.

배아 제브라피시에서 적혈구를 열거하기 위해 lcr:GFP16 배아는 PBS, 7.0 ng/nL ism1 MO, 또는 7.0 ng/nL ism1 MO를 가진 1세포 단계에서 7.0 ng ism1 mRNA12를주입하였다. 48 hpf에서 그들은 소화되었고 혈류 세포 측정 분석을 실시하였다. 각 샘플에서 GFP+ 적혈구의 백분율을 분석한 후(각 샘플은 5개의 무작위로 선택된 배?...

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Using Flow Cytometry to Detect and Quantitate Altered Blood Formation in the Developing Zebrafish

이 분석법은 배아 제브라피시를 개발하는 데 혈토포이성 세포를 양수화하는 간단한 방법입니다. 해리된 제브라피시로부터의 혈액세포는 혈류 세포측정 분석을 받게 된다. 이것은 돌연변이 동물및 유전 수정 후에 혈액 결점의 검출을 허용합니다.

유동 세포형을 사용하여 개발 중인 제브라피시에서 변경된 혈액 형성을 감지하고 양량화합니다.

The diversity of cell lineages that comprise mature blood in vertebrate animals arise from the differentiation of hematopoietic stem and progenitor cells ...

이 프로토콜은 개발 물고기에서 유전자의 녹다운 과 발현을 허용하고 혈액 세포에 대한 다운스트림 효과의 양을 허용하기 때문에 중요합니다. 이 프로토콜은 적절한 계측에 액세스하여 빠르고, 쉽게 수행되고, 경제적이며, 자동화하기 쉽습니다. 이 절차를 보여주는 크리스틴 Rueb, 실험실에서 학부 연구원이 될 것입니다.먼저 수정 후 5~200시간, 48시간 후 배아를 플라스틱 10센티미터 페트리 접시로 옮긴다. 배아가 아래쪽으로 가라 앉도록 접시를 기울이고 가능한 한 접시에서 E3 배지를 많이 제거합니다. 그런 다음 배아에 500 마이크로리터의 비료 프로테아를 추가합니다.실온에서 5분 후, 모든 배아를 접시의 아래쪽 가장자리에 다시 팁을 넣고 접시의 측면을 부드럽게 탭하여 배아가 접시 바닥에 부드럽게 문질러 서 완전히 치밀하게 제거합니다. 스퀴즈 병을 사용하여 프로테아제고를 희석시키고 배아가 정착할 수 있도록 E3 배지의 약 20밀리리터를 첨가합니다. 그런 다음 배지를 데수화하고 프로테아제의 모든 흔적을 제거하는 것으로 입증된 것처럼 신선한 배지로 배아를 세 번 더 헹취시한다.배아를 해리를 위해 준비하려면 P1000 파이펫을 사용하여 5-10개의 배아를 1개, 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브로 이송하고, 전달된 E3 배지를 흡인한다. 그런 다음 E3 배지에 10 밀리리터DTT를 배아 제브라피시에 넣고, 실온에서 30분 동안 마이크로센트심분리기 튜브를 수평 위치에 배치하여 점액 코팅을 제거한다. 배아 해리의 경우, DTT 처리된 배아를 세척당 칼슘과 마그네슘으로 보충한 DPBS 1밀리리터로 3회 세척하십시오.칼슘과 마그네슘으로 보충된 500마이크로리터와 밀리리터당 5밀리리터의 5마이크로리터를 첨가하기 전에 해리 프로테아제. 그런 다음 60 분 동안 분당 185 회전에서 수평 궤도 셰이커에 섭씨 37도에서 샘플을 배양합니다. 주기적으로 배아를 확인하십시오, 그래서 당신은 그(것)들을 소화하지 않습니다.일부 고체 조직을 가진 완전히 균일한 견본이 존재하는 경우에, 견본이 완전히 해리될 때까지 P1000 파이펫으로 배아를 삼각합니다. 유동 세포측정을 위해 해리된 제브라피시 배아 세포를 준비하려면 전체 셀 샘플을 5밀리리터 폴리스티렌 라운드 하단 튜브의 상단 저장소에 35 마이크로미터 셀 스트레이너 캡을 장착하여 전달합니다. 칼슘이나 마그네슘없이 PBS의 4 밀리리터로 캡을 헹구고, 원심분리에 의해 세포를 펠릿.그런 다음 튜브 당 칼슘과 마그네슘없이 PBS의 500 마이크로 리터에서 세포를 다시 중단합니다. 제브라피시 배아 세포의 유동 세포 측정 분석을 위해 각 튜브에 적죽은 세포 얼룩의 1-1,000 희석을 추가하기 전에 세포 현탁액을 부드럽게 소용돌이칩니다. 죽은 세포 얼룩을 적용 한 후 30 분 이내에, 폐기물 탱크를 비우고, 칼집 탱크를 적절한 용액으로 채우고, 유동 세포계의 유체 시스템을 시작합니다.분석 소프트웨어에서 5개의 플롯을 그리고 첫 번째 플롯을 설정하여 측면 분산과 반대로 측정합니다. 전방 분산을 선형으로 설정하고 측면은 로그와트믹으로 산란합니다. 두 번째 플롯을 설정하여 앞으로 산란 높이와 전방 분산 폭을 측정하고 세 번째 플롯은 분산 높이대 측면 분산 폭을 측정합니다.네 번째 플롯을 설정하여 x 축의 적색 죽은 세포 얼룩을 측정하고 y축에 측면 분산하여 죽은 세포에서 살아있는 사람의 차별을 허용합니다. 다섯 번째 플롯은 선택의 불소를 측정하도록 설정해야합니다. 모든 플롯이 설정된 경우 샘플을 사이토미터에 로드하고 유량을 줄여 세포가 빠르게 실행되지 않도록 합니다.세포 집단의 대부분을 명확하게 관찰할 수 있도록 전방 및 측면 분산 설정을 조정하고 세포 집단 주위의 게이트를 그립니다. 이 게이트 셀에 레이블을 지정합니다. 두 번째 점 플롯이 셀에 게이트되어 있고, 게이트는 앞으로 흩어지고 측면은 이중을 제외하기 위해 싱글을 흩어 놓습니다.네 번째 플롯에서 빨간색 죽은 셀 얼룩 설정을 조정하여 명확하게 부정적인 집단이 되도록 합니다. 이 세포 주위에 게이트를 그리고 이 게이트 라이브 셀에 레이블을 지정합니다. 다섯 번째 플롯에서, 살아있는 세포에 게이트와 양성 세포 주위에 게이트를 그립니다, 다음 적어도 수집 각 샘플을 실행 25, 000 라이브 셀 이벤트.모든 샘플을 분석한 후 종료 절차를 따라 유체를 끄고 칼집 탱크를 다시 채우고 폐기물 탱크를 비웁니다. 각 배아 제브라피쉬 샘플에서 GFP 양성 적혈구의 백분율을 분석한 후, 모든 대조군의 평균을 계산할 수 있다. 일반적으로 평균값은 하나로 설정되고 모든 백분율은 이 기준점에서 계산됩니다.본 대표적인 분석에서, 특정 모르폴리노를 가진 ISM1 성적체를 감소시키고, 수정 후 48시간 이내에 존재하는 GFP 양성 적혈구의 수를 감소시키는 것으로 판단되었다. 외인성 mRNA를 가진 ISM1 모르몰리노 수준에 있는 이 감소를 구출하고, 정상으로 적혈구의 수를 반환합니다. 시료에 적절한 소화가 중요합니다.과도하게 소화하거나 소화가 부족한 경우 올바른 결과를 얻지 못할 것입니다. 팩스 기계를 사용할 수 있는 경우, 연구원은 체 외 배양, RNA 시퀀싱 및 정량적인 RT-PCR에 대 한 정렬 하 여 혈액 세포를 수집할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

에반스 블루 염료와 Zebrafish의 애벌레 골격 근육 무결성 분석

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

연구

발생학

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

개발에 미세 주입을 대상으로 기술<em&gt; Xenopus의</em&gt; 신장

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

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Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Flow Cytometry에 의한 마우스 태아의 적혈구 전구 세포 (Erythromyeloid Progenitors)와 그 자손의 동정

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

Isolating and Analyzing Cells of the Pancreas Mesenchyme by Flow Cytometry

분리 및 유동 세포 계측법에 의해 췌장 중간 엽 세포 분석

The pancreas is comprised of epithelial cells that are required for food digestion and blood glucose regulation. Cells of the pancreas microenvironment, ...

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

제대혈 유래 다 능성 줄기 세포로부터 연골 형성 펠렛 형성

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells HSPCs in Developing Zebrafish Embryos

조 혈 줄기와 뿌리를 Quantitate를 생체 외에서 시험의 개발 세포 (HSPCs) Zebrafish 태아를 개발

Hematopoiesis is an essential cellular process in which hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) differentiate into the multitude of different cell ...

Use of Hematopoietic Stem Cell Transplantation to Assess the Origin of Myelodysplastic Syndrome

조 혈 줄기 세포 이식 Myelodysplastic 증후군의 평가에 사용

Myelodysplastic syndromes (MDS) are a diverse group of hematopoietic stem cell disorders that are defined by ineffective hematopoiesis, peripheral blood ...

Real-time Live-cell Flow Cytometry to Investigate Calcium Influx, Pore Formation, and Phagocytosis by P2X7 Receptors in Adult Neural Progenitor Cells

칼슘 유입, 기 공 형성 및 성숙한 신경 조상 세포 수용 체 P2X7에 의해 식 균 작용을 조사 하기 위해 실시간 라이브 셀 Cytometry

Live-cell flow cytometry is increasingly used among cell biologists to quantify biological processes in a living cell culture. This protocol describes a ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

혈관 발달에서 엔도글린의 역할을 연구하기 위해 iPSC-ECs의 제브라피시 배아 및 튜브 형성 분석에서 시투 혼성화에 대한 전체 마운트

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...