Name: using flow cytometry to detect and quantitate altered blood formation in the developing zebrafish
Uploaded: 2021-04-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Flow Cytometry to Detect and Quantitate Altered Blood Formation in the Developing Zebrafish at JoVE.com

Støtten ble gitt av National Institutes of Health (NIH: R15 DK114732-01 til D.L.S.), National Science Foundation (NSF: MR 1626406 til D.L.S.), og fra Honor's Program ved California State University Chico (til K.F.R.). Forfatterne takker Betsey Tamietti for laboratorieledelse og Kathy Johns for administrativ bistand.

Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) rådgivende styre ved California State University, Chico, godkjente alle metoder beskrevet nedenfor.
MERK: Det anbefales å behandle embryoer med 1-fenyl 2-tiourea (PTU; Tabell 1) på 24 timer postfertilisering (hpf) for å forhindre pigmentering som påvirker fluorescensdiskriminering negativt ved strømningscytometri. Alle prosedyrer som er oppført nedenfor er akseptable for strømningscytometri og fluorescensaktivert cell...

<ol>
	<li>Driever, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+for+mutations+affecting+embryogenesis+in+zebrafish.">A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish.</a> Development. 123, 37-46 (1996).</li><li>Weinstein, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+mutations+in+the+zebrafish.">Hematopoietic mutations in the zebrafish.</a> Development. , 303-309 (1996).</li><li>Ransom, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+zebrafish+mutants+with+defects+in+embryonic+hematopoiesis.">Characterization of zebrafish mutants with defects in embryonic hematopoiesis.</a> Development. 123, 311-319 (1996).</li><li>Amsterdam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large-scale+insertional+mutagenesis+screen+in+zebrafish.">A large-scale insertional mutagenesis screen in zebrafish.</a> Genes &amp; Development. 13, 2713-2724 (1999).</li><li>Gaiano, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+mutagenesis+and+rapid+cloning+of+essential+genes+in+zebrafish.">Insertional mutagenesis and rapid cloning of essential genes in zebrafish.</a> Nature. 383, 829-832 (1996).</li><li>Yeh, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovering+chemical+modifiers+of+oncogene-regulated+hematopoietic+differentiation.">Discovering chemical modifiers of oncogene-regulated hematopoietic differentiation.</a> Nature Chemical Biology. 5, 236-243 (2009).</li><li>Paik, E. J., de Jong, J. L., Pugach, E., Opara, P., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+genetic+screen+in+zebrafish+for+pathways+interacting+with+cdx4+in+primitive+hematopoiesis.">A chemical genetic screen in zebrafish for pathways interacting with cdx4 in primitive hematopoiesis.</a> Zebrafish. 7, 61-68 (2010).</li><li>Ridges, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+screen+identifies+novel+compound+with+selective+toxicity+against+leukemia.">Zebrafish screen identifies novel compound with selective toxicity against leukemia.</a> Blood. 119, 5621-5631 (2012).</li><li>North, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostaglandin+E2+regulates+vertebrate+haematopoietic+stem+cell+homeostasis.">Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis.</a> Nature. 447, 1007-1011 (2007).</li><li>Astuti, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Functional+Bioluminescent+Zebrafish+Screen+for+Enhancing+Hematopoietic+Cell+Homing.">A Functional Bioluminescent Zebrafish Screen for Enhancing Hematopoietic Cell Homing.</a> Stem Cell Reports. 8, 177-190 (2017).</li><li>Stachura, D. L., Traver, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+dissection+of+zebrafish+hematopoiesis.">Cellular dissection of zebrafish hematopoiesis.</a> Methods in Cell Biology. 133, 11-53 (2016).</li><li>Berrun, A. C., Stachura, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+In+Vitro+Assay+to+Quantitate+Hematopoietic+Stem+and+Progenitor+Cells+(HSPCs)+in+Developing+Zebrafish+Embryos.">Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (129), e56836 (2017).</li><li>Westerfield, M., Zon, L. I., Detrich, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Essential Zebrafish Methods: Cell and Developmental Biology. , (2009).</li><li>Drummond, I. A., Davidson, A. J., Detrich, H. W., Westerfield, M., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Kidney+Development.">Zebrafish Kidney Development.</a> The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, Part A. 100, 233-260 (2010).</li><li>Traver, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+and+in+vivo+imaging+of+multilineage+engraftment+in+zebrafish+bloodless+mutants.">Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants.</a> Nature Immunology. 4, 1238-1246 (2003).</li><li>Ganis, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+globin+switching+occurs+in+two+developmental+stages+and+is+controlled+by+the+LCR.">Zebrafish globin switching occurs in two developmental stages and is controlled by the LCR.</a> Developmental Biology. 366, 185-194 (2012).</li><li>Renshaw, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation.">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108, 3976-3978 (2006).</li><li>Lin, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+thrombocyte+development+in+CD41-GFP+transgenic+zebrafish.">Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish.</a> Blood. 106, 3803-3810 (2005).</li><li>Page, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evolutionarily+conserved+program+of+B-cell+development+and+activation+in+zebrafish.">An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish.</a> Blood. 122, e1-e11 (2013).</li><li>Ding, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+High-Throughput+Flow+Cytometry+in+Early+Drug+Discovery:+An+AstraZeneca+Perspective.">Application of High-Throughput Flow Cytometry in Early Drug Discovery: An AstraZeneca Perspective.</a> SLAS Discovery. 23, 719-731 (2018).</li><li>Ding, M., Kaspersson, K., Murray, D., Bardelle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+flow+cytometry+for+drug+discovery:+principles,+applications,+and+case+studies.">High-throughput flow cytometry for drug discovery: principles, applications, and case studies.</a> Drug Discovery Today. 22, 1844-1850 (2017).</li><li>Joslin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Fully+Automated+High-Throughput+Flow+Cytometry+Screening+System+Enabling+Phenotypic+Drug+Discovery.">A Fully Automated High-Throughput Flow Cytometry Screening System Enabling Phenotypic Drug Discovery.</a> SLAS Discovery. 23, 697-707 (2018).</li></ol>

Sebrafisk er et utmerket modellsystem for å studere primitive og definitive virveldyr hematopoiesis. I løpet av de siste tiårene har flere analyser blitt utviklet og raffinert, slik at sebrafisk kan bli en rask og økonomisk modell for testing av narkotika, generering og testing av genetiske mutanter, og generelt slik at forskere kan analysere molekylære veier som er avgjørende for hematopoiesis. Denne protokollen benytter embryonal sebrafisk som muliggjør rask datainnsamling, bruk av mindre fysisk plass enn voksne...

Blodproduksjon (hematopoiesis) er en viktig utviklingsprosess som først starter i det tidlige embryoet. Denne prosessen begynner med å generere primitive røde blodlegemer og makrofager direkte fra mesoderm, og skifter senere mot produksjon av hematopoietiske stamme- og stamceller (HSPCer). Disse stamcellene, som er multipotente, genererer alle varianter av modne blodlegemer i organismen. Systemet er i stand til selvfornyelse, og etterfylles kontinuerlig gjennom disse HSPCene. Mens denne prosessen starter tidlig i utviklingen, fortsetter hematopoiesis for dyrets liv, og gir evnen til å transportere oksygen til fjerne steder i kroppen, for å stoppe blødning etter skade og for å beskytte kroppen mot infeksjon. Utviklingen av dette komplekse systemet kontrolleres timelig og romlig under utvikling, og eventuelle perturbasjoner i blodcelleproduksjon kan være katastrofale for organismen, noe som resulterer i anemi, trombocytopeni, leukopeni og leukemi.
En populær dyremodell som brukes til hematopoietisk forskning er sebrafisken (Danio rerio) fordi de har lignende blodutvikling sammenlignet med mennesker. Faktisk er mange av genene og molekylære veier som brukes under hematopoiesis bevart gjennom virveldyrutvikling, slik at vi kan lære om menneskelige gener ved å studere sebrafisk. Det er viktig at sebrafiskembryoer utvikler seg utenfor kroppen, og innen 7 dager har generert de mest modne blodcelletypene, noe som gir direkte visualisering av det hematopoietiske systemet på kort tid. Sebrafisk er også ekstremt fecund, noe som gjør det mulig for forskere å observere et større antall prøver på kort tid, noe som også er viktig for å generere reproduserbare data. Sebrafiskens korte generasjonstid og eksterne utvikling gir enklere manipulering og observasjon under mutagenesestudier1,2,3,4,5 og legemiddelscreening6,7,8,9,10. Dette gjør at et panel med lovende terapeutiske forbindelser for menneskelige blodsykdommer raskt og effektivt kan testes.
Det er viktig at sebrafisk også er genetisk mottagelig, og genomet er sekvensert og kommentert. Denne luftbarheten gjør det mulig å utføre omvendte genetikkteknikker som morpholino- (MO-) mediert knockdown og CRISPR-mediert genetisk ablasjon. Sebrafisk har også bevist deres nytte som modell for å utføre fremover genetiske skjermer; mange essensielle gener og veier involvert i virveldyr bloddannelse har blitt oppdaget på denne måten. Tallrike metoder for å observere blodceller har også blitt utviklet i sebrafisk. Mens tradisjonelle histologiske fargingsteknikker eksisterer, er det også mulig å utføre in situ hybridisering for blodspesifikke transkripsjoner. Det er viktig at det også finnes mange transgene linjer med fisk der fluorescerende proteiner uttrykkes av avledningsspesifikke promotorer, slik at merking av spesifikke blodlegemer med fluorescerende proteiner11. Dette gjør det mulig for forskere å utføre opp-til-minutt observasjon av blodcelle genesis, ekspansjon og regulering i en levende organisme over tid.
Totalt sett har bevaring av det hematopoietiske systemet, tilstedeværelsen og enkel utvikling av transgene linjer, enkel visualisering og kort generasjonstid gjort sebrafisken til en økonomisk, rask og tilpasningsdyktig modell av hematopoiesis. For å forbedre verktøykassen for teknikker som er tilgjengelige for sebrafiskforskere, utviklet vi denne analysen for å kvantifisere antall blodceller i embryoer på en robust måte. Metoden innebærer å fordøye transgene dyr og utføre strømningscytometri for fluorescerende blodlegemer. På denne måten kan blodceller fra mutante dyr, effekten av MO og CRISPR modifikasjon, og effekten av små molekyler analyseres kvantitativt på en rask og reproduserbar måte. Disse analysene er brukervennlige og økonomiske måter å liste opp blodceller på, slik at undersøkelse av deres generasjon, spredning og vedlikehold over tid.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 ml MCF tube</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mm Polystyrene easygrip Petri dish</td>
			<td>Corning Falcon</td>
			<td>351008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml Polystyrene round bottom tube with cell strainer cap</td>
			<td>Corning Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria Fusion flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiolthreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>646563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (10x) with Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14080-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS 500 mL</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>100-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone PBS (1x)</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>sh30256.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Librease</td>
			<td>Roche Sigma-Aldrich</td>
			<td>5401119001</td>
			<td>dissociation protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Roche Sigma-Aldrich</td>
			<td>11459643001</td>
			<td>dechorionation protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Red Dead Cell Stain</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>S34859</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using flow cytometry to detect and quantitate altered blood formation in the developing zebrafish

Mangfoldet av celleavstamninger som består av modent blod i virveldyrdyr oppstår fra differensiering av hematopoietiske stamme- og stamceller (HSPCer). Dette er en kritisk prosess som oppstår gjennom hele levetiden til organismer, og forstyrrelse av molekylære veier involvert under embryogenese kan ha katastrofale langsiktige konsekvenser. Av mange grunner har sebrafisk (Danio rerio) blitt en modellorganisme for å studere hematopoiesis. Zebrafish embryoer utvikler seg eksternt, og med 7 dager postfertilisering (dpf) har produsert de fleste av undertypene av definitive blodlegemer som vil vedvare for livet. Analyser for å vurdere antall hematopoietiske celler er utviklet, hovedsakelig ved hjelp av spesifikke histologiske flekker, in situ hybridiseringsteknikker og mikroskopi av transgene dyr som bruker blodcellespesifikke promotorer som driver uttrykket av fluorescerende proteiner. Imidlertid kvanterer de fleste fargeanalyser og in situ hybridiseringsteknikker ikke nøyaktig antall blodceller som er tilstede; Bare store forskjeller i celletall visualiseres enkelt. Bruk av transgene dyr og analyse av individer med fluorescerende eller konfektmikroskopi kan utføres, men mengden av disse analysene er avhengig av enten å telle manuelt eller bruke dyr bildebehandlingsprogramvare, som begge kan gjøre feil. Utvikling av ytterligere metoder for å vurdere blodcelletall ville være økonomisk, raskere og til og med kunne automatiseres for raskt å vurdere effekten av CRISPR-mediert genetisk modifikasjon, morpholino-mediert transkripsjonsreduksjon og effekten av legemiddelforbindelser som påvirker hematopoiesis i stor skala. Denne nye analysen for å kvantisere blodceller utføres ved å dissosiere hele sebrafiskembryoer og analysere mengden fluorescerende merkede blodlegemer tilstede. Disse analysene bør tillate belysning av molekylære veier som er ansvarlige for blodcellegenerering, ekspansjon og regulering under embryogenese, noe som gjør det mulig for forskere å oppdage nye faktorer som er endret under blodsykdommer, samt veier som er essensielle under utviklingen av virveldyr hematopoiesis.

For å liste opp røde blodlegemer i embryonal sebrafisk ble lcr:GFP16 embryoer injisert i encellet stadium med PBS, 7,0 ng/nL ism1 MO eller 7,0 ng/nL ism1 MO med 7,0 ng ism1 mRNA12. Ved 48 hkf ble de fordøyd og utsatt for strømningscytometrianalyse. Etter å ha analysert prosentandelen av GFP+ røde blodlegemer fra hver prøve (hver prøve er 5 tilfeldig utvalgte embryoer; <strong class="xfig...

Watch this Scientific Journal Video about Using Flow Cytometry to Detect and Quantitate Altered Blood Formation in the Developing Zebrafish at JoVE.com

Using Flow Cytometry to Detect and Quantitate Altered Blood Formation in the Developing Zebrafish

Denne analysen er en enkel metode for å kvantifisere hematopoietiske celler i utviklingen av embryonal sebrafisk. Blodceller fra dissosiert sebrafisk blir utsatt for strømningscytometrianalyse. Dette gjør det mulig å oppdage blodfeil hos mutante dyr og etter genetisk modifikasjon.

Bruke Flow Cytometry til å oppdage og kvantisere endret bloddannelse i den utviklende sebrafisken

The diversity of cell lineages that comprise mature blood in vertebrate animals arise from the differentiation of hematopoietic stem and progenitor cells ...

Denne protokollen er betydelig fordi den tillater knockdown og over uttrykk for gener i en utviklende fisk, og mengden av de nedstrøms effektene på blodceller. Denne protokollen er rask, enkel å utføre, økonomisk og enkel å automatisere med tilgang til riktig instrumentering. Å demonstrere denne prosedyren vil være Kristen Rueb, en bachelorforsker i laboratoriet.Begynn med å overføre mellom fem og 200, 48 timer etter befruktning embryoer i en plast 10 centimeter Petri parabolen. Vipp parabolen slik at embryoet synker til bunnkanten, og fjern så mye E3 medium fra parabolen som mulig. Tilsett deretter 500 mikroliter dechorionation protease til embryoene.Etter fem minutter ved romtemperatur tipper du alle embryoene til bunnkanten av platen igjen og trykker forsiktig på siden av parabolen, slik at embryoene forsiktig gni mot bunnen av platen for å fjerne korionene helt. Bruk en klemmeflaske tilsett ca 20 milliliter E3 medium for å fortynne protease, og la embryoene bosette seg. Deretter dekanterer du mediet, og skyll embryoene tre ganger til med friskt medium som bare demonstrert for å fjerne alle spor av protease.For å forberede embryoene for dissosiasjon, bruk en P1000 pipette for å overføre fem til 10 embryoer til ett, 1,5 milliliter mikro sentrifugerrør, og aspirer det overførte E3-mediet. Tilsett deretter en milliliter 10 millimolar DTT i E3 medium til embryonal sebrafisk, og plasser mikrocentrifugerøret i horisontal stilling i 30 minutter ved romtemperatur for å fjerne slimbelegget. For embryodissosiasjon, vask DTT-behandlede embryoer tre ganger med en milliliter DPBS supplert med kalsium og magnesium per vask.Før du tilsetter 500 mikroliter DPBS supplert med kalsium og magnesium, og fem mikroliter på fem milligram per milliliter, dissosiasjonsprotease. Inkuber deretter prøvene ved 37 grader Celsius på en horisontal orbital shaker ved 185 omdreininger per minutt i 60 minutter. Pass på å periodisk sjekke embryoene, slik at du ikke over fordøyer dem.Når en ikke helt homogen prøve med noe fast vev tilstede kan observeres, triturer embryoene med en P1000 pipette til prøven er helt dissosiert. For å forberede de dissosierte sebrafisk embryonale cellene for strømningscytometri, overfør hele celleprøven til toppreservoaret til et fem millimeter polystyren rundt bunnrør, med en 35 mikrometer cellesilhette. Skyll hetten med fire milliliter PBS uten kalsium eller magnesium, og pellet cellene ved sentrifugering.Deretter resuspenderer cellene i 500 mikroliter PBS uten kalsium og magnesium per rør. For strømningscytometrisk analyse av sebrafisk embryonale celler, vir forsiktig cellesuspensjonene før du legger til en en til tusen fortynning av rød dødcelleflekk til hvert rør. Innen 30 minutter etter påføring av dødcelleflekken, tøm avfallstanken, fyll hylsetanken med riktig løsning, og start det fluidiske systemet til strømningscytometeret.I analyseprogramvaren tegner du fem tomter og angir det første plottet for å måle fremover kontra sidespredning. Sett fremoverspredningen til lineær, og sidespredningen til logaritmisk. Angi at det andre plottet skal måle spredningshøyde fremover i forhold til punktbredde fremover, og det tredje plottet for å måle punkthøyde kontra sidespredningsbredde.Sett det fjerde plottet for å måle den røde døde celleflekken på x-aksen, og sidespredning på y-aksen for å tillate diskriminering av levende fra døde celler. Den femte tomten skal settes til å måle den valgte fluoroforen. Når alle plottene er satt, laster du prøven på cytometeret og reduserer strømningshastigheten slik at cellene ikke går tom for raskt.Juster innstillingene for fremover- og sidespredning slik at hoveddelen av cellepopulasjonen tydelig kan observeres, og tegn en port rundt cellepopulasjonen. Merk disse portcellene. Med den andre prikken plottet inngjerdet på cellene, gate på fremover scatter og siden scatter singlets å utelukke doublets.I det fjerde plottet justerer du innstillingene for rød dødcelleflekk slik at det er en klart negativ befolkning. Tegn en port rundt disse cellene og merk denne porten levende celler. I det femte plottet, gate på levende celler og tegne en port rundt de positive cellene, deretter kjøre hver prøve samle minst 25,000 live celle hendelser.Når alle prøvene er analysert, følg avstengingsprosedyren for å slå av væskene, fylle på hylsetanken og tømme avfallstanken. Etter å ha analysert prosentandelen av GFP positive røde blodlegemer fra hver embryonale sebrafiskprøve, kan gjennomsnittet av alle kontrollgruppen beregnes. Gjennomsnittet angis vanligvis som én, og alle prosentene beregnes fra dette referansepunktet.I denne representative analysen ble det fastslått at reduksjon av ISM1-transkripsjonen med en bestemt morpholino, redusere antall GFP positive røde blodlegemer tilstede innen 48 timer etter befruktning embryoer. Redde denne reduksjonen i ISM1 morpholino nivåer med eksogen mRNA, returnere antall røde blodlegemer til normal. Riktig fordøyelse på prøvene er kritisk.Hvis du over-fordøye eller under-fordøye, vil du ikke få de riktige resultatene. Hvis en faksmaskin er tilgjengelig, kan forskere samle blodcellene ved å sortere etter in vitrokultur, RNA-sekvensering og kvantitativ RT-PCR.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse av Sebrafisk Larver Skeletal Muscle Integrity med Evans blå Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Teknikken til Target Mikroinjeksjon til utviklings<em&gt; Xenopus</em&gt; Nyre

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Ved hjelp av lys Sheet Fluorescensmikroskopi til bilde Sebrafisk Eye Development

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Identifikasjon av erytromyeloidprogenitorer og deres avkom i musembryoen ved flowcytometri

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

Isolating and Analyzing Cells of the Pancreas Mesenchyme by Flow Cytometry

Isolere og analysere cellene i bukspyttkjertelen Mesenchyme ved flowcytometri

The pancreas is comprised of epithelial cells that are required for food digestion and blood glucose regulation. Cells of the pancreas microenvironment, ...

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Kondrogen pelletsdannelse fra Cord Blood-avledede Induced Pluripotent Stamceller

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells HSPCs in Developing Zebrafish Embryos

Utvikling av In Vitro analysen å Quantitate blodkreft stilk og stamfar celler (HSPCs) i utvikle sebrafisk embryo

Hematopoiesis is an essential cellular process in which hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) differentiate into the multitude of different cell ...

Use of Hematopoietic Stem Cell Transplantation to Assess the Origin of Myelodysplastic Syndrome

Bruk av blodkreft stamcelletransplantasjon å vurdere opprinnelsen til AML

Myelodysplastic syndromes (MDS) are a diverse group of hematopoietic stem cell disorders that are defined by ineffective hematopoiesis, peripheral blood ...

Real-time Live-cell Flow Cytometry to Investigate Calcium Influx, Pore Formation, and Phagocytosis by P2X7 Receptors in Adult Neural Progenitor Cells

Sanntid Live-celle flowcytometri å undersøke kalsium tilstrømningen Pore dannelse og fagocytose av P2X7 reseptorer i voksen nevrale stamceller

Live-cell flow cytometry is increasingly used among cell biologists to quantify biological processes in a living cell culture. This protocol describes a ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Helmontering i Situ Hybridisering i sebrafisk embryoer og tube formasjonsanalyse i iPSC-ECs å studere rollen som Endoglin i vaskulær utvikling

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...