Name: using flow cytometry to detect and quantitate altered blood formation in the developing zebrafish
Uploaded: 2021-04-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Flow Cytometry to Detect and Quantitate Altered Blood Formation in the Developing Zebrafish at JoVE.com

O financiamento foi fornecido pelos Institutos Nacionais de Saúde (NIH: R15 DK114732-01 para d.L.S.), pela National Science Foundation (NSF: MRI 1626406 a D.L.S.), e pelo Programa de Honra da Universidade Estadual da Califórnia Chico (para K.F.R.). Os autores agradecem a Betsey Tamietti pela gestão laboratorial e Kathy Johns pela assistência administrativa.

O conselho consultivo do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade Estadual da Califórnia, Chico, aprovou todos os métodos descritos abaixo.
NOTA: É aconselhável tratar embriões com 1-fenil 2-thiourea (PTU; Tabela 1) em 24 horas de pós-fertilização (hpf) para evitar pigmentação que afeta negativamente a discriminação por fluorescência por citometria de fluxo. Todos os procedimentos listados abaixo são aceitáveis para citometria d...

<ol>
	<li>Driever, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+for+mutations+affecting+embryogenesis+in+zebrafish.">A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish.</a> Development. 123, 37-46 (1996).</li><li>Weinstein, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+mutations+in+the+zebrafish.">Hematopoietic mutations in the zebrafish.</a> Development. , 303-309 (1996).</li><li>Ransom, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+zebrafish+mutants+with+defects+in+embryonic+hematopoiesis.">Characterization of zebrafish mutants with defects in embryonic hematopoiesis.</a> Development. 123, 311-319 (1996).</li><li>Amsterdam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large-scale+insertional+mutagenesis+screen+in+zebrafish.">A large-scale insertional mutagenesis screen in zebrafish.</a> Genes &amp; Development. 13, 2713-2724 (1999).</li><li>Gaiano, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+mutagenesis+and+rapid+cloning+of+essential+genes+in+zebrafish.">Insertional mutagenesis and rapid cloning of essential genes in zebrafish.</a> Nature. 383, 829-832 (1996).</li><li>Yeh, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovering+chemical+modifiers+of+oncogene-regulated+hematopoietic+differentiation.">Discovering chemical modifiers of oncogene-regulated hematopoietic differentiation.</a> Nature Chemical Biology. 5, 236-243 (2009).</li><li>Paik, E. J., de Jong, J. L., Pugach, E., Opara, P., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+genetic+screen+in+zebrafish+for+pathways+interacting+with+cdx4+in+primitive+hematopoiesis.">A chemical genetic screen in zebrafish for pathways interacting with cdx4 in primitive hematopoiesis.</a> Zebrafish. 7, 61-68 (2010).</li><li>Ridges, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+screen+identifies+novel+compound+with+selective+toxicity+against+leukemia.">Zebrafish screen identifies novel compound with selective toxicity against leukemia.</a> Blood. 119, 5621-5631 (2012).</li><li>North, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostaglandin+E2+regulates+vertebrate+haematopoietic+stem+cell+homeostasis.">Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis.</a> Nature. 447, 1007-1011 (2007).</li><li>Astuti, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Functional+Bioluminescent+Zebrafish+Screen+for+Enhancing+Hematopoietic+Cell+Homing.">A Functional Bioluminescent Zebrafish Screen for Enhancing Hematopoietic Cell Homing.</a> Stem Cell Reports. 8, 177-190 (2017).</li><li>Stachura, D. L., Traver, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+dissection+of+zebrafish+hematopoiesis.">Cellular dissection of zebrafish hematopoiesis.</a> Methods in Cell Biology. 133, 11-53 (2016).</li><li>Berrun, A. C., Stachura, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+In+Vitro+Assay+to+Quantitate+Hematopoietic+Stem+and+Progenitor+Cells+(HSPCs)+in+Developing+Zebrafish+Embryos.">Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (129), e56836 (2017).</li><li>Westerfield, M., Zon, L. I., Detrich, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Essential Zebrafish Methods: Cell and Developmental Biology. , (2009).</li><li>Drummond, I. A., Davidson, A. J., Detrich, H. W., Westerfield, M., Zon, L. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+globin+switching+occurs+in+two+developmental+stages+and+is+controlled+by+the+LCR.">Zebrafish globin switching occurs in two developmental stages and is controlled by the LCR.</a> Developmental Biology. 366, 185-194 (2012).</li><li>Renshaw, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation.">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108, 3976-3978 (2006).</li><li>Lin, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+thrombocyte+development+in+CD41-GFP+transgenic+zebrafish.">Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish.</a> Blood. 106, 3803-3810 (2005).</li><li>Page, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evolutionarily+conserved+program+of+B-cell+development+and+activation+in+zebrafish.">An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish.</a> Blood. 122, e1-e11 (2013).</li><li>Ding, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+High-Throughput+Flow+Cytometry+in+Early+Drug+Discovery:+An+AstraZeneca+Perspective.">Application of High-Throughput Flow Cytometry in Early Drug Discovery: An AstraZeneca Perspective.</a> SLAS Discovery. 23, 719-731 (2018).</li><li>Ding, M., Kaspersson, K., Murray, D., Bardelle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+flow+cytometry+for+drug+discovery:+principles,+applications,+and+case+studies.">High-throughput flow cytometry for drug discovery: principles, applications, and case studies.</a> Drug Discovery Today. 22, 1844-1850 (2017).</li><li>Joslin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Fully+Automated+High-Throughput+Flow+Cytometry+Screening+System+Enabling+Phenotypic+Drug+Discovery.">A Fully Automated High-Throughput Flow Cytometry Screening System Enabling Phenotypic Drug Discovery.</a> SLAS Discovery. 23, 697-707 (2018).</li></ol>

Zebrafish é um excelente sistema modelo para estudar hematopoiese vertebral primitiva e definitiva. Ao longo das últimas décadas, vários ensaios foram desenvolvidos e refinados, permitindo que o zebrafish se tornasse um modelo rápido e econômico para testar drogas, gerar e testar mutantes genéticos, e, em geral, permitir que os pesquisadores analisassem caminhos moleculares essenciais para a hematopoiese. Este protocolo utiliza zebrafish embrionários que permite a coleta rápida de dados, o uso de menos espaço f...

A produção de sangue (hematopoiese) é um processo de desenvolvimento essencial que começa primeiro no embrião inicial. Esse processo começa gerando glóbulos vermelhos primitivos e macrófagos diretamente do mesoderme, e posteriormente muda para a produção de células-tronco hematopoiéticas e progenitoras (HSPCs). Essas células-tronco, que são multipotentes, geram todas as variedades de células sanguíneas maduras no organismo. Capaz de auto-renovação, o sistema é continuamente reabastecido através desses HSPCs. Enquanto esse processo começa no início do desenvolvimento, a hematopoiese continua para a vida do animal, fornecendo a capacidade de transportar oxigênio para locais distantes do corpo, parar de sangrar após lesões e proteger o corpo de infecções. O desenvolvimento deste complexo sistema é controlado temporal e espacialmente durante o desenvolvimento e qualquer perturbação na produção de células sanguíneas pode ser catastrófica para o organismo, resultando em anemia, trombocitopenia, leucopenia e leucemia.
Um modelo animal popular usado para pesquisa hematopoiética é o zebrafish (Danio rerio) porque eles têm desenvolvimento sanguíneo semelhante quando comparados aos humanos. Na verdade, muitos dos genes e vias moleculares usados durante a hematopoiese são conservados ao longo da evolução dos vertebrados, permitindo-nos aprender sobre genes humanos estudando zebrafish. É importante ressaltar que os embriões de zebrafish se desenvolvem fora do corpo e em 7 dias geraram a maioria dos tipos de células sanguíneas maduras, permitindo a visualização direta do sistema hematopoiético em um curto espaço de tempo. Os zebrafish também são extremamente fecundos, o que permite aos pesquisadores observar um número maior de amostras em um curto espaço de tempo, o que também é importante para a geração de dados reprodutíveis. O tempo de curta geração e o desenvolvimento externo do zebrafish proporcionam uma manipulação e observação mais fáceis durante os estudos de mutagênese1,2,3,4,5 e triagem de medicamentos6,7,8,9,10. Isso permite que um painel de compostos terapêuticos promissores para distúrbios sanguíneos humanos seja testado de forma rápida e eficiente.
É importante ressaltar que os zebrafish também são geneticamente favoráveis, e o genoma é sequenciado e anotado. Essa tratobilidade permite que técnicas de genética reversa, como o knockdown mediado por morpholino e ablação genética mediada pelo CRISPR sejam realizadas. Os zebrafish também provaram sua utilidade como modelo para realizar telas genéticas avançadas; muitos genes e caminhos essenciais envolvidos na formação de sangue de vertebrados foram descobertos desta maneira. Numerosos métodos de observação de células sanguíneas também foram desenvolvidos em zebrafish. Embora existam técnicas tradicionais de coloração histológica, também é possível realizar hibridização in situ para transcrições específicas do sangue. É importante ressaltar que existem numerosas linhas transgênicas de peixes pelas quais as proteínas fluorescentes são expressas por promotores específicos da linhagem, permitindo a rotulagem de células sanguíneas específicas com proteínas fluorescentes11. Isso permite que os pesquisadores realizem observação a ponto da gênese das células sanguíneas, expansão e regulação em um organismo vivo ao longo do tempo.
No geral, a conservação do sistema hematopoiético, a presença e o fácil desenvolvimento de linhas transgênicas, fácil visualização e tempo de geração curta tornaram o zebrafish um modelo econômico, rápido e adaptável de hematopoiese. Para melhorar a caixa de ferramentas de técnicas disponíveis para pesquisadores de zebrafish, desenvolvemos este ensaio para quantificar robustamente o número de células sanguíneas em embriões. O método envolve a digestão de animais transgênicos e a realização de citometria de fluxo para células sanguíneas fluorescentes. Desta forma, as células sanguíneas de animais mutantes, o efeito da modificação mo e crispr, e o efeito de pequenas moléculas podem ser analisados quantitativamente de forma rápida e reprodutível. Esses ensaios são formas fáceis de usar e econômicas para enumerar as células sanguíneas, permitindo o exame de sua geração, proliferação e manutenção ao longo do tempo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 ml MCF tube</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mm Polystyrene easygrip Petri dish</td>
			<td>Corning Falcon</td>
			<td>351008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml Polystyrene round bottom tube with cell strainer cap</td>
			<td>Corning Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria Fusion flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiolthreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>646563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (10x) with Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14080-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS 500 mL</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>100-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone PBS (1x)</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>sh30256.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Librease</td>
			<td>Roche Sigma-Aldrich</td>
			<td>5401119001</td>
			<td>dissociation protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Roche Sigma-Aldrich</td>
			<td>11459643001</td>
			<td>dechorionation protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Red Dead Cell Stain</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>S34859</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using flow cytometry to detect and quantitate altered blood formation in the developing zebrafish

A diversidade de linhagens celulares que compõem sangue maduro em animais vertebrados decorre da diferenciação de células hematopoiéticas e progenitoras (HSPCs). Este é um processo crítico que ocorre ao longo da vida útil dos organismos, e a interrupção das vias moleculares envolvidas durante a embriogênese pode ter consequências catastróficas a longo prazo. Por uma infinidade de razões, o zebrafish (Danio rerio) tornou-se um organismo modelo para estudar hematopoiese. Os embriões de zebrafish desenvolvem-se externamente, e em 7 dias a pós-fertilização (dpf) produziram a maioria dos subtipos de células sanguíneas definitivas que persistirão por toda a vida. Foram desenvolvidos ensaios para avaliar o número de células hematopoiéticas, utilizando principalmente manchas histológicas específicas, técnicas de hibridização in situ e microscopia de animais transgênicos que utilizam promotores específicos de células sanguíneas que conduzem a expressão de proteínas fluorescentes. No entanto, a maioria dos ensaios de coloração e técnicas de hibridização in situ não quantificam com precisão o número de células sanguíneas presentes; apenas grandes diferenças nos números de células são facilmente visualizadas. A utilização de animais transgênicos e a análise de indivíduos com microscopia fluorescente ou confocal podem ser realizadas, mas a quantitação desses ensaios depende da contagem manual ou do uso de softwares de imagem caros, ambos podem cometer erros. O desenvolvimento de métodos adicionais para avaliar o número de células sanguíneas seria econômico, mais rápido, e poderia até mesmo ser automatizado para avaliar rapidamente o efeito da modificação genética mediada pelo CRISPR, a redução da transcrição mediada por morfolino e o efeito de compostos medicamentosos que afetam a hematopoiese em larga escala. Este novo ensaio para quantificar as células sanguíneas é realizado pela dissociação de embriões inteiros de zebrafish e pela análise da quantidade de células sanguíneas fluorescentes rotuladas presentes. Esses ensaios devem permitir a elucidação de vias moleculares responsáveis pela geração, expansão e regulação das células sanguíneas durante a embriogênese, o que permitirá aos pesquisadores descobrir ainda mais novos fatores alterados durante doenças sanguíneas, bem como caminhos essenciais durante a evolução da hematopeiese vertebrada.

Para enumerar glóbulos vermelhos em zebrafish embrionários, foraminjetados 16 embriões de16 ng no estágio de uma célula com PBS, 7,0 ng/nL ism1 MO, ou 7,0 ng/nL ism1 MO com 7,0 ng ism1 mRNA12. Com 48 cvf foram digeridos e submetidos à análise de citometria de fluxo. Após analisar a porcentagem de GFP+ glóbulos vermelhos de cada amostra (cada amostra é de 5 embriões selecionados aleato...

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Using Flow Cytometry to Detect and Quantitate Altered Blood Formation in the Developing Zebrafish

Este ensaio é um método simples para quantificar células hematopoiéticas no desenvolvimento de zebrafish embrionário. As células sanguíneas de zebrafish dissociados são submetidas à análise de citometria de fluxo. Isso permite a detecção de defeitos sanguíneos em animais mutantes e após modificação genética.

Usando citometria de fluxo para detectar e quantificar a formação sanguínea alterada no zebrafish em desenvolvimento

The diversity of cell lineages that comprise mature blood in vertebrate animals arise from the differentiation of hematopoietic stem and progenitor cells ...

Este protocolo é significativo porque permite a derrubada e a expressão excessiva de genes em um peixe em desenvolvimento, e a quantitação desses efeitos a jusante sobre as células sanguíneas. Este protocolo é rápido, fácil de executar, econômico e fácil de automatizar com acesso à instrumentação adequada. Demonstrando esse procedimento será Kristen Rueb, pesquisadora de graduação em laboratório.Comece transferindo entre cinco e 200, 48 horas post fertilização embriões em uma placa de Petri de plástico de 10 centímetros. Incline o prato para que o embrião afunde até a borda inferior, e remova o máximo de E3 médio do prato possível. Em seguida, adicione 500 microliters de protease de descorionação aos embriões.Depois de cinco minutos em temperatura ambiente, coloque todos os embriões na borda inferior da placa novamente e bata suavemente na lateral do prato, permitindo que os embriões esfreguem suavemente contra a parte inferior da placa para remover completamente seus acordes. Usando uma garrafa de aperto adicione aproximadamente 20 mililitros de meio E3 para diluir a protease, e permitir que os embriões se instalem. Em seguida, decantar o meio, e enxaguar os embriões mais três vezes com meio fresco como apenas demonstrado para remover todos os traços da protease.Para preparar os embriões para dissociação, use uma pipeta P1000 para transferir cinco a dez embriões em um, tubo micro centrífuga de 1,5 mililitro e aspirar o meio E3 transferido. Em seguida, adicione um mililitro de 10 mililitros DTT em E3 médio ao zebrafish embrionário, e coloque o tubo de microcentrifuge em uma posição horizontal por 30 minutos à temperatura ambiente para remover o revestimento do muco. Para dissociação de embriões, lave os embriões tratados DTT três vezes com um mililitro de DPBS suplementado com cálcio e magnésio por lavagem.Antes de adicionar 500 microliters de DPBS suplementados com cálcio e magnésio, e cinco microlitres de cinco miligramas por mililitro, protease dissociação. Em seguida, incubar as amostras a 37 graus Celsius em um agitador orbital horizontal a 185 rotações por minuto durante 60 minutos. Certifique-se de verificar periodicamente os embriões, para que você não os digera demais.Quando uma amostra não completamente homogênea com algum tecido sólido presente pode ser observada, triturar os embriões com uma pipeta P1000 até que a amostra esteja totalmente dissociada. Para preparar as células embrionárias de zebrafish dissociadas para citometria de fluxo, transfira toda a amostra celular para o reservatório superior de um tubo de fundo redondo de poliestireno de cinco mililitros, com uma tampa de coador celular de 35 micrômetros. Enxágüe a tampa com quatro mililitros de PBS sem cálcio ou magnésio, e pelota as células por centrifugação.Em seguida, resuspend as células em 500 microliters de PBS sem cálcio e magnésio por tubo. Para análise citométrica de fluxo das células embrionárias do zebrafish, o vórtice suavemente as suspensões celulares antes de adicionar uma diluição de uma a mil manchas de células mortas vermelhas a cada tubo. Dentro de 30 minutos após a aplicação da mancha de célula morta, esvazie o tanque de resíduos, encha o tanque de baia com a solução apropriada e inicie o sistema fluido do citómetro de fluxo.No software de análise, desenhe cinco parcelas e defina o primeiro plot para medir a dispersão para frente versus lateral. Coloque a dispersão para a frente como linear, e a dispersão lateral para logarítmica. Defina o segundo plot para medir a altura de dispersão dianteira versus a largura de dispersão para a frente, e o terceiro gráfico para medir a altura de dispersão versus largura de dispersão lateral.Defina o quarto plano para medir a mancha de célula morta vermelha no eixo x, e disperso lateral no eixo y para permitir a discriminação de células mortas. O quinto enredo deve ser definido para medir o fluorohore de escolha. Quando todas as parcelas tiverem sido definidas, carregue a amostra no citômetro e reduza a taxa de fluxo para que as células não se escorram rapidamente.Ajuste as configurações de dispersão dianteira e lateral para que a maior parte da população celular possa ser claramente observada, e desenhe um portão em torno da população celular. Rotule essas celas. Com o segundo gráfico de pontos fechado nas celas, o portão na dispersão dianteira e os singlets de dispersão lateral para excluir doublets.Na quarta parcela, ajuste as configurações da mancha de células mortas vermelhas para que haja uma população claramente negativa. Desenhe um portão ao redor dessas celas e rotule essas celas vivas do portão. No quinto lote, portão nas células vivas e desenhar um portão ao redor das células positivas, em seguida, executar cada amostra coletando pelo menos 25.000 eventos de células ao vivo.Quando todas as amostras tiverem sido analisadas, siga o procedimento de desligamento para desligar os fluidos, reabastecer o tanque de baia e esvaziar o tanque de resíduos. Após analisar a porcentagem de glóbulos vermelhos positivos de GFP de cada amostra de zebrafish embrionário, a média de todo o grupo controle pode ser calculada. Normalmente, a média é definida como um e todos os percentuais são calculados a partir deste ponto de referência.Nesta análise representativa, foi determinado que a redução da transcrição do ISM1 com um morfolino específico, reduza o número de glóbulos vermelhos positivos GFP presentes dentro de 48 horas após os embriões de fertilização. Resgatando essa redução nos níveis de morfolino ISM1 com mRNA exógeno, devolva o número de glóbulos vermelhos ao normal. A digestão adequada nas amostras é crítica.Se você digerir demais ou subestimar, você não terá os resultados corretos. Se uma máquina de fax estiver disponível, os pesquisadores podem coletar as células sanguíneas classificando-se para cultura in vitro, sequenciamento de RNA e RT-PCR quantitativo.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Análise de Zebrafish larvas Músculo Esquelético Integrity com Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Biologia do Desenvolvimento

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Técnica ao Target microinjeção para o desenvolvimento<em&gt; Xenopus</em&gt; Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Usando folha de luz microscopia de fluorescência para Imagem Desenvolvimento Zebrafish Eye

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Identificação de progenitores eritromoelóides e sua progênie no embrião de mouse por citometria de fluxo

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

Isolating and Analyzing Cells of the Pancreas Mesenchyme by Flow Cytometry

Isolando e analisando células do pâncreas Mesênquima por citometria de fluxo

The pancreas is comprised of epithelial cells that are required for food digestion and blood glucose regulation. Cells of the pancreas microenvironment, ...

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Formação de grânulos condrogénicos a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por sangue do cordão umbilical

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells HSPCs in Developing Zebrafish Embryos

Desenvolvimento de um ensaio In Vitro para dosar o Progenitor e Hematopoietic Stem Cells (HSPCs) no desenvolvimento de embriões de peixe-zebra

Hematopoiesis is an essential cellular process in which hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) differentiate into the multitude of different cell ...

Use of Hematopoietic Stem Cell Transplantation to Assess the Origin of Myelodysplastic Syndrome

Uso de transplante de células-tronco hematopoiéticas para avaliar a origem da síndrome mielodisplásica

Myelodysplastic syndromes (MDS) are a diverse group of hematopoietic stem cell disorders that are defined by ineffective hematopoiesis, peripheral blood ...

Real-time Live-cell Flow Cytometry to Investigate Calcium Influx, Pore Formation, and Phagocytosis by P2X7 Receptors in Adult Neural Progenitor Cells

Citometria de fluxo de viver-pilha em tempo real para investigar o influxo de cálcio, formação de poros e fagocitose pelos receptores P2X7 em células progenitoras neurais adulto

Live-cell flow cytometry is increasingly used among cell biologists to quantify biological processes in a living cell culture. This protocol describes a ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Hibridização em Embriões de Zebrafish e Ensaio de Formação de Tubos em iPSC-CEs para estudar o papel da endoglina no desenvolvimento vascular

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...